方法文章

稳定纵向 在Vivo 细胞级可视化胰腺在穆林模型与胰腺内活性成像窗口

DOI：

10.3791/62538

⸱

2021年5月6日

 , 
1Department of Emergency Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, 2Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KI for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology

本文内容

摘要

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胰 腺的体内高分辨率成像利用胰腺内成像窗口获得便利。

摘要

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在活体小动物模型中，胰腺的直接 体内 细胞分辨率成像在技术上具有挑战性。最近的一项活体成像研究，带有腹部成像窗口，使 体内腹部器官中的细胞动力学可视化。然而，由于小鼠胰腺的软板状结构很容易受到生理运动（如持久性和呼吸）的影响，因此很难在细胞水平上在几周内进行稳定的 纵向体内 成像，以识别、跟踪和量化小鼠胰腺中的胰岛或癌细胞。在此，我们描述了一种植入新颖支撑基座的方法，一个集成的胰腺内成像窗口，可以在空间上将胰腺与肠道分离，用于胰腺微结构的纵向延时活性成像。带成像窗口 的纵向体内 成像可实现稳定的可视化，从而在 3 周内跟踪小岛，并实现微观结构的高分辨率三维成像，这一点在正位胰腺癌模型中就证明了这一点。通过我们的方法，进一步的活体成像研究可以阐明细胞水平上涉及胰腺的各种疾病的病理生理学。

引言

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胰腺是一种腹部器官，在消化道中具有外分泌功能，内分泌激素在血液中。胰腺的高分辨率细胞成像可以揭示涉及胰腺的各种疾病的病理生理学，包括胰腺炎、胰腺癌和糖尿病1。传统的诊断成像工具，如计算机断层扫描，磁分辨率成像和超声波学在临床领域广泛提供1，2。然而，这些成像模式仅限于可视化只有结构或解剖变化，而改变在细胞或分子水平无法确定。鉴于人类糖尿病或胰腺癌的分子变化可在诊断前10年以上启动，因此，在潜伏期从分子过渡中发现胰腺疾病有可能提供早期诊断和及时干预。因此，通过提供胰腺癌的早期诊断或在糖尿病5进展期间对胰岛变化的提前识别，能够克服分辨率的局限性并提供对功能的宝贵见解的成像将显著获得关注。

特别是小岛，核成像、生物发光成像和光学相干断层扫描被推荐为非侵入性胰岛成像技术6。然而，这些方法的分辨率非常低，典型值从几十微米到几百微米不等，因此检测胰岛细胞水平变化的能力有限。另一方面，以前对小岛的高分辨率研究是在前体7、8（

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方案

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本文描述的所有程序均按照《实验室动物护理和使用指南》（2011年 ）第8版（2011年）26 日进行，并经韩国高等科学技术研究院（KAIST）和首尔国立大学邦当医院（SNUBH）机构动物护理和使用委员会批准。

1. 准备窗户和其他材料

  1. 定制设计胰腺内成像窗口，使胰腺与腹腔内的肠道分离18（图1A，B）。在先前研究18的补充数字中描述了窗口的详细蓝图。
  2. 使用C57BL/6N小鼠，8-12周大的雄性，进行活体胰腺成像。注射抗CD31抗体与Alexa 647氟合体，在成像前2小时，用于容器标记18。
  3. 对于胰岛研究，准备一个转基因小鼠模型，其中小岛被标记为荧光记者蛋白。在这里，我们利用了MIP-GFP，其中绿色荧光蛋白在小鼠胰岛素1基因促进剂的控制下表达，该基因促进剂活跃在小鼠24个胰岛的所有β细胞中。
  4. 对于胰腺癌研究，准备带有荧光记者蛋白和BALB/C裸鼠标签的转基因癌细胞。在这项研究中，使用了PANC-1核光红细胞。PANC-1癌细胞

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结果

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活体显微镜结合支持基础集成胰腺内成像窗口，使小鼠胰腺的纵向细胞水平成像。此与胰腺内成像窗口的协议提供了长期组织稳定性，使高分辨率成像的获取能够跟踪单个小岛长达 3 周。因此，可以实现扩展视野的马赛克成像、Z 堆栈成像的三维 （3D） 重建以及同一位置的纵向跟踪。此外，我们的活体显微镜提供四个通道（405、488、561 和 647 nm）的采集，从而能够同时实现多个细胞可视化及其相互作用。

在初步成像中，窗口被植入C57BL/6N小鼠体内，静脉注射抗CD31抗体，与Alexa 647荧光素结合。宽区域成像 （图 3A） 和放大的 3D 成像 （图 3B-D， 补充视频 1） 的胰腺是促进与这个系统。胰腺组织通过自发光可视化，并识别了标有抗CD31抗体的相邻血管。由于渗透或呼吸引起的振荡未被识别，导致平均成像与高信号噪声比（图4）。需要在胰腺中以微尺度分辨率可视化的 Aci.......

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讨论

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此处描述的协议包括胰腺的活体成像，使用从腹部成像窗口修改的新型支持基础集成胰腺内成像窗口。在上述协议中，第一个关键步骤是将活体胰腺成像窗口植入小鼠体内。对于胶水在窗口中的应用，在窗口边缘和盖玻璃之间涂抹胶水很重要，但不要涂在胰腺组织上，因为它可能会显著中断活体成像。如果胶水直接涂在组织上，不仅玻璃和组织之间的胶水本身，而且辅助的灰尘颗粒也会在成像过程中诱发光线散射。此外，粘合剂的应用可能对胰腺产生有毒和非生理影响。

第二步是放置在金属支撑基板上的胰腺组织量。由于胰腺组织是一个类似板材的结构，因此需要控制板上的胰腺组织体积。如果在板上放置体积过大，则涂在环边缘的胶水可能粘附在组织上，质量效应可能会妨碍胰腺的灌注。另一方面，如果音量太小，可以可视化的视野可能有限。窗口上的手术方案可能需要几次试验才能达到一致的标准。

对于3周的长期成像，最令人担心的问题是胰腺成像窗口的潜在损害。在长期观察期间，胰腺成像窗口的盖玻璃可能会意外破坏。为了防止这种情况，带窗户的鼠标必须分开存放，并且应从笼子中取出具有锋利边缘的硬物。如果盖玻璃破裂，如果窗.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项研究得到了SNUBH研究基金第14-2020-002号赠款和韩国政府资助的韩国国家研究基金会（NRF-2020R1F1A1058381，NRF-2020R1A1A2C3005694）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 647 琥珀酰亚胺酯（NHS 酯）InvitrogenA20006与抗体
BALB/C 裸OrientBioBALB/C 裸BALB/C 裸
体 BD Intramedic 聚乙烯管BD Biosciences 427401PE10 导管，用于连接针头
C57BL/6NOrientBioC57BL/6NC57BL/6N
盖玻片 圆形Marienfeld0111520用于胰腺成像窗口的盖玻片
FITC Dextran 2MDaMerck （Former Sigma Aldrich）FD200S用于血管识别
IMARIS 8.1BitplaneIMARIS图像处理
体显微镜IVIM技术IVM-C活体显微镜
IRIS 剪刀JEUNGDO生物 &PLANT CO， LTDS-1107-10本产品可替换为其他公司的产品
乐泰 401汉高401氰基丙烯酸正丁酯胶
微型针架JEUNGDO BIO &PLANT CO，LTD H-1126-10本产品可替换为其他公司
的产品 微型卷具JEUNGDO BIO &PLANT CO， LTD17004-03本产品可替换为其他公司
MicroforcepsJEUNGDO BIO &PLANT CO， LTDF-1034本产品可替换为其他公司
MIP-GFPThe Jackson Laboratory006864B6 的产品。Cg-Tg（Ins1-EGFP）1Hara/J
尼龙 4-0AILEENB434非吸收缝合线
Omnican N 100 30GB BRAUN对于血管导管，仅使用针头部件
PANC-1 NucLightRed定制定制制造
胰腺成像窗Geumto Engineering定制订单胰腺成像窗 - 定制订单
PhysiosuiteKent ScientificPS-02恒温温度控制器
纯化的 NA/LE 大鼠抗小鼠 CD31BD Biosciences 553708用于体内血管标记的抗体
环形镊子JEUNGDO BIO &PLANT CO， LTDF-1090-3本产品可替换为其他公司
的产品 RompunBayerRompun麻醉剂
TMR Dextran 65-85kDaMerck （Former Sigma Aldrich）T1162用于容器识别
窗口支架Geumto Engineering定制订单窗口支架 - 定制订单
ZoletilVirbacZoletil100麻醉剂
体偶联物的荧光探针 体 活 FT9172220S 实验室

参考文献

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  1. Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
  2. Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology.

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