Summary
Qui è descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione del test dello stress mitocondriale e del test della velocità glicolitica in campioni di tessuto retinico ex vivo utilizzando un bioanalizzatore commerciale.
Abstract
La respirazione mitocondriale è una via critica che genera energia in tutte le cellule, in particolare i fotorecettori della retina che possiedono un metabolismo altamente attivo. Inoltre, i fotorecettori mostrano anche un'elevata glicolisi aerobica come le cellule tumorali. Misurazioni precise di queste attività metaboliche possono fornire preziose informazioni sull'omeostasi cellulare in condizioni fisiologiche e negli stati patologici. Sono stati sviluppati saggi basati su micropiastre ad alto rendimento per misurare la respirazione mitocondriale e varie attività metaboliche nelle cellule vive. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono sviluppati per cellule in coltura e non sono stati ottimizzati per campioni di tessuto intatto e per l'applicazione ex vivo. Qui è descritto un protocollo dettagliato passo-passo, che utilizza la tecnologia di fluorescenza basata su micropiastre, per misurare direttamente il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale, nonché il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) come indicatore di glicolisi, nel tessuto retinico ex vivo intatto. Questo metodo è stato utilizzato per valutare con successo le attività metaboliche nella retina del topo adulto e dimostrare la sua applicazione nello studio dei meccanismi cellulari dell'invecchiamento e della malattia.
Introduction
I mitocondri sono organelli essenziali che regolano il metabolismo cellulare, la segnalazione, l'omeostasi e l'apoptosi coordinando molteplici processi fisiologici cruciali1. I mitocondri fungono da centrale elettrica nella cellula per generare adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e fornire energia che supporta quasi tutti gli eventi cellulari. La maggior parte dell'ossigeno cellulare viene metabolizzato nei mitocondri, dove funge da accettore finale di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante la respirazione aerobica. Basse quantità di ATP possono anche essere prodotte dalla glicolisi nel citosol, dove il glucosio viene convertito in piruvato, che può essere ulteriormente convertito in lattato o trasportato nei mitocondri e ossidato in acetil-CoA, un substrato nel ciclo dell'acido tricarbossilico (ciclo TCA).
La retina è uno dei tessuti metabolicamente più attivi nei mammiferi2, che mostra alti livelli di respirazione mitocondriale e un consumo di ossigeno estremamente elevato3. I fotorecettori a bastoncello e cono contengono un'alta densità di mitocondri4 e OXPHOS genera la maggior parte dell'ATP nella retina5. Inoltre, la retina si basa fortemente sulla glicolisi aerobica6,7 convertendo il glucosio in lattato5. I difetti mitocondriali sono associati a varie malattie neurodegenerative8,9; e con le sue elevate richieste energetiche uniche, la retina è particolarmente vulnerabile ai difetti metabolici, compresi quelli che colpiscono OXPHOS4 mitocondriale e glicolisi10. La disfunzione mitocondriale e i difetti della glicolisi sono implicati nelle malattie degenerative della retina11,12 e macular13, nella degenerazione maculare legata all'età10,14,15,16 e nella retinopatia diabetica17,18. Pertanto, misurazioni accurate della respirazione mitocondriale e della glicolisi possono fornire parametri importanti per valutare l'integrità e la salute della retina.
La respirazione mitocondriale può essere misurata attraverso la determinazione del tasso di consumo di ossigeno (OCR). Dato che la conversione del glucosio in piruvato e successivamente in lattato provoca l'estrusione di protoni e l'acidificazione dell'ambiente extracellulare, le misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) forniscono un'indicazione del flusso di glicolisi. Poiché la retina è composta da più tipi di cellule con relazioni intime e sinergia attiva, incluso lo scambio di substrati6, è imperativo analizzare la funzione mitocondriale e il metabolismo nel contesto dell'intero tessuto retinico con laminazione e circuiti intatti. Negli ultimi decenni, gli elettrodi O2 di tipo Clark e altri microelettrodi di ossigeno sono stati utilizzati per misurare il consumo di ossigeno nella retina19,20,21. Questi elettrodi di ossigeno hanno importanti limitazioni nella sensibilità, nella necessità di un grande volume di campione e nella necessità di un'agitazione continua del campione sospeso, che di solito porta alla rottura del contesto cellulare e tissutale. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato utilizzando una tecnica di fluorescenza basata su micropiastre per misurare il metabolismo energetico mitocondriale nel tessuto retinico di topo ex vivo appena sezionato. Consente misurazioni in tempo reale a medio rendimento di OCR ed ECAR contemporaneamente utilizzando un piccolo campione (punzone da 1 mm) di tessuto retinico ex vivo, evitando la necessità di sospensione e agitazione continua.
Qui è dimostrata la procedura sperimentale per il test dello stress mitocondriale e il test della velocità glicolitica su dischi di punzonatura retinica appena sezionati. Questo protocollo consente la misurazione delle attività metaboliche correlate ai mitocondri in un contesto tissutale ex vivo. A differenza dei saggi eseguiti utilizzando cellule in coltura, le letture qui ottenute riflettono il metabolismo energetico combinato a livello tissutale e sono influenzate dalle interazioni tra i diversi tipi di cellule all'interno del tessuto. Il protocollo è stato modificato da una versione precedentemente pubblicata22,23 per adattarsi alla nuova generazione dell'analizzatore a flusso extracellulare a 24 pozzetti Agilent Seahorse (XFe24) con piastra Islet Capture. Anche il mezzo di dosaggio, le concentrazioni del composto di iniezione e il numero/durata dei cicli di analisi sono stati ottimizzati per il tessuto retinico. Viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la preparazione dei dischi di punzonatura retinica. Ulteriori informazioni sulla configurazione del programma e sull'analisi dei dati possono essere ottenute dalla guida per l'utente del produttore24,25,26.
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Protocol
Tutti i protocolli del topo sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee del National Eye Institute (NEI ASP# 650). I topi sono stati alloggiati in condizioni di luce-buio di 12 ore e curati seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, l'Istituto delle risorse animali da laboratorio e la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Cartuccia del sensore idratante e preparazione del mezzo di saggio
- Il giorno prima dell'esperimento, aggiungere 1 mL del mezzo di calibrazione a ciascun pozzetto della piastra di utilità. Posizionare il coperchio Hydro-Booster sulla parte superiore e abbassare la cartuccia del sensore attraverso l'apertura sul coperchio. Verificare che il sensore sia immerso nel mezzo di calibrazione. Incubare la cartuccia del sensore durante la notte in un incubatore privo di CO2 a 37 °C per attivare i fluorofori.
NOTA: per evitare l'evaporazione, l'incubatore viene umidificato mantenendo un vassoio d'acqua all'interno e la cassetta della cartuccia del sensore viene avvolta con un involucro di plastica trasparente. - Preparare il mezzo di analisi ricostituendo il mezzo DMEM di cavalluccio marino con l'aggiunta di glucosio, piruvato e glutammina alle concentrazioni desiderate. Nei saggi riportati in questo articolo, la concentrazione finale dei substrati nel mezzo di saggio è: 6 mM di glucosio, 0,12 mM di piruvato e 0,5 mM di glutammina. Per ogni piastra di analisi, 40 ml del mezzo di saggio vengono preparati freschi il giorno dell'esperimento.
- Impostare il programma di analisi nell'analizzatore seguendo le istruzioni del produttore26. Nel test qui dimostrato, il protocollo è impostato come segue: 5 cicli di misurazioni per la linea di base, quindi iniettare la porta A, seguita da 4 cicli di misurazioni, quindi iniettare la porta B e seguita da 4 cicli di misurazioni. Ogni ciclo è composto da mix (3 min), attesa (2 min) e misura (3 min).
2. Rivestimento di inserti a rete di micropiastra di cattura isolotto
- Preparare la miscela di rivestimento combinando 20 μL del mezzo di attacco cellulare (ad esempio, Cell-Tak) con 171 μL di bicarbonato di sodio 0,1 M e 9 μL di 1 M NaOH.
- Aprire il coperchio della cassetta contenente inserti a rete. Pipetta 8 μL della miscela di rivestimento per ogni inserto di rete. Utilizzare una punta della pipetta per spalmare / distribuire delicatamente la goccia intorno per distribuire equamente la miscela di rivestimento in tutto l'inserto a rete.
- Chiudere la cassetta e lasciare incubare gli inserti a rete a temperatura ambiente per almeno 25 minuti per adsorbimento.
- Lavare l'inserto a rete pipettando 4 mL del mezzo di dosaggio direttamente sugli inserti a rete. Agitare delicatamente la cassetta per assicurarsi che tutti gli inserti in rete vengano lavati con il mezzo di analisi.
- Tenere da parte l'inserto in mesh. È pronto all'uso.
3. Preparazione dei composti per iniezione
- Estrarre aliquote di riserva di Bam15 (10 mM), Rotenone (10 mM), Antimicina A (10 mM) e 2-DG (500 mM) da congelatore -80 °C e scongelare a temperatura ambiente.
NOTA: lo stock 2-DG è pronto per l'uso. Gli altri farmaci devono essere diluiti in scorte di lavoro. - Riscaldare 10 mL del mezzo di saggio a bagnomaria a 37 °C.
- Diluire 10 mM Bam15 stock a 50 μM di stock di lavoro utilizzando una procedura di diluizione in due fasi: mescolare 20 μL di 10 mM stock con 20 μL di DMSO per ottenere 5 mM di stock intermedio. Quindi mescolare 10 μL del materiale intermedio sopra di 5 mM con 990 μL di mezzo di saggio preriscaldato per ottenere lo stock di lavoro finale di 50 μM.
- Diluire e combinare 10 mM Rotenone e 10 mM Antimycin A stock a 10 μM Rotenone/Antimycin A (Rot/AA) stock di lavoro con due fasi di diluizioni: mescolare 10 μL ciascuno di 10 mM Rotenone e 10 mM Antimycin A stock con 80 μL di DMSO per ottenere 1 mM Rot/AA stock intermedio. Quindi mescolare 10 μL del materiale intermedio di cui sopra 1 mM con 990 μL di mezzo di saggio preriscaldato per ottenere lo stock finale di rot/AA da 10 μM.
- Preparare al momento le scorte di lavoro sopra menzionate di composti di iniezione il giorno dell'esperimento e metterle da parte a temperatura ambiente fino al caricamento nelle porte di iniezione della cartuccia del sensore.
4. Dissezione retinica e preparazione del punch retinico
- Eutanasia di un topo mediante asfissia di CO2 seguendo le linee guida AVMA sull'eutanasia27.
NOTA: Non lasciare l'animale in una camera di CO2 più a lungo del tempo necessario per l'eutanasia. - Enucleare gli occhi e metterli in un tampone PBS 1x vecchio di ghiaccio in una capsula di Petri e poi metterlo sotto un microscopio di dissezione.
- Rimuovere con cura, tagliando con microscissori, i muscoli retti extra attaccati all'esterno del bulbo oculare e tagliare il nervo ottico.
- Utilizzare un ago da 30 G per perforare un foro sul bordo della cornea (limbus); questo funge da sito di inserimento per i microscissori. Quindi, utilizzare un microscissore a dissezione fine per effettuare un taglio circolare lungo il bordo della cornea, separandolo dal padiglione oculare posteriore.
- Usa una pinza di dissezione affilata per rimuovere la cornea, la lente e l'umore vitreo lontano dalla coppa dell'occhio.
- Utilizzare microscissori a dissezione fine per effettuare diversi piccoli tagli sullo strato sclerale sul bordo della coppa oculare. Evitare di tagliare lo strato di retina. Utilizzare due pinze di dissezione affilate per trattenere il tessuto sclerale su ciascun lato del taglio e tirare con molta attenzione lo strato sclerale per rimuoverlo dalla retina neurale. Ripeti questo intorno alla coppa dell'occhio fino a quando tutta la sclera viene rimossa e si ottiene una coppa retinica intatta.
- Utilizzare microscissori di dissezione e fare tagli radiali sulla tazza retinica per appiattirla e generare diverse sezioni distinte.
NOTA: A seconda delle capacità di dissezione della persona e dell'esperienza nella gestione del tessuto retinico fresco, la tazza retinica può essere tagliata per generare da 3 a 5 sezioni distinte. - Utilizzare un perforatore per biopsia di 1 mm di diametro per tagliare un disco retinico da ciascuna sezione della tazza retinica appiattita.
NOTA: Bisogna fare attenzione a ottenere i dischi retinici perforati a uguale distanza dalla testa del nervo ottico. - Utilizzare una pinza per trasferire gli inserti in rete preverniciati nella capsula di Petri di dissezione. Con l'aiuto di due pennelli per ciglia superfini, posizionare il disco di punzonatura retinica sull'inserto a rete. Il disco di punzonatura retinica è posto al centro dell'inserto della rete con lo strato di cellule gangliari rivolto verso il basso che tocca la rete e lo strato di fotorecettore rivolto verso l'alto.
NOTA: Spesso, alcune cellule RPE rimangono attaccate ai fotorecettori e la pigmentazione di queste cellule può essere utilizzata come indicatore dell'orientamento del disco di perforazione retinica.
5. Caricamento delle porte di iniezione della cartuccia del sensore e calibrazione
- Estrarre la cassetta della cartuccia del sensore idratata dall'incubatore a 37 °C. Rimuovere il coperchio Hydro-Booster e riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di servizio.
- Caricare il volume desiderato di soluzioni di stock di lavoro composto per iniezione in porte appropriate. Tenere la punta della pipetta con un angolo di 45 °. Inserire la punta della pipetta a metà strada in una porta di iniezione con la smussatura della punta contro la parete opposta della porta di iniezione e caricare delicatamente il composto in ciascuna porta. Evitare di introdurre bolle d'aria.
- Fare riferimento alla guida per l'utente dello strumento per il volume del composto caricato in ciascuna porta di iniezione per un test specifico. Negli esperimenti presentati in questo articolo, 68 μL di 50 μM Bam15 (per il saggio di stress mitocondriale) o 68 μL di 10 μM Rot/AA di stock di lavoro (per il saggio della velocità glicolitica) vengono caricati nella porta A; 75 μL di 10 μM rot/AA (per il saggio di stress mitocondriale) o 75 μL di 500 mM di stock di lavoro 2-DG (per il saggio della velocità glicolitica) vengono caricati nella porta B.
- Porte di iniezione del carico di tutti i pozzetti della piastra, compresi i pozzetti di correzione di fondo e i pozzetti vuoti per garantire una corretta iniezione. Caricare la rispettiva soluzione composta in ogni porta per i pozzetti di correzione dello sfondo. Il mezzo di saggio può essere sostituito, invece della soluzione composta, in ciascuna delle porte dei pozzi bancari.
- Posizionare la piastra della cartuccia del sensore caricata, con il coperchio spento, nella macchina dell'analizzatore per avviare la calibrazione prima dell'esecuzione del test. Al termine della calibrazione, il programma si fermerà automaticamente, in attesa della sostituzione della piastra di utilità con la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici.
6. Caricamento della piastra di cattura dell'isolotto e avvio dell'esecuzione del test
- Aggiungere 607 μL del mezzo di analisi a ciascun pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto
- Utilizzare una pinza per afferrare il bordo dell'inserto a rete contenente dischi di punzonatura retinica sulla parte superiore ed estrarlo dalla capsula di Petri. Picchiettare leggermente il fondo dell'inserto a rete su un tessuto assorbente per rimuovere il liquido extra e metterlo nel pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti gli inserti a rete con punzoni retinici vengono inseriti nella piastra di cattura dell'isolotto. Riempire i pozzetti di correzione dello sfondo e i pozzetti vuoti con inserti mesh vuoti.
- Utilizzare due pinze Graefe per premere con attenzione e delicatezza il bordo di ciascun inserto in mesh e assicurarsi che questi siano inseriti saldamente nella parte inferiore della piastra di cattura dell'isolotto.
- Posizionare la piastra di cattura dell'isolotto caricata in un incubatore a 37 °C per 5 minuti per riscaldarsi.
- Espellere la piastra di utilità al termine della calibrazione e sostituirla con una e sostituirla con la piastra di cattura dell'isolotto, con coperchio spento, contenente punzoni retinici.
- Riprendere l'esecuzione del test.
7. Esegui la terminazione e l'archiviazione dei dati
- Al termine dell'esecuzione, espellere la cartuccia del sensore e la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici. I dati vengono salvati automaticamente come file .asyr.
- Utilizzare il software di analisi dei dati associato per visualizzare e analizzare i dati seguendo la guida per l'utente del produttore26.
- Utilizzare la funzione Esporta per esportare il file .xslx dei dati, che può essere visualizzato e analizzato utilizzando un software per fogli di calcolo.
8. Salvataggio del campione di punzonatura retinica
- Dopo il test, estrarre la piastra dalla macchina, rimuovere la cartuccia del sensore e rimuovere delicatamente il mezzo di dosaggio da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta.
- Applicare nuovamente il coperchio e sigillare i lati della piastra con la striscia di parafilm.
- Conservare a -80 °C.
- Per la normalizzazione, quantificare il DNA totale o il contenuto proteico del pugno in ciascun pozzetto.
9. Analisi dei dati
- Test dello stress mitocondriale
NOTA: il valore OCR misurato (totalOCR) rappresenta il consumo totale di ossigeno da parte del tessuto. Dopo l'iniezione di Bam15 (uncoupler), l'OCR aumenta dal livello basale (totalOCRbasal) al livello massimo (totalOCRmax) e diminuisce dopo l'iniezione di Rot/AA. Il valore residuo di OCR dopo iniezione di Rot/AA (totalOCRRot/AA) rappresenta il consumo di ossigeno non mitocondriale.- Calcola il consumo di ossigeno correlato ai mitocondri come:
(Eq. 1) 28 anni
- Calcola la capacità di riserva mitocondriale (MRC) come:
(Eq. 2) 29 anni
NOTA: L'ultima lettura tra le 5 misurazioni prima dell'iniezione di Bam15 viene presa come valore "basale" (per totalOCRbasal e mitoOCRbasal). La lettura più alta tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Bam15 viene utilizzata come valore "max" (per totalOCRmax e mitoOCRmax). La lettura più bassa tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Rot/AA viene utilizzata come totalOCRRot/AA.
- Calcola il consumo di ossigeno correlato ai mitocondri come:
- Saggio della velocità glicolitica
NOTA: Il valore ECAR misurato (totalECAR) rappresenta l'acidificazione totale del mezzo da parte dell'attività metabolica del tessuto. In generale, l'acidificazione del microambiente extracellulare risulta principalmente per estrusione del prodotto glicolitico, il lattato. Il catabolismo dei substrati nel ciclo TCA mitocondriale determina la produzione di CO2, che acidifica anche il mezzo extracellulare attraverso l'idratazione a bicarbonato.- Substract mitochondrial ha contribuito all'acidificazione media (mitoECAR) da totalECAR per ottenere il glycoECAR.
(Eq. 3) 28 anni
NOTA: La respirazione mitocondriale e il ciclo TCA sono processi fortemente accoppiati. La produzione di CO2 dai mitocondri è una funzione del tasso di OXPHOS, che è misurabile da mitoOCR. - Calcola il mitoECAR come:
(Eq. 4) 28 anni
dove, il CCF (CO2 Contribution Factor) è un valore di rapporto calcolato empiricamente, che rappresenta la quantità di contributo H+ da acidificazione mediata da CO2 rispetto a ciascun consumo di O2 da OXPHOS. Il CCF per questo sistema è predeterminato a 0,6028. La misurazione accurata dell'acidificazione del mezzo è determinata dalla capacità tampone del mezzo, dalla sensibilità del sensore di pH dello strumento e dall'effettiva capacità della camera di misura. Qui, il BF (Buffer Factor) è un parametro della capacità tampone sperimentale in situ, che rappresenta la quantità di H + o OH- aggiunta alla camera di misurazione efficace per modificare il livello di pH di 1 unità. Quando si utilizza un mezzo di saggio personalizzato, il BF può essere determinato titolando quantità note di acido nel mezzo di analisi seguendo il protocollo Buffer Factor30. Il Seahorse DMEM medium pH 7.4 utilizzato in questo protocollo ha un BF predeterminato di 2.60 mmol H+/L/pH. La piastra di cattura dell'isolotto utilizzata in questo protocollo ha una Volmicrochamber = 16,6 μL31. Il fattore di scala del volume, Kvol, è una costante determinata empiricamente. Il valore di Kvol non è disponibile per la piastra di cattura dell'isolotto, ma può essere calcolato dal valore della micropiastra28, tenendo conto della differenza di volume nelle loro microcamere, a 0,41.
NOTA: l'iniezione di Rot/AA arresta la respirazione mitocondriale e costringe il tessuto a passare alla glicolisi per la produzione di ATP, portando a una maggiore estrusione di lattato e ad un aumento della misurazione ECAR. La glicolisi viene interrotta con l'iniezione di 2-DG e la misurazione ECAR residua rivela acidificazione non glicolitica e non mitocondriale del mezzo. - Calcola la capacità di riserva glicolitica (GRC) come:
(Eq. 5) 32 anni
dove, l'ultima lettura tra le 5 misurazioni prima dell'iniezione di Rot/AA viene presa come valore "basale" (glicoECARbasal). La lettura più alta tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Rot/AA viene utilizzata come valore "max" (glycoECARmax). La lettura più bassa tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di 2-DG viene utilizzata come glycoECAR2-DG.
- Substract mitochondrial ha contribuito all'acidificazione media (mitoECAR) da totalECAR per ottenere il glycoECAR.
- Normalizzazione
NOTA: La normalizzazione è essenziale quando si confrontano le letture dei tessuti retinici di diverse fasce d'età o tra campioni wild-type e patologici/degenerativi, che potrebbero differire nel numero di cellule.- Utilizzare kit disponibili commercialmente per valutare il contenuto di DNA in ciascun disco di punzonatura retinica33,34.
- In alternativa, utilizzare il tampone del saggio di radioimmunoprecipitazione (tampone RIPA) per estrarre la proteina totale dal pugno retinico e utilizzare il contenuto proteico per la normalizzazione.
NOTA: La superficie di una retina di topo adulto è stata precedentemente determinata intorno ai 20 mm2 e ogni retina contiene circa 6,5 milioni di cellule35. Quindi, ogni punzone retinico di 1 mm di diametro è ~ 1/25 di una singola retina e contiene ~ 260K cellule. Si può fare riferimento a questi numeri quando si confrontano i dati di un pugno retinico con quelli di altri campioni di tessuto o cellule coltivate,
(Eq. 1) 28 anni
(Eq. 2) 29 anni
(Eq. 3) 28 anni
(Eq. 4) 28 anni
(Eq. 5) 32 anniSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dati riportati qui sono un test rappresentativo dello stress mitocondriale che mostra tracce OCR (Figura 1) e test della velocità glicolitica che mostra traccia OCR e traccia ECAR (Figura 2), che sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da 1 mm appena sezionati da topi transgenici Nrl-L-EGFP di 4 mesi ( sfondo C57B / L6). Questi topi esprimono GFP specificamente nei fotorecettori a bastoncello senza alterare il normale sviluppo retinico, l'istologia e la fisiologia e sono stati ampiamente utilizzati come controlli wild-type nella ricerca retinica. Due topi cucciolati Nrl-L-GFP sono stati utilizzati nei test qui presentati. La GFP espressa nei topi Nrl-L-GFP non interferisce con le misurazioni di OCR ed ECAR in questo protocollo. Cinque pugni retinici sono stati prelevati da ciascuna retina. Dieci dei pugni retinici sono stati utilizzati per il test dello stress mitocondriale e gli altri 10 sono stati utilizzati per il test della velocità glicolitica. Negli esperimenti sono stati utilizzati cavalluccio marino XF DMEM medio, pH 7,4 (costituito da 6 mM di glucosio, 0,12 mM piruvato e 0,5 mM di glutammina) e piastre di cattura delle isole Seahorse XFe24. I dati rappresentativi qui presentati sono stati ottenuti utilizzando lo stesso punzonatore da 1 mm di diametro, ma non sono stati normalizzati rispetto al contenuto di DNA/proteine.
Nel test di stress mitocondriale, il disaccoppiatore Bam1537 è stato iniettato dopo aver stabilito il basale OCR, portando a un miglioramento dell'OCR al livello massimo. Rotenone e Antimicina A sono stati iniettati per inibire la respirazione dei mitocondri rispettivamente nel complesso I e nel complesso III, con conseguente abbassamento dell'OCR al livello minimo (Figura 1). La differenza tra il livello massimo di OCR e l'ultima misurazione del livello di OCR basale riflette la capacità di riserva mitocondriale (MRC). L'MRC è calcolato al 19,2% ±3,4% utilizzando Eq. 2, in linea con i valori MRC precedentemente misurati nelle retine di topi Nrl-L-EGFP di ~ 3 mesi che utilizzano l'analizzatore Seahorse XF24 della generazione precedente22,38.
Nel test della velocità glicolitica, Rotenone e Antimicina A sono stati iniettati dopo aver stabilito il basale per l'ECAR totale. Con la produzione di ATP da OXPHOS interrotta, il tessuto è costretto a fare affidamento sulla glicolisi per l'energia, e un aumento del rilascio extracellulare di lattato porta ECAR al livello massimo. La glicolisi viene interrotta dall'iniezione di 2-DG, che compete con il glucosio per il legame con l'esochinasi, causando la caduta dell'ECAR al livello minimo (Figura 2). L'ECAR (mitoECAR) contribuito dai mitocondri può essere calcolato dal valore mitoOCR (Eq. 4). Glicolisi apportata ECAR glycoECAR è calcolato e tracciato sottraendo mitoECAR da totalECAR. La differenza tra il livello massimo di glycoECAR e l'ultima misurazione del livello basale di glycoECAR riflette la capacità di riserva di glicolisi (GRC). Qui, il GRC è calcolato per essere 35,7% ± 3,4% utilizzando Eq. 5.
Come tessuto altamente glicolitico, la produzione di lattato dalla retina rappresenta una delle principali fonti di acidificazione extracellulare, come rivelato dalla piccola differenza di glycoECAR dal totalECAR. È interessante notare che la misurazione ECAR non si stabilizza immediatamente dopo l'iniezione di Rot/AA, ma diminuisce dopo la seconda misurazione. Il punch disk retinico è un sistema ex vivo intatto composto da diversi tipi di cellule, comprese le cellule di Müller glia, che sono note per ricevere lattato (prodotto finale della glicolisi) rilasciato dai fotorecettori6. Quindi, un calo nella misurazione ECAR dopo l'iniezione di Rot / AA è probabilmente spiegato da una maggiore rimozione di lattato dallo spazio intercellulare, rallentando / impedendo il suo rilascio nel mezzo.
Figura 1: Test dello stress mitocondriale. Il grafico tracciato mostra la traccia OCR da dischi di punzonatura retinica da 1 mm nel tampone DMEM Seahorse XF, integrato con 6 mM di glucosio, 0,12 mM di piruvato e 0,5 mM di glutammina. Ogni punto dati rappresenta la media delle misurazioni da 10 pozzi. Barra di errore = errore standard. MrC è calcolato per essere 19,2% ±3,4%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Saggio della velocità glicolitica. Il grafico tracciato mostra la traccia OCR misurata, la traccia ECAR (totalECAR) e la glicolisi calcolata ha contribuito ECAR (glycoECAR) da dischi di punzonatura retinica da 1 mm nel tampone DMEM Seahorse XF integrato con 6 mM di glucosio, 0,12 mM di piruvato e 0,5 mM di glutammina. Ogni punto dati rappresenta la media delle misurazioni da 10 pozzi. Barra di errore = errore standard. GRC è calcolato per essere 35.7%±3.4% Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate per l'esecuzione di saggi basati su micropiastre della respirazione mitocondriale e dell'attività di glicolisi utilizzando dischi di perforazione retinica ex vivo appena sezionati. Il protocollo è stato ottimizzato per: 1) garantire l'utilizzo di un mezzo di saggio idoneo per il tessuto retinico ex vivo; 2) impiegare dischi di punzonatura retinica di dimensioni adeguate per ottenere letture OCR ed ECAR che rientrano nel campo di rilevamento ottimale della macchina; 3) rivestimento di inserti in rete per migliorare l'adesività del punzone retinico per una lettura stabile durante il ciclo di misurazione; 4) utilizzo della concentrazione ottimale di ciascun composto di farmaco iniettato; e 5) garantire una durata del ciclo alterata per raggiungere un plateau di stati mitocondriali ad ogni passo. I reagenti e il protocollo sono stati modificati da una versione precedentemente pubblicata23 per adattarsi alla macchina Seahorse XFe24 di nuova generazione. Invece del buffer Ames utilizzato nel protocollo precedente23, qui viene utilizzato un mezzo DMEM Seahorse di base per consentire la costituzione personalizzata della fonte di carburante aggiungendo separatamente glucosio, glutammina e piruvato. Ciò consente anche di eseguire vari saggi in cui un substrato di combustibile specifico viene fornito o privato dal mezzo. Nei saggi qui presentati, il mezzo è stato costituito alla stessa concentrazione di glucosio (6 mM), glutammina (0,5 mM) e piruvato (0,12 mM) del tampone di Ames, che si sono dimostrati adatti per il tessuto retinico. Un altro vantaggio di questo mezzo (con 5 mM HEPES) rispetto al buffer Ames (con 22,6 mM NaHCO3) è la sua bassa capacità tampone, che garantisce una misurazione sensibile e accurata di ECAR28.
Sia i saggi di stress mitocondriale che quelli di velocità glicolitica possono essere eseguiti seguendo il protocollo qui descritto con elevata precisione, come evidenziato dai rigorosi valori di errore standard tra i pozzetti di replicazione. Tuttavia, vale la pena notare i fattori che possono contribuire alla variabilità dei dati. Evitare la morte cellulare nel tessuto retinico. L'intero processo di dissezione deve essere eseguito in PBS 1x ghiacciato e il processo dall'enucleazione degli occhi all'inserimento della piastra di cattura dell'isolotto contenente il punzone retinico nella macchina non deve superare le 2 ore. Si deve prestare attenzione durante la dissezione della coppa della retina per evitare danni al tessuto retinico e i pugni non devono essere presi da aree danneggiate dalla dissezione. In ogni esperimento dovrebbe essere utilizzato un nuovo punzonatore per biopsia affilato e cambiare il punzone quando il bordo è opaco o piegato per garantire coerenza e precisione nel taglio di punzoni retinici a 1 mm di diametro. Cerca di ottenere i dischi retinici perforati a equidistanti dalla testa del nervo ottico per evitare variazioni regionali (centro contro periferico). Dopo il test, controllare ogni pozzetto per qualsiasi segno di staccato dal punzone retinico dall'inserto della rete. Quando un punzone retinico ha una scarsa adesione sull'inserto della rete o si stacca durante la misurazione, la distanza dalla sonda del sensore al tessuto cambierà, influenzando le letture. Ometti i dati da tali pozzi con pugno retinico staccato.
La misurazione del metabolismo mitocondriale in tempo reale nel tessuto retinico intatto ha ampie applicazioni e può fornire informazioni utili per vari studi. Questi saggi sono stati utilizzati per misurare la respirazione mitocondriale nei tessuti retinici di topi di diversa estrazione genetica per rivelare la loro differenza intrinseca nell'attività mitocondriale39,40. È stato anche usato per studiare i cambiamenti nel metabolismo energetico mitocondriale durante l'invecchiamento della retina38. Fornendo diversi substrati di combustibile e utilizzando vari inibitori mirati a diverse vie metaboliche, fornisce informazioni sulla preferenza della cellula / tessuto su determinate fonti di combustibile22,38. Inoltre, il confronto su OCR e MRC tra modelli murini e murini wild-type di degenerazione retinica ereditaria può fornire prove di difetti mitocondriali nella degenerazione della retina22.
Ci sono limitazioni di questa tecnica. La piastra di cattura delle isole utilizzata in questi saggi contiene solo 24 pozzetti; quindi, è solo in grado di fornire analisi a medio rendimento. La qualità dei dati di questo metodo dipende dalla qualità dei dischi di punzonatura retinica e dalla vitalità delle cellule. Inoltre, la dissezione retinica e la preparazione dei dischi di punzonatura retinica è un processo che richiede molto tempo, rendendo meno fattibile l'analisi ad alto rendimento su tessuti retinici ex vivo vivi anche quando sono disponibili piastre a 96 pozzetti. Rispetto a un monostrato di cellule coltivate, la penetrazione del composto farmacologico nel tessuto retinico influisce anche sulla lettura dei dati. Inoltre, i valori OCR ed ECAR misurati rappresentano le prestazioni totali dell'intero tessuto, che è composto da molti tipi di cellule diverse; quindi, è necessario considerare la relazione e le interazioni tra le diverse cellule neuronali e gliali nella retina durante l'interpretazione dei dati. Specifici disegni sperimentali dovrebbero essere implementati adattandoli a ciascun progetto. Si raccomanda di includere da 3 a 5 pugni retinici (dallo stesso occhio o dallo stesso topo) come repliche tecniche e utilizzare campioni di 3 o più topi come repliche biologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal programma di ricerca intramurale del National Eye Institute (ZIAEY000450 e ZIAEY000546).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
References
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