Summary
Denna artikel beskriver ett detaljerat protokoll för att använda RNA-targeting Cas13D enzym (RfxCas13D) i flugor.
Abstract
CasRx, en medlem av RNA-inriktade Cas13-familjen, är ett lovande nytillskott av CRISPR / Cas-teknikerna i effektiv genutskriftsreduktion med en attraktiv off-target-profil på både cellulära och organismala nivåer. Det rapporteras nyligen att CRISPR/CasRx systemet kan användas för att uppnå allestädes närvarande och vävnad-specifika gen transkription minskning i Drosophila melanogaster. Detta dokument beskriver metoderna från det senaste arbetet, bestående av tre delar: 1) allestädes närvarande in vivo endogen RNA-inriktning med hjälp av ett tvåkomponent CasRx-system; 2) Allestädes närvarande in vivo exogent RNA-mål med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter. och 3) vävnadsspecifik in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter. Effekterna av RNA inriktning observeras inkluderar riktade genspecifika fenotypiska förändringar, riktade RNA transkript minskning och tillfällig dödlighet fenotyper i samband med högt uttryck av CasRx protein och säkerheter verksamhet. Sammantaget visade dessa resultat att CasRx-systemet kan rikta RNA-transkriptreduktion på organismnivå på ett programmerbart och effektivt sätt, vilket visar att in vivo transcriptome-inriktning och teknik är genomförbar och lägger grunden för framtida in vivo CRISPR-baserade RNA-inriktningstekniker.
Introduction
Sedan tillkomsten av Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) teknik, mycket av fokus inom detta område har varit på DNA-redigering, som erbjuder transformativa tillämpningar inom medicin och bioteknik1. Permanent förändring av DNA-sekvenser är dock inte alltid önskvärd på grund av etiska överväganden. Mot bakgrund av detta började nyligen genomförda studier utveckla CRISPR-baserade verktyg för att rikta in sig på RNA och visade att CRISPR-teknik verkligen kan användas för RNA-inriktning i en mängd olika biologiska system2,3,4,5,6,7. I många av dessa testade system är den nuvarande allmänt använda metoden för att rikta in sig på RNA och transkriptreduktion RNA-interferens (RNAi), vilket är långt ifrån perfekt, ofta uppvisar varierad effekt och hög off-target-aktivitet när den används i vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Med tanke på statusen för dessa tekniker är det därför värt att ytterligare undersöka potentialen hos CRISPR-baserade verktyg för RNA-inriktning.
En anmärkningsvärd ny studie rapporterade att ribonukleas CasRx, en medlem av Cas13d-klassen, effektivt kan minska genutskriftsnivåer i mänsklig cellkultur och har en attraktiv off-target profil4. Detta konstaterande ledde till frågan om denna nya ribonukleas kan bibehålla sin effekt och låga off-target frekvens för RNA-inriktning på organismnivå. En nyligen genomförd studie tog upp denna fråga genom att visa att CasRx-systemet kan användas för att uppnå allestädes närvarande och vävnadsspecifik genutskriftsreduktion i Drosophila melanogaster5.
För att effektivisera användbarheten av denna nyligen publicerade metod beskriver detta protokoll metoderna från detta senaste arbete, som består av tre huvuddelar: 1) allestädes närvarande in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett tvåkomponent CasRx-system; 2) Allestädes närvarande in vivo exogent RNA-mål med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter. och 3) vävnadsspecifikt in vivo RNA-mål med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter.
Vägleda RNAs (gRNA) som uppsätta som målgener under kontrollera av en allestädes närvarande promotor planlades, och fluga fodrar att uttrycka dessa gRNA-innehållande konstruktioner genererades. CasRx konstruktioner under kontroll av antingen en allestädes närvarande promotor, eller en villkorlig uppströms aktiveringssekvens (UASt) promotor som kan aktiveras av GAL4 transkriptionsfaktorn, utformades också och fluglinjer som hyser dessa CasRx-innehållande konstruktioner genererade. Katalytiskt inaktiva CasRx konstruktioner, dCasRx, utformades och användes som negativa kontroller. Allestädes närvarande RNA-inriktning i flugor uppnås genom att korsa gRNA-uttryckande flyglinjer med allestädes närvarande CasRx-uttryckande flyglinjer. Avkomman som uttrycker både gRNA-konstruktionen som riktar sig mot en specifik genutskrift och CasRx-proteinet har en allestädes närvarande minskning av riktade genutskrifter. Vävnadsspecifik RNA-inriktning i flugor uppnås genom att först korsa gRNA-uttryckande flugor med UASt-CasRx uttrycker flugor, erhålla transheterozygous flugor som bär både gRNA och UASt-CasRx konstruktioner. Sådana flugor korsas i sin tur med vävnadsspecifika GAL4-uttryckande flugor, vilket resulterar i generering av vävnadsspecifikt CasRx-uttryck och RNA-inriktning hos flugor.
CasRx-systemets programmerbara karaktär erbjuder möjligheten till anpassning och optimering för att uppnå hög effektivitet och låg off-target-aktivitet för in vivo RNA-inriktning. Potentiella tillämpningar av CRISPR-baserad RNA-inriktning är många, inklusive att ersätta RNAi i laboratoriet och bidra till insektsvektorkontroll i naturen. Av de senare är ett av de globala ouppfyllda behoven utvecklingen av effektiva verktyg för att bekämpa infektioner av RNA-virus som överförs via myggor. Många RNA-virus, såsom denguefeber, Zika och chikungunyavirus, överförs via myggor, vilket påverkar människors hälsa och bidrar till dödlighet. Många förslag för att konstruera myggpopulationer med virusresistens för förebyggande av sjukdomar har lagts fram; Emellertid, ingen strömteknologi är kompetent att göra myggor samtidigt resistent till alla viktiga RNA-virus18.19.20.21.22.23. RNA-inriktade Cas-system kan utgöra en utgångspunkt för en sådan teknik genom att möjliggöra en programmerbar plattform för att rikta in sig på alla myggburna RNA-virus.
Protocol
1. Allestädes närvarande in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett casrxsystem med två komponenter
- Generera Ubiq-CasRx och Ubiq-dCasRx uttryck vektor
- Förstärk CasRx-sekvensen med hjälp av en polymeraskedjereaktion (PCR) med primer 1050E. C3 och 1050E. C4 och den ursprungliga CasRx-konstruktionen pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx); och förstärka dCasRx-sekvensen med PCR med primer 1050E. C3 och 1050E. C4 och den ursprungliga dCasRx-konstruktionen pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)4 (tabell 1). Gelrena de förstärkta CasRx- och dCasRx-fragmenten efteråt med hjälp av ett gelreningskit.
- Smält basvektor (Addgene plasmid #112686) med restriktionsenzymer SwaI och PacI24. I de resulterande produkterna, använd ett kit för att gel-rena det större fragmentet, som kallas basvektorns ryggrad.
- Montera Ubiq-CasRx-vektorn med basvektorns stamnät och CasRx-fragmentet med hjälp av Gibson-monteringsmetoden. montera Ubiq-dCasRx vektorn med basvektorns stamnät och dCasRx-fragmentet med hjälp av Gibson-monteringsmetoden25.
OBS: Addgene-ID för Ubiq-CasRx vektor (OA-1050E) är #132416, och Addgene ID för Ubiq-dCasRx vektor (OA-1050R) är #132417.
- Generera gRNA-uttryck vektor
- Designa varje gRNA-fragment baserat på följande kriterier: målsekvensen är 30 nukleotider i längd; Den maximala längden på poly-U-sträckor i målsekvensen är 4 baspar. målsekvensen GC-innehåll som är i intervallet 30% - 70%; målsekvensen förutspådde att inte bilda starka RNA hårnål strukturer; och målsekvensen som innehåller minimal förväntad RNA sekundär eller tertiär struktur5.
OBS: Denna studie designade varje gRNA som 4 tandemsekvenser var 30 nukleotider långa, fördelade av 36 nukleotid långa direkta upprepningar och med en 7-tymin terminator i båda ändar5. För exogen målgenen, GFP, följdes samma kriterier som ovan med ett tillägg av ett OpIE2-GFP-fragment5. - Förstärk U6:3-promotorsekvensen med PCR med primersna 1043.C1 och 1043.C23 och Addgene plasmid #112688 (tabell 1)26. Gelrening de förstärkta U6:3-fragmenten med hjälp av gelreningskit.
- Digest Addgene plasmid #112688 med restriction enzyme AscI och XbaI24. I de resulterande produkterna, använd ett kit för att gelrena de större fragmenten, som kallas pre-base vektor ryggrad.
- Montera basvektorn med pre-base vektor ryggrad och U6:3 fragment med Hjälp av Gibson monteringsmetod25. Basvektorn nedan heter OA-1043.
OBS: Plasmiden OA-1043:s Addgene-ID är #164586. - Syntetisera målgenens gRNA-fragment med hjälp av extern gensyntestjänst.
- Smält basvektorn OA-1043 med begränsningsenzymet PstI och NotI24. Håll hela matsmältningsprodukten, som kallas smält OA-1043.
- Montera gRNA-uttrycksvektor med den smälta OA-1043 och målgen gRNA-fragmentet med hjälp av Gibson-monteringsmetoden25.
OBS: Fyra målgener studerades: tre var endogena (vita, hack, gula), en var exogen (GFP). Deras Addgene ID är: #132420 (gRNAw), #132421(gRNAN), #132425 (gRNAy) och #133304 (gRNAGFP).
- Designa varje gRNA-fragment baserat på följande kriterier: målsekvensen är 30 nukleotider i längd; Den maximala längden på poly-U-sträckor i målsekvensen är 4 baspar. målsekvensen GC-innehåll som är i intervallet 30% - 70%; målsekvensen förutspådde att inte bilda starka RNA hårnål strukturer; och målsekvensen som innehåller minimal förväntad RNA sekundär eller tertiär struktur5.
- Generera transgena flugor
- Injicera uttrycksvektorer i flugembryon med hjälp av extern injektionstjänst för flugmbryon och embryon från flugor som innehåller ØC31-integrationsställen. Upp de injicerade embryona vid 26 °C.
OBS: Attp40w (med integration platser på 2: a kromosom) linjen användes för att generera CasRx linjer och 8622 (med integration platser på 3: e kromosom) linjen användes för att generera olika gRNA linjer. - Håll flugorna antingen som homozygous linjer eller som balanserade heterozygous linjer.
OBS: Ubiq-CasRx och Ubiq-dCasRx flugor hölls som heterozygous balanserade linjer med CyO som balansering. Dessutom innehåller både Ubiq-CasRx och Ubiq-dCasRx vektorer en dsRed markör. Som ett resultat har Ubiq-CasRx och Ubiq-dCasRx flugor följande tre fenotyper: dsRed-positiva, lockiga vingar och vita ögon. De gRNA-uttryckande flugorna hölls som homozygous linjer. Deras Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) fluglagernummer är: #84118 (Ubiq-CasRx), #84119 (Ubiq-dCasRx), #84124 (gRNAw), #84122 (gRNAN), #84123 (gRNAy), #84986 (gRNAGFP).
- Injicera uttrycksvektorer i flugembryon med hjälp av extern injektionstjänst för flugmbryon och embryon från flugor som innehåller ØC31-integrationsställen. Upp de injicerade embryona vid 26 °C.
- Flyggenetik (figur 1A)
- Samla 10 jungfruliga vuxna kvinnliga flugor från den homozygous gRNA-linjen och samla 5 vuxna manliga flugor från den balanserade heterozygous Ubiq-CasRx / CyO-linjen. Lägg de insamlade kvinnliga och manliga flugorna, som kallas föräldraflugorna, i en flaska kompletterad med torrt jästpulver (figur 1A).
- Upprepa föregående steg 3 gånger för att generera 3 replikat. För kontrollgruppen använder du Ubiq-dCasRx/CyO-linjen samtidigt som du behåller allt annat på samma sätt.
OBS: För en vanlig glasflaska med mat är 0,1 g torrt jästpulver tillräckligt. BDSC:s flugmatsrecept används. - Bakre injektionsflaskan som innehåller föräldraflugorna vid 26 °C i 48 timmar. Ta sedan bort alla föräldraflugor från varje flaska. Håll sedan injektionsflaskan vid 26 °C i minst 20 dagar.
- Observera injektionsflaskan varje dag för att se om några nya vuxna avkomlingar uppstod från puppar av F1-generationen. Om så är fallet, bedöva dem med koldioxid genom att sätta in ett rör som är anslutet till en koldioxidtank inuti flygflaskan och slå sedan på flödesbrytaren i 10 sekunder.
- När flugorna blir orörliga, töm dem från injektionsflaskan på en flugplatta, som också är ansluten till koldioxidtanken och koldioxid strömmar kontinuerligt ut genom flugplattan.
- Poängför de sövda flugornas fenotyp och avbilda dem med färgkamera ansluten till ett fluorescerande stereomikroskop. Räkna antalet avkommor med olika fenotyper. Använd bildbehandlingsprogram för efterbehandling och sammanställning av bilder (figur 2A - 2D).
OBS: Baserat på mendeliangenetik förväntas två typer av flugor bland avkomman för varje kors (figur 1A).
- RNA-Seq (Bild 2E – 2G)
- Exempelsamling
OBS: Välj en lämplig provsamlingsmetod bland de tre exemplen nedan; 3 replikat för varje distinkt provtyp krävs.- Samling av vuxenflughuvudprov
- Samla 10 jungfruliga vuxna kvinnliga flugor från den homozygous gRNA-linjen. Samla 5 vuxna hanflugor från den balanserade heterozygous Ubiq-CasRx / CyO-linjen. Sätt de insamlade kvinnliga och manliga flugorna, som är föräldraflugorna, i en flaska kompletterad med torrt jästpulver.
- Upprepa föregående steg 3 gånger för 3 replikat. För kontrollgruppen använder du Ubiq-dCasRx/CyO-linjen samtidigt som du behåller allt annat på samma sätt.
- Bakre injektionsflaskan som innehåller föräldraflugorna vid 26 °C i 48 timmar. Ta sedan bort alla föräldraflugor från varje flaska. Håll sedan injektionsflaskan vid 26 °C tills avkomma kommer ut ur puppar.
- Samla 10 1-dagars gamla vuxna flugor med rätt fenotyp. Bedöva flugorna med koldioxid, skär sedan av flughuvudet och lägg huvudena i ett 1,5 ml centrifugrör på torris. Förvara centrifugröret vid -80 °C. Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat.
- 17 – 20 timgamla embryoprovsamling
- Samla 8-10 jungfruliga vuxna kvinnliga flugor från den homozygous gRNA-linjen. Samla 4-5 vuxna manliga flugor från den balanserade heterozygous Ubiq-CasRx / CyO-linjen. Sätt de insamlade kvinnliga och manliga flugorna, som är föräldraflugorna, i en flaska kompletterad med torrt jästpulver.
- Upprepa föregående steg 3 gånger för 3 replikat. För kontrollgruppen använder du Ubiq-dCasRx/CyO-linjen samtidigt som du behåller allt annat på samma sätt.
- Bakre injektionsflaskan som innehåller föräldraflugorna vid 26 °C i 48 timmar.
- Förbered en embryosamlingskammare för druvsaft för varje replikat enligt detta recept: 376 ml vatten, 126 ml druvsaft, 15 g agar och 6 g sackaros. Lägg mediet i en 1 L-bägare och mikron den på hög i 5-6 minuter samtidigt som du håller ett öga på mediet i bägaren för att kontrollera om bubblor / skum visas. Stoppa i så fall mikrovågsugnen och låt bubblan/skummet sätta sig. Fortsätt mikrovåga på detta sätt tills bubblan blir klar. Virvla inte runt förrän alla bubblor är klara. Slutligen tillsätt 10 ml 100% alkohol och 5 ml ättiksyra. Blanda väl och rör sedan mediet i 35 mm Petri-rätter med en 25 ml serologisk pipet. När media stelnar i Petri-skålen är den klar att användas.
- I slutet av inkubationen på 48 timmar överför du föräldraflugor till insamlingskamrarna för druvsaft och inkuberade dem vid 26 °C i 3 timmar. Ta sedan bort de vuxna flugorna samtidigt som de nylagda embryona hålls på druvsaftplattorna i ytterligare 17 timmar vid 26 °C.
- Efter inkubation, samla upp de 50 - 100 embryona från druvsaftplattorna, rengör embryoytan genom att sänka dem i avjoniserat vatten och överför dem sedan till ett 1,5 ml centrifugrör på is. Förvara dem vid -80 °C. Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat.
- Första instar larver provsamlingen
- Samla 8-10 jungfruliga vuxna kvinnliga flugor från den homozygous gRNA-linjen. Samla 4-5 vuxna manliga flugor från den balanserade heterozygous Ubiq-CasRx / CyO-linjen. Sätt de insamlade kvinnliga och manliga flugorna, som är föräldraflugorna, i en flaska kompletterad med torrt jästpulver. Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat. För kontrollgruppen använder du Ubiq-dCasRx/CyO-linjen samtidigt som du behåller allt annat på samma sätt.
- Bakre injektionsflaskan som innehåller föräldraflugorna vid 26 °C i 48 timmar. Överför sedan de vuxna flugorna till en annan ny vanlig matflaska för inkubation över natten (16 h) vid 26 °C. Ta sedan bort de vuxna flugorna.
- Håll den embryoinnehållande injektionsflaskan vid 26 °C i 24 timmar och poängsätta sedan de transheterozygous första instar larverna under mikroskopet med hjälp av baserade distinkta markörer. Samla 15-30 larver med rätt fenotyper och lägg dem i ett 1,5 mL centrifugrör och lagra dem vid -80 °C. Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat.
- Samling av vuxenflughuvudprov
- Sekvensering
- RNA-extraktion: använd ett kommersiellt tillgängligt RNA-extraktionssats och följ satsens instruktioner för att bearbeta alla prover. Inkubera sedan de extraherade RNA-proverna med kommersiellt tillgänglig deoxyribonukleas och följ dess instruktioner för att ta bort eventuellt förorenande DNA från proverna.
- Mät RNA-koncentrationen med hjälp av kommersiellt tillgänglig UV-vis spektrofotometer. Mät RNA-integriteten i proverna med hjälp av kommersiellt tillgängliga RNA-integritetsanalysinställningar.
- Konstruera RNA-seq-biblioteken med hjälp av kommersiellt tillgängliga RNA-biblioteksförberedelser.
- Använd extern sekvenseringstjänst för bibliotekssekvensering med följande inställningar: enkelläsläge; läslängd: 50nt, djup: 20 miljoner läsningar per bibliotek. Utför basanrop med RTA 1.18.64 och konvertera sedan data till FASTQ med bcl2fastq 1.8.4.
OBS: Rådata finns i National Center for Biotechnology Information Sequencing Read Archive (inlämnings-ID: SUB6818910 [BioProject: PRJNA600654]).
- Bioinformatik
- Kartan läser från sekvenseringsdata till Release 6 Drosophila melanogastergenom från Berkeley Drosophila Genome Project (GenBank accession number: GCA_000001215.4) och de exogena CasRx - och GFP-sekvenserna med standardparameterinställningen för STAR aligner28 med tillägget av filteralternativet "-outFilterType BySJout" och "-sjdbGTFfile Drosophila_melanogaster. BDGP6.22.97.gtf" genöverföring format fil från ENSEMBL.
- Bestäm antalet råa transkriptioner för varje kommenterad transkription med funktionen Counts35 med alternativen "-t exon -g gene_id -M -O --fraction". Normalisera sedan antalet råa transkriptioner med hjälp av totalt antal transkriptioner med hjälp av Perl-skriptet "addTpmFpkmToFeatureCounts.pl".
- Använd den maximala posteriori-metoden med den ursprungliga krympningsuppskattningen i DESeq2-pipelinen för att uppskatta varje gens transkriptions logaritmiska vikningsförändring (LFC).
- Exempelsamling
2. Allestädes närvarande in vivo exogen RNA-inriktning med hjälp av ett trekomponents CasRx-system
- Generera exogen mål allestädes närvarande uttryck vektor
- PCR förstärker Ubiq-promotorfragmentet med primers 1052B. C1 och 1052B. C2 och Addgene-plasmiden #112686 26. Sedan förstärker PCR T2A-eGFP-fragmentet förstärkt från Addgene plasmid #112686 med primers 908A.1 och 908A.2 (tabell 1)26. Sedan förstärker PCR Ubiq-promotorfragmentet som omvänd sekvens med Addgene plasmid #112686 med primersna 908A.3 och 908A.4 (tabell 1)26. Gel-rena Ubiq promotor fragment, T2A-eGFP fragment och omvänd Ubiq promotor fragment med gel reningskit.
- Beställ en anpassad firefly luciferase kodningssekvens och ett anpassat fragment som innehåller ett p10 3'UTR-fragment, omvänd renilla luciferas följt av ett SV40 3'UTR-fragment.
- Digest Addgene plasmid #112688 med restriction enzyme AscI och XbaI24. I de resulterande produkterna renar gel-de större fragmenten med hjälp av gelreningssats, som kallas basvektorns ryggrad.
- Använd Gibson-monteringsmetoden för att montera basvektorn med basvektorns stamnät och följande fragment: Ubiq-promotorfragment, T2A-eGFP-fragmentet, det omvända Ubiq-promotorfragmentet, kodningssekvensen för firefly luciferas och omvänd renilla luciferas följt av ett SV40 3'UTR-fragment25.
OBS: Addgene-ID för den resulterande dual-luciferase uttryck vektorn (OA-1052B) är #132426.
- Generera gRNA-uttryck vektor
- PCR förstärker U6:3-promotorsekvensen med primersna 1043.C1 och 1043.C23 och Addgene plasmid #112688 (tabell 1)26. Gelrening de förstärkta U6:3-fragmenten med hjälp av gelreningskit.
- Digest Addgene plasmid #112688 med restriction enzymet AscI och XbaI24. I de resulterande produkterna renar gel-de större fragmenten, som kallas pre-base vektor ryggrad, med hjälp av gel reningssats.
- Montera basvektorn med pre-base vektor stamnät och U6:3 fragment med Hjälp av Gibson monteringsmetod25. Basvektorn nedan heter OA-1043.
- Syntetisera målgenens gRNA-fragment med hjälp av extern gensyntestjänst.
- Smält basvektorn OA-1043 med begränsningsenzymet PstI och NotI24. Behåll hela matsmältningsprodukten, som kallas smält OA-1043.
- Montera gRNA-uttrycksvektor med den smälta OA-1043 och målgen gRNA-fragmentet med hjälp av Gibson-monteringsmetoden25.
OBS: Addgene-ID för den resulterande plasmiden (OA-1052K) är #132422.
- Generera transgena flugor
- Injicera OA-1052B vektor i flugembryon med embryon från flugor som innehåller ØC31-integrationsstället på den tredje kromosomen, BDSC fluglagernummer 9744, via extern injektionstjänst för flugembryon. På samma sätt injiceraR du OA-1052K vektor i flugembryon med embryon från flugor som innehåller ØC31-integrationsplatsen på den tredje kromosomen, BDSC fluglager nummer 8622. Upp de injicerade embryona vid 26 °C.
- Håll de dubbel luciferas-uttryckande flugorna och gRNA flyger som homozygous linjer; håll Ubiq-CasRx-linjerna som dubbelbalanserade heterozygous linjer genom att överträffa den enkelbalanserade heterozygous Ubiq-CasRx linjen som genereras i avsnitt 1 till balanseringslinjer som bär TM6 balansering kromosom med stubb (Stb) markör och behålla endast de dubbelbalanserade avkomman med vitögda, lockiga vingar och dsRed-fluorescerande fenotyper samtidigt.
OBS: BDSC-flygstocksnumren är: #84127 (Ubiq-Fluc-Rluc), #84125 (gRNAFluc).
- Fluggenetik (figur 1B och figur 3A)
- Samla 8-10 jungfruliga vuxna kvinnliga flugor från den dubbla luciferas-uttryckslinjen. Samla 4-5 vuxna manliga flugor från den balanserade heterozygous Ubiq-CasRx / CyO; +/TM6, Stb linje som visar vitögda, lockiga vingar och dsRed fluorescens samtidigt. Lägg de insamlade kvinnliga och manliga flugorna, som är föräldraflugorna, i en flaska kompletterad med torrt jästpulver (nedan kallat Steg 1 Cross).
- Upprepa föregående steg 3 gånger för 3 replikat. För kontrollgruppen använder du Ubiq-dCasRx/CyO; +/TM6, Stb linje samtidigt som allt annat är detsamma.
- Bakre steg 1 Cross injektionsflaskan som innehåller föräldraflugorna vid 26 °C i 48 timmar. Ta sedan bort alla föräldraflugor från varje flaska. Håll sedan injektionsflaskan vid 26 °C i minst 14 dagar. Under denna tid samla 8-10 kvinnliga oskulder från den homozygous firefly luciferase-inriktning gRNA-linjen. Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat.
- Observera steg 1 Cross injektionsflaskan varje dag för att se om någon ny vuxenfluga kommer från puppar. Om så är fallet, bedöva dem med koldioxid, samla 5 manliga flugor som uttrycker både Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) och den dubbla luciferasreportern från avkomman och sätt dem i en ny flaska tillsammans med 10 jungfruliga honor från den brand luciferflyase-riktade gRNA-linjen (nedan kallad Steg 2 Cross). Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat.
- Samla en annan 5 endags gammal hane som uttrycker både Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) och den dubbla luciferasreportern från Steg 1 Cross injektionsflaskan och inkubera dem i 2 - 4 dagar vid 26 °C. Överför dem sedan till 1,5 ml centrifugrör och förvara dem vid -80 °C. Upprepa det här steget 3 gånger för tre replikat.
- Bakre steg 2 Cross injektionsflaskan som innehåller föräldraflugorna vid 26 °C i 48 timmar. Ta sedan bort alla föräldraflugor från varje flaska. Håll sedan injektionsflaskan vid 26 °C i minst 20 dagar.
- Observera steg 2 Cross injektionsflaskan varje dag för att se om några nya vuxna avkompenser kom från puppar. Om så är fallet, bedöva dem med koldioxid, poäng de sövda flugornas fenotyper och avbilda dem med färgkamera utrustad med ett fluorescerande stereomikroskop. Räkna antalet avkommor med olika fenotyper. Använd bildbehandlingsprogram för efterbehandling och sammanställning av bilder (bild 3B – 3C).
OBS: Mendelian genetik tyder på att, om flugor är alla livskraftiga, 4 typer av flugor förväntas bland avkomman från steg 2 Cross, var och en står för 25% av befolkningen (figur 1B och figur 3A).
- Luciferasanalys (figur 3D)
- Generera de tredubbla transheterozygous flugorna samt kontrollflugorna genom att upprepa steg 2.4.1-2.4.5. Samla manliga flugor vid födseln och ålder dem tills de är 3 dagar gamla.
- Överför de 3-dagars gamla flugorna till 1,5 mL centrifugrör och lysa dem med en pestle och luciferaslysbufferten av kommersiellt tillgängliga luciferasanalyssats.
- Använd 5 μL lyserad vävnad från varje prov för att mäta både firefly- och renilla luciferasaktivitet med hjälp av kommersiellt tillgängliga luciferasanalyskit och luminometer.
3. Vävnadsspecifik in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett trekomponents CasRx-system
- Generera UASt-CasRx och UASt-dCasRx uttryck vektor
- PCR förstärker UASt-promotorsekvensen med hjälp av plasmid pJFRC81 och primers 1041.C9 och 1041.C11; sedan förstärker PCR CasRx-fragment med plasmiden OA-1050E (Addgene ID #132416) och primers 1050L. C1 och 1050E. C4; och sedan PCR förstärka dCasRx fragment med plasmid OA-1050R (Addgene ID #132417) och primers 1050L. C1 och 1050E. C4 (tabell 1)26. Gelrena den förstärkta UASt-promotorsekvensen, CasRx- och dCasRx-fragmenten med hjälp av gelreningssats.
- Smält basvektor (Addgene plasmid #112686) med restriktionsenzymer NotI och PacI24. I de resulterande produkterna renar gel-det större fragmentet, som kallas basvektorns ryggrad, med hjälp av gelreningssats.
- Montera UASt-CasRx-vektorn med basvektorns stamnät, UASt-promotorsekvensen och CasRx-fragmentet med Hjälp av Gibson-enheten. montera sedan UASt-dCasRx-vektorn med basvektorns stamnät, UASt-promotorsekvensen och dCasRx-fragmentet med hjälp av Gibson-monteringsmetoden25.
OBS: UASt-CasRx vektorn är Addgene plasmid #132418, och UASt-dCasRx vektorn är Addgene plasmid #132419
- Generera transgena flugor
- Injicera UASt-CasRx vektor i flugembryon med hjälp av flugembryoninjektionstjänst och embryon från flugor ØC31 integrationsplats 8621 på deras andra kromosomer; injicera sedan UASt-dCasRx vektor i flugembryon med hjälp av fly embryo injektion service och embryon från flugor ØC31 integration plats 8621 på deras andra kromosomer. Upp de injicerade embryona vid 26 °C.
- Håll flugorna som dubbelbalanserade heterozygous linjer med CyO- och Sb-markörer. OBS: ID:erna för flyglinjerna i BDSC är 84121 (UASt-CasRx) och 84120 (UASt-dCasRx).
- Flyggenetik (figur 1C)
- Beställ önskade GAL4-rader från BDSC; Få relevanta gRNA-linjer från steg 3.2.2 (eller från BDSC).
OBS: Följande 2 GAL4-flugor från BDSC användes: GAL4-GMR (BDSC ID: #29967), GAL4-y (BDSC ID: #44373). Samma 3 gRNA-linjer som genererades i det första avsnittet användes: gRNAw (BDSC ID: #84124), gRNAN (BDSC ID #84122), gRNAy(BDSC ID: #84123). - Samla 5-10 jungfruliga vuxna kvinnliga flugor från gRNA-linjen. Samla 2-4 vuxna manliga flugor från den dubbelbalanserade heterozygous UASt-CasRx / CyO; +/TM6, Sb-linje som visar vitögda, lockiga vingar och dsRed fluorescens samtidigt. Lägg de insamlade kvinnliga och manliga flugorna, som är föräldraflugorna, i en vanlig matflaska (nedan kallad Steg 1 Cross). Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat. För kontrollgruppen använder du UASt-dCasRx/CyO; +/TM6, Sb linje samtidigt som allt annat är detsamma.
- Bakre steg 1 Cross injektionsflaskan som innehåller föräldraflugorna vid 26 °C i 48 timmar. Ta sedan bort alla föräldraflugor från varje flaska. Håll sedan injektionsflaskan vid 26 °C i minst 14 dagar. Under denna tid samlar du 5-10 kvinnliga oskulder från GAL4-linjen. Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat.
- Observera steg 1 Cross injektionsflaskan varje dag för att se om någon ny vuxenfluga kommer från puppar. Om så är fallet, bedöva dem med koldioxid, samla 2-4 manliga flugor som uttrycker både UASt-CasRx (eller UASt-dCasRx) och gRNA-vektorn från avkomman som samtidigt har dsRed-fluorescerande och stubbfenotyper. Lägg de insamlade hanarna från Steg 1 Cross i en ny flaska tillsammans med 5-10 insamlade jungfruliga kvinnor från GAL4-linjen (nedan kallad Steg 2 Cross). Upprepa det här steget 3 gånger för 3 replikat.
- Bakre steg 2 Cross injektionsflaskan som innehåller föräldraflugorna vid 26 °C i 48 timmar. Ta sedan bort alla föräldraflugor från varje flaska. Håll sedan injektionsflaskan vid 26 °C i minst 20 dagar.
- Observera steg 2 Cross injektionsflaskan varje dag för att se om någon ny vuxenfluga kommer från puppar. Om så är fallet, bedöva dem med koldioxid, poäng de sövda flugornas fenotyper och avbilda dem med färgkamera utrustad med ett fluorescerande stereomikroskop. Räkna antalet avkommor med olika fenotyper. Använd bildbehandlingsprogram för efterbehandling och sammanställning av bilder (bild 4).
OBS: Mendelian genetik tyder på att, om flugor är alla livskraftiga, 4 typer av flugor förväntas bland avkomman från Steg 2 Cross, var och en står för 25% av befolkningen (figur 1C).
- Beställ önskade GAL4-rader från BDSC; Få relevanta gRNA-linjer från steg 3.2.2 (eller från BDSC).
Representative Results
Allestädes närvarande in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett tvåkomponents CasRx-system
F1 transheterozygous flugor uttrycker både Ubiq-CasRx och gRNA (inriktning både endogena och exogena gener) konstruktioner visade markerade fenotyper jämfört med kontrollflugor som uttrycker Ubiq-dCasRx och gRNA konstruktioner (figur 2 och figur 4). Specifikt har de transheterozygous CasRx flugorna betydligt lägre överlevnadsnivåer jämfört med de transheterozgyous dCasRx flugor, vilket indikerar toxicitet i Ubiq-CasRx systemet (figur 2A och figur 4A). Det är värt att notera att både transheterozygous CasRx och dCasRx flugor har mindre än 50% arvsgrad, vilket är det förväntade förhållandet baserat på mendelian genetik. Av de tre målgenerna, Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ flugor och Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ flugor är icke-livskraftiga (0% arv) och växte inte utöver det andra instar larverna (figur 2A-2B). Den överlevande Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+ flugor, vars arv var 12,9%, visade en distinkt helt penetrant vitögd fenotyp (figur 2B). Förutom observerbara egenskaper associerade med CasRx, kunde vi bekräfta betydande minskning av målgen transkriptioner för 3 mål gener: Hack, gul och GFP (Figur 2E-2G). Minskning av vita gen transkript observerades i Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ flugor, jämfört med kontrollen Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+ flugor, även om minskningen inte var statistiskt signifikant (figur 2E - 2F). Vid jämförelse av de differentiellt uttryckta avskrifterna mellan prover från CasRx-expresserande flugor och prover från dCasRx-expresserande flugor (figur 2E, 2G) jämfördes de differentiellt uttryckta avskrifterna mellan prover från CasRx-uttryckande flugor och prover från dCasRx-uttryckande flugor (figur 2E, 2G). Antalet icke-målutskrifter som uttrycks väsentligt är som följer: vit, 253 (1,4% av de totala transkriptionerna); Skåra, 300 (1,7%).) gul, 41 (0,23%); GFP, 5 880 (33 %) (Figur2G). Av de totalt 17 779 olika transkriptionerna uttrycktes 6 icke-målutskrifter signifikant i alla 4 grupper av prover. En av de 6 transkriptioner som identifierades var Gadd45, en gen involverad i apoptos och cellulär arrestering i flugor, vilket ökar möjligheten att casRx enzymatiska verkan antingen direkt kan utlösa cellulär apoptos eller indirekt utlösa feluttryck av andra gener, vilket i sin tur leder till apoptos. Slutligen är det värt att notera att flugorna Ubiq-CasRx och Ubiq-dCasRx inte etablerades som homozygösa lager, förmodligen på grund av toxicitet som kännetecknas av högt allestädes närvarande uttryck. Som ett resultat användes heterozygous Ubiq-CasRx/CyO och Ubiq-dCasRx/CyO flugor för att korsa med homozygous gRNA fluglinjer. Sammanfattningsvis kan tvåkomponentsystemet Ubiq-CasRx uppnå allestädes närvarande RNA-inriktning för både endogena och exogena mål som resulterar i observerbara fenotyper och transkriptreduktion. Dessa resultat visade också att CasRx-medierad RNA-inriktning kan införa toxicitet in vivo.
Allestädes närvarande in vivo exogen RNA-inriktning med hjälp av ett trekomponents CasRx-system
Resultaten från tvåstegskorset visade att trots målgenens exogena karaktär (dvs. Fluc), som uttrycker alla tre transgenerna i F2 trippeltransheterozygotes (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) resulterade i 100% dödlighet jämfört med kontrollkors som involverar Ubiq-dCasRx, där ingen dödlighet observerades i F2 trippeltransheterozygotes (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc ). Mer specifikt resulterade endast kombinationen av alla tre transgenerna (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) i 100% dödlighet (figur 3B och D), medan (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) och (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) genotyper var livskraftiga och saknade fenotyper med deras arvshastigheter som matchade de förväntade mendelianska överföringshastigheterna, vilket tyder på att tillgängligheten av målsekvensen (dvs. firefly luciferas) i kombination med Ubiq-CasRx/+ och gRNAFluc är vad som resulterade i den observerade dödlighetsfenotyperna, förmodligen härrörande från den indirekta aktiviteten hos Cas13 enzymer . Dessutom inga urskiljbara fenotyper eller dramatisk påverkan på arv i F1 transheterozygotes (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ eller Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) observerades jämfört med Ubiq-dCasRx kontroller (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ eller Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (figur 3B), vilket indikerar att ett katalytiskt aktivt enzym är nödvändigt för att erhålla de observerade dödlighetsfenotyperna. Dessutom visade Fluc och Rluc uttryck nivåer i flugor av alla livskraftiga genotyper inte betydande minskning av Fluc uttryck i Ubiq-dCasRx trippel transheterozygotes (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) jämfört med dubbla luciferase reporter kontroller. Detta tyder på att Fluc protein uttryck nivåer inte minskades av dCasRx inriktning (figur 3D). Sammantaget indikerar den vanliga dödlighetsfenotypen i de två olika CasRx-medierade allestädes närvarande RNA-målexperimenten att när den används på vävnader som allestädes närvarande kan CasRx-medierad RNA-inriktning vara giftig för organismen.
Vävnadsspecifik in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett trekomponents CasRx-system
Den höga toxicitetsnivån som observerats i allestädes närvarande RNA-målexperiment fick oss att utforska den vävnadsspecifika RNA-inriktningen med hjälp av en trekomponent CasRx-systemdesign som beskrivs i metodavsnittet. Den observerade toxicitetsnivån minskades när det totala CasRx-uttrycket sänktes med hjälp av UASt-promotorn jämfört med Ubiq-promotorns, detta exemplifieras i tre aspekter: 1) UASt-CasRx- och UASt-dCasRx-linjerna bibehölls som homozygösa linjer, men baserat på tvåstegs korsschemat dubbelbalanserade UASt-CasRx- och UASt-dCasRx-linjer bibehölls som homozygösa linjer, men baserat på tvåstegs korsschemat dubbelbalanserade UASt-CasRx och UASt-dCasRx-linjer bibehölls som homozygösa linjer, men baserat på tvåstegs korsschemat dubbelbalanserade UASt-CasRx och UASt-dCasRx-linjer bibehölls som homozygösa linjer, men baserat på tvåstegs korsschemat dubbelbalanserade UASt-CasRx och UASt-dCasRx-linjer bibehölls som homozygösa linjer, men baserat på tvåstegs korsschemat dubbelbalanserade UASt-CasRx och UASt-dCasRx-linjer bibehölls som homozygösa linjer, men baserat på tvåstegs korsschemat dubbelbalanserade UASt-CasRx och UASt-dCasRx-linjer bibehölls som homozygösa linjer, men baserat på tvåstegs korsschemat dubbelbalanserade UASt-Ca 2) alla F2-generationen dCasRx trippel transheterozygous arv priser matchade den förväntade 25% Mendelian arvsgraden, och 3) F2-generationen CasRx trippel transheterozygous dödlighet fenotyp minskade måttligt. I det vita målexperimentet observerades endast 0,57% livskraftiga vuxna flugor (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4) av de 25% mendelian arvsfrekvenser som förväntades i F2 trippeltransheterozygotes, som alla visade allvarliga ögonspecifika pigmentering och morfologifenotyper (figur 4A och 4B). För det vita målkorset var den CasRx-uttryckande trippel transheterozygous F2 arvsfrekvensen betydligt lägre än för dCasRx-uttryckande trippel transheterozygous kontrollgrupp (27,6%) (figur 4A). I Notch-målexperimentet var CasRx-uttryckande trippel tranheterozygous som bär alla tre transgener 100% dödliga, medan dCasRx kontroll arvsgrad var 29,3% (figur 4A). I det gula målexperimentet visade F2 trippel transheterozygous CasRx-expresserande, gRNAy och y-GAL4 marginell chitinpigmentreduktion som små fläckar av gul nagelband på bröstkorgen och buken med en arvsfrekvens på 2,67%, mycket lägre än för dCasRx kontrollgruppen (25,2%) (Figur4A ). Alla dCasRx kontroll trippel transheterozygous flugor presenterade inte uppenbara fenotyper som CasRx-uttrycka flugor, vilket indikerar att katalytisk aktivitet av CasRx bidrog till de fenotyper observerade. Den låga arvsfrekvensen i CasRx trippel transheterozygous gruppen föreslog att två källor till toxicitet finns i CasRx RNA inriktning: en är associerad med högt uttryck av CasRx, vars toxicitet minskades av restriktiva CasRx uttryck, den andra är associerad med säkerhetsaktiviteten. Sammantaget visade dessa resultat att CasRx-systemet kan uppnå vävnadsspecifik in vivo RNA-inriktning genom att utnyttja det klassiska Gal4/UASt-systemet och under tiden minska toxiciteten. Toxicitet och enstaka dödlighet fenotyper observerades dock fortfarande på en lägre nivå av svårighetsgrad jämfört med de allestädes närvarande tillvägagångssätten, vilket tyder på att säkerhet klyvning verksamhet är associerad med toxicitet.
Figur 1: Allmän översikt över RNA-inriktning med hjälp av ett Cas13D-system. (A) Schematics av det genetiska korset i det allestädes närvarande in vivo RNA-målet med hjälp av ett tvåkomponent CasRx-system. (B) Scheman för ett tvåstegs genetiskt kors i det allestädes närvarande in vivo exogena RNA-målet med hjälp av casrxsystemet med tre komponenter. (C) Scheman för ett tvåstegs genetiskt kors i den vävnadsspecifika in vivo RNA-inriktningen med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Allestädes närvarande in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett casrxsystem med två komponenter (omtryckt5). (A) Totala arvsprocent av transheterozygous flugor som ärver Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) och gRNAs. Blå skuggning i låddiagrammet indikerar fenotyppenetrering. B) Fenotyper av transheterozygous flugor. Pilar indikerar vävnadsnekros i ögat. Svart och vit fluga märkt med ''X'' representerar dödlighet. C) Totala arvsprocent av transheterozygous flugor av dubbelriktade korsningar mellan Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) och gRNAGFP-OpIE2-GFP flyger. M, Mödraarv av CasRx; P, arvet av CasRx. D) F1 larver avkomma i faderskorset. (E) Avskrifternas maximala affisoriuppskattningar för den logaritmiska vikningsändringen. DESeq2-rörledningen användes. (F) Transkriptioner per miljon (TPM) riktade mot CasRx eller dCasRx. (G) CasRx-depentent differentiellt uttryckt transkriptionsprocent av transkriptioner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Allestädes närvarande in vivo exogen RNA-inriktning med hjälp av ett trekomponents CasRx-system. (A) Schematics av det tvåstegs genetiska korset. B) Totala arvsprocentsatser för alla genotyper som dyker upp i F2-generationen . Ärver alla tre transgener (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc och gRNAFLuc) i F2-avkomma resulterade i 100% dödlighet och var betydligt lägre jämfört med Ubiq-dCasRx trippeltransheterozygotes kontrollgrupp (p = 0,001, t-test). (C) Enbart Ubiq-CasRx/gRNAFluc eller Ubiq-CasRx och Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc ensam ledde inte till allvarlig dödlighet, och arvskvoterna mellan Ubiq-CasRx respektive Ubiq-dCasRxheter transozygotes var inte signifikant annorlunda (p = 0, 41 respektive p = 0,51). (D) Luciferasförhållanden normalisera Fluc avläsningar till Rluc avläsningar. Trippel transheterozygous flugor uttrycker Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc var embryonala dödliga, som representerades av en fluga med ett "X", och som ett resultat luciferas uttryck mättes inte. Fluc/Rluc-förhållandet mellan Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb transheterozygotes var betydligt lägre än för de andra Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-expresserande grupperna (p = 1,2e-06 eller lägre, t-test). Resultaten från gruppen gRNAFLuc var betydligt lägre än för alla andra grupper (p = 1, 2e-06 eller lägre, t-test). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Vävnadsspecifik in vivo RNA-inriktning med hjälp av ett casrxsystem med tre komponenter (omtryckt5). (A) Total arvsprocent av trippeltransheterozygous flugor som transporterar tre transgener (UASt-CasRx eller UASt-dCasRx, gRNAs och Gal4-driver. B) Fenotyper av de tredubbla transheterozygous flugorna. Den vita pilen indikerar chitinpigmentreduktion i bröstkorgen. Svart och vit fluga märkt med ''X'' representerar dödlighet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Konstruera | Beskrivning | Abc-bok | Primersekvens (5' till 3') | PCR-mall |
| OA-1050E | CasRx | 1050E. C3 | TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA |
pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx) |
| 1050E. C4 | CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTGG AACA |
|||
| OA-1050R | dCasRx | 1050E. C3 | TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA |
pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx) |
| 1050E. C4 | CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTG GAACA |
|||
| OA-1050L | UASt-promotor | 1041.C9 | GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGCGG GCATGTCGACGC GGCCGCAAACCAA CAACACTAGTAG |
pJFRC81 |
| 1041.C11 | CTGGCCTCCACC TTTCTCTTCTTCTTCT TGGGGCTCATGT TTAAACCCAATT CCCTATTCAGA |
|||
| CasRx | 1050L. C1 | AATACAAGAAGA GAACTCTGAATA GGGAATTGGGT TTAAACATGAGC CCCAAGAAGAA |
pCasRx | |
| 1050E. C4 | CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTA GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA ACA |
|||
| OA-1050S | UASt-promotor | 1041.C9 | GCGGGTTCTC GACGGTCACG GCGGGCATGT CGACGCGGCC GCAACCAACAA CACTAGTAG |
pJFRC81 |
| 1041.C11 | CTGGCCTCCA CCTTTCTCTTC TTCTTGGGGCT CATGTTTAAAC CCAATTCCCTA TTCAGA |
|||
| dCasRx | 1050L. C1 | AATACAAGAAG AGAACTCTGAAT AGGGAATTGGG TTTAAACATGAG CCCCAAGAAGAA |
pdCasRx | |
| 1050E. C4 | CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTAG CTAGCTTAAGCG TAATCTGGAACA |
|||
| OA-1043 | U6:3 promotor | 1043.C1 | GGGAATTGGGA ATTGGGCAATAT TTAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTTTGCTCACCT |
Addgene plasmid #164586 |
| 1043.C23 | ACACTAGTGGAT CTCTAGAGGTAC CGTTGCGGCCG CAAAAAAGTTGT AATAGCCCCTCA AAACTGGACCTT CCACAACTGCAG CCGACGTTAAAT TGAAA |
|||
| OA-1052B | Ubiq promotor | 1052B. C1 | GGGAATTGGGCA ATATTTAAATGGC GGCTGCAGCGC GCAGATCGCCGAT |
Addgene plasmid #112686 |
| 1052B. C2 | TTTCTTTATGTTTT TTGGCGTCTTCC ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA GAGATG |
|||
| T2A-eGFP | 908A1 | ATAAAGGCCAAG AAGGGCGGAAAA GATCGCCGTGG AGGGCAGAGGA AGTCTTCTAACAT GC |
Addgene plasmid #112686 | |
| 908A2 | TTGTTATTTTAAAAA ACGATTCATTCTA GGCGATCGCTTA CTTGTACAGCTC GTCCATGCC |
|||
| Omvänd Ubiq-promotor | 908A3 | ACCGTGACCTAC ATCGTCGACACTA GTGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC CGATG |
Addgene plasmid #112686 | |
| 908A4 | GGATCATAAACTT TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG GGTCAAAATAGAG ATGT |
Tabell 1: Förteckning över molekylär konstruktion och primers som används i denna studie. Den här listan innehåller alla konstruktioner (både ID och beskrivning) och varje konstruktions associerade primers (både ID och sekvenser (5' till 3')) och mallar som används.
Discussion
Med tre olika applikationsdesigner av CasRx-systemet visade detta arbete i vivoprogrammable RNA-inriktning i flugor. De olika strategierna tillgodoser olika projektbehov, såsom endogen kontra exogen geninriktning och allestädes närvarande kontra vävnadsspecifik RNA-inriktning. Effekterna av RNA inriktning ingår mål gen specifika fenotypiska förändringar, mål RNA transkript minskning och tillfällig dödlighet fenotyper i samband med högt uttryck av CasRx protein och säkerheter verksamhet. Sammantaget visade dessa resultat att CasRx-systemet kan rikta RNA-transkriptreduktion på organismnivå på ett programmerbart och effektivt sätt.
En av de viktigaste faktorerna för framgångsrik anpassning av CasRx-systemet är utformningen av gRNAs. Specifikt ska följande råd beaktas: målsekvensen är cirka 30 nukleotider i längd, längden på poly-U-sträckor i målsekvensen är 4 baspar eller mindre, målsekvensen GC-halten ligger i intervallet 30% - 70%, målsekvensen förutspås inte bilda starka RNA-hårnålsstrukturer och målsekvensen innehåller minimal förutsedd RNA sekundär eller tertiär struktur5.
Förutom gRNA-designerna är flyggenetiksteget i varje protokoll också avgörande för en framgångsrik implementering. Förekomsten eller bristen på de definierade fenotyper som överförs från föräldrarna i avkomman är viktiga för att identifiera och kvantifiera fenotyper som induceras av CasRx-systemet i transheterozygous avkomman. Att ställa in kontrollkors med dCasRx flugor parallellt är också till hjälp i de uteslutande icke-specifika fenotyperna i transheterozygous avkomman.
Det är värt att notera att dessa resultat avslöjade toxicitetsproblem som infördes genom att allestädes närvarande uttrycka CasRx och dCasRx-protein i flugan, en begränsning av CasRx-systemet. Allestädes närvarande uttryck av CasRx eller dCasRx enbart under Ubiq promotor, utan gRNAs, kom med icke-triviala fitness kostnader, eftersom varken Ubiq-CasRx eller Ubiq-dCasRx flugor kunde fastställas som homozygous linjer. Tvärtom kan UASt-CasRx- och UASt-dCasRx-flugor fastställas som friska homozygösa bestånd, men på grund av utformningen av korssystemet hölls de som dubbelbalanserade bestånd, ett faktum som stöder förekomsten av toxicitet som framkallas av allestädes närvarande CasRx proteinuttryck. Ett annat stödjande bevis är att i kontrollexperiment med dCasRx, som är katalytiskt inaktivt, var andelen flugor som transporterar både dCasRx och gRNA-konstruktioner av det totala antalet flugor i F1-generationen genomgående lägre än 50%, det förväntade förhållandet baserat på mendeliangenetik om ingen dCasRx-associerad toxicitet var närvarande. Detta indikerade att allestädes närvarande uttrycker dCasRx, tillsammans med gRNAs, inducerar toxicitet i flugan, vilket resulterar mindre än förväntat arv förhållande. Arvskvoterna av transheterozygous UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 flugor följde Mendelian genetik, som återigen föreslår toxicitet framkallas specifikt av allestädes närvarande uttryck av CasRx och dCasRx proteiner. Toxicitet i CRISPR/Cas-systemet är inte nytt. Stora mängder Cas9-protein har visat sig vara giftigt i flera organismer, inklusive flugor29,30,31,32. En ny studie har utvecklat ett anpassat GAL4/UAS-system som kan justera mängden Cas9-protein uttryckt i flugor genom att lägga till en öppen avläsningsram av varierande längd mellan UAS-sekvensen och Cas9-sekvensen i UAS-Cas9-konstruktionen33. Därför är det värt att utforska sätt att minska CasRx-inducerad toxicitet genom att justera CasRx proteinuttrycksnivå.
Förutom toxiciteten som framkallas av allestädes närvarande uttryck av CasRx- och dCasRx-proteiner, visade resultaten också dödlighet kopplad till CasRx-systemets icke-specifika effekter utanför målet, en egenskap hos många CRISPR-system1,2,7,34. I några av CasRx och icke-essentiella gen gRNA-uttrycka dubbla eller trippel transheterozygous flugor, till exempel när man riktar in sig på Notch, har de transheterozygous CasRx flugorna betydligt lägre överlevnadsnivåer jämfört med de transheterozgyous dCasRx flugor. I RNA-seq analysen av dessa CasRx och gRNA-uttrycka transheterozygous flugor, både minskningen av mål gen transkription nivåer och minskningen av icke-mål gen transkriptioner observerades. Dessa sidoeffekter var CasRx-beroende och målberoende, eftersom de endast observerades i transheterozygous flugor som uttrycker både CasRx proteinet och gRNA. Det är värt att påpeka att en av målgenerna, vit, visade endast en begränsad, icke-statistiskt signifikant minskning av transkriptioner när den vita genen riktades mot CasRx, vilket stod i kontrast till den tydliga pigmentreduktionsfenotypen. det är hypotesen att detta kan bero på det faktum att 1) tidpunkten för RNA-seq provsamling inte var väl i linje med tidpunkten när den vita genen når sitt topputtryck under tidig utveckling, och 2) det lokaliserade uttrycket av den vita genen i ögonen gör det utmanande att samla relevanta vävnader under tidig utveckling fas när endast hela kroppen prov samling är genomförbar. För att minska den indirekta aktiviteten i CasRx-systemet krävs framtida studier för att fullt ut förstå de mekanismer som ligger till grund för fenomenet utanför målet på organismnivå.
Intressant nog verkade en ny studie35 som beskriver RNA-inriktning Cas13 verktyg i flugor att lindra den allmänna toxiciteten i samband med CasRx uttryck, av flera möjliga skäl. För det första omkodade författarna Cas13-transgenerna för att optimera uttrycket i Drosophila och använde en mer svagt uttryckande promotor (aktin 5C) jämfört med den ubiquitinpromotor som används i den nuvarande studien, vilket sannolikt leder till lägre nivåer av Cas13-uttryck och därmed mindre toxicitet. Detta stöds i själva verket av observationerna att UASt-drivna CasRx- och dCasRx-uttryck inte i sig var giftigt, eftersom denna studie (och författarna i 35) inte observerade någon uppenbar dödlighet hos UASt-CasRx-flugor. Dessutom kodade dessa författare sina gRNAs annorlunda jämfört med denna studie, vilket kan ha påverkat deras uttryck och minskat systemets toxicitet i transheterozygous Cas13/gRNA flugor. Till exempel uttrycktes i sin studie två gRNAs med hjälp av U6:3 promotorn och flankerades av tRNAs för att möjliggöra gRNA-bearbetning vid tRNA-mognad utan att kräva CasRx35. Omvänt, i denna studie, gRNAs kodades som matriser som riktar sig upp till 4 platser per gen och härma den endogena Cas13 matrisstrukturen som finns i bakterier, vilket kräver Cas13 enzymet att bearbeta varje gRNA. Dessa olika tillvägagångssätt kan ha lett till skillnader i gRNA-uttrycksnivåer och andra faktorer som kan ha inneboende effekter på toxiciteten i hela systemet. Slutligen riktade Huynh m.fl. in sig på andra gener än de som var riktade i den aktuella studien, vilket resulterar i skillnader i target-Cas/gRNA-interaktion och sidoaktivitet och kan ha effekter på de observerade nivåerna av dödlighet. Dessa skillnader i observerad toxicitet motiverar ytterligare undersökningar för att identifiera sätt att förbättra de övergripande systemen.
Sammantaget är denna studie den första demonstrationen av ett funktionellt genetiskt kodat programmerbart RNA-riktat Cas-system i D. melanogaster, om än ytterligare optimering av CasRx-systemet (i linje med vad som rapporteras35) kommer att krävas för att ytterligare minska den off-target-associerade dödligheten och öka effekten av CasRx på-mål klyvning. RNA-inriktning med Cas-enzymer är ett snabbt föränderligt fält med många potentiella tillämpningar som sträcker sig från insektsvektorkontroll till terapeutiska användningar1,2,3,4,5,6,7, och detta protokoll erbjuder ett startpaket för alla som är intresserade av att designa sitt första CasRx-system i flugor, samtidigt som det är kompatibelt med anpassning och ytterligare optimering av systemet. Exemplen som presenteras här visar en rad resultat som man kan stöta på under genomförandet av detta system in vivo och kan fungera som riktmärken för andra användare vid utvärdering av CasRx-systemets prestanda i sina applikationer.
Disclosures
O.S.A är grundare av Agragene, Inc., har ett aktieintresse och sitter i bolagets scientific advisory board. Villkoren för detta arrangemang har granskats och godkänts av University of California, San Diego i enlighet med dess policyer för intressekonflikter. Alla andra författare förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av finansiering från ett DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047) och NIH-utmärkelser (R21RAI149161A, DP2AI152071) som tilldelats O.S.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Grape Juice | Welch Foods Inc. | N/A | |
| Active Dry Yeast (908g) | Red Star Yeast Company, LLC | N/A | |
| DMC4500 color camera | Leica Microsystems | DMC4500 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| GAL4-GMR flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 29967 | |
| GAL4-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 44373 | |
| Glomax 20/20 Luminometer | Promega | E5331 | |
| Illumina HiSeq2500 Sequencer | Illumina, Inc. | HiSeq2500 | |
| M165FC fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | M165FC | |
| Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer | ThermoFisher | NDONEC-W | |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit | New England Biolabs, Inc. | E7770 | |
| plasmid # 112686 | Addgene | 112686 | |
| plasmid # 112688 | Addgene | 112688 | |
| plasmid # 132416 | Addgene | 132416 | |
| plasmid # 132417 | Addgene | 132417 | |
| plasmid # 132419 | Addgene | 132419 | |
| plasmid # 132420 | Addgene | 132420 | |
| plasmid # 132421 | Addgene | 132421 | |
| plasmid # 132422 | Addgene | 132422 | |
| plasmid # 132425 | Addgene | 132425 | |
| plasmid # 132426 | Addgene | 132426 | |
| plasmid # 133304 | Addgene | 133304 | |
| plasmid # 164586 | Addgene | 164586 | |
| plasmid #132418 | Addgene | 132418 | |
| plasmid pJFRC81 | Addgene | 36432 | |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Restriction endonucleases AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | |
| Restriction endonucleases NotI | New England Biolabs Inc. | R0189L | |
| Restriction endonucleases PacI | New England Biolabs Inc. | R0547L | |
| Restriction endonucleases PstI | New England Biolabs Inc. | R0140L | |
| Restriction endonucleases SwaI | New England Biolabs Inc. | R0604L | |
| Restriction endonucleases XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145L | |
| RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Turbo DNase | Invitrogen | AM2238 | |
| U6-3:4-gRNA-Fluc flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84125 | |
| U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84986 | |
| U6-3:4-gRNA-N flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84122 | |
| U6-3:4-gRNA-w flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84124 | |
| U6-3:4-gRNA-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84123 | |
| UASt-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84121 | |
| UASt-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84120 | |
| Ubiq-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84118 | |
| Ubiq-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84119 | |
| Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84127 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kits | Zymo Research Corporation | D4007 |
References
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Communications. 9, 1911 (2018).
- Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), 5573 (2016).
- East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes. Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).
- Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 173 (3), 665-676 (2018).
- Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies. The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Abudayyeh, O., et al.
- Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. In vivo RNAi: today and tomorrow. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
- Ni, J., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
- Ni, J., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature Methods. 8, 405-407 (2011).
- Ni, J., et al. Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5, 49-51 (2008).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).
- Kulkarni, M., et al. Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays. Nature Methods. 3, 833-838 (2006).
- Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens. Nature. 443, 359-363 (2006).
- Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila. Fly. 1 (1), 1-5 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).
- Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations. Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).
- Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).
- Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).
- Franz, A., et al. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).
- Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti. Communications Biology. 1, 11 (2018).
- Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/ (2020).
- Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr/ (2020).
- Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL (2020).
- Dobin, A., et al.
- Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).
- Poe, A., et al. Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila. Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).
- Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).
- Yang, S., Li, S., Li, X. Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).
- Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. eLife. 9, 53865 (2020).
- Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).
- Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila. Genome Biology. 21, 279 (2020).
