Summary
Dette er en tilpasset metode til at identificere kandidat insekt kolonisering faktorer i en Burkholderia gavnlig symbiont. Billeværten er inficeret med et tilfældigt mutantbibliotek genereret via transposon mutagenese, og bibliotekets kompleksitet efter kolonisering sammenlignes med en kontrol dyrket in vitro.
Abstract
Udlede funktionen af gener ved at manipulere deres aktivitet er et vigtigt redskab til at forstå de genetiske fundamenter af de fleste biologiske processer. Fremskridt inden for molekylær mikrobiologi har set fremkomsten af forskellige mutagenese teknikker til manipulation af gener. Blandt dem er transposon-indsættelse sekventering (Tn-seq) et værdifuldt værktøj til samtidig at vurdere funktionaliteten af mange kandidat gener i en uformålt måde. Teknikken har været nøglen til at identificere molekylære mekanismer til kolonisering af eukaryote værter i flere patogene mikrober og et par gavnlige symbionter.
Her er Tn-seq etableret som en metode til at identificere koloniseringsfaktorer i en mutualistisk Burkholderia gladioli symbiont af billen Lagria villosa. Ved bøjning udføres Tn5 transposon-medieret indsættelse af en antibiotikaresistenskassette på tilfældige genomiske steder i B. gladioli. For at identificere effekten af genforstyrrelser på bakteriernes evne til at kolonisere billeværten podes det genererede B. gladioli transposon-mutant bibliotek på billeægene, mens en kontrol dyrkes in vitro i et flydende kulturmedium. Efter at have givet tilstrækkelig tid til kolonisering, dna er udvundet fra in vivo og in vitro dyrkede biblioteker. Efter en DNA-bibliotek forberedelse protokol, dna-prøverne er forberedt til transposon-indsættelse sekventering. DNA-fragmenter, der indeholder transposon-insert kant og flankerende bakteriel DNA er valgt, og mutation steder bestemmes ved sekventering væk fra transposon-insert kant. Endelig, ved at analysere og sammenligne frekvenserne af hver mutant mellem in vivo og in vitro biblioteker, betydningen af specifikke symbiont gener under bille kolonisering kan forudsiges.
Introduction
Burkholderia gladioli kan engagere sig i en symbiotisk tilknytning til Lagria villosa biller, der spiller en vigtig rolle i forsvaret mod mikrobielle antagonister af insektværten4,5,6. Kvindelige biller huser flere stammer af B. gladioli i specialiseret kirtler tilbehør til det reproduktive system. Ved æglægning smører hunnerne B. gladioli-celler på ægoverfladen, hvor antimikrobielle forbindelser produceret af B. gladioli hæmmer infektioner ved entomopatogene svampe4,6. Under sen embryonal udvikling eller tidligt efter larverne luge koloniserer bakterierne cuticular invaginationer på larvernes dorsale overflade. På trods af denne specialiserede lokaliserings- og vertikale transmissionsrute for symbionterne kan L. villosa formentlig også erhverve B. gladioli vandret fra miljøet4. Desuden er mindst tre stammer af B. gladioli blevet fundet i samarbejde med L. villosa4,6. Blandt disse er B. gladioli Lv-StA den eneste, der er modtagelig for dyrkning in vitro.
B. gladioli Lv-StA har et genomstørrelse på 8,56 Mb6 og indeholder 7.468 gener. Hvilke af disse gener er vigtige for B. gladioli bakterier at kolonisere bille vært? For at besvare dette spørgsmål brugte vi transposon-indsættelse sekventering (Tn-seq), en udforskende metode til at identificere betinget væsentlige mikrobielle gener1,2,3. Et mutant bibliotek af B. gladioli Lv-StA blev oprettet ved hjælp af en Tn5 transposon. Gennem bøjning fra Escherichia coli donorceller til B. gladioli Lv-StA, en pRL27 plasmid transporterer Tn5 transposon og en antibiotikaresistens kassette flankeret af omvendte gentagelser blev overført (figur 1). Derved blev der genereret et sæt mutanter, der individuelt bærer forstyrrelser af 3.736 symbiontgener (Figur 2).
Den mutante pool blev inficeret på billeæg for at identificere koloniseringsfaktorerne og blev som kontrol også dyrket in vitro i King's B (KB) medium. Efter at have givet tilstrækkelig tid til kolonisering blev udklækkede larver indsamlet og samlet til DNA-ekstraktion. Dna-fragmenter, der indeholder transposonindsatsen og den flankerende genomiske region B. gladioli Lv-StA, blev udvalgt ved hjælp af en modificeret DNA-biblioteksforberedelsesprotokol til sekventering. Læs kvalitetsbehandling efterfulgt af analyse med DESeq2 blev udført for at identificere specifikke gener, der er afgørende for B. gladioli Lv-StA for at kolonisere L. villosa larver, når de overføres via ægoverfladen.
Protocol
1. Medie- og bufferforberedelse
- Klargør KB- og LB-medier og agarplader som angivet i tabel 1og autoklave ved 121 °C, 15 psi, 20 min.
- Der tilsættes 50 μg/mL filtersteriliseret kanamycin og 300 μM filtersteriliseret 2,6 diaminopimelic syre (DAP) til det autoklavede LB-medium, inden der dyrkes E.coli WM3064 + pRL27.
- Tilsæt 50 μg/mL filtersteriliseret kanamycin til den autoklavede KB-agar for at hælde plader, der er nødvendige for at vælge vellykkede B. gladioli Lv-StA transkonjuganter.
- 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) ved blanding af følgende komponenter: NaCl 8 g/L, KCl 0,201 g/L, Na2HPO4 1,42 g/L og KH2PO4 0,272 g/L. Opløs saltene i destilleret vand, og autoklaven blandingen opløses ved 121 °C, 15 psi, 20 min før brug. Opbevar ved stuetemperatur.
- Der fremstilles en 2x Bind-and-wash buffer ved at opløse følgende komponenter: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA) og 2 M NaCl i destilleret vand. Filtersterilalisere blandingen før brug. Opbevar ved stuetemperatur.
- Forbered 1x Lav-TE ved at opløse 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 0,1 mM EDTA i dobbeltdestilleret vand. Steriliseres ved autoklavering ved 121 °C, 15 psi, 20 min. Opbevar ved stuetemperatur.
2. Bøjning til at generere transposon mutant bibliotek
Figur 1: Bøjningsprotokoltrin. Bøjningsmodtageren Burkholderia gladioli Lv-StA (rød) og donoren Escherichia coli, der indeholder pRL27 plasmid (pink), dyrkes i henholdsvis KB agar og LB suppleret med kanamycin og DAP. Efter bøjningsoverførsel af plasmiden i 12-18 timer ved 30 °C udvælges de transkonjugante B. gladioli-celler på KB, der indeholder kanamycin, og samles. Forkortelser: DAP = 2,6-diaminopimelic syre; Kan = kanamycin. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Under en steril hætte podes en frisk donorkultur af Escherichia coli WM3064 + pRL27 i 10 mL LB medium suppleret med kanamycin og DAP. Pode Burkholderia gladioli Lv-StA modtagerceller i 5 mL KB medium. Inkuber kulturerne ved 30 °C natten over på en shaker ved 250 omdrejninger.
- Efter natten vækst, centrifuge 4 mL af hver af de kulturer på 9.600 × g i 6 min at pellet cellerne. Kassér supernatanten.
- Under en steril hætte vaskes de pelleterede cellekulturer i KB-medium, der indeholder DAP, og genbruger til sidst kulturerne separat i 4 mL KB + DAP medium.
- I et friskt 15 mL rør blandes 250 μL af de vaskede E. coli-donorceller med 1 mL af de vaskede B. gladioli Lv-StA-modtagerceller.
- Spot 10 μL af denne bøjningscelleblanding på KB agarplader, der indeholder DAP. Lad pladen hvile uforstyrret i den sterile hætte ved stuetemperatur i 1 time. Derefter inkuberes pladerne med bøjningspunkterne ved 30 °C i 12-18 timer.
BEMÆRK: Bøjningsperioden kan justeres i henhold til målarten. Men en lang bøjningsperiode øger risikoen for dobbelt indsættelser eller plasmid integration i genomet. For langsomt voksende bakterier, give mulighed for længere bøjning perioder. - Efter inkubation tilsættes 2-4 mL 1x PBS i pladerne under en steril hætte og bruger en celleskraber til at frigive de dyrkede bakterielle bøjningspunkter fra agaren. Pipette konjugeret-celle-mix i 2 mL mikrofuge rør.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 9.600 × g i 2 min. Kassér supernatanten, og vask pelleten to gange i 1 mL 1x PBS ved at pipetter op og ned. Den endelige pille i 1200 μL på 1x PBS. Fortyndinger før plating, hvis antallet af celler i blandingen er over 1 × 104.
- 200 μL af celleblandingen blandes godt og spredes på store KB agarplader (om nødvendigt 6 eller flere) suppleret med kanamycin og inkuberes ved 30 °C natten over.
BEMÆRK: Mål mutantkolonier vises inden for 30 timer på de selektive agarplader. På grund af antibiotikaresistensmarkøren vises kun muterede kolonier på den selektive agarplade. Derfor forventes alle kolonier at være vellykkede transkonjuganter. - Tæl det samlede antal transkonjugankolonier på tre plader og ekstrapoler for at beregne det omtrentlige antal mutanter, der er opnået i alle pladerne. For at øge chancerne for at få et repræsentativt bibliotek skal du sikre dig, at det samlede antal kolonier er flere gange højere end det samlede antal gener i genomet. For at bekræfte bøjningens succes skal du udføre en PCR, der er rettet mod indsættelseskassetten ved hjælp af 10-20 prøvekolonier, som beskrevet i afsnit 3.
BEMÆRK: Målet er at sikre, at antallet af kolonier er mindst 10 gange antallet af gener i hele genomet, i dette tilfælde >75.000 mutanter. Det er dog generelt udfordrende at estimere antallet af kolonier nøjagtigt, der ville svare til et fuldt repræsentativt bibliotek. Antallet af unikke gener muteret er ikke tydeligt på dette tidspunkt, da forstyrrelser i essentielle gener ikke er fanget, er der ofte flere forskellige mutationssteder for det samme gen, og mutationer genereret med Tn5 transposoner er ikke helt tilfældige. - Under en steril hætte skrabe kolonier fra pladerne ved at tilføje 1-2 mL 1x PBS på agaren. Pulje celleblandingen skrabet af pladerne i 50 ML-rør. Vortex biblioteket til at blande grundigt og derefter opdele 4 mL af den poolede mutant bibliotek i flere cryotubes. Der tilsættes 1 mL 70 % glycerol til rørene, og opbevares ved -80 °C.
3. PCR og gel elektroforese for at bekræfte vellykkede indsættelser i B. gladioli Lv-StA
- For at bekræfte tilstedeværelsen af indsættelsen skal du vælge individuelle mutantkolonier fra markeringspladerne i trin 2.9 og udføre en PCR, der er rettet mod indsætningskassetten ved hjælp af primerne i tabel 2. Klargør PCR-masterblandingen i henhold til tabel 3 og sæt betingelser i termocyklussen som beskrevet i tabel 4.
- Kør PCR-produkterne på en 1,6% agarosegel ved elektroforese (250 V, 40 min) for at kontrollere, om de forstærkede DNA-fragmenter er af den forventede længde på 1580 bp.
4. Mutant pool infektion på bille æg
- Bibliotek vaske trin
- Tø en aliquot af den forberedte mutant bibliotek på is. Centrifuge ved 2.683 × g i 10 min og fjern supernatanten. Under en steril hætte vaskes cellerne med 4 mL 1x PBS for at fjerne eventuelle resterende medier fra cellerne. Brug cellerne igen i 4 mL af 1x PBS.
- Tæl antallet af celler i en aliquot af biblioteket ved hjælp af et celletællingskammer. Fortynd en del af biblioteket til 2 × 106 celler/μL i 1x PBS.
- Vortex biblioteket aliquot grundigt at blande hele biblioteket homogent, før du tager den nødvendige volumen.
- Æg kobling sterilisering og in vivo infektion
- Vælg en L. villosa æg kobling. Tæl antallet af æg og fortsæt, hvis koblingen indeholder mere end 100 æg.
- Steriliser hele ægkoblingen.
- Tilsæt 200 μL 70% ethanol og vask forsigtigt æggene i 5 min. Fjern ethanol og vask æggene to gange med autoklavet vand.
- Tilsæt 200 μL 12% blegemiddel (NaOCl) og vask forsigtigt æggene i 30 s. Fjern blegemidlet med det samme og vask æggene igen tre gange med 200 μL autoklavet vand.
- Inrmitér 2 × 106 celler/μL af det vaskede mutantbibliotek på den steriliserede ægkobling (2,5 μL pr. æg).
- To dage efter at de inficerede billelarver lukker, opsamles 1002 nd instar larver pr. 1,5 mL mikrofugerør og opbevares ved -80 °C.
-
In vitro mutant bibliotek kontrol
- Under en steril hætte podes 250 μL på 2 × 106 celler/μL af det vaskede mutantbibliotek i 10 mL KB-medium, der indeholder kanamycin.
- Inkuberes in vitro mutantkulturen ved 30 °C i 20 timer.
BEMÆRK: Beregn inkubationstiden, så den svarer til det omtrentlige antal generationer af WT B. gladioli Lv-StA in vivo under koloniseringen. - Efter inkubationen på 20 timer tilsættes et tilsvarende volumen på 70% glycerol til in vitro mutantkulturen, og den opbevares ved -80 °C.
5. Inficerede biller og in vitro mutant bibliotek DNA udvinding
BEMÆRK: DNA-ekstraktioner blev udført ved hjælp af et DNA- og RNA-rensningssæt i henhold til producentens protokol, der kort er beskrevet nedenfor.
- Homogeniser poolede larver (højst 4 mg pr. mikrofugerør) ved at tilsætte 1-2 mL flydende nitrogen og knuse med en støder.
- Optø de in vitro dyrkede mutantkulturer fra glycerollagre på is. Pellet cellerne ved centrifugering ved 9.600 × g i 10 min før celle lysis.
- Der tilsættes 300 μL vævs- og cellelyisopløsning til in vitro- og in vivoprøverne. Der tilsættes 5 μL på 10 mg/mL Proteinase K, blandingen inkuberes ved 60 °C i 15 min, og læg derefter på is i 3-5 min.
- Tilsæt 150 μL protein nedbør reagens til lysates og vortex grundigt. Pellet proteinrester ved centrifugering ved 9.600 × g i 10 min.
- Supernatanten overføres til et 1,5 mL mikrofugerør. Der tilsættes 500 μL isopropanol til supernatanten, og rørene vendes forsigtigt mindst 40 gange, inden de inkuberes ved -20 °C i 1 time eller natten over.
- Pellet den udfældede DNA ved centrifugering ved 9.600 × g i 10 min. Kassér supernatanten og tilsæt iskold 70% ethanol til DNA-pelleten.
- Centrifuge ved ≥10.000 × g i 5 min. Kassér supernatanten, og lad prøverne lufttørre i mindst 1 time.
- Brug DNA'et igen fra in vitro- og in vivoprøverne i 100 μL lav-TE-buffer.
- Prøverne opbevares ved -20 °C.
6. Forberedelse af biblioteksbiblioteker
BEMÆRK: Protokollen og reagenserne til forberedelse af DNA-biblioteket tilpasses og ændres ud fra instruktionerne fra producenten af DNA-bibliotekets forberedelsessæt.
Figur 2: Skematisk for DNA-bibliotekets forberedelsestrin. Efter klipning og adapter ligation, den ændrede protokol indeholder en streptavidin perle-udvælgelse skridt til at berige DNA-fragmenter, der indeholder indsættelse kassette. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Prøverne fortyndes til 20 ng/μL-koncentration og volumen på 100 μL, og opbevar dem på is.
- Forskydning in vivo og in vitro prøve DNA ved hjælp af en ultralydsenhed. Indstil ultralydsenheden til 70% strøm. Vortex prøverne kort og forskydning i 1 min 30 s.
BEMÆRK: Indstillingerne for ultralydsenheden vil variere mellem instrumenter. I dette tilfælde var fragmentstørrelsen 200-400 bp, hvilket er passende for denne sekventeringsmetode på 150 bp, parret (se trin. 9.1). Forskydningsparametrene kan justeres i henhold til eksperimentatorens krav. - Kontroller, om DNA'et blev klippet til det ønskede størrelsesområde (i dette tilfælde 200-400 bp). 5 μL af det uhørte og forskarnede DNA efter blanding med gelbelastningsfarvestof i et 1:1-forhold på en 1,6% agarosegel, der løber ved 250 V i 40 min (Figur 3A, B).
- Forberedelse af fragmentendere, der kræves til adapter ligation
- Til 50 μL af det forspæde DNA tilsættes de endedagenser, der er angivet i bibliotekets forberedelsessæt: 3 μL af enzymblandingen og 7 μL reaktionsbuffer og blandes godt ved pipettering. Indstil en termisk cycler med opvarmet låg ved ≥ 75 °C, og inkuber prøverne i 30 min ved 20 °C og 30 min ved 65 °C. Hold ved 4 °C.
- Adapter ligation
- Til adapter ligation tilsættes følgende reagenser til produkterne fra slutforberedelsestrinnet: 30 μL Ligation Master Mix, 1 μL Ligation Enhancer og 2,5 μL fortyndet adapter. Blandes grundigt ved rørledning og inkuberes prøven i 15 min ved 20 °C i den termiske cycler med det opvarmede låg af.
- Efter 15 min tilsættes 3 μL af enzymet (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII) (se materialetabellen). Blandingen blandes godt ved pipettering, og prøven inkuberes i 15 min ved 37 °C i en termisk cycler med låget opvarmet ved ≥47 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause ved dette trin, og prøverne kan opbevares ved -20 °C.
- Størrelsesvalg af adapter-ligated DNA-målretningsfragmenter på 250 bp
- Vortex den magnetiske perleopløsning (se materialetabellen)og placer den ved stuetemperatur i 30 minutter før brug.
- Tilsæt 0,3x af perler til 96,5 μL af den ligated DNA-blanding og blandes ved pipettering grundigt. Inkuber perleblandingen i 5 min.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af salte og polyethylenglycol i perleblandingen letter udfældning af DNA-fragmenter på perlerne. Et lavt forhold mellem perler og DNA-molekyler fører til binding af kun større DNA-fragmenter til perlerne. I dette tilfælde er DNA-fragmenter over 250 bp i længden bundet til perlerne. - Placer rørene på en magnetisk stativ til at trække ned perlerne og fjerne DNA-fragmenter af uønsket størrelse. Lad perlerne nøjes i 5 minutter og overfør derefter den klare supernatant til et nyt mikrofugerør (hold supernatanten).
- Tilsæt 0,15x af friske perler til supernatant og blandes ved pipettering godt. Inkuber perleblandingen i 5 minutter og læg derefter rørene på et magnetisk stativ for at trække perlerne bundet til mål-DNA'et. Vent i 5 min og kassér derefter supernatanten (hold perlerne).
BEMÆRK: Dette forhold mellem perler og DNA fører til binding af fragmenter af den ønskede 250 bp størrelse. - Med perlerne på det magnetiske stativ tilsættes 200 μL 80% ethanol (frisklavet) og vent i 30 s. Pipette ud og kassere ethanol vask omhyggeligt uden at forstyrre perlerne på den magnetiske stativ. Gentag dette trin.
- Efter den sidste vask skal du fjerne spor af ethanol fra perlerne og derefter lufttørre perlerne i 2 min, indtil de ser blanke ud, men ikke helt udtørret. Du må ikke overtørre perlerne.
- Fjern rørene fra det magnetiske stativ, og der tilsættes 17 μL på 10 mM Tris-HCl eller 0,1x TE (Low-TE). Bland ved pipetter ~ 10 gange og inkubere blandingen ved stuetemperatur i 2 min.
- Placer rørene tilbage på det magnetiske stativ og vent i 5 min. Når perlerne har slået sig ned, overføre DNA supernatant til et nyt rør.
- PCR I for at tilføje biotin-tag til DNA-fragmenter, der indeholder indsættelseskassetten
- Tilføj et biotinyleret primer-tag til DNA-fragmenter, der indeholder Tn5-indsættelseskassetten, ved hjælp af den transposonspecifikke biotinylerede primer (tabel 5) og en indeksprimer. Klargør PCR-mastermikset i henhold til tabel 6, og følg PCR-betingelserne for den termiske cyklusser, der er angivet i tabel 7.
- Oprydning af PCR I uden valg af størrelse
- Vortex 0,9 x perler og læg dem ved stuetemperatur i mindst 30 minutter før oprydning.
- Tilføj 0,9x perler til PCR produkter og bland grundigt.
- Placer perlerne på en magnetisk stå til at trække ned perlerne.
- Fjern det klare supernatant, og vask perlebundet DNA med 200 μL frisklavet 80% ethanol to gange.
- Fjern ethanol efter vasketrin og luft tørre perlerne, indtil de ser blanke, men ikke for tørre.
- Der tilsættes 32 μL på 10 mM Tris-HCl eller 0,1X TE (Low-TE) og inkuberes perlerne i 5 min. Placer blandingen tilbage på det magnetiske stativ og overfør supernatanten til et nyt mikrofugerør.
- Binding biotinylerede DNA-fragmenter til streptavidin perler
- Resuspend 32 μL af streptavidin perler i 1x Bind-and-wash buffer. Vask perlerne med bufferen tre gange, mens de placeres på et magnetisk stativ.
- Tilsæt 32 μL 2x Bind-og-vask buffer og genbruge perlerne. Hertil kommer 32 μL af de rensede PCR 1-produkter. Bland grundigt og inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
- Placer perle-DNA-blandingen på et magnetisk stativ i 2 min. Pipette ud supernatant som biotin-tagged DNA, der indeholder indsættelse kant binder sig til streptavidin på perlerne.
- Vask perlerne med 500 μL 1x Bind-og-vask buffer og vask derefter perlerne med 200 μL lav-TE. Brug de DNA-bundne perler i 17 μL lav-TE.
- PCR II for at føje adaptere til de fragmenter, der indeholder indsættelseskassettekanten
- Forbered en mastermix, som vist i tabel 8, ved hjælp af indeksprimere og modificerede universal-PCR-primere, der er angivet i tabel 5. Tilsæt 15 μL af de DNA-bundne streptavidinperler fra det foregående trin til PCR-blandingen. Se tabel 7 for de termiske cyklusserforhold.
- Ryd op i PCR-produkterne uden valg af størrelse som angivet i trin 6.8 i denne protokol. Eluter de endelige DNA-produkter i 30 μL molekylært vand.
- Prøverne opbevares ved -20 °C, og brug dem til rækkefølge.
7. Sekventering og analyse
- Sekvens biblioteket ved hjælp af høj-throughput sekventering teknologi. Juster rækkefølgens dybde afhængigt af transposon biblioteksstørrelsen, som nævnt nedenfor. Vurder læsekvaliteten med FastQC7. Vælg aflæsninger, der indeholder Tn5-indsættelseskanten i 5' ende af læsningen, og fjern indsætningskanten ved hjælp af Cutadapt8 og/eller Trimmomatic9.
BEMÆRK: Her blev en parret ende sekventering tilgang brugt til at målrette 150 bp pr læse og i alt 8 Mio læser. For at opnå et repræsentativt datasæt skal du sikre dig, at det samlede antal sekvenserede aflæsninger overstiger det maksimalt mulige antal mutanter i biblioteket, dvs. Som reference sigtede denne protokol mod 40 gange den maksimale biblioteksstørrelse. Andre vellykkede undersøgelser ved hjælp af Tn-seq til et lignende formål sekventeret et samlet antal læser tæt på 25-fold af det faktiske antal unikke indsættelser i den tilsvarende mutant bibliotek22,23. - I betragtning af at mutationer i enderne af gener ikke er funktionelt forstyrrende, trim 5% rabat på begge ender af genanmærkninger af referencegenomet GFF-filen. Kortlæg de trimmede læser til referencegenomet ved hjælp af Bowtie210.
- Beregn antallet af indsættelser ud fra antallet af entydige 5' positioner i justerings BAM-filen.
- Brug FeatureCounts11til at opnå antallet af hitgener for hver replikeret prøve.
- Ved hjælp af DESeq212-pakken i RStudio beregnes forskellen i mutant overflod mellem forskellige forhold.
Representative Results
Host-associerede bakterier kan anvende flere faktorer til at etablere en forening, herunder dem, der formidler vedhæftning, motilitet, chemotaxis, stressresponser eller specifikke transportører. Mens faktorer, der er vigtige for patogen-værtsinteraktioner, er blevet rapporteret for flere bakterier13,14,15,16,17,18, herunder medlemmer af slægten Burkholderia19,20, har færre undersøgelser undersøgt de molekylære mekanismer, der anvendes af gavnlige symbionter til kolonisering21,22,23 . Ved hjælp af transposon indsættelse sekventering, var målet at identificere molekylære faktorer, der gør det muligt for B. gladioli at kolonisere L. villosa biller.
Transposon-medieret mutagenese blev udført ved hjælp af pRL27 plasmid, som bærer en Tn5 transposon og en kanamycin modstand kassette flankeret af invertere gentagne steder. Plasmiden blev indført i mål B. gladioli Lv-StA-cellerne ved bøjning med plasmiddonor E. coli WM3064-stammen (som vist i figur 1). Efter bøjning blev bøjningsblandingen, der indeholder B. gladioli-modtager og E. coli-donorceller, forgyldt på selektive agarplader, der indeholder kanamycin. Fraværet af DAP på pladerne eliminerede donor E. coli-cellerne, og tilstedeværelsen af kanamycin udvalgt til vellykket B. gladioli Lv-StA transkonjuganter. Det samlede B. gladioli Lv-StA mutantbibliotek opnået ved at høste de 100.000 transkonjugankolonier blev forberedt til sekventering ved hjælp af et modificeret DNA-biblioteksforberedelsessæt og tilpassede primere. Figur 2 fremhæver DNA-bibliotekets forberedelsestrin. Sekventering gav 4 Mio parret læser; 3.736 gener ud af 7.468 gener i B. gladioli Lv-StA blev forstyrret.
For at identificere mutanter, der var koloniserings-defekte i værten, blev B. gladioli Lv-StA mutant biblioteket inficeret på billeæg og dyrket in vitro i KB medium som en kontrol. In vivo kolonisering flaskehals størrelse blev beregnet før eksperimentet. Et kendt antal B. gladioli Lv-StA-celler blev inficeret på billeæg, og antallet af koloniserende celler i friskklækkede første instar larver blev opnået ved at plating en suspension fra hver larve og tælle kolonidannende enheder pr. Individ. Disse beregninger blev gjort for at sikre, at antallet af koloniserende celler er nok til at vurdere alle eller en høj procentdel af mutanterne i biblioteket for deres evne til at kolonisere værten. Derudover blev væksttiden mellem in vitro- og in vivo-tilstande normaliseret baseret på antallet af bakteriegenerationer for at gøre disse prøver sammenlignelige.
Efter æggene blev udklækket, blev 1.296 larver indsamlet i 13 pools. De tilsvarende in vitro mutant kulturer blev dyrket og opbevaret som glycerol bestande. DNA af in vivo og in vitro dyrkede mutant biblioteker blev ekstraheret og fragmenteret i en ultralydsenhed. Figur 3 viser størrelsen fordeling af den forskydnings-DNA, hvor størstedelen af fragmenterne spænder mellem 100 og 400 bp, som forventet. Dette trin blev efterfulgt af den ændrede DNA-bibliotek forberedelse protokol til sekventering. Ved hvert trin i protokollen blev koncentrationen af resterende DNA kontrolleret for at sikre, at trinene blev udført korrekt og for at spore tab af DNA. Et kvalitetskontrol (se Materialetabellen)før sekventering afslørede, at DNA-bibliotekerne indeholdt uventet store DNA-fragmenter (>800 bp), og dette var mere udtalt i in vivobibliotekerne. I betragtning af vanskeligheden ved at optimere klyngedannelsen af fragmenter i sekventeringsbanerne var det nødvendigt at øge sekventeringsdybden til 10 Mio parrede aflæsninger i in vivobibliotekerne for at nå det ønskede antal aflæsninger. Analysen af sekventeringsresultaterne viste, at gennemsnitligt 4 Mio læser i in vivobibliotekerne, og 3,1 Mio. Fordelingen af de 24.224 unikke indsættelser på tværs af B. gladioli genomet i det oprindelige bibliotek er vist i figur 4. En analyse foretaget ved hjælp af DESeq2 viste, at overfloden af 271 mutanter var signifikant forskellig mellem in vivo- og in vitro-forholdene.
Figur 3: Agarose geler af en mutant og DNA-biblioteker. (A) Agarose gel med uhørt DNA af en mutant i bane x og en 1 kbp stige til skala. (B) Gel med klippet DNA-bibliotek. Stigens båndstørrelser i første vognbane er angivet i venstre side. De første tre baner a, b og c indeholder forskydning DNA-fragmenter af in vivo biblioteker. Baner d, e, f og g indeholder forskydede DNA-fragmenter af in vitro-bibliotekerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Placering af unikke indsættelsessteder i det oprindelige bibliotek på tværs af de fire replikoner i Burkholderia gladioli Lv-StA genomet. Hver søjle langs x-aksen er placeret på et indsættelsessted. Højden af en søjle langs y-aksen svarer til antallet af aflæsninger, der er knyttet til det pågældende websted. Bemærk, at de to kromosomer og to plasmider er vist i fuld længde og dermed har forskellige skalaer på x-aksen. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kongens B medium / agar | |
| Peptone (sojabønner) | 20 g/L |
| K2HPO4 | 1,5 g/L |
| MgSO4.7H2O | 1,5 g/L |
| Agar | 15 g/L |
| Opløst i destilleret vand | |
| LB medium/agar | |
| Tryptone | 10 g/L |
| Gærekstrakt | 5 g/L |
| NaCl | 10 g/L |
| Opløst i destilleret vand | |
Tabel 1: Mediekomponenter.
| Nej. | Primere | Sekvens | PCR-udglødning temp. (°C) | |
| 1 | tpnRL17–1RC | 5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3' | 58.2 | |
| 2 | tpnRL13-2RC | 5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3' | ||
Tabel 2: Primere til at bekræfte succesen med bøjning.
| Komponent | Volumen (μL) |
| HPLC-renset vand | 4.92 |
| 10x Buffer S (høj specificitet) | 1 |
| MgCl2 (25 mM) | 0.2 |
| dNTPs (2 mM) | 1.2 |
| Primer 1 (10 pmol/μL) | 0.8 |
| Primer 2 (10 pmol/μL) | 0.8 |
| Taq (5 U/μL) | 0.08 |
| Mastermix total | 9 |
| Skabelon | 1 |
Tabel 3: PCR master mix for at bekræfte succesen af bøjning. Forkortelser: HPLC = højtydende flydende kromatografi; dNTPs = deoxynucleoside triphosphat.
| Trin | Temperatur °C | Tidspunkt | Cykler |
| Indledende denaturering | 95 | 3 min. | 1 |
| Denaturering | 95 | 40 s | |
| Udglødning | 58.2 | 40 s | 30 til 35 |
| Forlængelse | 72 | 1-2 min | |
| Endelig forlængelse | 72 | 4 min | 1 |
| Holde | 4 | ∞ | |
Tabel 4: PCR-betingelser for at bekræfte bøjningens succes.
| Primere | Sekvens | Tm °C | Brug | Kilde | |
| Transposon-specifik biotinyleret primer | 5'-Biotin-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3' |
63.5 | 6.7.1. PCR I | Sædvane | |
| Modificeret Universal PCR-primer | 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCCCCCCCCCCC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3' |
62 | 6.10.1. PCR II | Sædvane | |
| Indeksprimer | Se producentens manual | 6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR II | NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Indeks primere sæt 1) | ||
| Adapter | Se producentens manual | 6.5. Adapter ligation | NEBNext Ultra II DNA-bibliotek prep kit til Illumina | ||
Tabel 5: Primere og adapter til PCR I og II under forberedelse af DNA-biblioteket.
| PCR mix | (μL) |
| Adapter-ligated DNA-fragmenter | 15 |
| NEBNext Ultra II Q5 master mix | 25 |
| Indeksprimer (10 pmol/ μL) | 5 |
| Transposon specifik biotinyleret primer (10 pmol/ μL) | 5 |
| Samlet volumen | 50 |
Tabel 6: FORBEREDELSE AF DNA-bibliotek-PCR I master mix.
| Trin | Temperatur | Tidspunkt | Cykler |
| Indledende denaturering | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C | 10 s | 6 til 12 |
| Udglødning | 65 °C | 30 s | |
| Forlængelse | 72 °C | 30 s | |
| Endelig forlængelse | 72 °C | 2 min | 1 |
| Holde | 16 °C | ∞ | |
Tabel 7: Forberedelse af DNA-bibliotek-PCR I og II-forhold.
| PCR mix | (μL) |
| Perlevalgt DNA | 15 |
| NEBNext Ultra II Q5 master mix | 25 |
| Indeksprimer | 5 |
| Modificeret universel PCR-primer | 5 |
| Samlet volumen | 50 |
Tabel 8: Forberedelse af DNA-bibliotek-PCR II master mix.
| Biblioteker | Invivo-1 | Invivo-2 | Invivo-3 | Invitro-1 | Invitro-2 | Invitro-3 | Oprindeligt bibliotek | |
| Nej. af læser (PE) | 56,57,710 | 39,19,051 | 30,65,849 | 35,73,494 | 28,83,440 | 36,61,956 | 46,09,410 | |
| Nej. aflæsninger indeholdende Tn – kant på 5 ' slutningen af Read-1 | 54,15,880 | 37,31,169 | 29,36,247 | 33,00,499 | 27,35,705 | 33,50,402 | 41,53,270 | |
| Bowtie2 samlede justeringshastighed (%) (skrivebeskyttet kun) | 95.53% | 83.71% | 89.87% | 80.79% | 78.00% | 73.06% | 74.92% | |
| Antal entydige indsættelser | 8,539 | 4,134 | 7,183 | 18,930 | 18,421 | 20,438 | 24,224 | |
| Antal gener ramt | 1575 | 993 | 1450 | 2793 | 2597 | 3037 | 3736 | |
Tabel 9: Oversigt over rækkefølgen af output og transposon indsættelse frekvens pr bibliotek. Forkortelse: PE = paired-end.
Discussion
En B. gladioli transposon mutant bibliotek blev genereret for at identificere vigtige værts kolonisering faktorer i symbiotiske samspil mellem L. villosa biller og B. gladioli bakterier. De vigtigste skridt i protokollen var bøjning, host-infektion, DNA-bibliotek forberedelse, og sekventering.
Da mange stammer af Burkholderia er modtagelige for genetisk modifikation vedbøjning 24,25, plasmid transporterer transposon og antibiotika indsættelse kassette blev konjugeret med succes i målet B. gladioli Lv-StA stamme fra E. coli. Tidligere forsøg på transformation ved elektroporation gav meget lav til næsten ingen B. gladioli transformanter. Det er tilrådeligt at optimere transformationsteknikken for målorganismen til effektivt at give et stort antal transformanter.
En runde af bøjning og 40 bøjning pletter forstyrret 3.736 gener i B. gladioli Lv-StA. Set i bakspejlet, flere runder af bøjning ville være nødvendigt at forstyrre de fleste af de 7.468 gener og få et mættet bibliotek. Især inkubationstiden under bøjningen fik ikke lov til at overstige 12-18 timer, hvilket er afslutningen på den eksponentielle vækstfase af B. gladioli. Hvis du tillader bøjning ud over den eksponentielle vækstfase af bakterieceller reducerer chancerne for succes for at opnå transkonjuganter26. Derfor bør bøjningsperioden justeres i henhold til bakterieartens vækst.
For at kunne udføre et eksperiment, der involverer infektion af mutant biblioteker i en vært, er det vigtigt at vurdere den bakterielle befolkning flaskehals størrelse under kolonisering og mangfoldigheden af mutanter i biblioteket før infektion1,2,27. Som forberedelse til eksperimentet anslog vi det mindste antal biller, der skal inficeret, for at have en stor chance for, at hver mutant i biblioteket prøves og får lov til at kolonisere. Den omtrentlige in vivo bakterieproduktionstid og antallet af generationer for eksperimentets varighed blev også beregnet. In vitro-kulturen blev derefter vokset op til et sammenligneligt antal generationer ved at justere inkubationstiden. For et lignende infektionseksperiment hos andre ikke-modelværter er evnen til at opretholde en laboratoriekultur og en konstant kilde til værtsorganismerne ønskelig.
Efter væksten af det mutante bibliotek in vivo og in vitro og prøvesamling blev der udført en modificeret DNA-biblioteksforberedelsesprotokol til transposon indsættelsessekvensering. Ændringen i protokollen involverede design af brugerdefinerede PCR-primere og tilføjelse af PCR-trin for at vælge dna-fragmenter, der indeholder indsætningskassetten. Da protokollen blev tilpasset, øgede yderligere PCR-cyklusser i protokollen risikoen for overamplificering og opnåelse af hybridiserede adapterkortfragmenter i slutbibliotekerne. Derfor anbefales et sidste oprydningstrin (uden størrelsesvalg) efter de to PCR'er, da det hjælper med at fjerne disse fragmenter. Størrelsen fordeling af DNA-biblioteker var stadig bredere end forventet. En forøgelse af sekventeringsdybden gav imidlertid tilstrækkelige data, der blev filtreret under bioinformatikanalysen, hvilket gav tilfredsstillende resultater.
Som transposon-medieret mutagenese genererer tusindvis af tilfældige indsættelser i et enkelt eksperiment, er det muligt at generere et mættet bibliotek af mutanter, der indeholder alle undtagen de mutanter, hvor gener afgørende for bakterievækst er blevet forstyrret. Vi sandsynligvis ikke arbejde med en mættet mutant bibliotek, i betragtning af skøn over væsentlige gener i andre undersøgelser på Burkholderia sp. 28,29. Et ikke-mættet bibliotek hjælper ikke desto mindre med at udforske forskellige kandidatgener til yderligere undersøgelser ved hjælp af målrettet mutagenese. Før forsøgene er det også vigtigt at huske, at nogle transposoner har specifikke indsætningsmålsteder, der øger overfloden af mutanter på visse loci i genomet30. Mariner transposoner er kendt for at målrette AT steder for indsættelse31, og Tn5 transposons har en GC bias32,33. Herunder trin under bioinformatik analyse til at genkende hotspots for transposon indsættelser vil hjælpe med at vurdere enhver fordeling bias.
Selvom tilbøjelige til tilbageslag, en veldesignet transposon indsættelse sekventering eksperiment kan være et kraftfuldt værktøj til at identificere mange betinget vigtige gener i bakterier inden for et enkelt eksperiment. For eksempel blev et dusin gener i Burkholderia seminalis vigtige for undertrykkelsen af orkidéblad nekrose identificeret ved at kombinere transposon mutagenese og genomforskning34. Ud over Burkholderia, flere vedhæftning og motilitet gener og transportører er blevet identificeret som vigtige kolonisering faktorer i Snodgrassella alvi symbionts af Apis mellifera (Honeybee)22, og i Vibrio fischerii symbionter af Euprymna scolopes (Hawaiian bobtail blæksprutte)23 ved hjælp af transposon-indsættelse mutagenese tilgang.
Som en alternativ tilgang, transposon mutagenese kan efterfølges af screening for de enkelte mutanter ved hjælp af selektive medier i stedet for sekventering. Fænotypisk screening eller bioassays at identificere mangler, såsom motilitet, produktion af bioaktive sekundære metabolitter, eller specifikke auxotrophies, er mulige. For eksempel har screening af et Burkholderia insecticola (omfordelt til slægten Caballeronia35) transposon mutantbibliotek været nøglen til at identificere, at symbionterne anvender motilitetsgener til kolonisering af Riptortus pedestris, deres insektvært36. Desuden blev den biosynetiske genklynge til den bioaktive sekundære metabolitcaryoynencin identificeret i Burkholderia caryophylli37ved hjælp af transposon mutagenese og fænotypisk screening. En auxotrofisk mutant af Burkholderia pseudomallei blev identificeret efter transposon mutagenese og screening og er en mulig svækket vaccine kandidat mod melioidosis, en farlig sygdom hos mennesker og dyr38. Således transposon mutagenese og sekventering er en værdifuld tilgang til at studere de molekylære træk af bakterier, der er vigtige for samspillet med deres respektive værter i patogene eller mutualistiske foreninger.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt vedrørende undersøgelsen.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Junbeom Lee for at give E. coli WM3064 + pRL27 stamme til bøjning og vejledning i proceduren, Kathrin Hüffmeier for at hjælpe med fejlfinding under mutant bibliotek generation, og Prof. André Rodrigues for at støtte insekt indsamling og tilladelse erhvervelse. Vi takker også Rebekka Janke og Dagmar Klebsch for støtte i indsamlingen og opdræt af insekterne. Vi anerkender de brasilianske myndigheder for at give følgende tilladelser til adgang, indsamling og eksport af insektprøver: SISBIO-godkendelse Nr. 45742-1, 45742-7 og 45742-10, CNPq-proces nº 01300.004320/2014-21 og 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF og 20BR035212/DF). Denne forskning blev støttet af midler fra German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 og KA2846/6-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
| Agar - Agar | Roth | 5210 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
| Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
| Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
| Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
| Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
| DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
| DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
| dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
| EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
| Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
| Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
| FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
| FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
| Glycerol | Roth | 7530 | |
| K2HPO4 | Roth | P749 | |
| Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
| KCl | Merck | 4936 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904 | |
| MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030 | |
| NaCl | Merck | 6404 | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
| Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
| peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
| Petri plates - 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
| Petri plates - 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
| Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
| Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
| Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
| Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
| Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
| Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
| Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
| USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
| Yeast extract | Roth | 2363 |
References
- Cain, A. K., et al. A decade of advances in transposon-insertion sequencing. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).
- Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments. Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).
- Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
- Flórez, L. V., et al. Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism. Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).
- Flórez, L. V., Kaltenpoth, M. Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia. Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).
- Flórez, L. V., et al. An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles. Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).
- Andrews, S. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Gaytán, M. O., Martínez-Santos, V. I., Soto, E., González-Pedrajo, B. Type three secretion system in attaching and effacing pathogens. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).
- Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. Type VI secretion and anti-host effectors. Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).
- Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease. Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).
- Silva, A. J., Benitez, J. A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).
- Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, Á, Larzábal, M. Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition. Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).
- Jones, C., et al. Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles. Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).
- Takeshita, K., Kikuchi, Y. Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations. Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).
- Powell, J. E., et al. Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).
- Brooks, J. F., et al. Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).
- Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans. BMC Research Notes. 3 (308), (2010).
- Garcia, E. C.
- Headd, B., Bradford, S. A. The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid. Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).
- Van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).
- Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis. mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).
- Wong, Y. -C., et al. Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS. Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).
- Moule, M. G., et al. Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development. mBio. 5 (1), 00926 (2014).
- Ding, Q., Tan, K. S. Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).
- Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons. Mobile DNA. 3, 3 (2012).
- Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs. Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).
- Ará Ujo, W. L., et al. Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli. Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).
- Dobritsa, A. P., Samadpour, M. Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).
- Ohbayashi, T., et al. Insect's intestinal organ for symbiont sorting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).
- Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria. Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).
- Atkins, T., et al. A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis. Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).
