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Neuroscience

वयस्क ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करके सीखने और मेमोरी अध्ययन में संज्ञानात्मक मूल्यांकन के लिए एक साहचर्य लर्निंग टूल के रूप में शटल बॉक्स परख

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62745
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

Summary

सीखना और स्मृति या तो विकास, रोग पर निर्भर, या पर्यावरण की दृष्टि से प्रेरित संज्ञानात्मक हानि का अध्ययन करने में शक्तिशाली मैट्रिक्स हैं । अधिकांश संज्ञानात्मक आकलन के लिए विशेष उपकरण और व्यापक समय प्रतिबद्धताओं की आवश्यकता होती है। हालांकि, शटल बॉक्स परख एक साहचर्य सीखने का उपकरण है जो वयस्क जेब्राफिश अनुभूति के तेजी से और विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए एक पारंपरिक जेल बॉक्स का उपयोग करता है।

Abstract

बिगड़ा सीखने और स्मृति सहित संज्ञानात्मक घाटे, विभिन्न विकासात्मक और उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों और दर्दनाक मस्तिष्क चोट (टीबीआई) का एक प्राथमिक लक्षण हैं । न्यूरोट्रॉमा के बाद विकास और मजबूत पुनर्योजी क्षमताओं के दौरान उनकी पारदर्शिता के कारण जेब्राफिश एक महत्वपूर्ण तंत्रिका विज्ञान मॉडल है। जबकि जेब्राफिश में विभिन्न संज्ञानात्मक परीक्षण मौजूद हैं, अधिकांश संज्ञानात्मक आकलन जो तेजी से गैर-साहचर्य सीखने की जांच कर रहे हैं। एक ही समय में, साहचर्य सीखने परख अक्सर कई दिनों या हफ्तों की आवश्यकता होती है । यहां, हम एक तेजी से साहचर्य-अधिगम परीक्षण का वर्णन करते हैं जो प्रतिकूल उत्तेजना (इलेक्ट्रिक शॉक) का उपयोग करता है और न्यूनतम तैयारी समय की आवश्यकता होती है। शटल बॉक्स परख, यहां प्रस्तुत, सरल, नौसिखिया जांचकर्ताओं के लिए आदर्श है, और न्यूनतम उपकरणों की आवश्यकता है । हम प्रदर्शित करते हैं कि, टीबीआई के बाद, यह शटल बॉक्स परीक्षण पुन: संज्ञानात्मक घाटे और युवा से पुराने जेब्राफिश तक वसूली का आकलन करता है। इसके अतिरिक्त, परख या तो तत्काल या देरी स्मृति की जांच करने के लिए अनुकूलनीय है । हम प्रदर्शित करते हैं कि एक टीबीआई और दोहराए गए टीबीआई दोनों घटनाएं सीखने और तत्काल स्मृति को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं लेकिन स्मृति में देरी नहीं करते हैं। इसलिए, हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि शटल बॉक्स परख पुन: संज्ञानात्मक हानि की प्रगति और वसूली को ट्रैक करता है।

Introduction

सीखना और स्मृति नियमित रूप से संज्ञानात्मक हानि के मैट्रिक्स के रूप में उपयोग किया जाता है, जो उम्र बढ़ने, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, या चोट के कारण होता है। दर्दनाक मस्तिष्क चोटों (TBIs) सबसे आम चोट है कि संज्ञानात्मक घाटे में परिणाम हैं । टीबीआई कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों, जैसे फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया और पार्किंसंस रोग1,2के साथ उनके सहयोग के कारण बढ़ती चिंता का विषय है। इसके अलावा, कुछ टीबीआई रोगियों में देखे गए बीटा-एमिलॉयड एकत्रीकरण में वृद्धि का सुझाव है कि यह अल्जाइमर रोग3,4के विकास से भी जुड़ा हो सकता है। टीबीआई अक्सर कुंद-बल आघात का परिणाम होता है और हल्के मस्तिष्क चोटों (एमआईटीबीआई) के साथ5गंभीरता की एक श्रृंखला का परिणाम होता है। हालांकि, miTBIs अक्सर असूचित और गलत निदान कर रहे हैं क्योंकि वे केवल एक छोटी अवधि के लिए मामूली संज्ञानात्मक हानि में परिणाम है, और घायल व्यक्तियों को आम तौर पर पूरी तरह से6ठीक हो । इसके विपरीत, बार-बार मिटीबीआई की घटनाएं चिंता का विषय रही हैं क्योंकि यह युवा और मध्यम आयु वर्ग के वयस्कों में अत्यधिक प्रचलित है, समय7के साथ जमा हो सकती है, संज्ञानात्मक विकास को बढ़ा सकती है, और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को बढ़ा सकती है1,2,3,4,5,उन व्यक्तियों के समान जो या तो मध्यम या गंभीर टीबीआई8का अनुभव करते हैं।

जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)न्यूरोसाइंस में विभिन्न विषयों की खोज के लिए एक उपयोगी मॉडल है, जिसमें केंद्रीय तंत्रिका तंत्र9,10, 11, 12,13में खोए या क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स को पुनर्जीवित करने की क्षमता शामिल है। टेलेंसेफेलन में तंत्रिका उत्थान का भी प्रदर्शन किया गया था, जिसमें पृष्ठीय-भीतरी क्षेत्र में आर्किपल्लीम शामिल है। यह न्यूरोएनाटॉमिकल क्षेत्र हिप्पोकैम्पस के अनुरूप है और 14 , 15,16मनुष्यों में मछली में अनुभूति और कम समय की स्मृति के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, ज़ेब्राफिश व्यवहार को बड़े पैमाने पर विशेषता और सूचीबद्ध किया गया है17। सीखने का अध्ययन विभिन्न तकनीकों के माध्यम से किया गया है, जिसमें चौंक प्रतिक्रिया18की आदत शामिल है, जो छोटे ब्लॉकों में प्रदर्शन करते समय और तेजी से क्षय समय19पर ध्यान देने के साथ गैर-संघीय सीखने के तेजी से रूप का प्रतिनिधित्व कर सकता है। इस तरह के टी बक्से, प्लस mazes, और दृश्य भेदभाव20, 21के रूप में साहचर्य सीखने के अधिक जटिल परीक्षणों का उपयोग कियाजाता है,लेकिन अक्सर समय लेने वाली हैं, दिन या तैयारी के सप्ताह की आवश्यकता होती है, और shoaling या सकारात्मक सुदृढीकरण पर भरोसा करते हैं । यहां, हम एक तेजी से प्रतिमान का वर्णन करने के लिए दोनों साहचर्य सीखने और या तो तत्काल या देरी स्मृति का आकलन । यह शटल बॉक्स परख कुंद बल टीबीआई के बाद संज्ञानात्मक घाटे और वसूली का आकलन करने के लिए एक विरोधी उत्तेजना और नकारात्मक सुदृढीकरण कंडीशनिंग का उपयोग करता है । हम प्रदर्शित करते हैं कि अक्षतिग्रस्त नियंत्रण वयस्क ज़ेब्राफ़िश (8-24 महीने) पुन: उत्पन्न रूप से शटल बॉक्स में 20 परीक्षणों (<20 मिनट के मूल्यांकन के भीतर लाल बत्ती से बचने के लिए सीखते हैं, पर्यवेक्षकों में उच्च स्तर की निरंतरता के साथ। इसके अतिरिक्त, शटल बॉक्स का उपयोग करके हम प्रदर्शित करते हैं कि वयस्क (8-24 महीने पुराने) में सीखने और स्मृति क्षमताएं सुसंगत हैं और या तो अलग टीबीआई गंभीरता या दोहराई गई टीबीआई के बीच महत्वपूर्ण हानि के साथ अनुभूति के लिए उपयोगी हैं। इसके अलावा, वयस्क जेब्राफिश में अनुभूति या वसूली को प्रभावित करने वाले रोग प्रगति या दवा हस्तक्षेपों की प्रभावकारिता को ट्रैक करने के लिए इस विधि को एक मीट्रिक के रूप में तेजी से नियोजित किया जा सकता है।

यहां, हम एक त्वरित संज्ञानात्मक मूल्यांकन का एक अनुदेशात्मक अवलोकन प्रदान करते हैं जो तत्काल और विलंबित स्मृति दोनों के संदर्भ में जटिल साहचर्य सीखने (धारा 1) और स्मृति दोनों की जांच कर सकता है। यह प्रतिमान एक विद्वान साहचर्य संज्ञानात्मक कार्य (धारा 2) की लघु और दीर्घकालिक स्मृति का आकलन प्रदान करता है।

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Protocol

जेब्राफिश को फ्रीमन लाइफ साइंसेज सेंटर में नोट्रे डेम ज़ेब्राफिश सुविधा में उठाया और बनाए रखा गया था। इस पांडुलिपि में वर्णित तरीकों को नोट्रे डेम एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (एनिमल वेलफेयर एश्योरेंस नंबर A3093-01) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. शटल बॉक्स सीखने प्रतिमान(चित्रा 1A)

नोट: सीखने के प्रतिमान साहचर्य सीखने के बारे में अनुभूति का एक तेजी से आकलन प्रदान करता है ।

  1. एक 45 डिग्री कोण पर प्रत्येक पक्ष में जोड़ा मछलीघर ग्रेड प्लेक्सीग्लास के एक 5 x 19 सेमी टुकड़ा के साथ एक 30.5 x 19 x 7.5 सेमी जेल बॉक्स को संशोधित करके शटल बॉक्स तैयार करें। टैंक के आधे रास्ते को चिह्नित करने के लिए एक लाइन बनाओ जब मछली टैंक(चित्रा 1B)के बीच को पार कर गया है का आकलन करने के लिए ।
  2. शटल बॉक्स में सिस्टम पानी की 800 एमएल जोड़ें। डिविशनाइज्ड आरओ वाटर के 1 एल में 60 मिलीग्राम इंस्टेंट ओशियन को घोलकर इस पानी को बनाएं। टैंक के बीच में पानी को 5 सेमी की गहराई तक भरें।
    नोट: हर घंटे या 3 मछलियों के परीक्षण के बाद 28 डिग्री सेल्सियस पर ताजा सिस्टम पानी से बदलें।
  3. एक होल्डिंग टैंक में 2-3 मछली रखें जिसमें सिस्टम पानी होता है, जो एक अंधेरे कमरे में स्थित है जहां शटल बॉक्स परख किया जाएगा।
    1. अंधेरे कमरे में, शटल बॉक्स के केंद्र में 1 मछली रखें, ढक्कन सुरक्षित करें, और इलेक्ट्रोड को बिजली की आपूर्ति में संलग्न करें।
      नोट: कमरे में अभिनंदन और परीक्षण के दौरान संभव के रूप में अंधेरा रहना चाहिए ।
  4. 15 मिनट के लिए शटल बॉक्स में मछली को स्वीकार करें।
    नोट: अन्वेषक को अभिनंदन अवधि के दौरान कमरे में रहना चाहिए या परीक्षण से पहले पर्याप्त समय के साथ चुपचाप परीक्षण कक्ष में लौटना चाहिए ताकि मछली को अन्वेषक की उपस्थिति में समायोजित करने की अनुमति दी जा सके । सफल अभिनंदन पर विचार किया जा सकता है जब मछली स्वतंत्र रूप से टैंक की पड़ताल करती है।
    1. यदि मछली का पता लगाने में विफल रहता है, एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए अभिनंदन जारी है । यदि मछली अभी भी शटल बॉक्स को स्वीकार करने में विफल रहती है, तो मछली को हटा दें। इस मछली का उपयोग परीक्षण के लिए न करें।
  5. मैन्युअल रूप से मछली द्वारा कब्जा कर लिया पक्ष पर जेल बॉक्स की दीवार से एक 800-ल्यूमेन लाल लेंस टॉर्च ~ 2 सेमी चमक, अभिनंदन के बाद।
    नोट: एक परीक्षण शुरू नहीं अगर मछली शटल बॉक्स के गहरे सिरों के पास दीवार के खिलाफ प्लेटिनम तार के बगल में आराम कर रहा है ।
  6. मछली पर सीधे प्रकाश उत्तेजना चमक और मैन्युअल रूप से उत्तेजना(चित्रा 1C)के नित्य दृश्य सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश के साथ मछली के किसी भी पार्श्व आंदोलन का पालन करें । जब तक निम्नलिखित स्थितियों में से किसी को पूरा नहीं किया जाता है तब तक प्रकाश उत्तेजना प्रदान करना जारी रखें।
    1. निशान सफल पर विचार करें अगर मछली प्रकाश जोखिम के 15 एस के भीतर टैंक के आधे रास्ते पर पार । एक बार जब मछली आधे रास्ते को पार कर जाती है, तो प्रकाश उत्तेजना को तुरंत बंद करदें (चित्रा 1D)।
    2. निशान के रूप में विफल पर विचार करें अगर मछली 15 एस में बॉक्स के आधे रास्ते पर पार नहीं करता है । इस मामले में, एक इलेक्ट्रोफोरेसिस बिजली की आपूर्ति का उपयोग करने के लिए एक नकारात्मक सदमे उत्तेजना (20 mV: 1 ए) बारी पर 2 एस, एक 15 एस अवधि के लिए बंद के 2 एस (4 झटके की अधिकतम), या जब तक मछली बॉक्स के आधे रास्ते बिंदु गुजरता है, जिस पर बिंदु दोनों प्रकाश और नकारात्मक उत्तेजना समाप्त ।
  7. मछली को 30 एस के लिए आराम करने दें और 1.5-1.6.2 को दोहराएं। सफल परीक्षणों (1.6.1) और असफल परीक्षणों (1.6.2) के क्रम का एक विस्तृत रिकॉर्ड रखें।
    नोट: यहां, हम लगातार 5 सफल परीक्षणों के पूरा होने के रूप में सीखने को परिभाषित किया । एक बार सीखने का प्रदर्शन किया गया है, मछली शटल बॉक्स से हटा दिया जाना चाहिए और मानवीय इच्छामृत्यु ।

2. स्मृति प्रतिमान(चित्रा 1A)

नोट: यह प्रतिमान एक विद्वान साहचर्य संज्ञानात्मक कार्य की छोटी और दीर्घकालिक स्मृति का आकलन प्रदान करता है।

  1. प्रशिक्षण अवधि
    1. शटल बॉक्स में सिस्टम पानी की 800 एमएल जोड़ें। डिविशनाइज्ड आरओ वाटर के 1 एल में 60 मिलीग्राम इंस्टेंट ओशियन को घोलकर इस पानी को बनाएं। टैंक के बीच में पानी को 5 सेमी की गहराई तक भरें।
      नोट: पानी को हर घंटे 28 डिग्री सेल्सियस पर या 3 मछलियों के परीक्षण के बाद ताजा सिस्टम पानी से बदला जाना चाहिए।
    2. एक होल्डिंग टैंक में 2-3 मछली रखें जिसमें सिस्टम का पानी होता है, एक अंधेरे कमरे में स्थित है जहां शटल बॉक्स परख किया जाएगा।
    3. अंधेरे कमरे में, शटल बॉक्स के केंद्र में 1 मछली रखें, ढक्कन सुरक्षित करें, और इलेक्ट्रोड को बिजली की आपूर्ति में संलग्न करें।
      नोट: कमरे में अभिनंदन और परीक्षण के दौरान संभव के रूप में अंधेरा रहना चाहिए ।
    4. 15 मिनट के लिए शटल बॉक्स में acclimate मछली ।
      नोट: अन्वेषक को अभिनंदन अवधि के दौरान कमरे में रहना चाहिए या मछली को अन्वेषक की उपस्थिति में समायोजित करने की अनुमति देने के लिए परीक्षण करने से पहले पर्याप्त समय के साथ चुपचाप परीक्षण कक्ष में लौटना चाहिए। सफल अभिनंदन निर्धारित करें जब मछली स्वतंत्र रूप से टैंक की खोज कर रही है।
    5. यदि मछली का पता लगाने में विफल रहता है, एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए अभिनंदन जारी है । यदि मछली अभी भी शटल बॉक्स को स्वीकार करने में विफल रहती है, तो मछली को हटा दें और परीक्षण के लिए इसका उपयोग न करें।
    6. सफल अभिनंदन के बाद, मछली द्वारा कब्जा किए गए शटल बॉक्स के किनारे, जेल बॉक्स साइड वॉल से मैन्युअल रूप से 800-ल्यूमेन लाल लेंस टॉर्च ~ 2 सेमी चमकाएं।
    7. मछली पर सीधे प्रकाश उत्तेजना चमक और मछली द्वारा उत्तेजना के नित्य दृश्य सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश के साथ मछली के किसी भी पार्श्व आंदोलन का पालन करें।
    8. जबकि प्रकाश मछली पर चमक रहा है, साथ ही प्रतिकूल सदमे उत्तेजना (20 mV:1 ए) बारी 2 एस पर, 2 एस 15 एस (4 झटके की अधिकतम) के लिए बंद, या जब तक मछली बॉक्स के आधे रास्ते से गुजरता है लागू होते हैं । एक बार यह प्राप्त हो जाने के बाद, प्रकाश और प्रतिकूल उत्तेजना दोनों को समाप्त करें।
      नोट: मछली को 30 एस के लिए आराम करने की अनुमति दें, फिर 25 पुनरावृत्तियों(चित्रा 1A)के लिए चरण 2.1.6-2.1.8 दोहराएं।
  2. प्रारंभिक परीक्षण
    1. प्रशिक्षण अवधि के बाद मछली को 15 मिनट आराम की अनुमति दें। उन्हें शटल बॉक्स से न हटाएं। इस विश्राम अवधि के तुरंत बाद प्रत्येक परीक्षण को कड़ाई से पास/असफल के रूप में रिकॉर्ड करके प्रारंभिक स्मृति प्रतिधारण का परीक्षण करें ।
    2. 15 एस तक के लिए केवल प्रकाश उत्तेजना लागू करें और प्रतिक्रियाओं को इस प्रकार रिकॉर्ड करें।
      1. परीक्षण सफल पर विचार करें यदि मछली प्रकाश उत्तेजना शुरू करने के बाद 15 एस के भीतर शटल बॉक्स के आधे रास्ते पर पार करती है। जब मछली आधे रास्ते को पार करती है तो प्रकाश उत्तेजना को तुरंत रोकें।
      2. परीक्षण के रूप में विफल विचार अगर मछली प्रकाश उत्तेजना शुरू करने के बाद शटल बॉक्स 15 एस के आधे रास्ते बिंदु पर पार नहीं करता है । 15 एस के बाद प्रकाश उत्तेजना बंद करो।
        नोट: प्रारंभिक परीक्षण के दौरान, एक असफल प्रयास के बाद एक प्रतिकूल उत्तेजना लागू नहीं किया जाता है।
    3. परीक्षणों के बीच 30 एस आराम की अवधि के साथ चरण 2.2.2 दोहराएं, और 25 परीक्षणों में सफल परीक्षण (2.2.2.1) और असफल परीक्षणों (2.2.2.2) को रिकॉर्ड करें। यह मूल्य प्रत्येक मछली के लिए एक व्यक्तिगत संदर्भ के रूप में काम करेगा।
  3. तत्काल स्मृति
    1. पसंदीदा क्षति प्रतिमान (उदाहरण के लिए, संशोधित मारमारू वजन ड्रॉप का उपयोग करके एक कुंद-बल आघात) द्वारा प्रारंभिक परीक्षण अवधि के तुरंत बाद चोट को प्रेरित करें। एक आसान पहचान के लिए व्यक्तिगत रूप से घर मछली। उनके प्रारंभिक परीक्षण मूल्यों को रिकॉर्ड करें और मछली को पशु सुविधा में वापस करें।
      नोट: मछली कुंद बल टीबीआई से घायल हो गए थे के रूप में पहले22वर्णित है ।
    2. पशु सुविधा से प्रारंभिक परीक्षण और/या 4 घंटे के बाद चोट (या प्रश्न में प्रयोगात्मक समय सीमा पर) के बाद 2-3 अक्षतिग्रस्त या टीबीआई मछली 4 घंटे इकट्ठा करें । सिस्टम पानी युक्त अलग-अलग टैंकों में अंधेरे कमरे में सभी मछलियों को रखें।
    3. शटल बॉक्स के केंद्र में मछली रखें (सिस्टम पानी के साथ तैयार के रूप में १.१ में वर्णित), एक समय में एक मछली, और ढक्कन सुरक्षित । बिजली की आपूर्ति संलग्न करें और मछली को 15 मिनट के लिए स्वीकार करने की अनुमति दें।
    4. अभिनंदन के बाद, तत्काल स्मृति का आकलन करें (कड़ाई से पास/असफल) 15 एस तक के लिए केवल प्रकाश प्रोत्साहन लागू करने और प्रतिक्रियाओं को इस प्रकार रिकॉर्ड करें ।
      1. परीक्षण सफल पर विचार करें यदि मछली 15 एस परीक्षण अवधि के भीतर बॉक्स के आधे रास्ते पर पार करती है। आधे रास्ते को पार करने पर प्रकाश उत्तेजना समाप्त करें।
      2. परीक्षण के रूप में विफल पर विचार करें अगर मछली प्रकाश उत्तेजना शुरू करने के 15 एस के भीतर बॉक्स के आधे रास्ते बिंदु पर पार नहीं करता है । 15 एस अवधि समाप्त होने के बाद प्रकाश उत्तेजना को समाप्त करें।
        नोट: इस चोट के बाद परीक्षण के दौरान, प्रतिकूल सदमे उत्तेजना एक असफल प्रयास के बाद लागू नहीं किया जाता है ।
    5. परीक्षणों के बीच 30 एस बाकी अवधि के साथ कदम 2.3.4 दोहराएं, और 25 परीक्षणों में सफल परीक्षणों (2.3.4.1) और असफल परीक्षणों (2.3.4.2) की संख्या रिकॉर्ड करें।
    6. समीकरण का उपयोग कर प्रारंभिक परीक्षण अवधि के लिए चोट के बाद सफल परीक्षणों में प्रतिशत अंतर की गणना करें:
      Equation 1
  4. देरी से स्मृति
    1. मछली वापसी, आसान पहचान और उनके प्रारंभिक परीक्षण मूल्यों की रिकॉर्डिंग के लिए व्यक्तिगत रूप से रखे, पशु सुविधा के लिए तुरंत प्रारंभिक परीक्षण अवधि के बाद ।
    2. प्रारंभिक परीक्षण और चोट और/या देरी स्मृति परीक्षण के बीच मछली 4 दिन (या प्रश्न में प्रयोगात्मक समय सीमा) की अनुमति दें ।
    3. पसंदीदा क्षति प्रतिमान द्वारा चोट को प्रेरित करें (जैसे कि कुंद-बल आघात को प्रेरित करने के लिए संशोधित मारमारू वजन ड्रॉप)। प्रारंभिक परीक्षण मूल्यों की आसान पहचान के लिए व्यक्तिगत रूप से घर मछली, और पशु सुविधा के लिए मछली वापसी ।
      नोट: मछली कुंद बल टीबीआई से घायल हो गए थे के रूप में पहले22वर्णित है ।
    4. पशु सुविधा से प्रारंभिक परीक्षण और/या 4 घंटे के बाद चोट (या प्रश्न में प्रयोगात्मक समय सीमा पर) के बाद 2-3 अक्षतिग्रस्त या टीबीआई मछली 4 घंटे इकट्ठा करें ।
    5. सिस्टम पानी युक्त व्यक्तिगत टैंकों में अंधेरे कमरे में सभी मछली रखें, और शटल बॉक्स के केंद्र में एक समय में एक रखें (सिस्टम के पानी के साथ तैयार जैसा कि 1.1 में वर्णित है), ढक्कन को सुरक्षित करें, बिजली की आपूर्ति संलग्न करें, और मछली को 15 मिनट की अनुमति दें।
    6. अभिनंदन के बाद, 15 एस तक के लिए केवल प्रकाश उत्तेजना लागू करके तत्काल स्मृति (कड़ाई से पास/असफल) का आकलन करें और निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें:
      1. यदि मछली 15 एस परीक्षण अवधि के भीतर बॉक्स के आधे रास्ते पर पार कर जाती है तो ट्रेल को सफल समझें। आधे रास्ते को पार करने पर प्रकाश उत्तेजना समाप्त करें।
      2. यदि मछली प्रकाश उत्तेजना शुरू करने के 15 एस के भीतर बॉक्स के आधे रास्ते पर पार नहीं करती है, तो विफल के रूप में निशान पर विचार करें, प्रकाश उत्तेजना को समाप्त करें।
        नोट: इस चोट के बाद परीक्षण के दौरान, एक असफल प्रयास के बाद एक प्रतिकूल सदमे उत्तेजना लागू नहीं किया जाता है ।
    7. परीक्षणों के बीच 30 एस बाकी अवधि के साथ चरण 2.4.6 दोहराएं, और 25 परीक्षणों में सफल परीक्षणों (2.4.6.1) और असफल परीक्षणों (2.4.6.2) की संख्या रिकॉर्ड करें।
    8. समीकरण के साथ प्रारंभिक परीक्षण अवधि के लिए चोट के बाद के सफल परीक्षणों में प्रतिशत अंतर की गणना करें:
      Equation 2

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Representative Results

प्रोटोकॉल और योजनाबद्ध(चित्रा 1)में उल्लिखित अधिगम प्रतिमान, साहचर्य सीखने के संबंध में अनुभूति का तेजी से आकलन प्रदान करता है। इसके अलावा, इस प्रतिमान में लगातार 5 सकारात्मक परीक्षणों के दोहराए गए और लगातार प्रदर्शन के रूप में सीखने को परिभाषित करके, स्ट्रिंग का एक उच्च स्तर है। यह प्रतिमान उम्र और चोटों की एक श्रृंखला पर भी लागू होता है। 8 महीने (युवा वयस्क), 18 महीने (मध्यम आयु वर्ग के वयस्क), और 24 महीने (बुजुर्ग वयस्क) पर अक्षतिग्रस्त मछली लाल बत्ती से बचने के व्यवहार को जानने के लिए परीक्षणों की एक समान संख्या की आवश्यकता (अक्षतिग्रस्त 8 मीटर: 15.28 ± 4.92 परीक्षण, 18 मीटर: 17.66 ± 5.5 परीक्षण, 24 मीटर: 16.2 ± 4.79 परीक्षण, 8 मीटर बनाम 18 मीटर पी = 0.92, 8 मीटर बनाम 24 मीटर पी=0.98, 18 मीटर बनाम 24 मीटर पी = 0.97, चित्रा 2A)। हमने एक गंभीर कुंद-बल दर्दनाक मस्तिष्क चोट (एसटीबीआई) मॉडल22 का भी उपयोग किया और देखा कि विभिन्न उम्र में मछली को चोट के बाद 1-5 दिनों में परख में महारत हासिल करने के लिए समान संख्या में परीक्षणों की आवश्यकता होती है (डीपीआई; 8 मीटर बनाम 18 मीटर, पी = 0.09, 8 मीटर बनाम 24 मीटर, पी = 0.96, 18 मीटर बनाम 24 मीटर, पी = 0.12, चित्रा 2 ए)। एसटीबीआई के बाद 1 दिन में, सभी उम्र की मछली (8, 18 और 24 मीटर) व्यवहार (8 मीटर: 73.3 ± 9.45 परीक्षणों) को जानने के लिए समान संख्या में परीक्षणों की आवश्यकता होती है, 18 मीटर: 79.33 ± 6.35 परीक्षण, 24 मीटर: 68.25 ± 6.65 परीक्षण, 8 मीटर बनाम 18 मीटर पी = 0.71, 8 मीटर बनाम 24 मीटर पी=0.76, 18 मीटर बनाम 24 मीटर पी=0.28, चित्रा 2ए) और वे सभी अक्षतिग्रस्त नियंत्रण (पी<0.01) से काफी अधिक थे। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि शटल बॉक्स का उपयोग उम्र सीमाओं में चोट से प्रेरित संज्ञानात्मक घाटे की जांच करने के लिए किया जा सकता है और सुझाव है कि वयस्क जेब्राफिश कुंद बल चोट के बाद संज्ञानात्मक रूप से ठीक हो सकता है ।

क्योंकि दोहराया MITBI घटनाओं तेजी से संज्ञानात्मक समारोह ख़राब कर सकते हैं, हम दोहराव टीबीआई का उपयोग कर खुराक पर निर्भर प्रगति को ट्रैक करने के लिए एक मीट्रिक के रूप में शटल बॉक्स परख का इस्तेमाल किया । हम इस परख कार्यरत एक miTBI कुंद बल चोट22 कि समय की विभिन्न लंबाई के लिए दैनिक दोहराया जाता है के बाद सीखने का आकलन करने के लिए । जैसा कि पहले देखा गया था, अक्षतिग्रस्त मछली ने तेजी से शटल-बॉक्स को 16.4 ± 3.5 परीक्षणों(चित्रा 2B)में लगातार 5 सकारात्मक परीक्षणों को प्राप्त करने में महारत हासिल की। एक दिन एक ही miTBI के बाद, मछली व्यवहार (४०.२५ ± १२.६५ परीक्षणों, पी<०.०५, चित्रा 2B) सीखनेके लिए परीक्षणों की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित करती है । 2 miTBI घटनाओं (४८ ± १४.९ परीक्षणों) के बाद यह घाटा बढ़ा और 3 miTBI चोटों (५६.६३ ± १२.७५ परीक्षणों, चित्रा 2B)के बाद और अधिक बढ़ा दिया गया था । इसके अतिरिक्त, हमने miTBI मछली के बीच संज्ञानात्मक हानि में उल्लेखनीय वृद्धि देखी, जिसे एक विलक्षण चोट और 3 चोटें (पी<0.05) प्राप्त हुईं।

हमने यह भी जांच की कि तत्काल और विलंबित स्मृति प्रतिमान(चित्रा 1A)के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करके बार-बार मिटीबीआई घटनाओं के बाद स्मृति कैसे प्रभावित हुई। भोली अक्षतिग्रस्त मछली को प्रशिक्षण अवधि और प्रारंभिक परीक्षण अवधि दी गई थी, जिसके बाद मछली का एक हिस्सा तत्काल स्मृति के लिए घायल हो गया था और अन्य को देरी से स्मृति(चित्रा 2C)तक पहुंचने के लिए 4 दिनों के लिए मछली की सुविधा में वापस कर दिया गया था । अक्षतिग्रस्त मछली दोनों तत्काल स्मृति (6.22% ± 4.7%) और देरी स्मृति (5.57%) ± 6.13% प्रारंभिक परीक्षण अवधि के सापेक्ष सफल परीक्षणों के प्रतिशत अंतर में मामूली वृद्धि का प्रदर्शन। हम, तो कई कुंद बल टीबीआई घटनाओं के प्रभाव की जांच की स्मृति पर था । तत्काल स्मृति में miTBI के बाद महत्वपूर्ण घाटे देखे गए, लेकिन देरी से स्मृति में नहीं । एक ही miTBI के बाद, मछली महत्वपूर्ण तत्काल स्मृति घाटे (-२६.७७% ± ८.९३%) अक्षतिग्रस्त मछली (पी<0.0001, चित्रा 2C) कीतुलना में प्रदर्शित किया । यह प्रवृत्ति 2x miTBI (-३७.४२% ± १०.०१%) और 3x miTBI (-३९.७१% ± ११.३९%) के बाद बढ़ते घाटे के साथ दोहराया चोट के साथ जारी रखा । इसके अलावा, हमने एक (1x) miTBI और 3x miTBI (पी<०.०५, चित्रा 2C)के साथ इलाज मछली के बीच एक समान खुराक प्रभाव देखा । इन आंकड़ों से पता चलता है कि चोटों की बढ़ती संख्या के साथ मिटी मछली में सीखने और स्मृति को कम किया जाता है, जिससे घाटा काफी बढ़ जाता है और ऊपर वर्णित शटल बॉक्स परख और प्रोटोकॉल इन मतभेदों का पता लगाने के लिए काफी संवेदनशील हैं ।

Figure 1
चित्रा 1:शटल बॉक्स परख। (क)संज्ञानात्मक मूल्यांकन के लिए अधिगम और स्मृति प्रतिमानों का अनुदेशात्मक अवलोकन । (ख)शटल बॉक्स परख के लिए एक परिवर्तित बड़े डीएनए जेल बॉक्स की योजनाबद्ध । (C,D) परीक्षणों के दौरान उत्तेजनाओं के आवेदन का चित्रमय प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:जेब्राफिश कुंद-बल टीबीआई के बाद संज्ञानात्मक घाटे का प्रदर्शन करता है। (ए)एसटीबीआई के बाद, 8, 18 और 24 महीने की उम्र में जेब्राफिश सीखने की कमी को प्रदर्शित करता है जो आयु समूहों के बीच काफी अलग नहीं हैं। उम्र से मेल खाते नियंत्रण की तुलना में शटल बॉक्स प्रतिमान जानने के लिए परीक्षणों की संख्या में महत्वपूर्ण वृद्धि 1 डीपीआई पर 4-5 डीपीआई द्वारा अक्षतिग्रस्त स्तर पर लौटने पर देखी गई। (B,C) बार-बार मिटीबी मछली ने खुराक पर निर्भर तरीके से सीखने(बी)और मेमोरी(सी)घाटे दोनों को प्रदर्शित किया । एसईएम ± मतलब ए और बीमें प्लॉट किया जाता है , जबकि मानक विचलन ± मतलब सी में प्लॉट किया जाताहै । सभी तीनों रेखांकनों पर प्रत्येक डेटा बिंदु एक वयस्क जेब्राफिश का प्रतिनिधित्व करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण या तो एक तरह से या दो तरह से ANOVA के साथ किया गया एक Tukey पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद । # p<0.05, ## p<0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

संज्ञानात्मक हानि जीवन की गुणवत्ता को काफी और नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। जनसंख्या में बढ़ी हुई दृश्यता और दर्दनाक मस्तिष्क चोटों की घटना के कारण, यह समझना महत्वपूर्ण है कि वे संज्ञानात्मक हानि का कारण कैसे बनते हैं और नुकसान को कैसे कम या उलट दिया जा सकता है। इन कारणों से, संज्ञानात्मक गिरावट के लिए परीक्षण किए जा सकने वाले मॉडल जीव इन अध्ययनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कृंतक लंबे समय से न्यूरोबिहेवियर और अनुभूति की जांच करने के लिए प्राथमिक मॉडल रहे हैं, हालांकि, जेब्राफिश विकास, आयु से संबंधित, और प्राप्त संज्ञानात्मक घाटे की एक श्रृंखला की जांच करने के लिए कई अलग व्यवहार के साथ एक उपयोगी मॉडल के रूप में उभरा है17,20,23,24,25,26। अनुभूति का आकलन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग एक आयामी सीखने से आदत के रूप में, जटिल सीखने और स्थानिक स्मृति, उपन्यास वस्तु और स्थान मान्यता,और निर्णय लेने18,19,20,27,28तक किया गया है। हालांकि, ये संज्ञानात्मक परीक्षण गैर-साहचर्य अनुभूति का परीक्षण करने तक सीमित हैं या एक जटिल सेट-अप, उपकरणों में वित्तीय निवेश, या परीक्षणों से पहले एक व्यापक समय प्रतिबद्धता की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, शटल बॉक्स और सीखने और स्मृति प्रतिमान यहां वर्णित एक जटिल साहचर्य सीखने परख है कि लागत प्रभावी है, एक तेजी से मूल्यांकन, और आसानी से एक नौसिखिया अन्वेषक द्वारा नियोजित का उपयोग करें । सबसे महत्वपूर्ण बात, अन्य संज्ञानात्मक परीक्षणों के अनुरूप, हमारी परख दर्शाता है कि अक्षतिग्रस्त मछली तेजी से साहचर्य कार्य सीखती है और बाद में रुक-रुक कर प्रशिक्षण29के बिना कार्य दिवसों को स्मृति कर सकती है।

परख की अनुकूलनशीलता रोग प्रगति या मशीनी हस्तक्षेप के एक मीट्रिक के रूप में सीखने और स्मृति के विभिन्न समय बिंदुओं की जांच करने के लिए रास्ते प्रदान करता है। परख की दो प्राथमिक विशेषताएं हैं। सबसे पहले, विधि सरल है। परख जल्दी से स्थापित है और सफल और असफल परीक्षणों के संबंध में स्पष्ट और अलग अंत अंक है, यह जांचकर्ताओं की एक श्रृंखला के लिए सुलभ बना रही है । हमने पाया कि इस परख की सादगी के कारण, शटल बॉक्स का सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए बहुत कम समस्या निवारण की आवश्यकता है। दूसरा, परख अन्य संज्ञानात्मक परीक्षाओं की तुलना में बहुत जल्दी है, जो लचीलापन प्रदान करता है या एक ही दिन में तेजी से बड़ी संख्या में मछली की जांच करने की क्षमता प्रदान करता है। सीखने का आकलन करने का समय न्यूनतम 19.75 मिनट(चित्रा 1)पर है, जिसमें मछली को शटल बॉक्स (टैंक अन्वेषण द्वारा निर्धारित) को स्वीकार करने के लिए 15 मिनट की आवश्यकता होती है, इसके बाद एक असफल परीक्षण (15 एस प्रकाश उत्तेजना, 15 एस घृणा उत्तेजना, परीक्षणों के बीच 30 एस) और 5 तत्काल और लगातार सकारात्मक परीक्षण (<15 एस प्रकाश उत्तेजना)। व्यवहार में, हमने देखा कि अक्षतिग्रस्त मछली को 6-30 परीक्षणों (19.75 मिनट-43.75 मिनट) की आवश्यकता होती है, जबकि चरम मामलों में (गंभीर कुंद-बल आघात के बाद), सबसे गंभीर घाटे को 100 परीक्षणों (113.75 मिनट) की आवश्यकता हो सकती है। मेमोरी स्टडीज भी तेजी से की जाती है। प्रोटोकॉल रूपरेखा के बाद, अभिनंदन, प्रशिक्षण और प्रारंभिक परीक्षण के लिए आवश्यक न्यूनतम समय 67.5 मिनट (15 मिनट अभिनंदन, 15 एस के लिए प्रकाश और सदमे के 25 पुनरावृत्तियों, परीक्षणों के बीच 30 एस आराम, और प्रतिकूल उत्तेजनाओं के बिना प्रारंभिक परीक्षण के लिए दोहराएं)। जबकि या तो तत्काल या देरी स्मृति पुनर्परीक्षण केवल ३३.७५ मिनट (15 मिनट अभिनंदन, 15 एस के लिए केवल प्रकाश उत्तेजना के 25 पुनः पेशीकरण, और परीक्षणों के बीच 30 एस आराम), चोट, उपचार, या संज्ञानात्मक घाटे की परवाह किए बिना की आवश्यकता है ।

न्यूरोबिएवियर का आकलन करते समय, विभिन्न प्रतिमान या तो सकारात्मक या प्रतिकूल उत्तेजनाओं का उपयोग करते हैं। भोजन या सामाजिक संपर्क के रूप में सकारात्मक उत्तेजनाएं, अक्सर शास्त्रीय टी-बॉक्स भूलभुलैया में उपयोग की जाती हैं, एक विद्वान कार्य की मजबूत प्रतिक्रिया में सहायता कर सकती हैं। हालांकि, परख सकारात्मक संघ का उपयोग समय की कीमत पर ऐसा करते हैं । इसके विपरीत, जबकि प्रतिकूल उत्तेजना के जवाब में कंडीशनिंग एक तेजी से सहयोग और मजबूत व्यवहार प्रतिक्रिया प्रदान करता है, यह प्रतिकूल उत्तेजना की कीमत पर है। अक्षतिग्रस्त मछली अक्सर शटल बॉक्स परख जल्दी सीखते हैं और इसलिए झटके की एक कम संख्या के अधीन हैं, और एक परिणाम के रूप में कोई प्रतिकूल घटनाओं है लगता है । हालांकि, गंभीर संज्ञानात्मक घाटे के साथ न्यूरोलॉजिकल रूप से छेड़छाड़ की गई मछली (टीबीआई) को महत्वपूर्ण संख्या में परीक्षणों और बिजली के झटके की आवश्यकता होती है। इन कई झटकों को कभी-कभार टॉनिक-क्लोनिक बरामदगी में परिणाम देने के लिए देखा गया है । शटल बॉक्स के भीतर टॉनिक-क्लोनिक जब्ती का अनुभव करने वाली किसी भी मछली को तुरंत हटा दिया जाना चाहिए और नैतिकता की दृष्टि से इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। इच्छामृत्यु मछली के लिए सभी परीक्षणों, तक और जब्ती घटना सहित, किसी भी सांख्यिकीय विश्लेषण में बाहर रखा जाना चाहिए । इसके अलावा, यह देखने लायक है कि न्यूरोलॉजिकल रूप से क्षतिग्रस्त विषय के लिए विद्युत आघात क्षतिग्रस्त मछली के बीच अनपेक्षित अंतर लागू कर सकता है जो शटल बॉक्स से उत्पंन नहीं होते हैं। इस कारण से, हमारा सुझाव है कि न्यूरोबिहेवियर मूल्यांकन के अधीन सभी मछलियों का उपयोग किसी अन्य मात्रात्मक मीट्रिक (सीरम बायोमार्कर, आईएचसी आदि) के लिए नहीं किया जाना चाहिए। यह समझना भी महत्वपूर्ण है कि सीखने की यह विधि एक दृश्य उत्तेजना पर आधारित है और नुकसान के लिए उपयुक्त नहीं है जो दृश्य सर्किट से समझौता कर सकती है, क्योंकि यह परिणामों को चकित कर देगा।

हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि कुंद-बल टीबीआई के बाद, ज़ेब्राफ़िश एक तेजी से संज्ञानात्मक घाटे का प्रदर्शन करता है जिसके परिणामस्वरूप शटल बॉक्स परख में एक साहचर्य कार्य में महारत हासिल करने के लिए परीक्षण ों में वृद्धि होती है। इसी तरह के तत्काल घाटे टीबीआई के कृंतक मॉडल में देखा जाता है, हालांकि ये घाटे कम हो सकते हैं, वे अक्सर बने रहते हैं और महत्वपूर्ण30रहते हैं। इसके विपरीत, जेब्राफिश चोट के बाद 7 दिनों के भीतर संज्ञानात्मक वसूली प्रदर्शित करता है। वयस्क जेब्राफिश की पुनर्योजी क्षमता9,10 , 11,12,13,14,15, टेलेंसेफेलन31,32के वेंट्रिकुलर/सबवेंट्रिकुलर जोन में ज्ञात न्यूरोजेनिक निकस के साथ अच्छीतरहसे प्रलेखित है। टीबीआई के बाद हमारे परख में देखी गई संज्ञानात्मक वसूली यह पहचानने के लिए आवश्यक परीक्षाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है कि क्या इन न्यूरोजेनिक निकस को उत्तेजित किया जाता है और ऊतक और संज्ञानात्मक वसूली में भूमिका निभाते हैं।

अंत में, शटल बॉक्स साहचर्य सीखने और स्मृति के संबंध में अनुभूति का एक तेजी से आकलन प्रदान करता है । परख न्यूनतम और कॉन्वेंटल उपकरण का उपयोग करता है और तकनीकी रूप से सरल है। भविष्य के अनुप्रयोगों का उपयोग न्यूरोप्रोटेक्शन के साथ-साथ अन्य चोट प्रतिमान या न्यूरोडीजेनेरेटिव मॉडल के संबंध में न्यूरोलॉजिकल रूप से अपमानित मछली के आनुवंशिक और औषधीय हस्तक्षेपों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को अपने विचारशील चर्चा और जेब्राफिश देखभाल और पशुपालन के लिए Freimann जीवन विज्ञान केंद्र तकनीशियनों के लिए हाइड लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में जेब्राफिश रिसर्च के लिए केंद्र, नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था, और राष्ट्रीय नेत्र संस्थान NIH R01-EY018417 (DRH), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप कार्यक्रम (जेटीएच), एलटीसी नील हाइलैंड फैलोशिप ऑफ नोट्रे डेम (जेठ) से अनुदान, फ्रीडम फेलोशिप (जेटीएच) के प्रहरी, और पैट टिलमैन स्कॉलरशिप (जेटीएच) । चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flashlight Ultrafire 9145
Instant Ocean Instant Ocean SS15-10
Large DNA Gel Box Fisher Scientific FB-SB-1316 Shuttle Box
Power Supply Fisher Scientific FB-105

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Hentig, J., Cloghessy, K., Hyde, D. R. Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (173), e62745, doi:10.3791/62745 (2021).

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