稳定纵向 在Vivo 细胞级可视化胰腺在穆林模型与胰腺内活性成像窗口

此协议使用新的胰腺内成像窗口描述胰腺的稳定和重复的细胞水平在体内成像。这项技术的主要优点是，在活老鼠的胰腺中，在三周内可以进行一动不动的三维成像，分辨率达到细胞水平。首先准备手术平台，用70%乙醇对表面进行消毒。

麻醉后，使用带有自热控制加热垫的直肠探头来监测体温。从鼠标的左侧取下头发，然后用酒精和碘替代，从切口部位旋转到外表面，永不回到切口部位，以碘结束。然后，在老鼠的左侧做一个1.5厘米的切口，解剖皮肤和肌肉。

使用黑色或尼龙 4-0 缝合线在切口边缘执行钱包串缝合。用环钳小心地拉动脾脏，识别胰腺。将窗口放在鼠标的侧翼，通过窗户的空地穿过脾脏和胰腺。

然后，轻轻地将胰腺放在成像窗的板上，同时将脾脏放在窗口的空地上。将PANC-1核素红色直接注射到胰腺中。使用 31 口径导管针将一滴 n-丁基氰酸丙烯酸酯胶水涂抹到成像窗口边缘，确保使用少量胶水。

轻轻地将 12 毫米圆形盖玻璃涂抹到成像窗的边缘。然后，握住缝合圈，使其适合窗口的横向凹槽，并将其绑住三次。最后，为了防止这些紧缝的中断，当小鼠清醒时，切开领带的最大近端部位。

首先打开活性显微镜，包括激光电源。要插入血管导管，请用食指和第三指对尾部近端施加压力。如有必要，用灯加热尾部。

用 70% 乙醇喷雾消毒尾静脉，然后将 30 度导管插入横向尾静脉，并可视化 PE-10 管中的血液回流。在导管上涂抹丝胶带以稳定导管。根据荧光探头的组合，酌情注射FITC德克斯特兰和TMR德克斯特兰或其他荧光探针。

插入直肠探头，通过家用热加热垫系统自动控制体温。然后，将在活体显微镜设置期间准备的胰腺成像窗口插入窗口支架。将鼠标从手术平台转移到成像阶段。

要执行活体成像，请从低放大倍率（如四次）对胰腺进行成像开始，以扫描胰腺成像窗口中胰腺的整个视图。确定感兴趣区域后，切换到更高的放大倍率目标透镜（如 20 倍或 40 倍），分别使用约 0.5 微米和 3 微米的横向和轴向分辨率进行细胞级成像。执行 Z 堆栈或延时成像，以观察 3D 结构或细胞级动态（如细胞迁移）。

活性显微镜与胰腺内成像窗口相结合，可提供长期组织稳定性，使高分辨率成像的采集能够跟踪单个小岛长达三周。窗户植入C57黑色6N小鼠与静脉注射抗CD31抗体，与Alexa 647荧光素结合，促进大面积成像和放大胰腺的3D成像。在相邻血管的胰腺组织平均图像中识别出阴性细胞，分别使用自发光和抗CD31抗体进行可视化。

使用马赛克成像方法，将广域视图与高分辨率成像相结合，在 MIP-GFP 鼠标中可视化大约 40 到 50 个小岛与相邻的血管。先前的研究表明，使用这种稳定的成像方法，可以跟踪小岛长达三周。为了可视化癌细胞，PANC-1核酸红细胞在手术过程中被直接植入小鼠胰腺，附近的血管被与Alexa 647结合的抗CD31染色。

使用此协议，生成胰腺癌的广域图像。这有助于划定肿瘤的边缘，以及实现高分辨率的3D图像在单细胞水平。这种方法最关键的一步是巧妙地将胰腺成像窗口植入小鼠体内。

利用荧光小鼠细胞和抗体探针的其他组合，可以识别附近细胞与小岛或取消细胞的动态相互作用。这种方法可以广泛应用于那些在胰腺癌的各种病理生理条件和微观环境中探索胰岛变化的人。