Summary
Las imágenes in vivo de alta resolución del páncreas se facilitaron con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas.
Abstract
Las imágenes directas de resolución celular in vivo del páncreas en un modelo de animal pequeño vivo han sido técnicamente desafiantes. Un reciente estudio de imagen intravital, con una ventana de imagen abdominal, permitió la visualización de la dinámica celular en los órganos abdominales in vivo. Sin embargo, debido a la arquitectura blanda en forma de lámina del páncreas del ratón que puede ser fácilmente influenciada por el movimiento fisiológico (por ejemplo, peristalsis y respiración), fue difícil realizar imágenes longitudinales estabilizadas in vivo durante varias semanas a nivel celular para identificar, rastrear y cuantificar islotes o células cancerosas en el páncreas del ratón. Aquí, describimos un método para implantar una nueva base de soporte, una ventana de imágenes intravitales pancreáticas integradas, que puede separar espacialmente el páncreas del intestino para obtener imágenes intravitales longitudinales de lapso de tiempo de la microestructura del páncreas. La obtención de imágenes longitudinales in vivo con la ventana de imágenes permite una visualización estable, lo que permite el seguimiento de los islotes durante un período de 3 semanas y la obtención de imágenes tridimensionales de alta resolución de la microestructura, como se evidencia aquí en un modelo de cáncer de páncreas ortotópico. Con nuestro método, otros estudios de imágenes intravitales pueden dilucidar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas a nivel celular.
Introduction
El páncreas es un órgano abdominal con una función exocrina en el tracto digestivo y una función endocrina de secretar hormonas en el torrente sanguíneo. Las imágenes celulares de alta resolución del páncreas podrían revelar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas, incluida la pancreatitis, el cáncer de páncreas y la diabetes mellitus1. Las herramientas de diagnóstico por imágenes convencionales, como la tomografía computarizada, las imágenes de resolución magnética y la ecografía, están ampliamente disponibles en el campo clínico1,2. Sin embargo, estas modalidades de imagen se limitan a visualizar solo cambios estructurales o anatómicos, mientras que las alteraciones a nivel celular o molecular no se pueden determinar. Dado que los cambios moleculares en la diabetes mellitus o el cáncer de páncreas en humanos pueden iniciarse más de 10 años antes del diagnóstico3,4,la detección de enfermedades pancreáticas a partir de su transición molecular durante el período latente tiene el potencial de proporcionar un diagnóstico temprano y una intervención oportuna. Por lo tanto, las imágenes que superarán las limitaciones de resolución y proporcionarán información valiosa sobre la función ganarán notablemente atención al proporcionar un diagnóstico temprano del cáncer de páncreas o la identificación avanzada de la alteración de los islotes durante la progresión de la diabetes mellitus5.
En particular con los islotes, la imagen nuclear, la imagen de bioluminiscencia y la tomografía de coherencia óptica se han sugerido como técnicas no invasivas de imagen de islotes6. Sin embargo, la resolución de estos métodos es sustancialmente baja, con valores típicos que van desde varias decenas hasta cientos de micrómetros, ofreciendo una capacidad limitada para detectar cambios a nivel celular en los islotes. Por otro lado, se realizaron estudios previos de alta resolución de islotes bajo condiciones ex vivo7,8 (por ejemplo, corte o digestión del páncreas), nofisiológicas 9 (por ejemplo, exteriorización del páncreas) y heterotópicas10,11,12 (por ejemplo, implantación debajo de la cápsula renal, dentro del hígado y en la cámara anterior del ojo), lo que restringe su interpretación e implicaciones clínicas. Si se puede establecer un modelo in vivo,fisiológico y ortotópico de imágenes de alta resolución, será una plataforma crítica para la investigación de los islotes pancreáticos.
Las imágenes intravitales, que revelan la fisiopatología a un nivel de resolución microscópica en un animal vivo, han recibido recientemente gran atención13. De los métodos de imagen in vivo, el desarrollo de una ventana de imagen abdominal14,que implanta una ventana en el abdomen de un ratón, ha permitido el descubrimiento de nuevos hallazgos (es decir, una etapa de pre-micrometástasis de metástasis hepática temprana15 y mecanismo de mantenimiento de células madre en el epitelio intestinal16). Aunque la ventana de imágenes abdominales proporciona resultados valiosos, las aplicaciones de esta ventana para el páncreas y la investigación de imágenes intravitales resultante basada en enfermedades que involucran el páncreas, no se han investigado ampliamente.
A diferencia de las características bien definidas de los órganos sólidos del páncreas humano, el páncreas de un ratón es una estructura similar a un tejido blando distribuida difusamente17. Por lo tanto, se ve afectado incesantemente por movimientos fisiológicos que incluyen peristalsis y respiración. Un estudio previo sobre la aplicación de una ventana de imagen abdominal para el páncreas demostró que la deambulación se produjo debido a artefactos de movimiento inducidos por los movimientos intestinales18. Se observó un desenfoque severo en la imagen promediada resultante, lo que impidió la visualización e identificación de las estructuras a microescala.
Aquí, describimos el uso de una nueva base de soporte integrada en la ventana de imágenes intravitales pancreáticas combinada con microscopía intravital19,20 para investigar los eventos a nivel celular longitudinal en enfermedades que involucran el páncreas. Además de una descripción detallada de la metodología en el estudio anterior18,en este trabajo se abordará la aplicación extendida de la ventana de imágenes pancreáticas para diversas enfermedades que involucran el páncreas. En este protocolo, se utilizó un sistema de microscopía confocal de escaneo láser de velocidad de video personalizado como un sistema de microscopía intravital. Se utilizaron cuatro módulos láser (longitudes de onda a 405, 488, 561 y 640 nm) como fuente de excitación, y se detectaron cuatro canales de señales de emisión mediante tubos fotomultiplicadores (PMT) a través de filtros de paso de banda (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). El escaneo láser consistió en un espejo poligonal giratorio (eje X) y un espejo de escaneo galvanómetro (eje Y) que permitió el escaneo de velocidad de video (30 cuadros por segundo). La información detallada sobre la microscopía intravital ha sido descrita en los estudios previos10,18,19,20,21,22,23.
En nuestro estudio anterior de islotes18,tomamos imágenes exitosas y estables de los islotes en ratones vivos utilizando un modelo de ratón transgénico (MIP-GFP)24 en el que los islotes fueron etiquetados con GFP. El método permitió la visualización de alta resolución de los cambios en los islotes durante un período de 1 semana. También facilitó la obtención de imágenes de los mismos islotes durante un máximo de 3 semanas, lo que sugiere la viabilidad de estudios a largo plazo de los islotes pancreáticos para el seguimiento o monitoreo funcional durante la patogénesis de la diabetes mellitus18. Además, desarrollamos un modelo de cáncer de páncreas ortotópico en el que las células fluorescentes de cáncer de páncreas (PANC-1 NucLight Red)25 se implantaron directamente en el páncreas del ratón. Con la aplicación de la ventana de imágenes intravitales pancreáticas, este modelo podría utilizarse como una plataforma para investigar la fisiopatología celular y molecular en el microambiente tumoral del cáncer de páncreas y para el monitoreo terapéutico de nuevos candidatos a fármacos.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con la8ª edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (2011)26 y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST) y el Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl (SNUBH).
1. Preparación de la ventana y otros materiales
- Diseño personalizado de la ventana de imágenes intravitales pancreáticas para separar el páncreas del intestino en la cavidad abdominal18 (Figura 1A,B). Un plano detallado de la ventana se describe en una figura complementaria de un estudio anterior18.
- Use ratones C57BL / 6N, machos de 8 a 12 semanas de edad, para imágenes pancreáticas intravitales. Inyecte anticuerpos anti-CD31 conjugados con un fluoróforo Alexa 647, 2 h antes de la toma de imágenes, con el fin de etiquetar los vasos18.
- Para el estudio de islotes, prepare un modelo de ratón transgénico en el que los islotes se etiqueten con una proteína reportera fluorescente. Aquí, utilizamos MIP-GFP, donde la proteína fluorescente verde se expresó bajo el control del promotor del gen insulina 1 de ratón, que está activo en las células beta de todos los islotes en elratón 24.
- Para el estudio del cáncer de páncreas, prepare células cancerosas transgénicas marcadas con una proteína reportera fluorescente y ratones desnudos BALB / C. En este estudio, se utilizaron los glóbulos rojos PANC-1 NucLight. Las células cancerosasPANC-1 25 fueron etiquetadas con la sonda fluorescente NucLight Red.
- Esterilice todas las herramientas quirúrgicas, cubra el vidrio (con PEG o no) y visualmente las ventanas con un autoclave.
- Aplique el recubrimiento PEG al vidrio de la cubierta para prevenir la respuesta inflamatoria y aumentar la biocompatibilidad, que es adecuada para imágenes a largo plazo.
2. Cirugía
- Preparar una plataforma quirúrgica estéril y esterilizar las superficies con etanol al 70%.
NOTA: Para las sesiones de imagen longitudinal, la técnica aséptica es esencial. - Anestesiar ratones con una mezcla de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg).
NOTA: Se recomienda el uso de tiletamine/zolazepam en lugar de ketamina debido a su efecto adverso de hiperglucemia. Se debe seleccionar la anestesia óptima para el propósito del experimento9,27. - Controle la temperatura corporal con una sonda rectal con una almohadilla térmica homeotérmica controlada.
- Afeitar el flanco izquierdo del ratón y aplicar tres rondas de exfoliante alternado a base de alcohol y yodo.
NOTA: Si se utiliza crema depilatoria, no dejar más de 1 minuto para evitar quemaduras químicas. - Haga una incisión de 1,5 cm en el flanco izquierdo del ratón y diseccione la piel y el músculo.
- Realice una sutura de cuerda de bolso con una sutura negra o de nylon 4-0 en el margen de la incisión.
- Use un micro retractor en la incisión y exponga suavemente el bazo.
- Acondicie cuidadosamente el bazo con forrceps anulares e identifique el páncreas.
- Coloque la ventana en el flanco del mouse y pase el bazo y el páncreas a través del espacio abierto de la ventana. La manipulación del páncreas tiene que ser muy gentil, ya que puede causar sangrado o pancreatitis
- Coloque suavemente el páncreas en la placa de la ventana de imágenes; el bazo se colocará en el espacio abierto de la ventana.
- Para el estudio de células cancerosas, inyecte PANC-1 NucLight Red (1.0 x 106 células) directamente en el páncreas.
NOTA: Para obtener imágenes de los xenoinjertos ortotópicos de cáncer de páncreas humano, se podría facilitar la implantación directa de células cancerosas como PANC-1 u otra célula de cáncer de páncreas humano28. Para visualizar con microscopía de fluorescencia intravital, las células PANC-1 fueron transducidas con proteína fluorescente roja utilizando el reactivo lentiviral NucLight Red que marca el núcleo29. Aunque el volumen máximo de inyección es incierto, disminuya el volumen lo más posible para evitar el efecto de presión en el páncreas. - Aplique gotas de pegamento de N-butil cianoacrilato en el margen de la ventana de imágenes.
- Para minimizar la cantidad de pegamento aplicado, use una aguja de catéter de 31 G para la aplicación. Si la cantidad de la gota es grande, entonces el tejido se adherirá involuntariamente a la ventana o al vidrio de la cubierta.
- Aplique suavemente un vidrio de cubierta redonda de 12 mm en el margen de la ventana de imágenes.
- Tire del lazo de sutura para que quepa en la ranura lateral de la ventana y átelo tres veces.
- Cortar el sitio proximal máximo del nudo para evitar la interrupción de los puntos apretados cuando estos ratones están despiertos.
- Deje que los ratones se recuperen de la anestesia (2-3 horas) e inyecte ketoprofeno (5 mg / kg, subcutáneo en la piel suelta en la base del cuello o la cadera del animal) para aliviar el dolor. Reevalúe los signos de dolor cada 12 horas y el ketoprofeno debe considerarse cada 24 horas durante 1-3 días.
NOTA: La analgesia influye en la secreción de insulina en respuesta a la glucosa9. La elección y el momento de la analgesia deben individualizarse para el propósito experimental. - Acomode al ratón en la jaula con suficiente ropa de cama para evitar el contacto de la ventana con la jaula. Evite alojar la casa con los ratones sin la cirugía de ventana.
3. Imágenes intravitales
- Encienda el microscopio intravital, incluida la potencia del láser.
- Encienda la almohadilla térmica y configure la regulación homeotérmica a 37 °C.
NOTA: Alternativamente, use una almohadilla térmica pasiva o una lámpara con control frecuente si no hay regulación homeotérmica. - Realizar anestesia intramuscular con una mezcla de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg).
NOTA: Se recomienda el uso de tiletamine/zolazepam en lugar de ketamina debido a su efecto adverso de hiperglucemia. Se debe seleccionar la anestesia óptima para el propósito de los experimentos9,27. - Inserte un catéter vascular para la inyección.
- Aplique presión en el lado proximal de la cola con el dedo índice y el tercer como alternativa a una aplicación de torniquete. Calienta la cola con una lámpara si es necesario.
- Esteriliza la vena de la cola con un spray de etanol al 70%.
- Inserte un catéter de 30 G en la vena lateral de la cola. La regurgitación de la sangre se visualizará en el tubo PE10.
- Aplique una cinta de seda en el catéter para estabilizarlo.
- Inyectar dextrano FITC/TMR u otras sondas fluorescentes (25 μg de anti-CD31 conjugado con Alexa 647), según corresponda, según la combinación de sondas fluorescentes18.
NOTA: Para sondas fluorescentes de anticuerpos conjugados, inyecte 2 h antes de la sesión de imágenes.
- Transfiera el ratón de la plataforma quirúrgica a la etapa de imagen.
- Inserte una sonda rectal para controlar automáticamente la temperatura corporal con el sistema de almohadilla térmica homeotérmica.
- Inserte la ventana de imágenes pancreáticas en el soporte de la ventana preparado durante la configuración de la microscopía intravital (Figura 2). Para un microscopio invertido, es posible que no se requiera un soporte para ventanas.
- Realizar imágenes intravitales.
- Para obtener imágenes del páncreas, comience con una lente de objetivo de bajo aumento (por ejemplo, 4x) para escanear toda la vista del páncreas en la ventana de imágenes pancreáticas (campo de visión recomendado: 2500 x 2500 μm).
- Después de determinar la región de interés, cambie a la lente de objetivo de mayor aumento (20x o 40x) para realizar la imagen a nivel celular (campo de visión recomendado: 500 x 500 μm o 250 x 250 μm). En este experimento, la resolución lateral y axial fue de aproximadamente 0,5 μm y 3 μm, respectivamente.
- Realice imágenes de pila z o de lapso de tiempo para observar la estructura 3D o la dinámica a nivel celular, como la migración celular.
NOTA: Para obtener imágenes de las células que expresan proteínas fluorescentes de animales transgénicos (MIP-GFP), 30 s de exposición intermitente al láser de 488 nm con una potencia de hasta 0,43 mW fue tolerable sin fotobleaching notable o daño tisular. Para obtener imágenes de las proteínas fluorescentes etiquetadas con Alexa 647, la potencia del láser de 640 nm de hasta 0,17 mW fue tolerable sin fotobleaching notable o daño tisular. La exposición prolongada al láser de excitación con una potencia superior a esta configuración puede provocar fotoblanqueo o daño tisular por fototoxicidad. Ajuste la ganancia y el poder adecuados para obtener una imagen adecuada de la región de interés. El ajuste detallado de los parámetros en la microscopía intravital debe individualizarse para cada microscopía intravital preparada en el instituto.
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Representative Results
La microscopía intravital combinada con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas integradas en la base de soporte permite obtener imágenes longitudinales a nivel celular del páncreas en un ratón. Este protocolo con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas proporciona estabilidad tisular a largo plazo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución para rastrear islotes individuales durante un máximo de 3 semanas. Como resultado, se pueden lograr imágenes de mosaico para un campo de visión extendido, reconstrucción tridimensional (3D) de imágenes de pila z y seguimiento longitudinal de la misma posición. Además, nuestra microscopía intravital proporciona cuatro canales (405, 488, 561 y 647 nm) de adquisición, lo que permite la visualización simultánea de múltiples células con sus interacciones.
Para la imagen preliminar, la ventana se implantó en un ratón C57BL/6N con anticuerpo anti-CD31 inyectado por vía intravenosa conjugado con un fluoróforo Alexa 647. Con este sistema se facilitaron imágenes de área amplia(Figura 3A)e imágenes 3D ampliadas(Figura 3B-D, Video Complementario 1)del páncreas. El tejido pancreático se visualizó con autofluorescencia y se identificó la vasculatura adyacente etiquetada con el anticuerpo anti-CD31. No se identificó la oscilación debida al peristaltismo o a la respiración, lo que resultó en imágenes promediadas con una alta relación señal-ruido(Figura 4). Las células acinares, que requieren visualización a una resolución a microescala en el páncreas, se visualizaron claramente en las imágenes promediadas.
Para la obtención de imágenes de los islotes, se utilizó un ratón MIP-GFP. Utilizando el método de imágenes de mosaico, una vista de campo amplio con imágenes de alta resolución permitió la visualización de los islotes con la vasculatura adyacente (Figura 5). Se identificaron aproximadamente 40-50 islotes en la vista de campo amplio. Este método de imagen estable podría facilitar aún más el seguimiento de los islotes durante un tiempo de hasta 3 semanas, como se muestra en un estudio anterior(Figura 6)18.
Para las imágenes de células cancerosas, los glóbulos rojos PANC-1 NucLight se implantaron directamente en el páncreas del ratón durante la cirugía(Figura 7). Se utilizó una estrategia de doble etiquetado, consistente en células rojas PANC-1 NucLight y vasos cercanos teñidos con anti-CD31 conjugados con Alexa 647. Con nuestro protocolo, se logró la obtención de imágenes de campo amplio del cáncer de páncreas(Figura 7A),que delinea el margen del tumor, y la obtención de imágenes 3D de alta resolución a nivel de una sola célula(Figura 7B-D, Video complementario 2).
Figura 1: Diseño y fotografía de la ventana de imagen intravital pancreática. (A) Una vista 3D y transversal de la ventana de imágenes intravitales pancreáticas. Un plano detallado del tamaño y el diámetro se describe en el documento anterior18. (B) Fotografía anterior y posterior de la ventana de imágenes pancreáticas. Copyright 2020 Asociación Coreana de Diabetes de Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Reimpreso con permiso de la Asociación Coreana de Diabetes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fotografía de la implementación de la ventana de imagen intravital pancreática. Se implanta una ventana de imágenes intravitales pancreáticas en el ratón en la etapa traslacional XYZ y el soporte de la cámara de imágenes conectado al soporte basculante está conectado a la ventana de imágenes pancreáticas. Copyright 2020 Asociación Coreana de Diabetes de Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Reimpreso con permiso de la Asociación Coreana de Diabetes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen pancreática intravital representativa en ratón C57BL/6N. (A) Imagen de área amplia y (B) imagen 3D ampliada del páncreas (verde) y su microvasculatura (rojo) en el ratón C57BL/6N. Los vasos están marcados con un anticuerpo anti-CD31 conjugado con el fluoróforo Alexa 647. (C) Imagen reconstruida en 3D y (D) imagen de representación superficial del páncreas del ratón. Barra de escala: 200 μm (A) y 50 μm (B-D). Vea también el Video Complementario 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes intravitales de células acinares y vasculatura adyacente. Células acinares (verde) y vasculatura adyacente (rojo) en el ratón C57BL/6N. Los vasos están marcados con anticuerpos Anti-CD31 conjugados con el fluoróforo Alexa 647. La estabilidad del tejido lograda con la ventana de imágenes pancreáticas proporciona una imagen de alta relación señal-ruido. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imagen intravital representativa de islotes pancreáticos en el ratón MIP-GFP. Mosaico de área amplia e imagen ampliada de los islotes (verde) y la vasculatura adyacente (rojo) procesada con el método de proyección de máxima intensidad en el páncreas del ratón MIP-GFP. Los vasos están marcados con un anticuerpo anti-CD31 conjugado con el fluoróforo Alexa 647. Barra de escala: 500 μm (área amplia) y 50 μm (ampliada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imagen intravital longitudinal de islotes en el páncreas del ratón MIP-GFP. Imagen longitudinal de los islotes durante un tiempo de hasta 3 semanas en el páncreas en el ratón MIP-GFP. Cada punta de flecha con diferentes colores indica los mismos islotes. Barra de escala: 100 μm. Copyright 2020 Asociación Coreana de Diabetes de Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Reimpreso con permiso de la Asociación Coreana de Diabetes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Imagen intravital representativa del modelo de cáncer de páncreas. (A) Imagen de área amplia y (B) imagen 3D ampliada de los glóbulos rojos PANC-1 NucLight implantados (rojo) en el ratón desnudo BALB/c. Los vasos (azules) están marcados con un anticuerpo anti-CD31 conjugado con el fluoróforo Alexa 647. (C) Imagen reconstruida en 3D y (D) imagen de representación superficial del cáncer de páncreas en el modelo de ratón. Barra de escala: 500 μm (A) y 50 μm (B-D). Vea también el Video Complementario 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo complementario 1: Imágenes pancreáticas 3D in vivo en ratón C57BL/6N. Imágenes 3D in vivo del páncreas (verde) del ratón C57BL/6N inyectado por vía intravenosa con un anticuerpo anti-CD31 conjugado con el fluoróforo Alexa 647 (rojo). La barra de escala se muestra en el video. Este video corresponde a la Figura 3C,D. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo complementario 2: Imágenes de cáncer de páncreas 3D in vivo (PANC-1 NucLight Red) en ratón desnudo BALB/C. Imágenes 3D in vivo de cáncer de páncreas (rojo) implantadas en ratón DESNUDO BALB/C inyectado por vía intravenosa con un anticuerpo anti-CD31 conjugado con el fluoróforo Alexa 647 (azul). La barra de escala se muestra en el video. Este video corresponde a la Figura 7C,D. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
El protocolo descrito aquí consiste en imágenes intravitales del páncreas utilizando una nueva base de soporte integrada en la ventana de imágenes intravitales pancreáticas modificada desde una ventana de imágenes abdominales. Entre los protocolos descritos anteriormente, el primer paso crítico es la implantación de la ventana de imágenes pancreáticas intravitales en el ratón. Para la aplicación del pegamento en la ventana, es importante aplicar el pegamento entre el margen de la ventana y el vidrio de la cubierta, pero no en el tejido pancreático, ya que puede interrumpir significativamente las imágenes intravitales. No solo el pegamento en sí entre el vidrio y el tejido, sino también las partículas de polvo adjuntas pueden inducir la dispersión de la luz durante la obtención de imágenes si el pegamento se aplica directamente al tejido. Además, la aplicación del adhesivo puede tener efectos tóxicos y no fisiológicos en el páncreas.
El segundo paso es la cantidad de tejido pancreático colocado en la placa base de soporte metálico. Debido a que el tejido pancreático es una estructura similar a una hoja, el volumen de tejido pancreático en la placa debe ser controlado. Si se coloca un volumen demasiado grande en la placa, el pegamento aplicado al margen del anillo podría adherirse al tejido, y el efecto de masa podría obstaculizar la perfusión del páncreas. Por otro lado, si se coloca un volumen demasiado pequeño allí, el campo de visión que se puede visualizar puede ser limitado. Este protocolo de cirugía en la ventana puede requerir varios ensayos para cumplir con un estándar consistente.
Para las imágenes a largo plazo durante un período de 3 semanas, el problema más preocupante fue el daño potencial a la ventana de imágenes pancreáticas. La destrucción involuntaria del vidrio de la cubierta en la ventana de imágenes pancreáticas podría ocurrir durante el período de observación a largo plazo. Para evitar esto, el mouse con la ventana debe alojarse por separado, y los objetos duros con bordes afilados deben retirarse de la jaula. La eutanasia de ratones debe considerarse en caso de que el vidrio de la cubierta se rompa, si hay signos graves de inflamación cerca de la ventana o si el animal parece estar en peligro. En nuestra experiencia, los ratones con la ventana de imágenes pancreáticas pudieron comer y hacer ejercicio normalmente cuando la recuperación después de la cirugía fue apropiada y no se desarrolló ninguna otra complicación.
En nuestra experiencia previa con la ventana de imágenes abdominales, no pudimos adquirir imágenes de nivel celular de alta calidad, así como el seguimiento longitudinal de las mismas manchas durante varios días. En comparación con la ventana de imágenes abdominales, que proporciona una plataforma diversa para varios órganos abdominales, la ventana de imágenes pancreáticas se especifica aún más para obtener imágenes del páncreas, así como de otros órganos que son suaves y fácilmente influenciados por movimientos como el mesenterio, el bazo y el intestino delgado. Sin embargo, el hígado y el riñón pueden ser inviables en la ventana de imágenes pancreáticas debido al espacio limitado.
Si bien la combinación de un ratón fluorescente, células y sondas de anticuerpos permite la visualización de las interacciones dinámicas entre las células endoteliales y los islotes o las células cancerosas, el protocolo descrito aquí podría reproducirse con otras composiciones de células o sondas moleculares etiquetadas con fluorescentes adecuadas para cada condición respectiva. Además, se esperan aplicaciones expansivas integradas con nuestro método, como el ratón reportero CpepSfGFP con secreción de insulina9,30,la entrega de genes mediada por AAV8 dirigida a especies reactivas de oxígeno (ROS)31,o el modelo de tumor ortotópico32,33,34 en el que el tumor in situ puede estimular completamente el microambiente tumoral, incluida la tumorigénesis, el desarrollo y la metástasis35. Además, los modelos de xenoinjerto derivados del paciente también se pueden estudiar utilizando nuestra plataforma36.
Hay algunas limitaciones que deben abordarse en este estudio. Primero, incluso cuando utilizamos la base de metal para la estabilización, no pudimos determinar el estrés mecánico inducido en el tejido por la base y el vidrio de la cubierta, lo que podría afectar el flujo sanguíneo. Sin embargo, como se muestra en las figuras anteriores, la inyección intravenosa de un anticuerpo conjugado con fluorescencia (CD31) o dextrano etiquetó adecuadamente el vaso sin un área no perfundida distinguible, lo que sugiere un impacto mínimo de la tensión mecánica en el flujo sanguíneo normal dentro del tejido pancreático. En segundo lugar, las reacciones adversas debidas al adhesivo no pudieron evaluarse en el tejido pancreático. Sin embargo, se intentó evitar tocar el páncreas con adhesivos con el mayor cuidado posible para evitar cualquier efecto adicional. En tercer lugar, como se discutió anteriormente, el impacto no deseado de los agentes anestésicos podría afectar la sensibilidad y secreción de insulina, como se describió en el estudio anterior9,27. En nuestra experiencia, una mezcla de ketamina y xilazina indujo hiperglucemia en comparación con la mezcla de tiletamina, zolazepam y xilazina. Se debe realizar un estudio adicional que investigue el efecto de la anestesia sobre la secreción de insulina y se debe seleccionar una anestesia adecuada con efectos adversos mínimos de acuerdo con cada experimento. Cuarto, las imágenes del páncreas se centran en la porción de la cola, y las imágenes de la parte de la cabeza del páncreas podrían limitarse con nuestra ventana.
En resumen, una imagen longitudinal estabilizada del páncreas a nivel celular durante varias semanas fue facilitada por nuestro sistema de imágenes integrado con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas optimizada para imágenes de páncreas in vivo. Debido a que las imágenes intravitales proporcionan información dinámica sobre la biología celular, la inmunología y la biología tumoral, este protocolo podría ser un método útil para investigar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la subvención No. 14-2020-002 del Fondo de Investigación SNUBH y por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
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