Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att analysera ultrastructure av megakaryocyterna in situ med hjälp av överföring elektronmikroskopi (TEM). Murin benmärg samlas in, fixas, bäddas in i epoxiharts och skärs i ultrathin sektioner. Efter kontrastfärgning observeras benmärgen under ett TEM-mikroskop vid 120 kV.
Abstract
Differentiering och mognad av megakaryocyter förekommer i nära samband med cellulära och extracellulära komponenter i benmärgen. Dessa processer kännetecknas av det gradvisa utseendet av väsentliga strukturer i megakaryocytcytplasman såsom en polyploid och polylobulated kärna, ett internt membrannätverk som kallas avgränsning membransystem (DMS) och de täta och alfagranulat som finns i cirkulerande trombocyter. I den här artikeln beskriver vi ett standardiserat protokoll för in situ ultrastructural studie av murine megakaryocyter med hjälp av överföring elektronmikroskopi (TEM), vilket möjliggör identifiering av viktiga egenskaper som definierar deras mognadsstadium och cellulära densitet i benmärgen. Benmärgar spolas, fixeras, dehydreras i etanol, bäddas in i plastharts och monteras för att generera tvärsnitt. Halvtunna och tunna sektioner är förberedda för histologiska respektive TEM observationer. Denna metod kan användas för alla benmärgsceller, i alla EM-anläggningar och har fördelen att använda små provstorlekar som möjliggör kombinationen av flera bildframställningsmetoder på samma mus.
Introduction
Megakaryocyter är specialiserade stora polyploida celler, lokaliserade i benmärgen, ansvariga för trombocytproduktion1. De härstammar från hematopoetiska stamceller genom en invecklad mognadsprocess, under vilken megakaryocytprekursorer gradvis ökar i storlek, samtidigt som de genomgår omfattande samtidiga morfologiska förändringar i cytoplasman och kärnan2. Under mognad utvecklar megakaryocyter ett antal urskiljbara strukturella element, inklusive: en polylobulerad kärna, invaginationer av ytmembranet som bildar avgränsning membranet (DMS), en perifer zon utan organeller omgiven av det aktinbaserade cytoskeletala nätverket och många organeller inklusive α-granuler, täta granulat, lysosomer och flera Golgi-komplex. På den strukturella nivån är en större modifiering som observeras den cytoplasmiska compartmentalizationen i diskreta regioner avgränsade av DMS3. Denna omfattande tillförsel av membran kommer att driva förlängningen av långa cytoplasmiska processer i den inledande fasen av trombocytproduktionen, som sedan kommer att omvandlas till trombocyter inuti cirkulationen. Eventuella defekter under megakaryocytdifferentiering och mognad kan påverka trombocytproduktionen när det gäller trombocytantal och/eller trombocytfunktion.
Tunt lager transmission elektronmikroskopi (TEM) har varit den bildframställningsmetod som valts i årtionden vilket ger högkvalitativ ultrastruktur av megakaryocyter som har format vår förståelse av fysiologin hos trombopoiesis4,5. Detta dokument fokuserar på en standardiserad TEM-metod som gör det möjligt att fånga processen av trombocyt biogenes som förekommer in situ inom den inhemska benmärg mikromiljön, som också kan tjäna som grund för att analysera någon benmärg cell typ. Vi ger strukturella exempel på utvecklingen av megakaryocyter från omogna till fullt mogna, vilket förlänger cytoplasmiska processer till mikrocirkulationen av sinusoider6. Vi beskriver också ett enkelt förfarande för att kvantifiera de olika megakaryocyt mogna stadierna, instruera om regenerering och trombocyt produktionskapacitet benmärgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med europeiska standarder 2010/63/EU och CREMEAS Committee on the Ethics of Animal Experiments vid universitetet i Strasbourg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Protokollet visas schematiskt i figur 1.
1. Insamling och fixering av benmärg (figur 1A)
VARNING: Denna procedur omfattar cancerframkallande, mutagena och/eller giftiga ämnen och utförs under en kemisk extraktionshuv. Använd lämplig skyddsutrustning som handskar och skyddsglasögon.
- Förbered den fixativa lösningen bestående av 2,5% glutaraldehyd i cacodylatebuffert (se Kompletterande fil).
- Benmärg samling
- Använd vuxna C57BL/6 möss av båda könen 12-18 veckor. Avliva mössen genom CO2 kvävning och livmoderhalscancer förskjutning.
- Skär huden runt låret med en tunn sax och använd pincett för att skala av huden. Ta bort tassens extremitet och skär sedan mellan höften och låret. Lös skenbenet från lårbenet genom att skära vid knäledsledikulationen och avlägsna vidhäftande vävnad på skenben och lårben med hjälp av en skalpell.
- Ta bort epifyserna med ett vasst rakblad. Medan du håller lårbenet med pincett, använd en 5 ml spruta fylld med cacodylate buffert med en 21 G nål för att spola benmärgen i ett 15 ml rör fyllt med 2 ml cacodylate buffert. För att göra det, sätt in nålens avfasning i benmärgsöppningen och tryck långsamt kolven tills märgen utvisas.
- Benmärg fixering genom snabb nedsänkning i fixativ.
- Omedelbart efter spolning, använd en plastpipett för att överföra benmärgscylindern till 1 ml färsk glutaraldehydfixativ lösning (tidigare beredd i 1.1) i 60 min vid rumstemperatur.
OBS: För att bevara vävnaden, se till att hela processen, från ben dissekering till fixeringssteget, slutförs på mindre än 10 min. För fixeringen, se till att fixeringslösningen är i rumstemperatur för att undvika värmestöt.
- Omedelbart efter spolning, använd en plastpipett för att överföra benmärgscylindern till 1 ml färsk glutaraldehydfixativ lösning (tidigare beredd i 1.1) i 60 min vid rumstemperatur.
2. Inbäddning av benmärg i agaros
OBS: Märgvävnad är inte tillräckligt sammanhållen för att upprätthålla sin integritet under de olika tvättstegen och material kan lätt gå förlorade. För att övervinna detta problem är märgen täckt i en gel av agar före uttorkning.
- Förbered agaroselösningen enligt beskrivningen i tilläggsfilen.
- Tvätta den fasta märgen från sektion 1.3 i cacodylatbuffert och överför den försiktigt till en glasrutschbana med en plastpipett. Använd en varm pipett och applicera snabbt en droppe 2% flytande agar på benmärgscylindern.
OBS: Agaren stelnar snabbt under kylning. För att säkerställa en homogen täckning av benmärgen måste agarlösningen hållas varm tills den deponeras på glidbanan. - Placera snabbt glidningen snabbt på is tills agaren stelnar (1-2 min).
- Under ett mikroskop, använd ett skarpt rakblad för att skära och kassera extremiteterna i benmärgscylindern på grund av eventuell vävnadskomprimering i dessa områden. Överför märgblocken i 1,5 ml mikrocentrifugerör som innehåller 1 ml cacodylatbuffert.
3. Inbäddning av benmärg i harts
VARNING: Hartskomponenter är giftiga; vissa är cancerframkallande och måste hanteras varsamt under en kemisk extraktionshuv. Använd lämplig skyddsutrustning som handskar och skyddsglasögon. Osmium tetroxid är mycket flyktigt vid rumstemperatur och dess ångor är mycket skadliga för ögon, näsa och hals. Innan 2% osmium tetroxid kasseras måste neutraliseras genom att tillsätta dubbelt så mycket vegetabilisk olja.
- Förbered epoxihartset enligt beskrivningen i tilläggsfilen.
- Inbäddning av harts
OBS: Förvara proverna i samma mikrocentrifugerör under inkubationer i på varandra följande bad av osmium, uranylacetat och etanol. Aspirera supernatanterna med en Pasteur pipett. Den lösningsvolym som används för varje bad skall motsvara minst 10x provets volym.- Efterfixera blocken med 1% osmium i cacodylatbuffert i 1 h vid 4 °C, tvätta en gång i cacodylatbuffert och sedan en gång i destillerat vatten.
- Fläcka med 4% uranylacetat i destillerat vatten i 1 h, tvätta två gånger i destillerat vatten.
- Dehydrera genom en graderad serie etanol i destillerat vatten: 4 gånger i 75% etanol i 5 min, följt av 3 gånger i 95% etanol i 20 min och sedan 3 gånger i 100% etanol i 20 min. Ta i detta steg en spruta epoxiharts ut från frysen.
OBS: Protokollet kan pausas i 100% etanol i 1 h. - För att få enhetlig infiltration och polymerisation av epoxiharts inuti märgen, inkubera först blocken i 2 på varandra följande bad av propylenoxid i 15 min.
- Tillsätt en 1:1 blandning av 100% propylenoxid och epoxiharts och inkubera i 1 h. Placera proverna på en långsam roterande skakapparat vid rumstemperatur.
- Tillsätt 100% epoxiharts lämna provet för inkubation över natten under agitation.
- Tillsätt 100% epoxiharts för 2 h inkubation, fortfarande under omrörning.
- Under ett mikroskop placerar du märgblocken i platta silikonformar. Orienteringsprover för att möjliggöra efterföljande tvärgående sektionering av hela benmärgen. Fyll formarna med epoxiharts och placera dem vid 60 °C i 48 timmar.
OBS: Alla lösningar (utom etanol och propylenoxid) filtreras genom 0,22 μm-filter för att undvika provkontaminering. För att säkerställa adekvat polymerisation av hartset, undvik bubblor medan du fyller formarna.
4. Ultrathin-sektionering (bild 1B)
OBS: Transmission EM kräver tunna vävnadssektioner genom vilka elektroner kan passera som genererar en projektionsbild av insidan av celler, struktur och organisation av inre organeller (granuler, endoplasmiskt retikulum, Golgi) och arrangemanget av intracellulära cellmembran.
- Montera provblocket i ett ultramikrotomstöd. Sätt den på provhållaren. Trimma proverna vid 45° för att avlägsna överskottet av harts runt vävnaden med en roterande diamant eller volframfräs.
- Montera proverna på ultramicrotomen med ett diamantknivblad utrustat med en vattentank. Kapa tvärgående sektioner på 500 nm respektive 100 nm tjocklek för histologiska respektive TEM analyser. Samla flytande sektioner på vattenytan med en slinga.
- Sätt den 500 nm tjocka sektionen på en glasrutschbana och 100 nm tjocka sektioner på 200 mesh tunnstångs koppargaller med ett pappersfilter under. Förbered fem rutnät för ett villkor: färga två rutnät först och behåll de tre återstående rutnäten som en säkerhetskopia om det behövs.
5. Toluidin blå färgning för histologi
OBS: Färgning avsnitt för histologi är viktigt av tre skäl: 1) att se till att vävnaden faktiskt skärs och inte hartset, 2) för att kontrollera kvaliteten på inklusionen, och 3) för att snabbt utvärdera märgprovet. Om detta inte är korrekt, skär djupare i blocket.
- Torka de halvtunna sektionerna glida på en värmeplatta (60 °C).
- Tillsätt filtrerat 1% toluidinblått/1 % natriumborat i destillerat vatten på rutschkanorna och värm på en kokplatta (60 °C) i 1-2 min. Tvätta rutschkanorna med destillerat vatten och låt det torka på värmeplattan.
- Montera sektioner på täckslipar med en droppe poly(butyl metakrylat-co-metylmetakelmetakulat) och undersök under ett ljusmikroskop.
6. Färgning av tungmetaller för TEM-observation(figur 1C)
OBS: För kontrasten vänds den övre sidan av gallret på 100 μL droppar av varje på varandra följande bad med en slinga. Före användning filtreras varje lösning till 0,22 μm. Ta bort överskottet av vätska mellan varje bad genom att försiktigt kontakta gallersidan på ett filterpapper.
- Fläcka med 4% uranylacetat i destillerat vatten i 5 min.
- Tvätta 3 gånger i destillerat vatten i 5 min.
- Fläcka med blycitrat i 3 min.
- Tvätta 3 gånger i destillerat vatten i 5 min.
- Sätt gallren på undersidan i kontakt med filterpapperet för att låta dem torka.
OBS: Tungmetaller reagerar i närvaro av koldioxid. För att minimera fällningar, undvik luftförskjutning under kontrasten, tala inte, håll miljön lugn och stäng av luftkonditioneringen.
7. TEM (figur 1e)
OBS: Sektionerna introduceras i ett TEM-mikroskop och undersöks vid 120 kV.
- Undersök först sektionerna vid låg förstoring (< 500x) för att uppskatta den allmänna aspekten av preparatet (frånvaro av hål i hartset, veck / kompression i sektionerna, fällningar på grund av färgning).
- Undersök sedan sektionerna vid högre förstoring (~ 2000x så att man kan skilja mognadsstadiet). Räkna megakaryocyterna manuellt från varje mognadsstadium över hela tvärgående sektioner (se Representativa resultat om hur man visuellt identifierar varje steg).
OBS: Varje kvadrat i gallret definieras som ett område för undersökning (vilket motsvarar 16000 μm2 för 200 kopparnät med maskor). - För att bedöma antalet megakaryocyter, kvantifiera endast de rutor som är helt täckta med ett avsnitt. För att göra det, använd en modell baserad på screening av intervall. Observera ett första intervall av rutor från en extremitet av sektionen till en annan, sedan ett annat intervall på samma sätt etc. Med hjälp av denna procedur, screena helt och systematiskt hela märg tvärgående sektion kvadrat för kvadrat.
- För varje ruta, poängsätt antalet steg I, II eller III megakaryocyter.
OBS: Högre förstoringar krävs för att analysera granuler, DMS-organisationen, storleken på cytoplasmiska territorier och den polylobulerade kärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benmärg histologi
Observation av benmärgens toluidinblå histologi under ett ljusmikroskop är nyckeln till att snabbt analysera den övergripande vävnadsarkitekturen när det gäller t.ex. vävnadskomprimitet, mikrovesselkontinuitet och storlek och form av megakaryocyter (figur 1D). Det utförs före ultrathin sektioner för att bestämma behovet av att skära djupare i benmärg blocket. På grund av deras jättestorlek och nukleära lobulation kan de mer mogna megakaryocyterna lätt visualiseras med ett 40x-mål. Detta ger en utmärkt och snabb översikt över densiteten hos mogna megakaryocyter i vävnaden och deras relativa lokalisering till mikrovessels. Anomalier i megakaryocyte spridning och mognad kunde redan upptäckas i sådana halvtunna avsnitt.
Benmärg ultrastruktur
På grundval av distinkta strukturella egenskaper är murin megakaryocyter indelade i 4 steg som representerar sekventiella stadier i mognaden (figur 2A). Steg I megakaryocyter är 10-15 μm i diameter med en stor kärna som upptar större delen av cellen och innehåller rikliga ribosomer och grov endoplasmiskt reticulum. Förekomsten av det tidigaste detekterbara stadiet av DMS, kallat pre-DMS, är också ett nyckelkriterium för att särskilja steg I MKs i TEM-analys3. I mognadsstadiet II börjar granulatbildning och utvecklingen av DMS initieras. Megakaryocyter ökar i storlek, mäter 15-25 μm i diameter och utvecklar nukleär lobulation. Mogna steg III megakaryocyter är jätteceller 25-50 μm i diameter. Deras cytoplasma innehåller en välutvecklad DMS med tydligt definierade cytoplasmiska territorier och en perifer zon utan organeller. I detta skede är kärnan i allmänhet placerad excentriskt och verkar mycket oregelbunden med kondenserat kromatin som ligger vid kärnmembranet. Det sista steget kännetecknas av en naken kärna, även kallad pyrenocyt, bestående av en stor kärna omgiven av ett plasmamembran efter att huvuddelen av cytoplasman har eliminerats. I möss av vild typ C57BL/6 omfattar benmärgen ca 8% steg I, 20% steg II, 71% steg III megakaryocyter och < 1% pyrenocyter. Det genomsnittliga antalet megakaryocyter är mellan 1,7 och 2,2 celler per kvadrat. Denna godtyckliga klassificering gör det möjligt att bekvämt övervaka en kontinuerlig process av celldifferentiering och upptäcka dess möjliga avvikelser.
Förutom dessa klassiska mognadsstadier gör observation av fasta megakaryocyter i benmärgen det möjligt att analysera serien av händelser som inträffar när megakaryocyter interagerar med sinusformade väggen (figur 2B). Megakaryocyter i kontakt med endotelcellerna observeras ofta i tunna sektioner. Ibland observerar man megakaryocyter som bildar korta invasiva utskjutningar som tränger in i endotel eller utökar stor projektion av dess cytoplasma i sinusformad lumen7,8. Anmärkningsvärt nog visar dessa intravaskulära cytoplasmiska processer varierande storlekar, längder och diametrar, vilket illustrerar den progressiva trombocyt ombyggnad i cirkulationen. Trombocyter som redan finns i den allmänna cirkulationen, med en discoidform som upprätthålls av omkretsmikropubulespolar, är också synliga i sinusoidernas lumen. Denna typiska morfologi av trombocyterna är vägledande för korrekt fixering av provet.
Transmission elektronmikroskopi har den upplösningsnivå som krävs för att visualisera strukturella detaljer, såsom nukleär lobulation, rumslig organisation av DMS och granulat när det gäller storlek, form och distribution. Figur 2C är ett exempel på regionen perinukleära i ett stadium III megakaryocyte som visar förekomsten av α granulat, Golgi cisternae, mitokondrier och endoplasmic reticulum. Också anmärkningsvärt i figur 2C är en multivesikulär kropp, som representerar ett mellansteg i bildandet av alfa och täta granulat, som innehåller multiplar exosomer som mäter mindre än 200 Å i diameter9,10. Slutligen gör transmissionselektronmikroskopi det möjligt att visualisera neutrofiler och andra hematopoetiska celler som finns inuti megakaryocyterna , (figur 2D) efter en ovanlig process som kallas emperipolesis varigenom en cell tränger in i en annan levande cell11. Denna process, som gäller 4% av megakaryocyter i normalt fysiologiskt tillstånd, kan ökas avsevärt under vissa patologiska tillstånd12.
Bild 1: Schematisk illustration av den experimentella installationen. ( A)Inbäddning av benmärg. Benmärgen spolas och fixeras genom snabb nedsänkning i glutaraldehydlösning. Fotografiet illustrerar det typiska utseendet på benmärgscylindern efter spolning. Efter 1 h fixering vid rumstemperatur är märgen omgiven i agaros, postfixerad i osmium tetroxid och inkuberad i uranylacetat. Vävnaderna sköljs sedan i buffert, dehydreras i en serie graderad etanol, inkuberas i propylenoxid och infiltreras med epoxiharts. b)Benmärg blockerar sektionering. Den inbäddade benmärgen är monterad på en ultramicrotomhållare, trimmad vid 45° och skuren antingen i halvtunna (500 nm) eller tunna (100 nm) sektioner. För strukturella studier plockas de flytande sektionerna upp med en slinga och deponeras på galler med ett pappersfilter under. c)Kontrastfärgning för TEM-observationer. Galler inverteras på uranylacetatdroppar, tvättas på destillerade vattendroppar och inkuberas på blycitrat före en annan tvättning. Efter torkning (ovansidan med sektionerna) är proverna redo att undersökas enligt TEM. ( D) Histologi av en mus femoral märg avsnitt färgade med toluidin blå. Jättecellerna motsvarar mogna megakaryocyter (1), vissa är i kontakt med sinusoider (2). Sinusoiderna konvergerar på en stor central sinus ådra (3). Stapel: 20 μm Infälld: Normalt utseende hos en mogen megakaryocyt vid 40x förstoring. (E) Representativ TEM-bild av en benmärgssektion vid låg förstoring. Cellerna är tätt packade med lite extracellulärt utrymme. Varje rutnätsruta i avsnittet observeras från en extremitet till en annan genom att följa den schematiska pilbanan (röda pilar). Bar: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder på megakaryocyter ultrastruktur. ( A ) Karakteristiska mognadsstadier av vilda megakaryocyter. Megakaryocyter klassificeras i fyra mognadsstadier: Steg I, en cell 10-15 μm i diameter med en stor kärna; Steg II, en cell 15–30 μm i diameter som innehåller dms under utveckling. steg III, en 30-50 μm cell som innehåller ett välutvecklat avgränsningsmembransystem (DMS) som definierar cytoplasmiska territorier och har en organellfri perifer zon. En pyrenocyt motsvarar den nakna polylobulated kärnan kvar i benmärgen efter full cytoplasmic förlängning. Staplar: 10 μm (B) Megakaryocyt-endotelcellinteraktioner och intravaskulära cytoplasmiska processer. i) Periferin (PZ) i en megakaryocyt är nära tillämplig på den abluminala ytan av det sinusformade endotel. ii) En megakaryocyt som bildar korta invasiva utskjutningar som tränger djupt in i endotelskiktet (pilspetsar). iii-v) Pilarna indikerar cytoplasmiska processer hos megakaryocyter med varierande diametrar, av vilka några är mycket stora och har en perifer zon som kan representera fragment som just har kommit in i blodomloppet. vi) En typisk discoidplätt (P) som observerats i sinuslumen. I varje mikrograf indikerar den röda linjen den lysande sidan av endotelbarriären och stjärnan indikerar sinusoidlumen. Stänger: 2 μm. (C) Högre förstoringar av perinukleära regionen i en mogen megakaryocyt. α alfagranulat; rer, grov endoplasmiskt retikulum; G, golgi; MVB, multivesikulär kropp; m, mitokondrier. Bar: 0,5 μm. (D) Exempel på en megakaryocyt som visar emperipolesis. Den uppslukade neutrophil verkar morfologiskt oförändrad av interaktionen med megakaryocyter. Stapel: 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande akt: Beredning av reagenserna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Direkt undersökning av megakaryocyter i deras ursprungliga miljö är avgörande för att förstå megakaryopoiesis och trombocytbildning. I detta manuskript tillhandahåller vi en överföring elektronmikroskopi metod som kombinerar benmärg spolning och fixering genom nedsänkning, så att dissekera in situ morfologi egenskaper hos hela processen av megakaryocyt morfogenes äger rum i benmärgen.
Spolningen av benmärgen är ett kritiskt steg i denna metod, eftersom framgången för en högkvalitativ spolning beror på operatörens praxis och träning. Även om delikat, spola benmärgen är det bästa sättet att undvika avlägsnande av mineraliserade ben, som vanligtvis kräver en 2-veckors EDTA behandling för fullständig avkalkning är associerad med betydande artefakter på megakaryocyt morfologi. Dessutom är en stor fördel med att samla hela ofixerade benmärgar från skenben och lårben förmågan att kombinera flera bildframställningsmetoder till samma mus. I praktiken krävs endast en enda benmärg för den strukturella studien, där de övriga tre exemplaren finns tillgängliga för kompletterande analyser. Den andra benmärgen kan sedan användas för beredning av färska benmärgsexplanter, för att studera dynamiken i proplateletbildning av inhemska megakaryocyter6. Det tredje provet är vanligtvis utformat för immunstainingstudier på tjocka sektioner, vilket ger 3D-avbildning och distribution av megakaryocyter i deras naturliga miljö. Det sista provet kan frysas och lagras för ytterligare studier av immunogoldelektronmikroskopi, där subcellulär lokalisering av proteiner undersöks vid högupplöst4. Dessa kombinerade bildframställning metoder, tillsammans med tillgängligheten av riktade borttagning/mutation av gener i en mus, ger ett viktigt sätt att avgränsa in situ den biologiska rollen av ett givet protein i trombopoiesis. Det bör dock påpekas här att en begränsning av denna metod är tillbakadragandet av de epifyser som behövs för att spola märgen. Epifyser är kända för att vara viktiga områden för hematopoiesis, och deras avlägsnande hindrar därför alla möjligheter att analysera hematopoetiska stamceller och de inledande faserna av engagemang13. En annan begränsning är att stamfarna av megakaryocyter före det omogna stadiet jag inte kan identifieras eftersom dessa celler inte har specifika strukturella egenskaper. För att övervinna denna begränsning kan en EM immunogold strategi användas.
Det andra viktiga steget i metoden är benmärgsfixeringen genom nedsänkning. När den utförs under de förhållanden som beskrivs här, dvs. fixering omedelbart efter att den kompakta benmärgscylindern spolats ut, har den följande fördelar: i) den är snabb och lätt att utföra, (ii) den bevarar en ultrastruktur nära den som observerats efter fixering genom perfusion6, och iii) den upprätthåller fria megakaryocytprocesser och trombocyter i sinusoidomloppet som annars spolas ut/förloras efter perfusion. Med denna teknik är det möjligt att undersöka megakaryocyternas inträde i sinusformad cirkulation och att karakterisera alla mellanliggande former av cytoplasmiska processer från vilka trombocyter uppstår8. I linje med detta har det nyligen rapporterats att de stora utskjutningarna intravaserande från megakaryocyter in vivo är strukturellt åtskilda från de tunna förlängningar som bildas av megakaryocyter in vitro, med särskilt ett annat arrangemang av mikrotubulierna7. På samma sätt har vi nyligen visat att mekanismen som styr trombocytbildning in vivo skiljer sig från den som identifierats in vitro14.
Viktiga strukturella skillnader erkänns alltmer mellan in vitro odlade och in vivo genererade inhemska megakaryocyter, vilket understryker behovet av benmärg mikromiljön för en fullständig megakaryocyt differentiering/mognad. Efter kombination av benmärg spolning och fixering genom nedsänkning beskrivs i denna artikel, konventionella överföring elektronmikroskopi är fortfarande ett ovärderligt verktyg för att studera megakaryocyte biologi och trombocyt bildas, under fysiologiska och patologiska villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Europeiska unionen genom Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF) och genom anslag ANR-17-CE14-0001-01 till H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
