本方案介绍了一种通过化学诱导的蛋白质二聚化系统，在染色质上形成凝聚体的方法。 该方法利用化学二聚剂在端粒上诱导早幼粒细胞白血病（PML）核体的形成。通过活细胞成像、免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）技术，对液滴的生长、溶解、定位及组成进行监测。
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本文内容
摘要
摘要
染色质相关缩合物参与多种细胞核过程，但其潜在机制尚不明确。本实验方案描述了一种化学诱导的蛋白质二聚化系统，用于在端粒上形成缩合物。该化学二聚剂由两个相连的配体组成，每个配体可分别结合一种蛋白质：Halo配体结合Halo酶，三甲氧苄二氢叶酸还原酶（trimethoprim, TMP）结合大肠杆菌二氢叶酸还原酶（E. coli dihydrofolate reductase, eDHFR）。将Halo酶与端粒蛋白融合，可通过共价的Halo配体-酶结合将二聚剂锚定在端粒上。TMP与eDHFR的结合可招募与eDHFR融合的相分离蛋白至端粒，从而诱导缩合物的形成。由于TMP与eDHFR的相互作用为非共价结合，因此可通过加入过量游离TMP竞争eDHFR的结合位点，从而逆转缩合过程。本文展示了在端粒上诱导早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukemia, PML）核体形成，并测定缩合物的生长、溶解、定位及组成的示例。通过将Halo酶融合至直接结合局部染色质的蛋白，或融合至由向导RNA靶向特定基因组位点的dCas9蛋白，该方法可轻松适用于在其他基因组位点诱导缩合物的形成。该方法兼具单细胞活体成像所需的时间分辨率，同时可在细胞群体中维持相分离状态以进行生物化学分析，因此适用于研究染色质相关缩合物的形成及其功能。
引言
许多蛋白质和核酸经历液-液相分离（LLPS），并自组装形成生物分子凝聚体，以在细胞内组织生物化学反应1,2染色质结合蛋白的液-液相分离导致与特定基因组位点相关联的凝聚体形成，并参与多种局部染色质功能3例如，HP1蛋白的液-液相分离（LLPS）是异染色质结构域形成的基础，有助于基因组的组织4,5转录因子的液-液相分离形成转录中心以调控转录6, 新生mRNA与多性梳蛋白的液-液相分离形成组蛋白基因座小体以调控组蛋白mRNA的转录和加工7. 然而，尽管已发现大量与染色质相关的凝聚体实例，其形成、调控及功能的潜在机制仍远未明确。特别是，并非所有与染色质相关的凝聚体都通过液-液相分离（LLPS）形成，仍需在活细胞中对凝聚体的形成进行严谨评估。8,9例如， 小鼠中的HP1蛋白在活细胞中仅表现出较弱的液滴形成能力 异染色质焦点表现为坍缩的聚合物球状体10
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方案
1. 瞬时细胞系的制备
- 将U2OS受体细胞培养于6孔板中经多聚-D-赖氨酸包被的22 × 22 mm玻璃盖玻片（用于活细胞成像）或12 mm直径圆形盖玻片（用于免疫荧光或FISH）上，使用生长培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM），待细胞融合度达到60–70%。
- 转染前，将生长培养基更换为1 mL转染培养基（不含青霉素-链霉素溶液的生长培养基）。
- 每孔转染体系中，向150 μL低血清培养基中加入4 μL转染试剂，涡旋10秒，室温孵育5分钟。
- 每孔中，将Halo载体质粒（Halo-GFP-TRF1或Halo-TRF1）与eDHFR载体质粒（mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDHFR-SIM突变体）以1:1质量比（0.5 μg Halo载体质粒与0.5 μg eDHFR载体质粒）逐滴加入150 μL低血清培养基中，用移液器轻轻混匀。
注意：标签分子量相对较小（Halo 33 kD，eDHFR 28 kD，mCherry 30 kD，eGFP 27 kD），未观察到对相分离有影响。然而，建议使用突变体（如本实验中使用的SIM突变体），以确保相变行为对突变敏感，而非受标签影响。SIM来源于PIASx28,30。SIM序列为AAAGTCGATGTAAT....
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结果
通过端粒DNA FISH与SUMO蛋白免疫荧光染色鉴定的SUMO在端粒定位的代表性图像如图2所示。与SIM突变体招募细胞相比，SIM招募细胞在端粒上富集了更多的SUMO1和SUMO2/3。这表明，由SIM二聚化诱导的端粒上SUMO富集依赖于SUMO-SIM相互作用。
TRF1 与 SIM 二聚化后的一个代表性延时录像如视频 1所示。图 3A展示了四个时间点的图像快照。SIM 成功被招募至端粒，且 SIM 与 TRF1 的焦点均变得更大更亮，符合液滴形成与生长的预期特征（图 1B）。此外，观察到 TRF1 焦点发生融合（图 3B），导致端粒聚集，表现为端粒数量减少（图 3E）以及随时间推移端粒信号强度增加（图 3D.......
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讨论
本方案展示了利用化学二聚化系统在端粒上形成和解聚凝聚物的过程。通过活细胞成像监测相分离动力学以及液滴融合诱导的端粒聚集现象。采用DNA FISH和蛋白质免疫荧光（IF）确定凝聚物的定位及其组分。
本实验方案中有两个关键步骤。第一步是确定相分离蛋白和二聚化诱导剂（dimerizer）的浓度。在基因组位点诱导局部相分离的成功与否，取决于相分离蛋白在局部的浓度是否超过其发生相分离的临界浓度（图1B）。相分离蛋白的全局浓度必须足够高，以确保有足够数量的蛋白可被富集到局部区域；但又不能过高，以免引发全细胞范围内的相分离或使其易于被诱导发生全局相分离。 锚定DNA的长度（即锚定蛋白所结合的修饰染色质区域的大小）以及Halo融合锚定蛋白的浓度，共同决定了在最大二聚化效率下成核中心的大小。锚定区域越大，越有利于相分离凝聚体的成核。二聚化效率受二聚化诱导剂与锚定蛋白相对量的影响：二聚化诱导剂过少时，无法占据所有可用的锚定蛋白；而过多时，则会导致eDHFR与过量的游离二聚化诱导剂发生非功能性结合，而非与锚定蛋白上的二聚.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（H.Z. 获资助号 1K22CA23763201，D.M.C. 获资助号 GM118510）和H.Z. 获查尔斯·E·考夫曼基金会资助。作者感谢 Jason Tones 对手稿的校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA | Corning | MT25053CI | |
| 16%（w/v）甲醛，无甲醇 | Thermo Scientific | 28906 | 用1×PBS配制1%溶液 |
| 6孔培养板 | VWR | 10861-554 | |
| 铝箔 | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| 抗mCherry抗体 | Abcam | Ab183628 | |
| 抗PML抗体 | Santa Cruz | sc966 | |
| 抗SUMO1抗体 | Abcam | Ab32058 | |
| 抗SUMO2/3抗体 | Cytoskeleton | Asm23 | |
| 封闭剂 | Roche | 11096176001 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| 圆形盖玻片 | Thermo Scientific | 3350 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| 含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基 | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD相机 | iXon Life | 897 | |
| 乙醇 | Fisher Scientific | 4355221 | |
| 胎牛血清，经认证，符合美国农业部批准地区标准 | Gibco | A4766801 | |
| 去离子甲酰胺 | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）重组二抗，Alexa Fluor 647标记 | Invitrogen | A28181 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）重组二抗，Alexa Fluor 647标记 | Invitrogen | A32733 | |
| 高精度直锥超细尖镊子/持针器 | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| 激光合并模块 | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz L-15培养基 | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668027 | |
| 图形绘制软件，MATLAB | The MathWorks | ||
| 显微镜载玻片盒 | Fisher Scientific | 34487 | |
| 指甲油 | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| 成像软件，NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM减血清培养基 | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm封口膜 | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10×，pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| 青霉素-链霉素溶液，100× | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-驱动器 | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| 移液器吸头 | VWR | 10017 | |
| 带磨砂夹角的普通载玻片 | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| 聚-D-赖氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| 转盘式共聚焦系统 | Yokogawa | CSU-X1 | |
| 方形盖玻片 | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10×溶液 | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | 由Chenoweth实验室合成 | 可应要求提供 | |
| TNH | 由Chenoweth实验室合成 | 可应要求提供 | |
| Tris溶液 | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| 10% Triton X-100溶液 | MilliporeSigma | 64-846-350ML | 用1×PBS配制0.5%溶液 |
| U2Os细胞系 | 来自E.V. Makayev实验室（新加坡南洋理工大学） | HTB-96 | |
| VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | NC9524612 |
参考文献
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
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重印与许可
