Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

مراقبة تفاعلات البروتين والرباط في الخلايا البشرية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي الكمي داخل الخلية في الوقت الفعلي باستخدام مفاعل حيوي عالي الكثافة للخلايا

Published: March 9, 2021 doi: 10.3791/62323
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Magnetic Resonance Center − CERM, University of Florence, 2Consorzio Interuniversitario Risonanze Magnetiche di Metalloproteine − CIRMMP, 3Neurofarba Department, University of Florence

Summary

يصف هذا البروتوكول إعداد مفاعل حيوي للرنين المغناطيسي النووي للحفاظ على الخلايا البشرية المغلفة قابلة للحياة لمدة تصل إلى 72 ساعة ، تليها الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية وتحليلها بمرور الوقت. يتم تطبيق المنهجية لمراقبة التفاعلات بين البروتين والرباط داخل الخلايا في الوقت الفعلي.

Abstract

الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية هو نهج فريد لمراقبة الخصائص الهيكلية والديناميكية للجزيئات البيولوجية الكبيرة عند الدقة الذرية مباشرة في الخلايا الحية. يمكن ملاحظة طي البروتين والتعديلات الكيميائية والتغيرات التوافقية الناجمة عن ربط الليغاند. لذلك ، فإن هذه الطريقة لديها إمكانات كبيرة في سياق تطوير الأدوية. ومع ذلك ، فإن العمر القصير للخلايا البشرية المحصورة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي يحد من نطاق تطبيق الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية. للتغلب على هذه المشكلة ، يتم استخدام المفاعلات الحيوية NMR التي يمكن أن تحسن بشكل كبير استقرار عينة الخلية بمرور الوقت ، والأهم من ذلك ، تمكين التسجيل في الوقت الفعلي لأطياف الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية. وبهذه الطريقة ، يمكن مراقبة تطور العمليات مثل اختراق الليغاند والارتباط بهدف البروتين داخل الخلايا في الوقت الفعلي. غالبا ما تكون المفاعلات الحيوية محدودة بسبب انخفاض صلاحية الخلايا عند أعداد الخلايا العالية ، مما يؤدي إلى مفاضلة بين الحساسية الكلية للتجربة وجدوى الخلية. لقد أبلغنا مؤخرا عن مفاعل حيوي للرنين المغناطيسي النووي يحافظ على عدد كبير من الخلايا البشرية النشطة استقلابيا لفترات طويلة من الزمن ، تصل إلى 72 ساعة. تم تطبيق هذا الإعداد لمراقبة تفاعلات البروتين والرباط والتعديل الكيميائي للبروتين. كما قدمنا سير عمل للتحليل الكمي لبيانات الرنين المغناطيسي النووي في الوقت الفعلي ، استنادا إلى دقة منحنى متعدد المتغيرات. توفر هذه الطريقة ملامح تركيز الأنواع الكيميائية الموجودة في الخلايا كدالة للوقت ، والتي يمكن تحليلها بشكل أكبر للحصول على المعلمات الحركية ذات الصلة. نقدم هنا وصفا مفصلا لإعداد المفاعل الحيوي NMR وتطبيقه لمراقبة تفاعلات البروتين والرباط في الخلايا البشرية.

Introduction

ظهر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية (NMR) مؤخرا كنهج قوي للتحقيق في الخصائص الهيكلية والديناميكية للجزيئات الكبيرة داخل البيئة الخلوية1،2،3،4،5،6. نجح الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية في التحقيق في العمليات ذات الصلة وظيفيا مثل طي البروتين / سوء طيه 7,8,9 ، وربط المعادن7,10 ، وتكوين رابطة ثاني كبريتيد 11,12 ، وتفاعل البروتين مع البروتين13 ، وتفاعل البروتين - الليغاند 14,15,16 ، وتفاعل الحمض النووي - الليغاند 17 ، 18 في الخلايا البشرية الحية. أحد العوامل المحددة لتطبيقات الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية هو العمر القصير للخلايا أثناء التجربة. وينطوي حل هذه المشكلة على استخدام المفاعلات الحيوية للرنين المغناطيسي النووي. في هذه الأجهزة ، يتم تطبيق تدفق مستمر لوسط النمو على الخلايا ، والتي تبقى محصورة داخل مطياف الرنين المغناطيسي النووي ، من أجل توفير الأكسجين والمواد المغذية وإزالة المنتجات الثانوية السامة. بعد ظهور الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية، تم تطوير العديد من تصاميم المفاعلات الحيوية للرنين المغناطيسي النووي لتحسين صلاحية الخلية لفترات أطول من الزمن، حيث يتم تغليف البكتيريا أو خلايا الثدييات في هيدروجيل19،20،21،22 أو الاحتفاظ بها في تعليق وتنصهر من خلال استخدام غشاء غسيل الكلى المجهري23 . وقد سمحت هذه المفاعلات الحيوية بالحصول على تجارب أطول للرنين المغناطيسي النووي مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S/N)5، والأهم من ذلك، يمكن استخدامها للتحقيق في العمليات الخلوية في الوقت الحقيقي22،23،24. بفضل الحساسية الكيميائية والتوافقية العالية للرنين المغناطيسي النووي ، يمكن للتطبيق الأخير أن يوفر رؤى ثمينة حول حركية العمليات الوظيفية داخل الخلايا الحية بدقة ذرية.

في هذا البروتوكول ، نوضح كيفية إعداد وتشغيل مفاعل حيوي محسن تم الإبلاغ عنه مؤخرا25 ، والذي تم الحصول عليه من خلال الجمع بين تصميم مفاعل حيوي معياري موجود23 مع النهج الذي يعتمد على تغليف الخلايا في الهيدروجيل الذي كانت رائدة من قبل مجموعات أخرى19،20،21،22،26،27 . نحن نصف تطبيق المفاعل الحيوي على دراسات الرنين المغناطيسي النووي في الخلية في الوقت الحقيقي لربط ربط الليجند داخل الخلايا بالبروتين في خلايا HEK293T. في المفاعل الحيوي ، يتم تغليف الخلايا بكثافة عالية في خيوط هلام الأغاروز ويتم الحفاظ عليها قابلة للحياة للغاية ونشطة استقلابيا لمدة تصل إلى 72 ساعة ، يتم خلالها تسجيل تجارب الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية في الوقت الفعلي. يتكون المفاعل الحيوي من أنبوب زجاجي يناسب مجسات الرنين المغناطيسي النووي القياسية مقاس 5 مم مانعة للماء ومتصلة بحامل أنبوب بحيث يكون قطر غرفة العينة الداخلية 4.2 مم داخليا وارتفاعها 38 مم وحجمها 526 ميكرولتر. المدخل عبارة عن شعيرات شعرية PEEK بطول 7 أمتار (o.d. = 1/32 "، أي = 0.5 مم) يتم إدخالها في غرفة العينة وصولا إلى ~ 6 مم من الأسفل ، في حين أن المخرج عبارة عن شعيرات شعرية PTFE بطول 7 أمتار (o.d. = 1/32 "، i.d. = 0.5 مم) متصلة في الجزء العلوي من حامل الأنبوب (الشكل 1). يتم إدخال الأنابيب بشكل محوري في خط يتم التحكم في درجة حرارته متصل بحمام مائي. يتم توصيل المدخل والمخرج من خلال أنابيب PEEK بصمام 4 اتجاهات ، 2-position متصل بمضخة FPLC للتحكم في التدفق المتوسط وحاوية النفايات.

يتم تطبيق المفاعل الحيوي لدراسة حركية التفاعل ، الذي تم الإبلاغ عنه سابقا 14,25 ، بين عقارين ، acetazolamide (AAZ) و methazolamide (MZA) ، في الخلايا البشرية مع الشكل الثاني من الأنهيدراز الكربوني البشري (CA II) ، وهو هدف ذي صلة دوائية 28,29,30 ، وحركية تكوين رابطة ثاني كبريتيد داخل الجزيئية ، التي يعززها الجزيء الصغير ebselen25 ، 31 ، من شكل النحاس البشري الخالي من النحاس والزنك ، ديسموتاز الزنك الفائق الأكسيد (SOD1) ، وهو إنزيم مضاد للأكسدة متورط في بداية التصلب الجانبي الضموري 7،8،32. وأخيرا، يتم إجراء التحليل الكمي لبيانات الرنين المغناطيسي النووي في الوقت الحقيقي في MATLAB باستخدام خوارزمية المربعات الصغرى متعددة المتغيرات (MCR-ALS)33، والتي يتم من خلالها الحصول على المكونات الطيفية النقية وملامح التركيز كدالة للوقت للأنواع المرصودة، والتي يمكن تحليلها بشكل أكبر للحصول على المعلمات الحركية ذات الصلة.

يبدأ البروتوكول من قارورة T75 من خلايا HEK293T (~ 3 × 107 خلايا لكل قارورة) تبالغ بشكل عابر في التعبير إما عن CA II البشري (غير المصنف) أو SOD1 البشري (المسمى 15N). نمت الخلايا وحافظت عليها في قوارير T75 مع ارتفاع نسبة الجلوكوز DMEM بنسبة 1:10 كل 3-4 أيام وتم نقلها باستخدام cDNA الذي يشفر البروتين محل الاهتمام قبل 48 ساعة من التجربة. وترد تفاصيل الخطوات التي تنطوي عليها هذه المرحلة في أماكن أخرى(34).

Protocol

1. إعداد الكاشف والحل

  1. لإعداد DMEM كامل ، أضف 5 مل L-glutamine 200 mM ، و 5 مل من البنسلين - الستربتومايسين 100x ، و 50 مل من مصل البقر الجنيني (FBS ، 10٪ vol / vol التركيز النهائي) إلى 440 مل DMEM.
    ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
  2. تحضير محلول الأغاروز عن طريق إذابة 150 ملغ من الأغاروز منخفض التبلور في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند 85 درجة مئوية للحصول على محلول 1.5٪ (ث / v). تعقيم عن طريق الترشيح مع مرشح 0.22 ميكرومتر. تحضير 1 مل من محلول الأغاروز في أنابيب مغطاة 1.5 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. تحضير وسط المفاعل الحيوي.
    1. قم بإذابة 13.4 جم من مسحوق DMEM في 1 لتر من H2O فائق النقاء.
      ملاحظة: اعتمادا على التطبيق ، قد يختلف الحجم النهائي المطلوب (على سبيل المثال ، بالنسبة لوسط 500 مل ، قم بإذابة 6.7 جم من المسحوق في 500 مل H2O).
    2. أضف 2٪ FBS ، و 10 mM NaHCO3 ، و 1x البنسلين - الستربتومايسين (100x) ، و 2٪ D2O (على سبيل المثال ، لوسط 500 مل ، أضف 10 مل من FBS ، و 0.4 جم من NaHCO3 ، و 5 مل من البنسلين - ستربتومايسين 100x ، و 10 مل من D2O).
    3. قم بقياس الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني وإذا لزم الأمر اضبط على 7.4 عن طريق إضافة HCl.
      ملاحظة: عادة ما يكون الرقم الهيدروجيني الأولي قريبا جدا من 7.4.
    4. قم بتصفية وسط المفاعل الحيوي باستخدام فلتر معقم يعمل بالتفريغ في زجاجة زجاجية معقمة سعة 250 مل أو 500 مل.
    5. في غطاء التدفق الرقائقي ، أغلق الزجاجة بغطاء رأس فولاذي معقم مع فوهتين خرطوميتين وقم بتوصيلهما بأنبوب FEP (o.d. = 1/8 "، i.d. = 1.6 مم) سيتم توصيله بالمضخة وبمرشح حقنة PTFE 0.22 ميكرومتر لسحب الهواء.

2. إعداد المفاعل الحيوي

  1. قم بتجميع وحدة التدفق باستخدام أنبوب NMR لوحدة التدفق الثانية ، والذي سيتم استبداله لاحقا بأنبوب يحتوي على الخلايا. ارجع إلى تعليمات تشغيل وحدة التدفق للحصول على التجميع الصحيح.
    ملاحظة: في هذه المرحلة يجب تنظيف وحدة التدفق بالفعل (إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بتنفيذ الخطوة 4.2).
  2. اضبط الحمام المائي المتصل بوحدة التحكم في درجة حرارة وحدة التدفق على 37 درجة مئوية. ضع زجاجة الخزان في الحمام المائي.
  3. قم بتوصيل أنبوب FEP لزجاجة الخزان بالمضخة.
  4. أدر صمام المفاعل الحيوي إلى "تجاوز" واملأ المضخة مسبقا بمتوسط.
  5. حول صمام المفاعل الحيوي إلى "تدفق" واملأ المفاعل الحيوي مسبقا بمتوسط عند 0.1 مل / دقيقة.

3. تحضير عينة الخلية

  1. جمع الخلايا من حاضنة CO2 .
    1. خذ قارورة T75 من خلايا HEK293T المنقولة من حاضنة CO2 وقم بإزالة الوسط المستهلك.
    2. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 7 مل (لكل منهما) من PBS في درجة حرارة الغرفة (~ 20 درجة مئوية).
    3. استخدم 2 مل من التربسين / EDTA لفصل الخلايا. بعد إضافة المحلول ، احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل الخلايا.
      ملاحظة: قد تستغرق الخلايا المنقولة وقتا أطول قليلا حتى يتم فصلها. إذا لزم الأمر ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية.
    4. تعطيل التربسين مع 20 مل من DMEM الكامل ؛ أعد تعليق الخلايا تماما عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ونقلها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
    5. الطرد المركزي للخلايا في 800 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant.
    6. اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS في درجة حرارة الغرفة لإزالة الوسط المتبقي.
    7. الطرد المركزي للخلايا في 800 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant.
    8. انقل حبيبة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مغطى بسعة 1.5 مل.
  2. تضمين الخلايا في خيوط الأغاروز.
    1. قم بإذابة أليكوت واحد من الأغاروز الصلب عند 85 درجة مئوية في حمام مائي ثم احتفظ به في محلول عند 37 درجة مئوية في سخان كتلة.
    2. باستخدام ماصة باستور ، املأ الجزء السفلي من أنبوب NMR لوحدة التدفق ب 60-70 ميكرولتر من هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪ وضعه في الجليد. سيؤدي ذلك إلى إنشاء قابس سفلي مرتفع ~ 5 مم يسمح بوضع عينة الخلية داخل الحجم النشط لملف 1H NMR.
    3. سخني حبيبات الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.8 عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 ثانية في الكتلة الحرارية.
    4. إعادة تعليق الخلايا في 450 ميكرولتر من محلول الأغاروز. كن حذرا لتجنب تشكيل الفقاعات.
    5. قم بشفط تعليق الخلية - الأغاروز في أنبوب كروماتوغرافي PEEK بطول ~ 30 سم (أي = 0.75 مم) متصل بحقنة 1 مل.
      ملاحظة: قبل الشفط ، يجب ملء الأنابيب والحجم الميت للمحقنة مسبقا ب PBS في درجة حرارة الغرفة لتجنب تكوين فقاعات. طول الأنابيب ليس حرجا.
    6. دع الأنابيب تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    7. املأ مسبقا وحدة التدفق NMR أنبوب 100 ميكرولتر من PBS في درجة حرارة الغرفة.
    8. صب خيوط الخلايا المضمنة في الأغاروز في وحدة التدفق أنبوب الرنين المغناطيسي النووي عن طريق دفع المحقنة بلطف.
      ملاحظة: لملء أنبوب الرنين المغناطيسي النووي بشكل متجانس، ابدأ بوضع نهاية أنبوب PEEK في أسفل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي واستمر نحو الأعلى بينما تتأرجح ببطء من اليسار إلى اليمين.
    9. كرر الخطوات 3.2.5 و 3.2.6 و 3.2.8 حتى يتم إرسال كل تعليق الأغاروز الخلوي.
  3. أدخل الخلايا في المفاعل الحيوي.
    1. قم بإزالة أنبوب الرنين المغناطيسي النووي الفارغ من وحدة التدفق وزيادة معدل التدفق إلى 2 مل / دقيقة لبضع دقائق لإزالة فقاعات الغاز المتبقية في أنابيب المدخل.
    2. اضبط معدل التدفق على 0.2 مل / دقيقة وأدخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي الذي يحتوي على الخلايا عن طريق دفعه لأعلى ببطء ولكن بثبات.
      ملاحظة: يتجنب التدفق النشط للوسط التدفق العكسي لمحتوى الأنبوب عبر المدخل ، والذي كان سيحدث أثناء الإدخال.

4. تشغيل المفاعل الحيوي وتنظيفه

  1. تشغيل المفاعل الحيوي أثناء تجربة الرنين المغناطيسي النووي.
    1. اضبط درجة الحرارة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي على 310 كلفن.
    2. أدخل وحدة التدفق في مقياس الطيف.
    3. قم بتزويد وسط المفاعل الحيوي بمعدل تدفق قدره 0.1 مل / دقيقة طوال مدة تجارب الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية.
    4. في الوقت المطلوب أثناء التجربة ، قم بحقن محلول مركز من الجزيء الخارجي في زجاجة الخزان المتوسطة عن طريق ثقب أنبوب السيليكون بحقنة معقمة طويلة الإبرة.
      ملاحظة: ينبغي اختيار التركيز النهائي للجزيء في الوسط استنادا إلى المعرفة السابقة بسمية الخلية، وإذا كان ذلك متاحا، إلى معدل الانتشار المتوقع/المقدر عبر غشاء الخلية.
    5. في نهاية تجربة الرنين المغناطيسي النووي ، استبدل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بأنبوب فارغ وشطف وحدة التدفق بالماء.
  2. المفاعل الحيوي نظيف في مكانه.
    1. تنظيف وحدة التدفق عن طريق تدفق المحاليل التالية عند 1 مل / دقيقة: 0.2 م هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ؛ 3 م حمض الستريك. 0.2 M NaOH ، لمدة 30 دقيقة على الأقل لكل منها ، تليها مياه فائقة النقاء مفلترة معقمة لمدة >2 ساعة.
    2. تنظيف وتعقيم زجاجة الخزان ومجموعة الأنابيب بعد كل تشغيل.

5. تجارب الرنين المغناطيسي النووي

  1. إعداد تجارب الرنين المغناطيسي النووي.
    ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات مسبقا، قبل إعداد عينة الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية، لتجنب أي تأخير بين جمع الخلايا والحصول على البيانات.
    1. قم بإنشاء مجموعة بيانات جديدة على مطياف الرنين المغناطيسي النووي وقم بتعيين المعلمات لتجارب الرنين المغناطيسي النووي المطلوبة.
    2. تعيين المعلمات لتجارب 1D 1H NMR.
    3. قم بتوسيط تردد الناقل 1H عند 4.7 جزء في المليون على إشارة الماء.
    4. حدد برنامج نبضة zgesgp ، واضبط العرض الطيفي على 20 جزءا في المليون ، ونبضة مربعة 1000-μs 180 درجة لقمع الماء. تعيين تأخير بين المسح الضوئي من 1 ثانية. احصل على الطيف من خلال 32 عملية مسح.
    5. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن CA II غير المصنف: حدد برنامج النبض p3919gp ، واضبط العرض الطيفي على 30 جزء في المليون لتغطية منطقة imino من الطيف ، واضبط التأخير لقمع الماء ذي الحدين بحيث يتركز الحد الأقصى للإثارة عند التحولات الكيميائية للإشارات ذات الأهمية (d7 = 20 μs عند 950 MHz). قم بتعيين تأخير بين المسح الضوئي بمقدار ≥1 ثانية. احصل على 512 عملية مسح.
    6. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن SOD1 المسمى 15N: حدد برنامج نبضة sfhmqf3gpph ، واضبط العرض الطيفي 1H و 15N على 16 و 50 جزء في المليون ، على التوالي ، وإزاحة النبضة على شكل وعرض النطاق الترددي للإثارة إلى 8.5 و 6 جزء في المليون ، على التوالي ، ونبضة 350 ميكروثانية لنظام فك الارتباط (garp4 أو غيرها اعتمادا على الأداة). قم بتعيين تأخير بين المسح الضوئي بمقدار 0.3 ثانية. احصل على 16 عملية مسح ضوئي و 128 زيادة في البعد 15N.
  2. اكتساب أطياف الرنين المغناطيسي النووي في الوقت الحقيقي.
    1. بمجرد إدخال المفاعل الحيوي في مطياف الرنين المغناطيسي النووي ، انتظر لبضع دقائق للسماح بتبادل الوسط.
      ملاحظة: تتم مراقبة هذه العملية بسهولة من ظهور إشارة القفل حيث يتم استبدال PBS بوسيط يحتوي على 2٪ D2O.
    2. اضبط مطابقة وضبط قناة 1H ، وقم بتحريك المغناطيس ، واحسب طول النبضة الصلبة 1H 90 درجة.
    3. اضبط مستويات الطاقة 1H في كل تسلسل نبضة وفقا للنبضة الصلبة 1H.
    4. سجل أول طيف zgesgp 1H للتحقق من محتوى العينة وتجانس المجال.
    5. انسخ تجارب zgesgp و p3919gp/sfhmqcf3gpph إلى الرقم المطلوب ووضعها في قائمة الانتظار في التخزين المؤقت للاستحواذ.
      ملاحظة: تستخدم أطياف zgesgp فقط للتحكم في حالة العينة وتجانس الحقل. لذلك ، يمكن إما تخطيها أو تسجيلها بشكل أقل تكرارا.
    6. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن CA II غير المصنف: قم بمعالجة أطياف p3919gp عن طريق تطبيق وظيفة نافذة توسيع الخط الأسي والتعبئة الصفرية (LB = 20 هرتز).
    7. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن SOD1 المسمى 15N: قم بمعالجة أطياف sfhmqcf3gpph عن طريق تطبيق وظيفة نافذة جرس جيب الزاوية الصفرية والمربعة (SSB = 2) في كلا البعدين.
      ملاحظة: يمكن تقليل حجم الأطياف المعالجة عن طريق إزالة المناطق الخالية من الإشارات (في Topspin ، يتم ذلك عن طريق تعيين قيم STSR و STSI المطلوبة).

6. تحليل MCR-ALS

  1. لتحليل أطياف CA II ، قم باستيراد المناطق الطيفية 1D في MATLAB R2019b.
    1. في البرنامج، قم بإنشاء قائمة بالتجارب المراد تصديرها في قائمة مجموعة بيانات العملية.
    2. باستخدام نسخة معدلة من برنامج au convbin2asc ، قم بتصدير المنطقة الطيفية ذات الأهمية بتنسيق ASCII لكل طيف.
      ملاحظة: يؤدي هذا إلى إنشاء ملف نصي باسم ascii-spec.txt في كل دليل فرعي للطيف.
    3. في MATLAB، قم باستيراد المناطق الطيفية باستخدام البرنامج النصي المخصص Load_ascii_spectra.
      ملاحظة: يتطلب هذا البرنامج النصي دليل مجموعة البيانات كإدخال وينتج أطياف صفيف 2D تحتوي على أطياف 1D مكدسة ومصفوفة 1D cs تحتوي على التحولات الكيميائية.
    4. قم بتشغيل البرنامج النصي Load_acqus لاستخراج الطوابع الزمنية من أطياف 1D.
      ملاحظة: ينتج هذا البرنامج النصي صفيفا 1D times_hours يحتوي على الزيادة الزمنية لكل طيف معبرا عنه بالساعات، مع الطيف الأولي في الوقت = 0.
  2. لتحليل أطياف SOD1 ، قم باستيراد أطياف ثنائية الأبعاد في MATLAB R2020b.
    1. في Topspin، قم بإنشاء قائمة بالتجارب المراد تصديرها في قائمة مجموعة بيانات العملية.
    2. في MATLAB ، قم باستيراد أطياف 2D باستخدام البرنامج النصي المخصص Load_2D_spectra.
      ملاحظة: يتطلب هذا البرنامج النصي دليل مجموعة البيانات كإدخال وينتج مصفوفة 3D Spectra تحتوي على أطياف 2D مكدسة ومصفوفة 1D cs تحتوي على التحولات الكيميائية.
    3. قم بتشغيل البرنامج النصي Load_acqus لاستخراج الطوابع الزمنية من أطياف 2D.
    4. حدد المناطق الطيفية ذات الأهمية في البرنامج النصي المخصص Cut_2D_spectra وقم بتشغيل البرنامج النصي لقص المصفوفات الفرعية ثلاثية الأبعاد [(1H x 15N) الكثافات الطيفية) × الوقت] ؛ إعادة تشكيلها كمصفوفات 2D (النقاط الزمنية × الكثافة الطيفية) وضمها معا.
      ملاحظة: ينتج عن ذلك صفيف 2D JoinSpec_flat يحتوي على المناطق الطيفية المعاد تشكيلها والانضمام إليها.
  3. قم بتشغيل MCR-ALS 2.0 في وضع واجهة المستخدم الرسومية.
    1. افتح MCR-ALS 2.0 GUI عن طريق تشغيل البرنامج النصي mcr_main.
    2. في علامة التبويب تحديد البيانات ، قم بتحميل الأطياف أو مصفوفة JoinSpec_flat. يمكن رسم البيانات للتحقق.
    3. قم بتقييم عدد المكونات إما عن طريق تحلل القيمة المفردة (SVD) أو يدويا.
      ملاحظة: يجب أن يتوافق عدد المكونات مع عدد الأنواع المتميزة الموجودة في التجربة. في هذه الحالة n = 2 ، المقابلة للبروتين الحر والمقيد.
    4. حدد طريقة للتقدير الأولي للأطياف النقية. يمكن استخدام أنقى كشف متغير أو تحليل العوامل المتطورة (EFA).
    5. في نافذة تحديد مجموعة البيانات ، حدد متابعة.
    6. قم بتعيين القيود الخاصة بالتركيزات في النافذة القيود: وضع الصف . تطبيق قيد عدم السلبية ، حدد fnnls (المربعات الضئيلة السريعة غير السلبية المقيدة) ك "تنفيذ و 2 نوع". تطبيق قيد إغلاق واحد ، وتعيين القيد إلى 1 ، وشرط الإغلاق على أنه "مساو" وينطبق على جميع الأنواع.
      ملاحظة: هذا يجبر مجموع تركيزات كل نوع على أن يكون مساويا ل 1 ، بحيث يتم تطبيع الملامح التي تم الحصول عليها لكل نوع فيما يتعلق بتركيز البروتين الكلي.
    7. قم بتعيين قيود الأطياف في النافذة القيود: وضع العمود . تطبيق قيود عدم السلبية ، حدد fnnls ك "تنفيذ و 2 الأنواع".
      ملاحظة: لا ينبغي تطبيق هذا القيد في حالة وجود إشارات سالبة في أطياف الرنين المغناطيسي النووي.
    8. في النافذة النهائية ، قم بتعيين 50 تكرارا ومعيار تقارب 0.01. حدد أسماء المخرجات للتركيزات والأطياف وانحراف Std. انقر فوق متابعة لتشغيل تركيب MCR-ALS.
      ملاحظة: ستعرض نافذة رسومية نتيجة التركيب مع مخططات لملفات تعريف التركيز وأطياف المكونات النقية.
    9. بالنسبة لمجموعة بيانات SOD1: استخدم البرنامج النصي المخصص Rebuild_2D_spectra لإعادة بناء المناطق الطيفية ثنائية الأبعاد من إخراج 1D من MCR-ALS ورسمها.

7. اختبار تريبان الأزرق

  1. استرجع محتوى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي باستخدام ماصة باستور ، وانقل خيوط الأغاروز إلى أنبوب مغطى بسعة 1.5 مل.
  2. قم بإزالة الوسط المتبقي عن طريق شطف خيوط الأغاروز ب 600 ميكرولتر من PBS وطردها مركزيا عند 4000 × g لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت.
  3. أضف 250 ميكرولتر من PBS و 50 ميكرولتر من محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪.
  4. احتضان لمدة 2 دقيقة مع السحب المستمر.
  5. يغسل مرتين مع 600 ميكرولتر من PBS مع التخلص من supernatant.
  6. ضع بعض خيوط الأغاروز على شريحة مجهرية وقطعها بشفرات حلاقة لإنشاء شرائح صغيرة من الجل. حدد أنحف الشرائح (سمك < 0.4 مم ، من الناحية المثالية ~ 0.2 مم) للتحليل.
  7. انقل شرائح الجل إلى غرفة عد خلايا ذاتية الصنع تتكون من شريحتين زجاجيتين متباعدتين بثلاث طبقات من فيلم البارافين (سمك إجمالي ~ 0.4 مم) على كل جانب.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام شريحة حجرة؛ ومع ذلك ، سيتم ضغط شرائح الجل الأكثر سمكا من ارتفاع الغرفة (0.1 مم) ، مما يؤدي إلى تمزق الخلايا المدمجة.
  8. الحصول على صور للخلايا داخل الأغاروز وحساب الخلايا البيضاء والزرقاء.
  9. حساب صلاحية الخلية ك (إجمالي الخلايا - الخلايا الزرقاء) / إجمالي الخلايا.

Representative Results

يسمح البروتوكول أعلاه بتغليف الخلايا في خيوط الهيدروجيل لزيادة صلاحية الخلية لفترات طويلة من الزمن ، وهو أمر ضروري للتحقيق في العمليات داخل الخلايا في الوقت الفعلي. في المفاعل الحيوي ، يتم الحفاظ على الخلايا حية ونشطة استقلابيا حتى 72 ساعة ، كما هو مؤكد من خلال اختبار Trypan Blue (الشكل 2a-c). من حيث المبدأ ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمراقبة بروتين داخل الخلايا ذي أهمية يخضع لأي تغييرات مطابقة أو كيميائية. في التطبيق الأول الموصوف أعلاه ، يتم تطبيق المفاعل الحيوي لمراقبة في الوقت الفعلي ربط اثنين من المثبطات ، AAZ و MZA ، إلى CA II المبالغة في التعبير عنها في سيتوسول خلايا HEK293T. يستخدم أول طيف نحت للإثارة 1H (zgesgp) المسجل لتقييم شدة الإشارة الإجمالية (التي تتناسب مع عدد الخلايا) ، ووجود إشارات من البروتين المفرط في التعبير وتجانس المجال (الشكل 2d). في حالة CA II ، يمكن مراقبة الارتباط داخل الخلايا للمثبطين بواسطة أطياف WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR (p3919gp) ، من خلال مراقبة إشارات 1H في المنطقة بين 11 و 16 جزء في المليون. تنشأ هذه الإشارات من الهيستيدين المنسق للزنك والمخلفات العطرية الأخرى ل CA II36 وتنزعج عند ربط الليغاند 14,15. ويمكن اختيار تركيزات الليغاند استنادا إلى معدل الانتشار أو، إن وجد، من قيم النفاذية المحددة مسبقا14. يتم تأكيد الربط الناجح بصريا من خلال ظهور مجموعة إضافية من الإشارات في المنطقة الطيفية ذات الأهمية ، والتي تحل تدريجيا محل الإشارات الأصلية (الشكل 3). يتم الحصول على منحنيات الربط المعتمدة على الوقت من خلال تحليل MCR-ALS ، الذي يفصل بين مجموعتين من إشارات الرنين المغناطيسي النووي الناشئة عن CA II الحر والمقيد (الشكل 4 أ) ويوفر في نفس الوقت ملامح التركيز النسبي للنوعين (الشكل 4 ب). في التطبيق الثاني ، يتم تطبيق المفاعل الحيوي لمراقبة تكوين رابطة ثاني كبريتيد SOD1 داخل الجزيئات المرتبطة بالزنك التي يعززها الإبسيلين ، وهو محاكاة للجلوتاثيون بيروكسيديز ، في الخلايا البشرية. تتم مراقبة هذه العملية من خلال مراقبة التغيرات في أطياف 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 (التي توفر بصمة لتكوين العمود الفقري للبروتين) الناجمة عن اضطرابات بنية البروتين الناجمة عن تكوين رابطة ثاني كبريتيد. تظهر إشارات إضافية ناشئة عن SOD1 المؤكسد ثنائي كبريتيد في طيف 1H-15N وتحل تدريجيا محل تلك الناتجة عن SOD المختزل بثاني كبريتيد 1. يفصل تحليل MCR-ALS على مناطق مختارة من الطيف ثنائي D الإشارات الناشئة عن النوعين (الشكل 5 أ) ويوفر ملامح تركيزهما النسبية (الشكل 5 ب). يمكن تحليل منحنيات التركيز التي تم الحصول عليها بشكل أكبر عن طريق التركيب غير الخطي لتوفير معلومات عن حركية العمليات قيد الدراسة25.

Figure 1
الشكل 1: مخطط المفاعل الحيوي. على اليسار: عرض المقطع العرضي لوحدة التدفق الفارغة. على اليمين: مخطط إعداد المفاعل الحيوي. تظهر أنابيب مدخل PEEK باللون الأخضر. تظهر أنابيب مخرج PTFE باللون الأزرق. اللوحة اليسرى مستنسخة بإذن من Luchinat et al.25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: اختبار تريبان الأزرق على الخلايا المغلفة وفحص العينة بواسطة 1H NMR. شرائح تمثيلية من الأغاروز تحتوي على خلايا مدمجة وملطخة باللون الأزرق المثقبي (أ) مباشرة بعد الصب و (ب) بعد 72 ساعة في المفاعل الحيوي ؛ (ج) صلاحية الخلية كدالة للوقت في المفاعل الأحيائي للرنين المغناطيسي النووي تحت التدفق النشط (الأسود) وتحت الظروف الثابتة (الحمراء)، التي تقاس بواسطة اختبار تريبان الأزرق. (د) أطياف الرنين المغناطيسي النووي zgesgp 1H المسجلة على الخلايا المدمجة في الأغاروز التي تبالغ في التعبير عن CA II في غياب (أسود) وفي وجود (أحمر) فقاعات الغاز في المفاعل الأحيائي. في الحالة الأخيرة ، يؤدي انخفاض تجانس المجال إلى توسيع الخط وظهور قطع أثرية لقمع المذيبات. يتم تصنيف الميزات الطيفية المثيرة للاهتمام. وتستنسخ الأفرقة (من أ إلى ج) بإذن من لوشينات وآخرين(25). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: بيانات تمثيلية في الوقت الحقيقي داخل الخلية 1H NMR تم الحصول عليها على الخلايا المغلفة بالأغاروز في المفاعل الحيوي. مخططات شلال من أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1D 1H (منطقة بين 15.6 و 11.1 جزء في المليون) من خلايا HEK293T التي تبالغ في التعبير عن CA II ومعالجتها لاحقا ب (أ) 25 ميكرومتر AAZ و (ب) 10 ميكرومتر MZA ، المسجلة كدالة للوقت في المفاعل الحيوي NMR. يظهر وقت علاج الليغاند بسهم. الكثافة الطيفية (a.u.) مرمزة بالألوان من الأزرق (الأدنى) إلى الأصفر (الأعلى). وهذا الرقم مستنسخ بإذن من لوشينات وآخرين(25). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: المخرجات التمثيلية MCR-ALS من أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1D. (أ) أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1H للمكونات النقية التي أعيد بناؤها بواسطة MCR-ALS: CA II في حالة عدم وجود روابط (أسود) وفي المجمع مع AAZ (أحمر) أو MZA (أرجواني)؛ (ب) أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1H للمكونات النقية التي أعيد بناؤها بواسطة MCR-ALS: CA II في حالة عدم وجود روابط (أسود) وفي المجمع مع AAZ (أحمر) أو MZA (أرجواني)؛ (ب) أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1H للمكونات النقية التي أعيد بناؤها بواسطة MCR-ALS: CA II في حالة عدم وجود روابط (أسود) وفي المجمع مع AAZ (أحمر) أو MZA (أرجواني)؛ (ب) أطياف الرنين المغناطيسي النووي (1H) للمكونات النقية التي أعيد بناؤها بواسطة MCR-ALS: CA II في حالة عدم وجود روابط (أسود) وفي المجمع مع (ب) ملامح التركيز النسبي للتركيز الحر (الأسود) والمرتبط CA II كدالة للوقت عند إضافة AAZ (أحمر) أو MZA (أرجواني) التي حصلت عليها MCR-ALS. يتم تمييز أوقات علاج الليغاند بالأسهم. وهذا الرقم مستنسخ بإذن من لوشينات وآخرين(25). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الناتج التمثيلي MCR-ALS من أطياف الرنين المغناطيسي النووي ثنائي D. (أ) المناطق الطيفية 1H-15N (المسماة I-IV) للمكونات النقية التي أعيد بناؤها بواسطة MCR-ALS: SOD1 (أسود) و SOD1 المؤكسد ثنائي الكبريتيد (أحمر)؛ (ب) المناطق الطيفية 1H-15N (المسماة I-IV) للمكونات النقية التي أعيد بناؤها بواسطة MCR-ALS: SOD1 (أسود) و SOD1 المؤكسد ثنائي الكبريتيد (أحمر)؛ (ب) المناطق الطيفية 1H-15N (المسماة I-IV) للمكونات النقية التي أعيد بناؤها بواسطة MCR-ALS: SOD1 (أسود) و SOD1 المؤكسد ثنائي الكبريتيد (أحمر)؛ (ب) المناطق الطيفية 1H-15N (المسماة I-IV) للمكونات النقية التي أعيد بناؤها بواسطة MCR-ALS: SOD1 (أسود) SOD1 (أسود) (ب) مواصفات التركيز النسبي للمكونات النقية كدالة للوقت عند إضافة إبسلين (معلمة بسهم) التي حصلت عليها MCR-ALS. وهذا الرقم مستنسخ بإذن من لوشينات وآخرين(25). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الهدف من استخدام مفاعل حيوي لتجربة الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية هو الحفاظ على الخلايا حية ونشطة استقلابيا لفترة طويلة من الزمن. ويجب أن يؤخذ في الاعتبار عدد من الجوانب الحاسمة لتحقيق هذا الهدف. أولا ، من الأهمية بمكان تجنب التلوث البكتيري عند إعداد عينة الخلية وأثناء الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي النووي. إذا تم استخدام سلالات من الإشريكية القولونية أو غيرها من البكتيريا التي يشيع استخدامها لاستنساخ الجينات والتعبير عن البروتين المؤتلف في المختبر، فإنها قد تلوث الخلايا أثناء إعداد العينة. بمجرد دخولها إلى المفاعل الحيوي ، ستنمو البكتيريا بسرعة مستغلة وسط النمو الطازج وستسبب موت الخلايا بسبب إنتاج السموم الداخلية. يتم رصد التلوث البكتيري فقط في مرحلة متقدمة ، عندما يتحول متوسط النمو إلى اللون الأصفر والعكر. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتسبب التنظيف غير الكامل للمفاعل الحيوي في تلوث المضخة أو الأنابيب بالبكتيريا أو الخمائر أو القوالب الشائعة.

شرط نجاح التجربة هو تجنب تكوين فقاعة الغاز. ومن شأن فقاعات الغاز المحاصرة بين خيوط الأغاروز في الحجم النشط لملف الرنين المغناطيسي النووي أن تحدث عدم تجانس كبير في المجال المغناطيسي، مما يتسبب في قمع غير كامل لإشارة H2O وفقدان شديد للجودة الطيفية (الشكل 2 د). قد تكون الفقاعات ناتجة عن الهواء المحبوس في النظام أو عن طريق تكوين CO2 الغازي. يمكن تجنب الأول بسهولة عن طريق تنظيف النظام بوسط قبل إدخال عينة الخلية ، بينما لتجنب الأخير ، يوصى بتقليل تركيز NaHCO3 في وسط النمو ، والحفاظ على جميع أجزاء النظام عند درجة حرارة ثابتة لتقليل الاختلافات في قابلية ذوبان CO2. قد يتسبب التمثيل الغذائي الهوائي الخلوي أيضا في تكوين CO2 الغازي ، والذي يمكن منعه عن طريق زيادة معدل التدفق.

يجب التحقق من صلاحية الخلية بعد كل تشغيل بواسطة Trypan Blue Test. ومع ذلك ، هذا لا يوفر رؤى حول النشاط الأيضي. للحصول على صورة أكثر اكتمالا للحالة الأيضية للخلايا أثناء تشغيل المفاعل الحيوي ، يمكن إجراء أطياف الرنين المغناطيسي النووي 31P لتقييم إنتاج ATP كدالة للوقت23,25. ومع ذلك ، غالبا ما يكون المسبار المخصص ضروريا لهذا القياس ، مما قد يسمح بالتسجيل المتزامن باستخدام 1H NMR.

في حالة CA II ، فإن وجود إشارات مراسلة جيدة الحل في منطقة غير عادية من طيف 1H يسهل التحليل من أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1D البسيطة ولا يتطلب إثراء النظائر أثناء التعبير عن البروتين. وبوجه عام، يمكن أن تؤدي البروتينات الأخرى إلى ظهور إشارات 1H مفيدة لرصد التغيرات الطيفية في مناطق أخرى، مثل تلك النموذجية لنواة البروتين الكارهة للماء بين 0 و-1 جزء في المليون11؛ ومع ذلك ، تميل هذه المناطق إلى أن تكون مزدحمة بالبروتينات المطوية التي يزيد حجمها عن ~ 10 كيلو دالتون. في هذه الحالة ، كما هو موضح في SOD1 ، من الأفضل إثراء البروتين ب 15N ، من خلال توفير وسط نمو غني ب 15N بشكل موحد أثناء التعبير عن البروتين ، ومراقبة التغيرات في الوقت الفعلي في أطياف الرنين المغناطيسي النووي 2D 1H-15N. يتم استيراد أطياف 2D كمصفوفات ثنائية الأبعاد في MATLAB ، ويعاد ترتيبها إلى صفائف 1D ومكدسة قبل تحليل MCR-ALS. ينطبق النهج الأخير بشكل عام على أي بروتين داخل الخلايا يؤدي إلى إشارات يمكن اكتشافها ، ويوفر معلومات عن التغيرات التوافقية للبروتين على مستوى البقايا المفردة. ومن حيث المبدأ، يمكن تعميم النهج الأخير على أطياف التنمية غير الزراعية وعلى مخططات وسم النظائر الأخرى.

فيما يتعلق بالتطبيق على أنواع مختلفة من الخلايا ، يجب تكييف البروتوكول بسهولة مع خطوط الخلايا المختلفة ولا يتطلب أن يتم التعبير عن البروتين محل الاهتمام مباشرة في الخلايا. لذلك ، يمكن دمج طرق أخرى للرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية مع هذا البروتوكول ، حيث يتم إنتاج الجزيء الكبير ذي الأهمية بشكل مؤتلف ، أو تصنيعه ، ثم إدخاله لاحقا في الخلايا عن طريق الكهربية أو بطرق التسليم الأخرى 1،9،38. عند العمل مع خطوط خلوية مختلفة أو بروتوكولات تحضير العينات ، قد تحتاج معلمات مثل تركيز الأغاروز وسمك الخيط وكثافة الخلية النهائية في خيوط الأغاروز إلى التحسين تجريبيا. علاوة على ذلك ، يقتصر تطبيق البروتوكول الموصوف هنا على الخلايا التي تتسامح مع تغليف الأغاروز. قد تتطلب أنواع الخلايا الأخرى تركيبات هيدروجيل مختلفة، في حين يوصى بإعداد مختلف عند تحليل الخلايا التي تنمو أصلا في التعليق، على سبيل المثال، الاستفادة من غشاء غسيل الكلى المجهري المحوري لضمان انتشار المغذيات مع إبقاء الخلايا المعلقة محصورة في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي23.

بالمقارنة مع تصاميم المفاعلات الحيوية NMR الأخرى19،20،21،22 ، يعتمد الجهاز الموصوف هنا على وحدة تدفق متاحة تجاريا ، تم تكييفها مع تعديلات طفيفة. لذلك ، يمكن تكرار الجهاز بسهولة في مختبرات مختلفة ذات قابلية عالية للتكرار. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالتشغيل الموحد والامتثال الكامل للوائح سلامة المختبرات الصارمة ، إذا لزم الأمر. وعموما، ينبغي أن تسمح مرونة وسهولة تشغيل المفاعل الحيوي بالعديد من التطبيقات الأخرى للرنين المغناطيسي النووي للمحلول، سواء في الخلايا أو في المختبر، بالإضافة إلى تلك التي سبق الإبلاغ عنها23،25. وفي نهاية المطاف، يمكن تطبيق نفس تصميم المفاعل الحيوي على العينات التي تشبه إلى حد كبير البيئة الفسيولوجية للأنسجة، مثل الكرويات أو المواد العضوية، شريطة العثور على سقالات مناسبة للحفاظ على هذه العينات على قيد الحياة - أو حتى الحفاظ على نموها - في مطياف الرنين المغناطيسي النووي.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال iNEXT-Discovery ، رقم المنحة 871037 ، بتمويل من برنامج Horizon 2020 التابع للمفوضية الأوروبية ، ومن قبل Instruct-ULTRA ، والمنحة رقم 731005 ، وهو مشروع الاتحاد الأوروبي H2020 لمواصلة تطوير خدمات Instruct-ERIC ، ومن قبل Ministero dell'Istruzione ، dell'Università e della Ricerca PRIN grant 20177XJCHX. يعترف المؤلفون بدعم Instruct-ERIC ، وهو مشروع Landmark ESFRI ، من خلال جائزة JRA رقم 815 واستخدام موارد CERM / CIRMMP Italy Center. نشكر ماتيو بينيستري (بروكر، المملكة المتحدة) على تقديم الدعم لتشغيل وحدة تدفق InsightMR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
D2O Sigma-Aldrich 453366
DMEM, high glucose Life Technologies 10313-021
DMEM, high glucose, powder Sigma-Aldrich D5648
FBS Life Technologies 10270
HCl Sigma-Aldrich 30721
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030
Low-gelling agarose, powder Sigma-Aldrich A4018
NaHCO3, powder Carlo Erba 478537
PBS Life Technologies 10010
Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
NaOH, pellets Sigma-Aldrich 30620
Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) Sigma-Aldrich T8154 Hazard statement(s): H350 may cause cancer.
Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) Life Technologies 25300-054
Equipment
Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe Bruker n/a All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible.
InsightMR flow unit Bruker n/a
P-920 pump module from ÄKTA FPLC GE Healthcare n/a Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Inomata, K., et al. High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells. Nature. 458 (7234), 106-109 (2009).
  2. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, Pt 2 108-118 (2017).
  3. Dzatko, S., et al. Evaluation of the stability of DNA i-motifs in the nuclei of living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (8), 2165-2169 (2018).
  4. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR in human cells: direct protein expression allows structural studies of protein folding and maturation. Accounts of Chemical Research. 51 (6), 1550-1557 (2018).
  5. Tanaka, T., et al. High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (22), 7284-7288 (2019).
  6. Siegal, G., Selenko, P. Cells, drugs and NMR. Journal of Magnetic Resonance. 306, San Diego, Calif. 202-212 (1997).
  7. Banci, L., et al. Atomic-resolution monitoring of protein maturation in live human cells by NMR. Nature Chemical Biology. 9 (5), 297-299 (2013).
  8. Luchinat, E., et al. In-cell NMR reveals potential precursor of toxic species from SOD1 fALS mutants. Nature Communications. 5, 5502 (2014).
  9. Theillet, F. -X., et al. Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells. Nature. 530 (7588), 45-50 (2016).
  10. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Intracellular metal binding and redox behavior of human DJ-1. Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: A Publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 23 (1), 61-69 (2018).
  11. Banci, L., Barbieri, L., Luchinat, E., Secci, E. Visualization of redox-controlled protein fold in living cells. Chemistry & Biology. 20 (6), 747-752 (2013).
  12. Mercatelli, E., Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Direct structural evidence of protein redox regulation obtained by in-cell NMR. Biochimica Et Biophysica Acta. 1863 (2), 198-204 (2016).
  13. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Protein interaction patterns in different cellular environments are revealed by in-cell NMR. Scientific Reports. 5, 14456 (2015).
  14. Luchinat, E., et al. Drug screening in human cells by NMR spectroscopy allows the early assessment of drug potency. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (16), 6535-6539 (2020).
  15. Luchinat, E., et al. Intracellular binding/unbinding kinetics of approved drugs to carbonic anhydrase II observed by in-cell NMR. ACS Chemical Biology. 15 (10), 2792-2800 (2020).
  16. DeMott, C. M., et al. Potent inhibitors of mycobacterium tuberculosis growth identified by using in-cell NMR-based screening. ACS Chemical Biology. 13 (3), 733-741 (2018).
  17. Krafcikova, M., et al. Monitoring DNA-ligand interactions in living human cells using NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (34), 13281-13285 (2019).
  18. Broft, P., et al. In-cell NMR of functional riboswitch aptamers in eukaryotic cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
  19. Sharaf, N. G., Barnes, C. O., Charlton, L. M., Young, G. B., Pielak, G. J. A bioreactor for in-cell protein NMR. Journal of magnetic resonance. 202 (2), San Diego, Calif. 140-146 (2010).
  20. Kubo, S., et al. A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 52 (4), 1208-1211 (2013).
  21. Inomata, K., Kamoshida, H., Ikari, M., Ito, Y., Kigawa, T. Impact of cellular health conditions on the protein folding state in mammalian cells. Chemical Communications. 53 (81), Cambridge, England. 11245-11248 (2017).
  22. Breindel, L., DeMott, C., Burz, D. S., Shekhtman, A. Real-time in-cell nuclear magnetic resonance: ribosome-targeted antibiotics modulate quinary protein interactions. Biochemistry. 57 (5), 540-546 (2018).
  23. Cerofolini, L., et al. Real-time insights into biological events: in-cell processes and protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 116 (2), 239-247 (2019).
  24. Breindel, L., Burz, D. S., Shekhtman, A. Active metabolism unmasks functional protein-protein interactions in real time in-cell NMR. Communications Biology. 3, (2020).
  25. Luchinat, E., Barbieri, L., Campbell, T. F., Banci, L. Real-time quantitative in-cell NMR: ligand binding and protein oxidation monitored in human cells using multivariate curve resolution. Analytical Chemistry. 92 (14), 9997-10006 (2020).
  26. Koczula, K. M., et al. Metabolic plasticity in CLL: adaptation to the hypoxic niche. Leukemia. 30 (1), 65-73 (2016).
  27. Alshamleh, I., et al. Real-time NMR spectroscopy for studying metabolism. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (6), 2304-2308 (2020).
  28. Supuran, C. T. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators. Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (2), 168-181 (2008).
  29. Neri, D., Supuran, C. T. Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 767-777 (2011).
  30. Alterio, V., Di Fiore, A., D'Ambrosio, K., Supuran, C. T., De Simone, G. Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15 different isoforms. Chemical Reviews. 112 (8), 4421-4468 (2012).
  31. Capper, M. J., et al. The cysteine-reactive small molecule ebselen facilitates effective SOD1 maturation. Nature Communications. 9 (1), 1693 (2018).
  32. Trist, B., Hilton, J. B., Crouch, P. J., Hare, D. J., Double, K. L. Superoxide dismutase 1 in health and disease: How a front-line antioxidant becomes neurotoxic. Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).
  33. Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
  34. Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 11 (6), 1101-1111 (2016).
  35. Piotto, M., Saudek, V., Sklenár, V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. Journal of biomolecular NMR. 2 (6), 661-665 (1992).
  36. Vasa, S. K., Singh, H., Grohe, K., Linser, R. Assessment of a large enzyme-drug complex by proton-detected solid-state NMR spectroscopy without deuteration. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (17), 5758-5762 (2019).
  37. Schanda, P., Brutscher, B. Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds. Journal of the American Chemical Society. 127 (22), 8014-8015 (2005).
  38. Ogino, S., et al. Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O. Journal of the American Chemical Society. 131 (31), 10834-10835 (2009).

Tags

الكيمياء ، العدد 169 ، الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية ، في الوقت الفعلي ، المفاعل الحيوي ، دقة منحنى متعدد المتغيرات ، ربط الليغاند ، أنهيدراز الكربونيك II ، أسيتازولاميد ، ميثازولاميد ، أكسدة البروتين ، ديسموتاز الفائق الأكسيد 1 ، إبسلين
مراقبة تفاعلات البروتين والرباط في الخلايا البشرية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي الكمي داخل الخلية في الوقت الفعلي باستخدام مفاعل حيوي عالي الكثافة للخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barbieri, L., Luchinat, E.… More

Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring Protein-Ligand Interactions in Human Cells by Real-Time Quantitative In-Cell NMR using a High Cell Density Bioreactor. J. Vis. Exp. (169), e62323, doi:10.3791/62323 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter