Summary
Her præsenterer vi en protokol for kryogen prøveforberedelse og overførsel af krystaller til vakuumendestationen på beamline I23 ved Diamond Light Source til makromolekylære røntgenkrystallografieksperimenter med lang bølgelængde.
Abstract
Makromolekylær krystallografi med lang bølgelængde (MX) udnytter de uregelmæssige spredningsegenskaber af elementer, såsom svovl, fosfor, kalium, chlor eller calcium, der ofte er til stede i makromolekyler. Dette muliggør direkte strukturopløsning af proteiner og nukleinsyrer via eksperimentel fasning uden behov for yderligere mærkning. For at eliminere den betydelige luftabsorption af røntgenstråler i dette bølgelængderegime udføres disse eksperimenter i et vakuummiljø. Beamline I23 hos Diamond Light Source, UK, er det første synkrotroninstrument af sin art, designet og optimeret til MX-eksperimenter i det lange bølgelængdeområde mod 5 Å.
For at gøre dette muligt omslutter en stor vakuumbeholder alle slutstationskomponenter i prøvemiljøet. Nødvendigheden af at opbevare prøver ved kryogene temperaturer under opbevaring og dataindsamling i vakuum kræver anvendelse af termisk ledende prøveholdere. Dette letter effektiv varmefjernelse for at sikre prøvekøling til ca. 50 K. Den nuværende protokol beskriver de procedurer, der anvendes til prøveforberedelse og overførsel af prøver til vakuum på beamline I23. For at sikre ensartethed i praksis og metoder, der allerede er etableret inden for det makromolekylære krystallografisamfund, kan prøvekøling til flydende nitrogentemperatur udføres i enhver laboratorieindstilling udstyret med standard MX-værktøjer.
Kryogen opbevaring og transport af prøver kræver kun standard kommercielt tilgængeligt udstyr. Der kræves specialudstyr til overførsel af kryogent afkølede krystaller fra flydende nitrogen til vakuumendestationen. Skræddersyede prøvehåndteringsværktøjer og et dedikeret kryogent overførselssystem (CTS) er blevet udviklet internt. Diffraktionsdata indsamlet på prøver udarbejdet ved hjælp af denne protokol viser fremragende fusionsstatistikker, hvilket indikerer, at kvaliteten af prøverne er uændret under proceduren. Dette åbner unikke muligheder for in-vacuum MX i et bølgelængdeområde ud over standard synkrotronstrålelinjer.
Introduction
Langbølgelængde røntgendiffraktion bruges til at udnytte de uregelmæssige spredningsegenskaber af specifikke lysatomer, der er hjemmehørende i makromolekyler. Dette hjælper med at løse det krystallografiske faseproblem og entydigt bekræfte identiteten og placeringen af sådanne elementer inden for makromolekyler. Mens de novo-strukturer i de tidlige dage af makromolekylær krystallografi blev løst ved flere isomorfe udskiftninger1, med fremkomsten af justerbare røntgenstrålelinjer ved synkrotroner, er eksperimentel fase baseret på multibølgelængde og enkeltbølgelængde (SAD) uregelmæssige diffraktionsteknikker blevet de dominerende metoder2 . Begge metoder har historisk set været afhængige af det isomorfe eller uregelmæssige signal fra tungmetaller, som kunstigt skal indføres i krystallerne ved co-krystallisation eller krystalblødning3. Trial-and-error-tilgangen og det uforudsigelige resultat kan gøre disse eksperimenter frustrerende tidskrævende. Inkorporeringen af seleno-methionin under proteinekspression4 er en meget elegant måde at overvinde disse begrænsninger på og udnytte uregelmæssig diffraktion ved korte bølgelængder, selvom det kan være meget udfordrende i eukaryote proteinekspressionssystemer.
MX med lang bølgelængde er yderst tiltalende for strukturbestemmelse ved hjælp af native SAD-eksperimenter5,6 på grund af bekvemmeligheden ved at bruge krystaller direkte fra et vellykket krystallisationsforsøg uden yderligere behandling. Derudover åbner adgang til absorptionskanterne af elementer af høj biologisk betydning, såsom calcium, kalium, chlor, svovl og fosfor, mulighed for direkte at identificere positionerne af disse elementer i makromolekyler7,8,9,10. Ved medium og lav opløsning kan elementtildeling baseret på 2Fo-Fc elektrondensitet og kemisk miljø være vanskelig, især for elementer med tilsvarende antal elektroner eller svagt bundne ioner med delvis belægning. Disse uklarheder kan løses ved at indsamle data under og over absorptionskanten af elementet af interesse og fortolkning af den resulterende modelfasede uregelmæssige forskel Fourier-kort11,12. Lokalisering af svovlatompositioner i disse kort kan også hjælpe modelopbygning i kort over elektrondensitet med lav opløsning13. Absorptionskanterne af disse lyselementer observeres ved bølgelængder mellem λ = 3 og 6 Å (se figur 1, øverst). Dette bølgelængdeområde har været langt ud over mulighederne for enhver synkrotron MX-strålelinje, og effektiv drift i dette område kræver at overvinde flere tekniske udfordringer, som beskrevet nedenfor.
Beamline I23 ved Diamond Light Source, UK, er et unikt instrument, specielt designet til at lette MX-eksperimenter med lang bølgelængde, der kan indstilles i et bølgelængdeområde mellem λ = 1,13 og 5,9 Å (energiområde mellem E = 2,1 og 11 keV). Ved at operere i et miljø med højt vakuum14 elimineres luftabsorption og -spredning, hvilket forbedrer effektiviteten af diffraktionseksperimenter og signal-støj-forholdet. En stor vakuumendestation omslutter alle komponenterne i prøvemiljøet, herunder den halvcylindriske Pilatus 12M-detektor, et flerakset goniometer, onlinevisnings- og kollimationssystemerne samt det skræddersyede udstyr til prøveoverførsel og opbevaring (figur 2). Hvert stykke udstyr er optimeret for at sikre, at der kan indsamles data af den bedste kvalitet med lang bølgelængde. Den buede Pilatus 12M-detektor kan indsamle til diffraktionsvinkler på 2θ = ±100°, hvilket resulterer i tilstrækkeligt højopløselige diffraktionsdata selv ved længste bølgelængder (figur 1, nederst). De 120 detektormoduler er specielt udvalgt til lavenergikompatibilitet, og kalibreringer til en ekstra ultrahøj forstærkningstilstand er blevet leveret.
Den lavest mulige detektortærskel er 1,8 keV, hvilket fører til øgede hjørne- og kanteffekter for energier lavere end 3,6 keV, og kompromitteret datakvalitet ved de længste bølgelængder, især for krystaller med lav mosaik, kan observeres. Denne effekt i kombination med faldet i detektorkvanteeffektiviteten15 skal tages i betragtning, når man planlægger et eksperiment. Det fleraksede goniometer muliggør omorientering af krystaller for at muliggøre dataindsamlingsstrategier, der maksimerer kvaliteten og styrken af det uregelmæssige signal samt fuldstændigheden af de indsamlede uregelmæssige data. Prøveabsorption er en begrænsende faktor for eksperimenterne, især ved længste bølgelængder. Absorptionskorrektioner, som implementeret i almindeligt anvendte MX-behandlingssoftwarepakker16,17, fungerer godt til bølgelængder omkring 3 Å. Længere bølgelængder vil kræve analytiske absorptionskorrektioner baseret på tomografiske rekonstruktioner18 eller laserablation for at fjerne ikke-diffrakterende materiale og skære krystallerne i veldefinerede former19. Sidstnævnte vil også hjælpe med at reducere størrelsen af større krystaller, da røntgendiffraktionseksperimenter ved længere bølgelængder er mere effektive for mindre krystaller14. Udfordringen med at holde prøver ved kryogene temperaturer under dataindsamling løses ved ledende køling, da anvendelse af åbne koldgastrømsanordninger ikke er kompatible med et vakuummiljø. Derfor er termisk ledende materialer, såsom kobber, nødvendige for at forbinde prøven til et pulsrør kryokøler. SPINE-standardstifterne i rustfrit stål, der anvendes i hele MX, samt andre kommercielt tilgængelige prøvemonteringer er ikke egnede til MX med lang bølgelængde i vakuum på grund af deres dårlige varmeledningsevne.
Prøveholderne (SH'er) til MX i vakuum skal være en væsentlig del af varmefjernelsens termiske vej (figur 3A). Som sådan består de af et termisk ledende kobberlegeme og en stift og omfatter to vigtige funktioner: en stærk magnetbase for at sikre en tilstrækkelig termisk forbindelse til det kolde goniometerhoved og en prøvemontering, lavet af polyimid, for at minimere røntgenabsorption og spredning20. Der blev gjort en indsats for at sikre, at brugeroplevelsen af krystalhøstning og flashkøling er næsten identisk med den, der er forbundet med standard MX-praksis. Da de dedikerede I23 SH'er ikke er direkte kompatible med andre synkrotronstrålelinjer, anvendes en adapter i rustfrit stål til kompatibilitet med de krystalhøstende magnetiske tryllestave og eksisterende goniometergrænseflader på andre MX-strålelinjer (figur 3B). Adapteren er også vigtig for at gøre brug af automatiseringsfaciliteterne på andre Diamond MX-strålelinjer, der er baseret på ALS-type robotgriberhoveder21 og unipuck-stil baselayouts22, hvis prøvevariation kræver hurtig forscreening for udvælgelse af de bedste diffrakterende krystaller. Prøveforberedelses- og indlæsningsprotokollen kan opdeles i to faser:
Trin 1: Høst af krystaller og flashfrysning udført af brugere i deres egne laboratorier
Efter vurdering af projektets egnethed til I23-dataindsamling sendes prøveholdere med sløjfer, der matcher krystalstørrelserne (formonteret med adaptere), til brugerlaboratorier til krystalhøstning. For at undgå skader bør SH'er og adaptere ikke adskilles og skal anvendes som én enhed med henblik på fiskeri af krystaller med løkker af passende størrelse ved hjælp af standardmagnetstave til krystalhøstning. Som det er almindeligt i MX, udføres denne opgave manuelt under mikroskopet, og krystaller lynkøles straks i en skumafgang med flydende nitrogen23. På grund af en uoverensstemmelse mellem magnetiske kræfter er SH'erne i øjeblikket ikke kompatible med unipucks. Opbevaring og forsendelse realiseres ved hjælp af kamipucks (se materialetabellen), som er tilgængelige for brugerne efter anmodning sammen med de kompatible tørafsenderindsatser (figur 3C). Disse pucks deler den samme bundplade med de meget anvendte unipucks og tillader hurtig forscreening af prøver på andre Diamond MX beamlines. Udlån af dette udstyr til brugerne er i øjeblikket det bedste arrangement, indtil de skræddersyede prøveholdere er kommercielt tilgængelige. Transport til beamline kræver de standard tørafskibere, der anvendes i MX-fællesskabet.
Trin 2: Overførsel af kryokølede prøver til vakuumendestationen
Når prøverne ankommer til strålelinjen, forberedes de til overførsel til vakuumendestationen. Dette indebærer fjernelse af SH'er fra kamipucks og adskillelse fra adaptere. Introduktion af biologiske prøver til vakuum udføres rutinemæssigt inden for kryo-elektronmikroskopi. Nogle af de veletablerede koncepter blev tilpasset til I23-prøveoverførslen. Kort sagt overføres SH'er under flydende nitrogen til overførselsblokke (figur 3D). Disse blokke har fremragende varmeledningsevne og en betydelig termisk masse, hvilket forhindrer krystallerne i at nå glasovergangstemperaturen, når de er i vakuum. Op til fire blokke med en kapacitet på fire prøver hver lægges under flydende nitrogen i en blokpuck (figur 3H), som enten anvendes til overførsel af prøver til det kryogene overførselssystem (CTS) eller til opbevaring i flydende nitrogendewars mellem eksperimenter.
Det kryogene overførselssystem, der er udviklet på Diamond Light Source, består af to underenheder, prøvestationen og rumfærgen (figur 4A). Prøvestationen består af et flydende nitrogenbad til midlertidig opbevaring af proteinkrystaller og har særlige egenskaber, der sikrer sikkerhed og giver mulighed for en brugervenlig oplevelse (figur 5). CTS styres af en programmerbar logisk controller via en brugervenlig berøringsskærmsgrænseflade. Prøvestationen har indbyggede lysdioder for bedre visualisering og et sæt varmeapparater, der styres i tæt kredsløb for at automatisere tørringen af det flydende nitrogenbad, når prøverne er overført. Det har også en række sensorer for at sikre systemets sikkerhed og effektive funktion. Prøvestationen har skræddersyet hardware til at give en pålidelig elektrisk grænseflade til at interagere med rumfærgen til operationer, såsom pumpning ned til groft vakuum til prøveoverførsel samt overvågning af flydende nitrogenniveauer og temperaturen inde i rumfærgen.
Rumfærgen (figur 6) er en bærbar enhed, der bruges til at opfange en overførselsblok fra prøvestationens flydende nitrogenbad og overføre den inde i et kryogent og vakuummiljø til slutstationen. Det inkluderer en flydende nitrogen dewar for at holde prøverne kolde under overførsel, væskestandsovervågning i dewaren og en række sensorer til drift og brugersikkerhed. Overføringsarmen er udstyret med et magnetisk drev og inkluderer bearbejdede riller til at guide brugerne i sikker på- og aflæsning af overføringsblokke til slutstationen. Overførsel fra rumfærgen til vakuumbeholderen foregår via en luftsluse. Luftslusen er en grænseflade til rumfærgen på slutstationen, der bruges til at evakuere mellemrummet mellem rumfærgen og slutstationen, inden rumfærgen og slutstationens vakuumventiler åbnes. Pumpe- og udluftningssekvenserne er fuldautomatiske og kan betjenes via en stor berøringsskærm med en brugervenlig grænseflade (figur 4C). Den nuværende protokol bruges til at overføre en thaumatinkrystal til vakuumslutstationen til dataindsamling.
Protocol
1. Krystal høst
BEMÆRK: Brug passende personlige værnemidler: beskyttelsesbriller og handsker, hvor det er muligt.
- Når SH'erne ankommer til brugerlaboratoriet i kamipucks (figur 3C), adskilles låget fra bunden af kamipucken, således at SH'erne forbliver fastgjort til basen, og hætteglas bevares i låget.
- Sænk låget med hætteglas i flydende nitrogen. Fastgør en SH + adapter (figur 3B, højre) til en magnetstav, og høst krystaller som normalt.
- Flashkøl hver prøve direkte ind i kamipucken, især opmærksom på prøvepositionen. For at lukke pucken skal du bruge en puckstav til at fastgøre basen til låget.
- Overfør kamficken fra flydende nitrogen til tørskiberen eller flydende nitrogenopbevaringsdewar. Send den tørre afsender til Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).
2. Prøveoverførsel til vakuum
- Indlæsning af SH fra kamipuck til overførselsblokken
- Anbring bunden af blokpucken (figur 3H), der allerede er befolket med tomme overføringsblokke (figur 3D), på dens støttebase inde i det flydende nitrogen i en skumbeholder (figur 3J-b).
BEMÆRK: Overføringsblokkenes orientering er vigtig for nøjagtigheden af prøveoverførslen inde i vakuumbeholderen. Som sådan skal blokkene placeres på blokpuckbasen og sørge for, at stiften markeret med en pil i figur 3D er til venstre for blokken. - Anbring hætteglaspucken i skumbeholderen fyldt med flydende nitrogen, og sørg for, at puckens bund er fastgjort til magnetholderen inde i skumbeholderen (figur 3J-a).
- Forkøl alle nødvendige værktøjer i flydende nitrogen. Brug puckseparatorværktøjet vist i figur 3G på den høje indstilling H til at adskille låget fra bunden, således at basen forbliver fastgjort til magnetholderen, og SH'erne udsættes inde i det flydende nitrogen.
- For at fjerne hver SH fra sin adapter skal du bruge separatorstaven (figur 3F) til at samle SH'en op fra kamduckbasen og placere den i den passende position af overføringsblokken i karrusellens vandrette position i figur 3J-b.
- Placer separatorstaven over SH + adapteren så langt ned, som den kan gå, og sørg for, at staven er lodret, for at undgå at røre ved prøven.
- Flyt det lille håndtag på separatorstaven ned med tommelfingeren, indtil den klikker, for at fastgøre SH'en indeni og trække SH'en ud af adapteren.
- Sænk separatoren over den ønskede blokposition, og sørg for, at en af de tre stifter passer ind i blokkens centrale hul.
- Slip SH'en ved at flytte håndtaget op igen. Gentag disse trin for hver SH.
- Hvis du vil indlæse prøver i den næste prøveblok, skal du bruge karruselnøgleværktøjet (figur 3E) til at rotere en tom blok i vandret position.
- Fastgør puckseparatorværktøjet vist i figur 3G ved hjælp af den lave indstilling L til låget på blokpucken ved at skrue med uret.
- Når alle SH'er er overført, skal du placere låget i flydende nitrogen for at lukke blokpucken og vente på, at temperaturen udlignes, og derefter montere låget over bunden som i figur 3I. Løft forsigtigt med separatorværktøjet for at frigøre det fra karrusellen.
- På dette stadium kan blokpucken overføres til CTS (figur 4B) eller til en flydende nitrogenlagringsdewar.
- Anbring bunden af blokpucken (figur 3H), der allerede er befolket med tomme overføringsblokke (figur 3D), på dens støttebase inde i det flydende nitrogen i en skumbeholder (figur 3J-b).
- Lastning af overføringsblokke i vakuumbeholderen
- Sørg for, at rumfærgen er sikkert fastgjort til stationen. Åbn nitrogengas- og luftventilerne, og sørg for, at gasserne strømmer. Tænd for CTS.
- Hvis der ikke er nogen advarselsmeddelelser på displayet, skal du fortsætte med at køle både badet og rumfærgen ned med flydende nitrogen. Placer den medfølgende tragt i påfyldningsporten på rumfærgen, og hæld langsomt flydende nitrogen i tragten, mens du overvåger niveauet på skærmen. Stop, når indikatoren skifter fra rød til blå.
BEMÆRK: Rumfærgen er klar til brug, når temperaturen på det kolde sæde, der vises på berøringsskærmen, er under 100 K. Prøvestationsbadet kan fyldes samtidigt ved hjælp af den korrekte tragt til det niveau, der er markeret på badets væg eller 100% på displayet med flydende nitrogenniveau. Flydende nitrogenniveauer og temperatursensorer skal overvåges konstant under hele driften; flere påpånninger vil være påkrævet. - Når rumfærgens kolde sædetemperatur er under 100 K, og flydende nitrogenniveauer på rumfærgen og badet stabiliseres, skal du overføre en blokpuck fra flydende nitrogen til CTS-badet ved hjælp af det vedhæftede puckseparatorværktøj. Fjern låget på blokpucken, og luk låget på CTS-badet.
- For at indføre en blok i rumfærgen skal du åbne CTS-ventilen, hvis den ikke allerede er åben, ved at trykke på knappen Åbn shuttleventil på displayet. Lås rumfærgehåndtaget op ved at dreje 90° med uret, og fremryk det mod badet, så det guidede spor på håndtaget håndhæver den korrekte rejsevej mod badet. Når blokdækslet er synligt inde i badet, skal du lade dækslet køle af. Når boblen af flydende nitrogen omkring dækslet er stoppet, skal du gå videre til overførselsblokken.
- For at låse overføringsblokken på rumfærgen skal du dreje håndtaget 180° med uret.
- Træk håndtaget tilbage til den oprindelige rygposition, og 'Lås' det derefter på plads ved at dreje 90° mod uret.
- Tryk på Luk shuttleventil og pumpe på displayet for at starte evakuering af rumfærgen.
- Når meddelelsen Shuttle klar til at løsne vises på berøringsskærmen, skal du trykke på håndtaget under rumfærgen og forsigtigt løfte den ved hjælp af håndtaget øverst.
- Bær rumfærgen til luftslusen på vakuumendestationen i opretstående stilling.
- Fastgør rumfærgen til luftslusen på vakuumendestationen.
BEMÆRK: Når den er sikkert fastgjort, bekræfter berøringsskærmen på slutstationen status for rumfærgen og låsen. - Vælg en tom blokposition i beholderen ved at trykke på den tilsvarende knap på berøringsskærmen og flytte prøvehotellet til den korrekte lasteposition.
- Når prøvehotellet er på plads, bliver knappen Åbn aktiv. Tryk på denne knap for at starte vakuumlåsningssekvensen.
BEMÆRK: Pumpen starter, og fremskridtene vises på skærmen. Dette kan tage op til to minutter at gennemføre. - Når sekvensen er afsluttet, ændres status til Airlock åben, overførsel i gang. Drej håndtaget 90° med uret for at låse stangen op, og skub forsigtigt stangen ind i karret, så det guidede spor igen håndhæver den korrekte rejsevej mod prøvehotelpositionen. Brug videofeedet, der vises på skærmen til vejledning, til langsomt at indsætte blokken i hotellet, og sikre, at blokpositionslyset på berøringsskærmen er aktiveret. Når det er aktiveret, skal du dreje håndtaget 180° mod uret for at frigøre blokken og trække stangen ud af beholderen. Når håndtaget er trukket helt tilbage, skal du dreje håndtaget 90° mod uret for at låse stangen.
- Når stangen er låst, bliver knappen Luk aktiv. Tryk på dette for at lukke slutstationens vakuumventil, og udluft mellemrummet mellem rumfærgen og beholderen til atmosfærisk tryk og vente i op til 20 s for færdiggørelse.
- Vent på, at displayet viser status okay for at fjerne shuttle , når sekvensen er afsluttet. På dette tidspunkt skal du fjerne rumfærgen og vende tilbage til CTS for at gentage processen for den næste blok.
- For at forberede den næste blok til overførsel skal du dreje blokpucken inde i badet. Skub den indbyggede rotationsnøgle på toppen af akryllåget ned i låsen i midten af blokpucken. Mens du holder den nede, skal du dreje nøglen for at placere den ønskede blok i afhentningspositionen.
- Når alle blokke er blevet overført, skal du sørge for, at shuttleventilen er åben, mens den er monteret på CTS. Tryk på bageknappen på berøringsskærmen, og vælg både bad og shuttle, og tryk derefter på bagning.
BEMÆRK: Dette opvarmer både rumfærgen og badet for at koge det flydende nitrogen af og efterfølgende fordampe eventuel akkumuleret is/kondens inden næste brug. Når bagningen er startet, kan gassen og luften slukkes.
Representative Results
En thaumatinkrystal blev introduceret til vakuumendestationen ved hjælp af protokollen skitseret ovenfor. Diffraktionsdata blev indsamlet ved en bølgelængde på 2,7552 Å (E = 4500 eV) som 3600 billeder med en rotationsforøgelse på 0,1° og 0,1 s eksponering pr. billede. Strålestørrelsen blev justeret til 150 μm x 150 μm og reduceret til 10% transmission med en tilsvarende fluxmåling på 7,1 x 109 fotoner/s. Valget af λ = 2,7552 Å er baseret på et kompromis mellem stigningen i uregelmæssige signal- og prøveabsorptionseffekter og faldet i opløsning til længere bølgelængder. Selvom det ikke er tæt på den teoretiske absorptionskant af svovl (λ = 5.0095 Å), ved denne bølgelængde, er det imaginære bidrag til spredningsfaktoren for svovl f" 1.57 e- , en faktor på 1.6-2.1 større sammenlignet med bølgelængder mellem 1.7 og 2 Å. De resulterende stærkere uregelmæssige signaler muliggør vellykket S-SAD-fasning til mere udfordrende projekter.
En række vanskelige faseforsøg er allerede blevet udført på beamline I2324,25,26,27, med data indsamlet ved denne bølgelængde. Mens fasning af S-SAD er mulig ved hjælp af meget kortere bølgelængder, kræver dette ofte opbygning af uregelmæssigt signal gennem fletning af data fra mange isomorfe krystaller for at nå multiplicitetsværdier over 10028. På grund af det forbedrede uregelmæssige signal ved længere bølgelængder krævede de fleste faseprojekter, der blev løst på I23, kun data fra en krystal. Et repræsentativt diffraktionsbillede er vist i figur 7, til venstre. Databehandling ved hjælp af Xia2-3dii29 gav fremragende sammenlægningsstatistikker som beskrevet i tabel 1. Figur 7, til højre, viser en del af et repræsentativt diffraktionsbillede fra thaumatindatasættet og illustrerer den lave baggrund omkring Bragg-refleksionerne, hvilket bidrager til de store I/σ(I)-værdier, der typisk observeres i vakuumopsætningen, hvilket sikrer, at kun røntgenstråler spredt af prøven når detektoren.
Den maksimalt opnåelige opløsning på 1,8 Å skyldes detektorgeometrien og den valgte bølgelængde af røntgenstrålingen. Datasættet gav et meget stærkt unormalt signal, hvilket afspejles i midten af hældningen af den unormale normale sandsynlighedsparameter på 2.677, hvilket letter strukturløsningen ved hjælp af den automatiske fasepipeline CRANK2. Den høje kvalitet af det resulterende elektrondensitetskort muliggjorde en vellykket automatisk modelopbygning af Buccaneer30-modulet i CRANK231 med korrekt placering for 100% af aminosyresekvensen af thaumatin. Den fasede uregelmæssige forskel Fourier-kortet, beregnet med ANODE11, afslører 16 meget velordnede svovlatomer og et svovlatom fra Cys159 med to alternative konformationer, som bekræftet af de 18 signifikante højder af toppe ved positionerne af de uregelmæssige spredere i tabel 2. De 16 cysteinrester i thaumatin danner 8 disulfidbroer, som alle er tydeligt synlige på 2Fo-Fc-kortet (figur 8).
Figur 1: Diffraktionsdata i høj opløsning fra MX-eksperimenter med lang bølgelængde. A) Afbildning af f"-værdier i forhold til energi, der angiver absorptionskanter for lyselementer, der er tilgængelige på strålelinje I23. (B) Maksimal opløsning, der kan opnås i hjørnerne af P12M-detektoren mod energi. Forkortelse: MX = makromolekylær krystallografi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vandret sektion gennem vakuumbeholderen med alle komponenterne i slutstationen. Forkortelse: OAV = visningssystem på aksen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Prøvehåndteringsværktøjer. (A) I23 Prøveholder. (B) MX spine-standardstift (venstre) ved siden af en I23-prøveholder med adapter (højre). C) Kamudsug og bund med I23-prøveholdere (blå). Bloker pucklåg og base med to overførselsblokke (guld). En tør afsenderstok, der er kompatibel med både kamipucks og blokpucks, er synlig bagpå. D) Overførselsblok med fire I23-prøveholdere. (E) Nøgleværktøj, der anvendes til rotation af blokpuckbasen. (F) Separatorstav. (G) Puckseparatorværktøj med to pile, der viser de høje og lave indstillinger. (H) Bloker puckbasen med fire tomme Cu-blokke. (I) Låg til blokpucken. (J) Skumbeholder med alt nødvendigt værktøj til overførsel af prøveholdere fra kamipuckbaser til kobberblokke. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kryogent overførselssystem. A) CTS-prøvestation med shuttle monteret og tragte, der anvendes til påfyldning. (B) En blokpuck med to overførselsblokke placeret inde i CTS. (C) CTS-kontrolsoftwarens berøringsskærm. Forkortelse: CTS = Kryogent overførselssystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Prøvestation for kryogent overførselssystem. Forkortelser: LED'er = lysemitterende dioder; LN2 = flydende nitrogen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kryogen overførselssystem shuttle. Forkortelser: LED'er = lysemitterende dioder; LN2 = flydende nitrogen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Diffraktionsbilleder. Til venstre et diffraktionsbillede fra datasættet indsamlet på thaumatinkrystallen. Til højre, et diffraktionspunkt omgivet af baggrundspixels med lavt antal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Strukturopløsning af Thaumatin med automatisk rørledning CRANK2 (standardindstillinger, ingen efterfølgende forfining). (A) Oversigt over thaumatin med 2Fo-Fc-kort ved 1,6σ (blå) og faseinddelt uregelmæssig forskel Fourier-kort ved 5σ beregnet i ANODE (grøn). (B) Oversigt over thaumatin, der kun viser den faseinddelte uregelmæssige forskel Fourier-kort ved 5σ. (C) Nærbillede af en disulfidbro til stede i thaumatin med 2Fo-Fc-kort på 1,6σ (blå) og faset uregelmæssig forskel Fourier-kort på 5σ. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn | Thaumatin |
| Dataindsamlingsbølgelængde (Å) (energi (eV)) | 2.7552 (4500) |
| Antal billeder x kilestørrelse (°) | 3600 x 0,1 |
| Rumgruppe | P 41212 |
| Enhedscellekonstanter | |
| (a = b, c) (Å) | 57.8, 150.2 |
| (α = β = γ) (°) | 90 |
| Opløsning (Å) | 150.22–1.80 (1.84–1.80) |
| Fuldstændighed | 96.3 (81.1) |
| Isa | 36.48 |
| Rmeas | 0.042 (0.118) |
| Rpim | 0.01 (0.049) |
| CC1/2 | 1 (0.989) |
| I/σ(I) | 57.9 (14.7) |
| Mangfoldighed | 15.0 (5.4) |
| Midt i hældningen | 2.677 |
Tabel 1: Dataindsamling og behandlingsstatistik for Thaumatin ved 2.755 Å bølgelængde ved beamline I23, DLS. For opløsning, fuldstændighed, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/ σ(I) og mangfoldighed vises skaller med høj opløsning i parentes. Forkortelse: DLS = Diamond Light Source.
| Nærmeste atom | Højeste højde (sigma) |
| CYS9 | 25.83 |
| CYS56 | 25.03 |
| MET112 | 24.54 |
| CYS149 | 24.37 |
| CYS126 | 24.21 |
| CYS145 | 24.2 |
| CYS134 | 23.6 |
| CYS177 | 23.48 |
| CYS204 | 23.43 |
| CYS66 | 23.17 |
| CYS164 | 22.54 |
| CYS193 | 22.15 |
| CYS158 | 21.51 |
| CYS77 | 21.21 |
| CYS121 | 20.8 |
| CYS71 | 19.17 |
| CYS159_1 | 12.27 |
| CYS159_2 | 8.34 |
Tabel 2: Uregelmæssig forskel Fourier kortlægger tophøjder som beregnet af ANODE ved hjælp af den faseinddelte og automatisk byggede model fra CRANK2.
Discussion
Den nuværende protokol er udviklet til at overholde kravene til prøveforberedelse for MX-eksperimenter med lang bølgelængde i vakuum på beamline I23. Det har været i brug på beamline i det forløbne år og har bidraget til en vellykket gennemførelse af flere projekter. Som det fremgår af de resultater, der præsenteres her, muliggør protokollen en sikker og pålidelig overførsel af prøver til vakuumslutstationen, samtidig med at deres diffraktionskvalitet bevares. Det er et vigtigt aspekt for strålelinjedriften og vil blive ledsaget af personlig brugeruddannelse af beamline-personale. Nogle af trinnene er værd at fremhæve som afgørende for en vellykket og sikker gennemførelse af proceduren: Overførsel af prøver fra kamipuckbaser til prøveblokke kræver nøjagtighed og opmærksomhed for at undgå at beskadige prøver (se trin 2.1.4); det er vigtigt at overvåge niveauet af flydende nitrogen i alle faser for at forhindre, at prøver udsættes for luft eller er i tæt kontakt med dele, der ikke er korrekt afkølet (2.1.3 og 2.2.2) vente, indtil Luk-sekvensen (2.2.14) er helt færdig, før rumfærgen fjernes fra slutstationen (2.2.15), for at undgå nedbrydning af slutstationsvakuummet.
Udformningen af protokollen blev indledt sammen med en ingeniørindsats med det formål at udvikle specialbygget udstyr til overførsel af proteinkrystaller til vakuummiljøet. De endelige produkter af dette projekt var CTS og de tilhørende prøvehåndteringsværktøjer beskrevet ovenfor. CTS er en betydelig forbedring i forhold til forgængeren, Leica EM VCT10014, og fjerner flere begrænsninger, såsom manglen på prøveafskærmning og vakuummiljø under overførsel, isopbygning inde i det flydende nitrogenbad og fraværet af en intuitiv brugergrænseflade og sikkerhedsfunktioner. Yderligere funktioner i CTS, der forbedrer brugeroplevelsen, er temperatur- og væskeniveauovervågning inde i rumfærgen og prøvestationen, et bad med større kapacitet med plads til fire blokke samtidigt i stedet for en og en selvstyret mekanisme til shuttle-operationen. CTS er fuldt integreret i beamline-styresystemet med en brugervenlig berøringsskærmsgrænseflade og forbedret vakuum- og mekanisk sikkerhed ved grænseflade med slutstationen.
Beamline I23 er det første MX-synkrotroninstrument med lang bølgelængde af sin art, og som sådan har det krævet en betydelig indsats at indføre proteinkrystaller i et miljø med højt vakuum og opbevare dem ved kryogene temperaturer. Forbedringer af prøveforberedelsesværktøjerne og protokollen samt bestræbelserne på at strømline processerne er i gang. Som en del af brugersupporten står beamline-medarbejdere altid til rådighed for at hjælpe med fejlfinding. Et eksempel på et sådant scenario ville være problemer, der kompromitterer vakuumsystemets integritet, hvilket fører til vanskeligheder med at fastgøre eller fjerne rumfærgen til/fra enten CTS- eller slutstationsluftslusen. Forskellige niveauer af test udføres ugentligt og dagligt, og brugeruddannelsen vil omfatte yderligere kontroller for at undgå potentielle fejl, såsom visuel inspektion af O-ringene på de grænseflader, rumfærgen er fastgjort til. Mens vakuummiljøet åbner mulighed for at udføre diffraktionseksperimenter i et bølgelængdeområde, der ikke er tilgængeligt ved andre strålelinjer, reducerer det ekstra overførselstrin den samlede prøvegennemstrømning.
Den manuelle overførsel med kun fire prøver pr. overførselsblok og op til fem blokke inde i vakuumbeholderen begrænser den samlede kapacitet til 20 prøver. For projekter med en stor prøve til prøvevariabilitet bør prøver derfor forscreenes ved Diamond high-throughput beamlines, og derefter bør kun de mest lovende prøver overføres til det efterfølgende optimerede langbølgelængdeeksperiment. Mens prøveholderne og overførselsblokkene er uændrede fra deres oprindelige introduktion for et par år siden, er de håndteringsværktøjer, der præsenteres her, alle nye udviklinger. De dedikerede I23-prøveholdere er uforanderlige på grund af deres rolle i kølekonceptet for beamline. Som sådan havde designet af prøvehåndteringsværktøjerne til formål at skabe en forbindelse mellem denne nye type holder og standard kommercielt tilgængelige værktøjer, som MX-brugerfællesskabet havde vedtaget i lang tid, såsom kamipucks, krystalhøstestave og tørafsendertransportsystemet. Deres design involverede betydelig konsultation med brugerfællesskabet og krævede flere iterationer for at fuldføre. Det udstyr, værktøjer og protokol, der præsenteres her, repræsenterer et simpelt og robust system til overførsel af brugerprøver til eksperimenter ved beamline I23 ved Diamond Light Source. Dette instrument til in-vacuum makromolekylær krystallografi med lang bølgelængde åbner nye muligheder for strukturel biologi.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha og Kevin Wilkinson for deres støtte til udviklingen af Cryogenic Sample Transfer System (CTS). Dette arbejde blev finansieret af iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansieret af Europa-Kommissionens Horisont 2020-program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12M detector | Dectris, Switzerland | single-photon-counting X-ray detector | |
| CombiPuck | MiTeGen | SKU: M-CBP-P1 | Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Crystal-harvesting magnetic wand | Molecular Dimensions | MD7-411 | Used for harvesting crystal |
| Dry Shipper (CX100) | Molecular Dimensions | MD7-21 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) | MiTeGen | SKU: M-CBP-PTC1 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Kapton polyimide | sample mount made of Kapton polyimide | ||
| Perpsex lid | acrylic lid with built-in rotation key | ||
| Thaumatin powder | Sigma-Aldrich | T7638 | Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion |
References
- Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287 (1954).
- Hendrickson, W. A. Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation. Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).
- Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
- Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).
- Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).
- Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S.
- Rozov, A. Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction. Nature Communications. 10 (1), 2519 (2019).
- Rocchio, S., et al. Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).
- Langan, P. S., et al. Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels. Nature Communications. 9 (1), 4540 (2018).
- Lolicato, M., et al. K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions. Science Advances. 6 (44), (2020).
- Thorn, A., Sheldrick, G. M. ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation. Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).
- Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography. Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).
- Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters. Nature Communications. 9 (1), 550 (2018).
- Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V.
- Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector. Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).
- Kabsch, W.
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
- Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples. Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).
- Kitano, H., et al. Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).
- Mykhaylyk, V., Wagner, A. Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum. Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010 (2013).
- Snell, G., et al. Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source. Structure. 12 (4), 537-545 (2004).
- The universal container project. , Available from: https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/ (2020).
- Teng, T. Y., et al. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film. Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).
- Esposito, D., et al. Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3. Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).
- O'Donnell, J. P., et al. The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion. eLife. 9, 57887 (2020).
- Mishra, A. K., et al. Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38. Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).
- Rudolf, A. F., et al. The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism. Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).
- El Omari, K., et al. Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).
- Winter, G. XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Cowtan, K. The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).
- Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4 (1), 2777 (2013).
