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方法文章

化学诱导二聚化介导的端粒蛋白凝聚体

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DOI：

10.3791/62173

⸱

2021年4月12日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

本方案介绍了一种通过化学诱导的蛋白质二聚化系统，在染色质上形成凝聚体的方法。  该方法利用化学二聚剂在端粒上诱导早幼粒细胞白血病（PML）核体的形成。通过活细胞成像、免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）技术，对液滴的生长、溶解、定位及组成进行监测。

摘要

染色质相关缩合物参与多种细胞核过程，但其潜在机制尚不明确。本实验方案描述了一种化学诱导的蛋白质二聚化系统，用于在端粒上形成缩合物。该化学二聚剂由两个相连的配体组成，每个配体可分别结合一种蛋白质：Halo配体结合Halo酶，三甲氧苄二氢叶酸还原酶（trimethoprim, TMP）结合大肠杆菌二氢叶酸还原酶（E. coli dihydrofolate reductase, eDHFR）。将Halo酶与端粒蛋白融合，可通过共价的Halo配体-酶结合将二聚剂锚定在端粒上。TMP与eDHFR的结合可招募与eDHFR融合的相分离蛋白至端粒，从而诱导缩合物的形成。由于TMP与eDHFR的相互作用为非共价结合，因此可通过加入过量游离TMP竞争eDHFR的结合位点，从而逆转缩合过程。本文展示了在端粒上诱导早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukemia, PML）核体形成，并测定缩合物的生长、溶解、定位及组成的示例。通过将Halo酶融合至直接结合局部染色质的蛋白，或融合至由向导RNA靶向特定基因组位点的dCas9蛋白，该方法可轻松适用于在其他基因组位点诱导缩合物的形成。该方法兼具单细胞活体成像所需的时间分辨率，同时可在细胞群体中维持相分离状态以进行生物化学分析，因此适用于研究染色质相关缩合物的形成及其功能。

引言

许多蛋白质和核酸经历液-液相分离（LLPS），并自组装形成生物分子凝聚体，以在细胞内组织生物化学反应1,2染色质结合蛋白的液-液相分离导致与特定基因组位点相关联的凝聚体形成，并参与多种局部染色质功能3例如，HP1蛋白的液-液相分离（LLPS）是异染色质结构域形成的基础，有助于基因组的组织4,5转录因子的液-液相分离形成转录中心以调控转录6,  新生mRNA与多性梳蛋白的液-液相分离形成组蛋白基因座小体以调控组蛋白mRNA的转录和加工7.  然而，尽管已发现大量与染色质相关的凝聚体实例，其形成、调控及功能的潜在机制仍远未明确。特别是，并非所有与染色质相关的凝聚体都通过液-液相分离（LLPS）形成，仍需在活细胞中对凝聚体的形成进行严谨评估。8,9例如，  小鼠中的HP1蛋白在活细胞中仅表现出较弱的液滴形成能力 异染色质焦点表现为坍缩的聚合物球状体10因此，开发可在活细胞染色质上诱导从头形成凝聚体的工具具有重要意义，尤其是那些能够结合活细胞成像与生化分析，用于监测凝聚体形成动力学、所形成凝聚体的理化性质以及凝聚体形成所致细胞效应的工具。

本方案报告了一种通过化学二聚化系统在染色质上诱导蛋白质凝聚体的方法11 (图1A）。该二聚化分子由两个相连的蛋白结合配体组成：甲氧苄啶（TMP）和Halo配体，可使与相应受体融合的蛋白发生二聚化： 大肠杆菌 二氢叶酸还原酶（eDHFR）和一种细菌烷基脱卤酶酶（Halo酶）12Halo配体与Halo酶之间的相互作用是共价的，从而能够  Halo酶通过与染色质结合蛋白融合，作为锚定装置，用于将与eDHFR融合的相分离蛋白招募至染色质。在初始招募后，相分离蛋白的局部浓度升高，超过相分离所需的临界浓度，从而在锚定位点成核并形成凝聚体（图1B通过将荧光蛋白（如 mCherry 和 eGFP）分别与 eDHFR 和 Halo 融合，可利用荧光显微镜实时观察凝聚体的成核与生长过程。由于 eDHFR 与 TMP 之间的相互作用为非共价结合，可通过加入过量游离 TMP 与二聚化分子竞争 eDHFR 的结合位点，从而将相分离蛋白从锚定位点释放，导致染色质相关凝聚体解聚。

我们利用该工具在端粒酶阴性的癌细胞中诱导端粒上新生早幼粒细胞白血病（PML）核体的形成，这些细胞通过端粒替代性延长机制维持端粒长度 端粒维持的替代性延长（ALT）途径13,14.  PML核小体是无膜结构的细胞核区室，参与多种细胞核过程15,16 并在ALT端粒上特异性定位，形成与ALT端粒相关的PML小体（APBs）17,18. 端粒在APBs内聚集，推测可为替代性长度延长（ALT）途径中同源定向的端粒DNA合成提供修复模板19确实，在APB中已检测到端粒DNA的合成，且APB在富集DNA修复因子至端粒的过程中发挥着关键作用20,21然而，APB组装以及APB内端粒聚集的机制尚不清楚。由于ALT细胞中的端粒蛋白被小泛素样修饰物（SUMO）特异性修饰22许多APB组分含有SUMO化位点 22,23,24,25 和/或 SUMO 相互作用基序（SIMs）26,27 以及SUMO-SIM相互作用驱动相分离28我们假设端粒上的SUMO化修饰会导致含SUMO/SIM的蛋白质在端粒富集，这些蛋白质之间的SUMO-SIM相互作用进而引发相分离。  PML蛋白具有三个SUMO化位点和一个SIM结构域，可被招募至发生SUMO化的端粒，形成APB，而液态APB的融合会导致端粒聚集。为验证这一假设，我们采用化学诱导二聚系统，通过将SIM招募至端粒来模拟由SUMO化诱导的APB形成过程图2A)11GFP 与 Halo酶 融合用于可视化，并与端粒结合蛋白 TRF1 融合以将二聚化分子锚定至端粒。SIM 与 eDHFR 和 mCherry 融合。通过活细胞成像追踪凝聚体形成的动力学及液滴融合诱导的端粒聚集。  通过添加过量游离的TMP以竞争eDHFR结合，可逆转相分离。采用免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）检测凝聚体的组成及其与端粒的关联。招募SIM可使SUMO在端粒上富集，且所诱导形成的凝聚体含有PML，因此为APBs。而招募无法与SUMO相互作用的SIM突变体，则不能在端粒上富集SUMO，也不能诱导相分离，表明APB凝聚的基本驱动力是SUMO-SIM相互作用。与此观察一致，将polySUMO-polySIM聚合物与TRF2结合因子RAP1融合，同样可诱导APB的形成。29与聚SUMO-聚SIM融合系统（只要表达足够量的蛋白即可发生相分离）相比，本文介绍的化学诱导二聚化方法能够按需诱导相分离，从而提供更优的时间分辨率，以监测相分离及端粒聚集过程的动力学。此外，该化学二聚化系统允许招募其他蛋白质，以评估其诱导相分离和端粒聚集的能力。例如，一种无序蛋白被招募至端粒后，虽不诱导APB形成，但仍可形成液滴并促使端粒聚集，表明端粒聚集独立于APB的化学组成，仅依赖于APB的液态特性11. 

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方案

1. 瞬时细胞系的制备

  1. 将U2OS受体细胞培养于6孔板中经多聚-D-赖氨酸包被的22 × 22 mm玻璃盖玻片（用于活细胞成像）或12 mm直径圆形盖玻片（用于免疫荧光或FISH）上，使用生长培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM），待细胞融合度达到60–70%。
  2. 转染前，将生长培养基更换为1 mL转染培养基（不含青霉素-链霉素溶液的生长培养基）。
  3. 每孔转染体系中，向150 μL低血清培养基中加入4 μL转染试剂，涡旋10秒，室温孵育5分钟。
  4. 每孔中，将Halo载体质粒（Halo-GFP-TRF1或Halo-TRF1）与eDHFR载体质粒（mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDHFR-SIM突变体）以1:1质量比（0.5 μg Halo载体质粒与0.5 μg eDHFR载体质粒）逐滴加入150 μL低血清培养基中，用移液器轻轻混匀。
    注意：标签分子量相对较小（Halo 33 kD，eDHFR 28 kD，mCherry 30 kD，eGFP 27 kD），未观察到对相分离有影响。然而，建议使用突变体（如本实验中使用的SIM突变体），以确保相变行为对突变敏感，而非受标签影响。SIM来源于PIASx28,30。SIM序列为AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT。SIM突变体通过将SIM氨基酸VIDL突变为VADA28获得，其序列为AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT。我们已将质粒提交至addgene：#164644 3XHalo-GFP-TRF1；#164646 mCherry-eDHFR-SIM；#164649 mCherry-eDHFR-SIM突变体。
  5. 将150 μL转染试剂-低血清培养基混合液逐滴加入含DNA的150 μL低血清培养基中，用移液器轻轻混匀，室温孵育5分钟。
  6. 将300 μL转染试剂-DNA混合液逐滴加入细胞中，然后将细胞放回培养箱继续培养。
  7. 转染后24–48小时，进行活细胞成像、免疫荧光（IF）或荧光原位杂交（FISH）。

2. 端粒上的二聚化

  1. 将二聚化分子溶解于二甲基亚砜中，配制成10 mM溶液，并分装于塑料微量离心管中，于−80 °C长期保存。
    注意：此处使用的是在三甲氧苄啶（TMP）与Halo配体之间含有光敏连接子6-硝基愈创木基氧羰基（NVOC）的二聚化分子TMP-NVOC-Halo（TNH），而非直接将TMP与Halo连接的二聚化分子（TMP-Halo，TH）31。这是因为TNH进入细胞所需时间较短（约5分钟），而TH则需约20分钟。使用TH同样可以获得本文所示结果。使用TNH时，应避免其暴露于光线下，以防NVOC发生光解。操作TNH时应在暗室中使用微弱红光灯照明，将二聚化分子储存于琥珀色塑料管中，并用铝箔包裹含有TNH的容器或处理过的细胞。使用微分干涉差（DIC）显微镜观察TNH是安全的。
  2. 从−80 °C取出10 mM的二聚化分子 aliquot，用成像培养基稀释至10 μM的储存浓度，并于−20 °C保存。
  3. 使用前，将10 μM的二聚化分子储存液用生长培养基（用于固定后成像）或成像培养基稀释至终工作浓度100 nM。对于活细胞成像，直接在显微镜载物台上以100 nM终浓度处理细胞；若用于免疫荧光（IF）或荧光原位杂交（FISH），则需在培养箱中孵育4–5小时。
    注意：所用二聚化分子的浓度会影响二聚化效率，从而影响相分离过程。实现最大二聚化效率所需的二聚化分子浓度取决于细胞类型及锚定蛋白的表达水平，因此需根据不同实验条件进行优化。一种简单方法是：将表达锚定蛋白和mCherry-eDHFR（未融合相分离蛋白，或融合非相分离突变体）的细胞与不同浓度的二聚化分子共孵育，测定锚定位点处mCherry荧光强度达到最高时对应的二聚化分子浓度。更系统的方法是：将仅表达锚定蛋白的细胞与不同浓度的二聚化分子孵育，随后加入Halo结合染料，通过检测Halo染料荧光强度开始趋于平台期的浓度，判断此时所有Halo融合的锚定蛋白已被二聚化分子占据，无剩余结合位点可供染料结合32。
  4. 为逆转二聚化过程，先将细胞与二聚化分子孵育2–5小时（可伴随活细胞成像，也可不进行），或直至达到预期的液滴大小，然后向培养基中加入终浓度为100 μM的游离TMP（用成像培养基稀释后添加）。

3. 免疫荧光（IF）

  1. 在6孔板中，将105个细胞接种于经多聚-D-赖氨酸包被的直径为12 mm的圆形盖玻片上。随后转染两种质粒（Halo-GFP-TRF1 与 mCherry-eDHFR-SIM 或 mCherry-eDHFR-SIM 突变体），转染后等待24–48小时，再进行免疫荧光实验。
    注意：转染后等待超过一天可获得更高的表达水平。  
  2. 用生长培养基稀释二聚化分子，使其终浓度为100 nM，将稀释后的二聚化分子加入细胞中，并在37 °C孵育4–5小时。
    注意：加入二聚化分子后可迅速诱导相分离（< 30分钟）。延长孵育时间有助于液滴粗化并增大尺寸。可通过活细胞成像追踪液滴生长过程，以确定液滴达到目标状态所需的时间。
  3. 在室温下，用含4%甲醛和0.1% Triton X-100的PBS溶液固定细胞10分钟，以实现细胞通透。用PBS洗涤细胞3次。
    注意：此步骤后可暂停实验，细胞可在4 °C保存长达一周。
    警告：甲醛吸入或吞咽有害，对眼睛、呼吸系统和皮肤具有刺激性，可能具有致癌风险。操作时需佩戴个人防护装备，仅在通风橱中使用。使用后应放入废液容器，不得倒入水槽。
  4. 用50 μL TBS-Tx洗涤盖玻片两次，再用50 μL抗体稀释缓冲液（AbDil）洗涤一次。TBS-Tx由TBS、0.1% Triton X-100和0.05%叠氮化钠配制而成。AbDil由TBS-Tx、2% BSA和0.05%叠氮化钠配制而成。
  5. 在湿润盒中，每张盖玻片加入50 μL一抗溶液（抗PML抗体，AbDil中1:50稀释；抗SUMO1抗体，AbDil中1:200稀释；抗SUMO2/3抗体，AbDil中1:200稀释），于4 °C孵育过夜。也可使用抗mCherry抗体（AbDil中1:200稀释）以辅助FISH实验中mCherry信号的检测。
    注意：FISH会淬灭mCherry的荧光信号，导致在FISH实验中难以区分转染与未转染mCherry质粒的细胞。建议使用抗mCherry抗体。或者，可构建稳定表达含eDHFR蛋白的细胞系。
  6. 用AbDil洗涤盖玻片3次，以去除未结合的一抗。
  7. 在避光条件下，室温下用二抗溶液孵育细胞1小时[针对PML和SUMO使用Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG (H+L)二抗，针对mCherry使用Alexa Fluor 555标记的抗兔IgG (H+L)二抗，均以AbDil中1:1000稀释]。
  8. 用TBS-Tx洗涤盖玻片3次。
  9. 标记载玻片，将DAPI稀释于封片介质中，使DAPI终浓度为1 μg/mL。取2 μL稀释后的DAPI滴加至载玻片上。将盖玻片翻转，使其细胞面朝下覆盖在DAPI液滴上，用吸水纸吸去盖玻片边缘多余液体。
  10. 用指甲油封片，待其干燥后，从盖玻片顶部用水轻轻冲洗。保存于冷冻保存盒中，以备成像使用。

4. 荧光原位杂交（FISH）

  1. 在6孔板中，将105个细胞接种于经多聚-D-赖氨酸包被的直径为12 mm的圆形盖玻片上。转染 细胞，导入Halo-TRF1和mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDHFR-SIM突变体质粒，转染后24–48小时进行FISH实验。二聚化步骤同3.2节所述。
    注：此处TRF1未与GFP融合，因此绿色荧光通道可用于端粒DNA探针。
  2. 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，用PBS洗涤4次。如需进行免疫荧光-荧光原位杂交（IF-FISH），从此处开始进行免疫荧光（IF）实验；在完成IF步骤中二次抗体的洗涤（3.8节）后，再次用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，并用PBS洗涤3次。
  3. 将盖玻片依次在70%、80%、90%乙醇中脱水，每种浓度各2分钟。
  4. 在杂交液（含70%去离子甲酰胺、10 mM Tris（pH 7.4）、0.5%封闭试剂）中加入488标记的telC PNA探针（稀释比例1:2000），取5 μL加至盖玻片，于75 °C孵育5分钟，随后在湿盒中室温过夜孵育。
  5. 用洗涤缓冲液（70%甲酰胺、10 mM Tris）在室温下洗涤盖玻片3次，每次2分钟，然后用含1 μg/mL DAPI的封片剂封片，用于成像。
    注：本FISH实验方案引自已发表文献33’34。

5. 活细胞成像

  1. 当细胞准备就绪进行成像时，将盖玻片置于磁性腔室中，并在带加热台的环境腔室内用1 mL不含酚红的成像培养基维持细胞。
  2. 设置显微镜和环境控制装置。图像使用转盘共聚焦显微镜采集，配备100倍、1.4 NA物镜、压电Z驱动器、电子倍增电荷耦合器件 (EMCCD)相机，以及由成像软件控制的、带有455、488、561、594和647 nm激光器的激光合束模块。所有激光器在光纤末端测得的输出功率均为20 mW。
  3. 寻找端粒上具有明亮GFP信号、核质中mCherry信号呈弥散分布的细胞。找到约20个细胞，记录每个细胞的x、y、z位置信息，并设置延时成像参数：Z轴范围共8 μm，步距0.5 μm，时间间隔5分钟，持续2–4小时，同时采集GFP和mCherry通道图像。使用594 nm激光功率的30%和488 nm激光功率的50%，曝光时间为200 ms，相机增益为300。
    注意：激光器单元的输出功率为20 mW。明亮的GFP焦点表明锚定结构较大，更易于成核形成凝聚体。应选择mCherry信号强度范围较广的细胞，因为相分离依赖于细胞内SIM的浓度。mCherry信号过弱或过强的细胞可能无法发生相分离。为避免光漂白，请勿使用过高的激光功率或过长的曝光时间。
  4. 开始成像，采集一轮图像作为二聚化前的基准。暂停成像，向载物台上的成像腔室中加入0.5 mL含有15 μL 10 μM二聚化分子的成像培养基，使二聚化分子的终浓度为100 nM。恢复成像。
  5. 当需要逆转二聚化时，暂停成像，向载物台上的成像腔室中加入0.5 mL含有2 μL 100 mM储备液TMP的成像培养基，使TMP终浓度达到100 μM。继续对细胞成像1–2小时。

6. 固定成像

  1. 显微镜设置与活细胞成像相同，无需载物台加热。使用 488 nm 激光进行端粒 FISH 成像，561 nm 激光用于 mCherry 免疫荧光，647 nm 激光用于 PML 或 SUMO 免疫荧光。
    注意：若未使用 mCherry 抗体，则可直接成像 mCherry 蛋白，但由于 FISH 过程中的淬灭作用，信号可能较弱。  仍应使用 561 nm 激光而非 594 nm 激光成像 mCherry，以避免 Cy5 信号渗漏至 mCherry 通道。
  2. 寻找约 30–50 个具有红色信号（mCherry 或 mCherry 免疫荧光）的细胞，以筛选转染成功的细胞。
  3. 采用 0.3 µm 的 Z 轴步进间距，共采集 8 µm 厚度的 Z 栈图像以获取更多信号。激光功率设置为 647 nm 的 80%、561 nm 的 80% 和 488 nm 的 70%，曝光时间为 600 ms，相机增益为 300。

7. 处理延时图像

  1. 定义端粒的二值化图像
    选择一个包含所有时间点和z-stack信息的细胞，仅选择GFP通道，并通过设定阈值创建二值化图层。调整阈值的下限和上限，使用“平滑”、“去噪”和“填充孔洞”等功能，观察该阈值在所有时间点上对目标对象的识别效果。
  2. 减去背景信号
    选择所有通道，在细胞外的背景区域绘制矩形兴趣区域（ROI）。将此ROI定义为背景，然后减去背景强度。
  3. 将端粒二值化图像与端粒荧光强度关联
    选择端粒二值化图像，并将其与GFP通道关联，以计算二值化对象内的GFP平均强度，作为端粒强度。
  4. 随时间计算端粒数量和强度
    指定需导出的信息，例如时间、对象ID、平均强度、总强度，并导出数据。使用绘图软件读取导出的表格，生成端粒数量和端粒强度随时间变化的图表（先对每个端粒体积内的强度进行汇总，再对单个细胞内所有端粒的强度取平均）。

8. 处理固定细胞图像

  1. 定义APBs的二值图像
    通过观察561 nm通道中的信号，选择转染的细胞进行分析。按照7.1节中的步骤，分别在GFP通道（端粒DNA FISH）和Cy5通道（PML或SUMO免疫荧光）中设定阈值，生成端粒和PML小体或SUMO的二值图像。将GFP和Cy5的二值图层合并，并创建一个新图层，包含同时具有GFP和Cy5信号的颗粒，以表示PML小体在端粒上的共定位，即APBs。
  2. 计算APB/SUMO的数量和强度
    按照7.2节进行图像背景扣除。按照7.3节将APB/SUMO二值图层与Cy5通道关联。计算APB/SUMO的数量和强度。按照7.4节导出并绘制数据。

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结果

通过端粒DNA FISH与SUMO蛋白免疫荧光染色鉴定的SUMO在端粒定位的代表性图像如图2所示。与SIM突变体招募细胞相比，SIM招募细胞在端粒上富集了更多的SUMO1和SUMO2/3。这表明，由SIM二聚化诱导的端粒上SUMO富集依赖于SUMO-SIM相互作用。

TRF1 与 SIM 二聚化后的一个代表性延时录像如视频 1所示。图 3A展示了四个时间点的图像快照。SIM 成功被招募至端粒，且 SIM 与 TRF1 的焦点均变得更大更亮，符合液滴形成与生长的预期特征（图 1B）。此外，观察到 TRF1 焦点发生融合（图 3B），导致端粒聚集，表现为端粒数量减少（图 3E）以及随时间推移端粒信号强度增加（图 3D...

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讨论

本方案展示了利用化学二聚化系统在端粒上形成和解聚凝聚物的过程。通过活细胞成像监测相分离动力学以及液滴融合诱导的端粒聚集现象。采用DNA FISH和蛋白质免疫荧光（IF）确定凝聚物的定位及其组分。 

本实验方案中有两个关键步骤。第一步是确定相分离蛋白和二聚化诱导剂（dimerizer）的浓度。在基因组位点诱导局部相分离的成功与否，取决于相分离蛋白在局部的浓度是否超过其发生相分离的临界浓度（图1B）。相分离蛋白的全局浓度必须足够高，以确保有足够数量的蛋白可被富集到局部区域；但又不能过高，以免引发全细胞范围内的相分离或使其易于被诱导发生全局相分离。  锚定DNA的长度（即锚定蛋白所结合的修饰染色质区域的大小）以及Halo融合锚定蛋白的浓度，共同决定了在最大二聚化效率下成核中心的大小。锚定区域越大，越有利于相分离凝聚体的成核。二聚化效率受二聚化诱导剂与锚定蛋白相对量的影响：二聚化诱导剂过少时，无法占据所有可用的锚定蛋白；而过多时，则会导致eDHFR与过量的游离二聚化诱导剂发生非功能性结合，而非与锚定蛋白上的二聚...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（H.Z. 获资助号 1K22CA23763201，D.M.C. 获资助号 GM118510）和H.Z. 获查尔斯·E·考夫曼基金会资助。作者感谢 Jason Tones 对手稿的校对。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTACorningMT25053CI
16%（w/v）甲醛，无甲醇Thermo Scientific28906用1×PBS配制1%溶液
6孔培养板VWR10861-554
铝箔Fisher Scientific01-213-101
抗mCherry抗体AbcamAb183628
抗PML抗体Santa Cruzsc966
抗SUMO1抗体AbcamAb32058
抗SUMO2/3抗体CytoskeletonAsm23
封闭剂Roche11096176001
牛血清白蛋白（BSA）Fisher ScientificBP9706100
BTX Tube micro 1.5ML VWR89511-258
圆形盖玻片Thermo Scientific3350
共聚焦显微镜 NikonMQS31000
DAPIFisher ScientificD1306
二甲基亚砜 Sigma-Aldrich472301
含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基CorningMT10017CV
EMCCD相机iXon Life 897
乙醇Fisher Scientific4355221
胎牛血清，经认证，符合美国农业部批准地区标准GibcoA4766801
去离子甲酰胺MilliporeSigma46-101-00ML
山羊抗小鼠IgG（H+L）重组二抗，Alexa Fluor 647标记InvitrogenA28181
山羊抗兔IgG（H+L）重组二抗，Alexa Fluor 647标记InvitrogenA32733
高精度直锥超细尖镊子/持针器Fisher Scientific12-000-122
激光合并模块 NikonNIIMHF47180
Leibovitz L-15培养基Gibco21083027
Lipofectamine 2000转染试剂Invitrogen11668027
图形绘制软件，MATLABThe MathWorks
显微镜载玻片盒Fisher Scientific34487
指甲油Fisher Scientific50-949-071
成像软件，NIS-Elements Nikon
Opti-MEM减血清培养基Gibco51985091
Parafilm封口膜Bemis13-374-12
PBS 10×，pH 7.4Fisher Scientific70-011-044
青霉素-链霉素溶液，100×Gibco15140122
Piezo Z-驱动器 Physik Instrumente (PI)91985
移液器吸头VWR10017
带磨砂夹角的普通载玻片Fisher Scientific22-037-246
聚-D-赖氨酸溶液Sigma-AldrichA-003-E
叠氮化钠Fisher ScientificBP922I-500
转盘式共聚焦系统YokogawaCSU-X1
方形盖玻片Thermo Scientific3305
TBS 10×溶液Fisher ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMP由Chenoweth实验室合成可应要求提供
TNH由Chenoweth实验室合成可应要求提供
Tris溶液Fisher Scientific92-901-00ML
10% Triton X-100溶液MilliporeSigma64-846-350ML用1×PBS配制0.5%溶液
U2Os细胞系来自E.V. Makayev实验室（新加坡南洋理工大学）HTB-96
VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesNC9524612

参考文献

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

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