Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Dual-Color Fluorescens Krydskorrelation Spektroskopi til undersøgelse protein-protein interaktion og protein dynamik i levende celler

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62954
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 1
1Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, 2Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en eksperimentel protokol og dataanalyse workflow til at udføre levende celle dual-color fluorescens kryds korrelation spektroskopi (FCCS) kombineret med Förster Resonans Energioverførsel (FRET) til at studere membran receptor dynamik i levende celler ved hjælp af moderne fluorescens mærkning teknikker.

Abstract

Vi præsenterer en protokol og arbejdsgang til at udføre levende celle dual-color fluorescens krydskorrelation spektroskopi (FCCS) kombineret med Förster Resonans Energioverførsel (FRET) til at studere membran receptor dynamik i levende celler ved hjælp af moderne fluorescens mærkning teknikker. I dual-color FCCS, hvor udsvingene i fluorescensintensiteten repræsenterer det dynamiske "fingeraftryk" af den respektive fluorescerende biomolekyle, kan vi sonde co-diffusion eller binding af receptorerne. FRET, med sin høje følsomhed over for molekylære afstande, tjener som en velkendt "nanoruler" til at overvåge intramolekylære ændringer. Samlet set bliver kropslige ændringer og nøgleparametre såsom lokale receptorkoncentrationer og mobilitetskonstanter tilgængelige i cellulære indstillinger.

Kvantitative fluorescens tilgange er udfordrende i celler på grund af høje støjniveauer og sårbarheden af prøven. Her viser vi, hvordan du udfører dette eksperiment, herunder kalibreringstrinene ved hjælp af dual-color mærket β2-adrenergic receptor (β2AR) mærket med eGFP og SNAP-tag-TAMRA. Der tilbydes en trinvis dataanalyseprocedure ved hjælp af open source-software og skabeloner, der er nemme at tilpasse.

Vores retningslinje gør det muligt for forskere at optrævle molekylære interaktioner af biomolekyler i levende celler in situ med høj pålidelighed på trods af de begrænsede signal-til-støj-niveauer i levende celleforsøg. FRET's operationelle vindue og især FCCS ved lave koncentrationer muliggør kvantitativ analyse ved næsten fysiologiske forhold.

Introduction

Fluorescensspektroskopi er en af de vigtigste metoder til at kvantificere proteindynamik og proteinproteininteraktioner med minimal forstyrrelser i en cellulær sammenhæng. Konfokal fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) er en af de kraftfulde metoder til at analysere molekylær dynamik, da det er enkelt-molekyle følsomme, meget selektiv, og levende celle kompatibel1. Sammenlignet med andre dynamik-orienterede tilgange, FCS har en bredere målbar tidsinterval spænder fra ~ ns til ~ s, vigtigst dækker de hurtige tidsskalaer, der ofte er utilgængelige ved billedbehandling-baserede metoder. Desuden giver det også rumlig selektivitet, så membran, cytoplasmisk og kerne molekylær dynamik let kan skelnes 2. Molekylær blink, den gennemsnitlige lokale koncentration og diffusionskoefficienten kan således analyseres kvantitativt med FCS. Intermolekylær dynamik såsom binding bliver let tilgængelig, når sondering co-diffusion af to molekylære arter i fluorescens krydskorrelation spektroskopi (FCCS) analyse3,4,5 i en tofarvet tilgang.

Det vigtigste underliggende princip i korrelationsspektroskopi er den statistiske analyse af intensitetsudsving, der udsendes af fluorescerende mærkede biomolekyler, der spreder sig ind og ud af et laserfokus (Figur 1A). De resulterende auto- eller krydskorrelationsfunktioner kan derefter analyseres yderligere ved kurvemontering for i sidste ende at udlede rentekonstanter af interesse. Med andre ord giver de statistiske metoder FCS og FCCS ikke enkeltmolekylespor som i enkelt partikelsporing, men et dynamisk mønster eller "fingeraftryk" af en undersøgt prøve med høj tidsmæssig opløsning. Når det kombineres med Förster resonans energioverførsel (FRET), intramolekylær dynamik såsom kropsbygning ændringer kan overvåges på samme tid i en fælles confocal setup5,6. FRET sonder afstanden mellem to fluorophorer og kaldes ofte en molekylær "nanoruler". Energioverførsel finder kun sted, når molekylerne er i nærheden (< 10 nm), donorens emissionsspektrum overlapper signifikant med acceptmolekylets absorptionsspektrum, og donorens og acceptorens dipoloris orientering er (tilstrækkeligt) parallel. Således giver kombinationen af FRET og FCCS en teknik med meget høj spatio-temporal opløsning. Når rumlig selektivitet, følsomhed samt levende celle kompatibilitet er påkrævet, FRET-FCCS har indlysende fordelagtige i forhold til andre metoder såsom Isoterm titrering Calorimetry (ITC)7, Surface Plasmon Resonans (SPR)8, eller Nuclear Magnetic Resonance (NMR)9,10 til måling af protein dynamik og interaktioner.

På trods af evnerne og løftet om dual-color fluorescens krydskorrelation spektroskopi (dc-FCCS), udfører dc-FCCS i levende celler er teknisk udfordrende på grund af spektrale bleed-through eller krydstale mellem kanalerne3,4, forskellen i confocal mængder på grund af spektralt forskellige laser linjer3,4,11, baggrundssignal, og støj eller begrænset fotostabilitet af prøverne12, 13,14,15. Indførelsen af puls interleaved excitation (PIE) til FCCS var en vigtig tweak at tidsmæssigt afkoble de forskellige laser excitationer for at reducere den spektrale krydstale mellem kanalerne16. Andre korrektionsmetoder til imødegåelse af spektrale gennemblødning17,18,19 og baggrundskorrektioner er også blevet godt accepteret17,18,19. For detaljer og grundlæggende om FCS, PIE eller FRET læseren henvises til følgende referencer2,4,6,16,20,21,22,23,24.

Her præsenteres alle nødvendige kalibreringsforsøg og analyser sammen med de eksperimentelle resultater af en prototypisk G-protein koblet receptor, β 2-adrenergic receptor (β2AR), for tre forskellige scenarier: (1) enkeltmærkede molekyler, der bærer enten en "grøn" (eGFP) eller en "rød" (SNAP-tag-baseret mærkning)25 fluorophor; (2) en dobbeltmærket konstruktion, som bærer et N-terminal SNAP-tag og intracellulær eGFP (NT-SNAP) [i dette tilfælde er begge etiketter på samme protein. Der forventes således 100 % co-diffusion]; og (3) en dobbeltmærket prøve, hvor begge fluorheste er på samme side af cellemembranen (CT-SNAP). Det bærer en C-terminal SNAP-tag og en intracellulær eGFP. Her er begge etiketter igen på samme protein med igen 100% co-diffusion forventes. Da begge etiketter er meget tæt på hinanden, på samme side af cellemembranen, viser det potentialet til at observere FRET og antikorreleret adfærd. Alle konstruktioner blev transficeret i kinesiske Hamster Ovary (CHO) celler og senere mærket med en rød fluorescerende substrat, som er membran-uigennemtrængelig for NT-SNAP konstruktion og membran-permeable for CT-SNAP konstruktion. Endelig eksemplificerer simulerede data eksperimentelle parametres indflydelse på den FRET-inducerede antikorrelation og effekten af protein-proteininteraktioner på co-diffusions amplituden.

Således giver denne protokol en komplet guide til at udføre den kombinerede FRET-FCCS i levende celler for at forstå proteindynamik og protein-protein interaktioner, samtidig med at du gør opmærksom på tekniske / fysiske artefakter, udfordringer og mulige løsninger.

Protocol

1. Eksperimentel protokol

  1. Prøveforberedelse
    BEMÆRK: Udfør cellesåning og transfektion under sterile forhold.
    1. Placer en renset coverlip per godt i en 6-brønd kultur plade og vask tre gange med steril fosfat-buffered saltvand (PBS).
      BEMÆRK: Coversliprengøringsprotokollen er beskrevet i supplerende bestemmelse 1.
    2. Til hver brønd tilsættes 2 mL af det komplette cellekulturmedium, der indeholder phenolrød (suppleret med 10% fosterkvægsserum (FBS), 100 μg/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin) og holder pladen til side.
    3. Dyrke cho-cellerne i samme medium, der indeholder phenolrød ved 37 °C og 5% CO2. Vask cellerne med 5 mL PBS for at fjerne de døde celler.
    4. Tilsæt 2 mL trypsin og inkuber i 2 min ved stuetemperatur (RT).
    5. Fortynd de løsrevne celler med 8 mL medium, der indeholder phenol rød og blandes omhyggeligt ved pipettering.
    6. Cellerne tælles i et Neubauer-kammer og frø ved en massefylde på 1,5 x 105 celler/brønd i den 6-brønds cellekulturplade, der indeholder omslagene (fremstillet i trin 1.1.1-1.1.2).
    7. Lad cellerne vokse i en inkubator (37 °C, 5% CO2) i 24 timer for at opnå ca. 80% sammenløb.
    8. Fortynd 2 μg af det ønskede vektor-DNA (f.eks. CT-SNAP eller NT-SNAP) og 6 μL af transfectionreagenset i to separate rør, der hver indeholder 500 μL af det reducerede serummedium for hver brønd og inkuberer i 5 min ved RT.
    9. Bland de to opløsninger sammen for at opnå transfectionblandingen og inkubere den i 20 minutter på RT.
    10. I mellemtiden vaskes de seedede CHO-celler en gang med steril PBS.
    11. Udskift PBS med 1 mL/brønd af phenol rød-fri medium suppleret med 10% FBS uden antibiotika.
    12. Der tilsættes hele 1 mL transfectionblandingen dropwise til hver brønd og inkuberes cellerne natten over ved 37 °C, i 5% CO2.
    13. Ved mærkning af SNAP-konstruktionen fortyndes den relevante SNAP-substratlageropløsning i 1 mL af mediet suppleret med 10% FBS for at opnå en endelig koncentration på 1 μM.
    14. Vask de transfected celler én gang med PBS og tilsæt 1 mL pr. brønd af 1 μM SNAP substratopløsning. Inkuberes cellerne i 20 min ved 37 °C i 5% CO2.
    15. Vask cellerne tre gange med phenol rød-fri medium og tilsæt 2 mL pr godt phenol rød-fri medium. Inkuberes cellerne i 30 min ved 37 °C i 5% CO2.
    16. Dækslerne af alle prøver overføres efterfølgende til billedkammeret, og der vaskes med 500 μL billedbuffer. Tilføj 500 μL billedbuffer, før du går over til FRET-FCS-opsætningen.
  2. Kalibreringsmålinger
    BEMÆRK: FRET-FCS setup er udstyret med en konfokal mikroskop vand mål, to laser linjer, en Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system, to hybrid photomultiplier rør (PMT) og to lavine photodiodes (APD) for foton indsamling og dataindsamling software. Det er meget vigtigt at justere opsætningen hver gang før live celle målinger. Den detaljerede opsætningsbeskrivelse findes i supplerende note 2. Både lasere og alle detektorer (to PMT'er og to APD'er) er altid TÆNDT under målingerne, da alle målinger skal udføres under identiske forhold. Til kalibreringsmålingerne skal du bruge en coverlip fra det samme parti, som cellerne blev sået på, hvilket reducerer variationen i kraveringenskorrektion.
    1. For at justere fokus, pinhole og krave ring position, placere 2 nM grøn kalibrering løsning på et glas coverlip og tænde 485 nm og 560 nm laser. Betjen laser i Pulserende Interleaved Excitation (PIE) tilstand16.
    2. Fokuser på opløsningen og juster pinhole og krave ring position således, at den højeste tællehastighed og mindste konfokale volumen opnås for at få den maksimale molekylære lysstyrke.
    3. Gentag denne proces for de røde kanaler med 10 nM rød kalibreringsopløsning og en blanding af både den grønne og røde kalibreringsløsning.
    4. Placer 10 nM DNA-opløsningen på en glasdækslede og juster fokus-, pinhole- og kraveringspositionen, så krydskorrelationen mellem de grønne og røde detektionskanaler er størst, dvs.
      BEMÆRK: Trin 1.2.1 og 1.2.4 skal muligvis gentages frem og tilbage for at finde den optimale justering. Tag 3-5 målinger fra hver kalibreringsløsning i 30 s - 120 s efter fokus, pinhole og krave ring position er blevet justeret optimalt for de grønne og røde detektionskanaler og confocal overlapning volumen.
    5. Mål et fald på ddH2O, billedmediet og en ikke-overført celle 3-5 gange hver for 30 s - 120 s for at bestemme baggrundstællingsraterne.
    6. Saml instrumentresponsfunktionen med 3-5 målinger i 30 s - 120 s. Dette er valgfrit, men kan varmt anbefales.
  3. Målinger af levende celler
    1. Find en passende celle ved at belyse med kviksølvlampen og observere gennem okulæren.
      BEMÆRK: Egnede celler er i live, der viser den typiske morfologi af den respektive klæbende cellelinje. Fluorescensen af proteinet af interesse, her en overflade receptor, er synlig over hele overfladen. Mindre lyse celler er mere egnede end lysere på grund af den bedre kontrast i FCS, når et lavt antal molekyler er i fokus.
    2. Tænd begge lasere i PIE-tilstand og fokuser på membranen ved at se på de maksimale antal pr. Sekund.
      BEMÆRK: Lasereffekten skal muligvis reduceres for celleprøverne (mindre end 5 μW under mål). Dette afhænger af de anvendte fluorophores og opsætningen.
    3. Overhold eGFP's auto- og krydskorrelationskurver eller mærket SNAP-tag, der er fastgjort til β2AR i onlineeksemplet af dataindsamlingssoftwaren, og indsamle flere korte målinger (~ 2 -10) med en anskaffelsestid mellem 60 -180 s.
      BEMÆRK: Opildne cellerne ikke i lang tid kontinuerligt, da fluorophorerne kan blege. Det afhænger dog af lysstyrken i hver celle, hvor længe målingerne kan være, og hvor mange målinger i alt der kan udføres.

2. Dataanalyse

  1. Eksport af data
    1. Eksporter korrelationskurverne, G(tc) og tællehastigheder, CR, fra alle målinger.
    2. Pas på at definere tidsvinduerne "prompt" og "delay" korrekt, og brug indstillingen "microtime gating" i datakorrelationssoftwaren.
      BEMÆRK: I alt kræves der tre forskellige korrelationer: (1) autokorrelation mellem den grønne kanal i prompttidsvinduet (ACFgp), (2) autokorrelation mellem de røde kanaler i forsinkelsestidsvinduet (ACFrd) og endelig (3) krydskorrelationen mellem det grønne kanalsignal i prompttidsvinduet med det røde kanalsignal i forsinkelsestidsvinduet (CCFPIE). Dataeksporten vises trin for trin for forskellig software i supplerende note 3.
  2. Kalibreringsmålinger
    1. Brug autokorrelationsfunktionerne for de grønne (ACFgp) og de røde (ACFrd)fluorophoreopløsninger, og sæt dem i en 3D-diffusionsmodel med et ekstra tredobbelt udtryk, hvis det kræves (eq. 1) til at kalibrere formen og størrelsen af den konfokale detektionsvolumen for de to anvendte farvekanaler:
      Equation 1 eq. 1
      Her er b kurvens grundlinje, N antallet af molekyler i fokus, tD diffusionstiden (i ms) og s = z0/w0 formfaktoren for det konfokale volumenelement. Triplet blinkende eller anden fotofysik er beskrevet ved sin amplitud enR og afslapning tid tR.
      BEMÆRK: Alle variabler og symboler, der bruges i protokollen, er angivet i tabel 1.
    2. Brug de kendte diffusionskoefficienter D for den grønne26 og røde kalibreringsstandard27 og de opnåede formfaktorer grønne og røde til at bestemme dimensionerne (bredde w0 og højde z0) og volumen V-eff af det konfokale volumenelement (eq. 2a-c).
      Equation 2eq. 2a
      Equation 3eq. 2b
      Equation 4eq. 2c
      BEMÆRK: Skabeloner til beregning af kalibreringsparameteren leveres som supplerende filer (S7).
    3. Spektral krydstale α af det grønne fluorescenssignal (indsamlet i kanal 0 og 2) i de røde detektionskanaler (kanal nummer 1 og 3) som et forhold mellem de baggrundskorrigerede (BG)-signaler (eq. 3).
      Equation 5
      eq. 3
    4. Bestem den direkte excitation af acceptorfluoriorten δ af donor excitation bølgelængden ved forholdet mellem baggrundskorrigeret optællingshastighed for de røde kalibreringsmålinger i tidsvinduet "prompt" (excitation ved grøn laser) til den baggrundskorrigerede tællehastighed i tidsvinduet "forsinkelse" (excitation ved rød laser) (eq. 4).
      Equation 6
      eq. 4
    5. Den molekylære lysstyrke B beregnes på basis af baggrundskorrigerede tællehastigheder og det opnåede antal molekyler i fokus, N, fra 3D-diffusionsanfaldet (eq. 1):
      Equation 7eq. 5a
      Equation 8eq. 5b
    6. Der er plads til både ACFgp og ACFrd samt CCFPIE af det dobbeltmærkede DNA til 3D-diffusionsmodellen (eq. 1). Hold de opnåede formfaktorer, sgrøn og rød , konstant for henholdsvis ACFgp og ACFrd. Figurfaktoren for CCFPIE, sPIE , er normalt mellem disse to værdier.
      BEMÆRK: I en ideel opsætning, både Veff,grøn og Veff, rød ville have samme størrelse og overlappe perfekt.
    7. Bestem amplituden ved nul korrelationstid, G0(tc), baseret på de fundne værdier af det tilsyneladende antal molekyler i fokus (Ngrøn, Nrød og NPIE).
    8. Amplitudforholdet rGR og rRG beregnes for en prøve med 100% co-diffusion af grønne og røde fluorophorer (eq. 6). Vær opmærksom på, at NPIE ikke afspejler antallet af dobbeltmærkede molekyler i fokus, men kun afspejler 1 /G0(tc).
      Equation 9og Equation 10 eq. 6
  3. Eksperimenter med levende celler
    1. For konstruktioner med en enkelt etiket skal celleeksemplerne tilpasses en passende model. For den viste membran receptor, diffusion sker i en bimodal måde med en kort og en lang diffusion tid. Derudover skal fotofysikken og blinkende af fluorophorerne overvejes:
      Equation 11 eq. 7
      Her er td1 og td2 de to krævede diffusionstider, og en1 er den brøkdel af den første diffusionstid.
      BEMÆRK: I modsætning til kalibreringsmålingerne, hvor de frie farvestoffer og DNA-strenge frit diffuserer i alle retninger, viser membranreceptoren kun 2D-diffusion langs cellemembranerne. Denne forskel mellem 3D- og 2D-diffusion afspejles af det ændrede diffusionsudtryk (sammenlign eq. 1), hvor tD i 2D-sagen ikke afhænger af formfaktorerne for det konfokale volumenelement.
    2. Koncentrationen c af grønne eller røde mærkede proteiner beregnes ud fra de respektive N- og V-eff ved hjælp af grundtetik (eq. 8):
      Equation 12eq. 8
      hvor NA = Avogadros nummer
    3. For N-terminal SNAP-etiket og intracellulær eGFP skal de to autokorrelationer (ACFgp og ACFrd)for den dobbeltmærkede prøve ved hjælp af samme model som for de enkeltmærkede konstruktioner for AIF'erne (eq. 7) og CCFPIE ved hjælp af en tomodal diffusionsmodel (eq. 9):
      Equation 13eq. 9
      BEMÆRK: For en global beskrivelse af systemet skal alle tre kurver være i form i fællesskab: Diffusionsudtryk er identisk for alle tre kurver, og den eneste forskel er afslapningsbetegnelsen for CCFPIE. Da fotofysik af to fluorophorer er normalt uafhængige, ingen korrelation sigt er påkrævet. Denne mangel på afslapning vilkår resulterer i en flad CCFPIE på korte korrelation gange. Krydstale og direkte excitation af acceptoren på grund af donorfluoriphen kan dog vise falsk-positive amplituder og bør kontrolleres omhyggeligt for at bruge kalibreringsmålingerne.
    4. Koncentrationen c af grønne eller røde mærkede proteiner ud fra de respektive N- og V-eff ved hjælp af ligning 8.
    5. Skøn over fraktionen eller koncentrationen, cGR eller cRG, af interagerende grønne og røde mærkede proteiner fra celleprøverne ved hjælp af de korrektionsfaktorer, der er opnået fra DNA-prøverne, amplitudforhold rGR og rRG i celleprøven og deres respektive opnåede koncentrationer (eq. 10).
      Equation 14 og Equation 15 eq. 10
    6. For C-terminal SNAP-etiket og intracellulær eGFP skal du passe til de to autokorrelationer (ACFgp og ACFrd)i FRET-prøven som enkeltmærkede prøver (ligning 7) og CCFFRET til en bimodal diffusionsmodel, der indeholder et antikorrelationsudtryk (ligning 11)
      Equation 16 eq. 11
      hvor enf afspejler amplituden af den samlede antikorrelation og enR og tR den respektive amplitud og afslapningstid.
      BEMÆRK: I tilfælde af antikorrelerede fluorescensændringer som følge af FRET kan der være behov for et eller flere korrelationsbegreber (eq. 11), hvilket resulterer i et "dyk" af CCFFRET ved lave korrelationstider, der falder sammen med en stigning i de to autokorrelationer (ACFgp og ACFrd). Vær dog opmærksom på, at fotofysik som triplet blinkende kan maskere antikorrelationsudtryk ved at dæmpe den FRET-inducerede antikorrelation. En fælles analyse suppleret med filtrerede FCS-metoder kan bidrage til at afsløre antikorrelationsbegrebet. Derudover bør tekniske artefakter, der stammer fra døde tider i tælleelektronik i nanosekunder rækkevidde udelukkes16. En mere detaljeret trinvis procedure for, hvordan analysen udføres i ChiSurf28 og skabeloner til beregning af konfokal volumen eller molekylær lysstyrke, findes på Github-lageret (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) og som supplerende filer (supplerende note 4 og supplerende note 6). Derudover kan python-scripts til batcheksport af data erhvervet med Symphotime-softwaren i .ptu-format findes der.

Representative Results

Eksemplariske resultater af kalibrerings- og livecellemålingerne diskuteres nedenfor. Derudover demonstreres effekten af FRET på krydskorrelationskurverne baseret på simulerede data ved siden af effekten af protein-protein-interaktion, der øger CCF PIE-amplituden.

PIE-baseret FCS-dataeksport
I PIE-eksperimenter indsamles data i tid-tag-tidstil (TTTR)29,30. Figur 1B viser foton ankomsttid histogrammer af en PIE måling af en dobbelt-mærket DNA-streng på den beskrevne opsætning (Supplerende note 1). Opsætningen har fire registreringskanaler. Fluorescens emission er først delt af polarisering i "S" og "P" retninger (med henvisning til vinkelrette og parallelle plan, hvor det elektriske felt af en lysbølge er oscillerende). For det andet opdeles hver polariseringsretning derefter i to farvekanaler (grøn, rød) før detektion, hvilket resulterer i fire kanaler (S-grøn, S-rød, P-grøn, P-rød). I tidsvinduet "prompt" bliver den grønne fluorophore ophidset, og signalet registreres i både de grønne og røde kanaler på grund af FRET. I forsinkelsestidsvinduet er det kun den røde fluorophore (i den røde kanal), der er synlig. Baseret på detektionskanalerne og "prompt" versus "forsinkede" tidsvinduer kan der opnås mindst fem forskellige korrelationskurver (3 autokorrelationskurver (ACF'er) og 2 krydskorrelationskurver (CCFs)) (Figur 1C-D): (1) grønt signal i prompttidsvinduet (ACFgp), (2) rødt signal i prompt time-vinduet (i tilfælde af FRET, ACFrp), og (3) rødt signal i forsinkelsestidsvinduet (ACFrd). Disse ACF'er rapporterer om proteinmobilitet, fotofysik (f.eks. triplet blinkende) og andre tidskorrelerede lysstyrkeændringer i fluorophorerne (f.eks. på grund af FRET). (4) Den PIE-baserede ccfPIE på tværs af korrelationen af det grønne signal i prompttidsvinduet med det røde signal i forsinkelsestidsvinduet gør det muligt at bestemme den del af co-diffusionen af det grønne og røde fluorophor16. (5) Den FRET-baserede krydskorrelation CCFFRET af den grønne med det røde signal i prompt time window er relateret til FRET-induceret, antikorreleret lysstyrke ændringer i de grønne og røde signaler31,32,33.

Figure 1
Figur 1: Pulserende interleaved excitation (PIE) baseret fluorescens (kryds) korrelation spektroskopi (F(C)CS). (A) I FCS fluorescerende mærkede molekyler diffus frit ind og ud af en (diffraktion-begrænset) brændpunkt formet af en fokuseret laserstråle, der fremkalder fluorescens inden for denne lille volumen. De resulterende intensitetsudsving af molekyler, der kommer ind og ud af volumen, er korrelerede og giver oplysninger om molekylernes mobilitet. (B) I PIE anvendes to forskellige laserlinjer ("prompt" og "delay") til at ophidse prøven mærket med to forskellige fluorophorer ("grøn" og "rød"). Tidsforskellen mellem begge excitationsimpulser er tilpasset fluorescensleviteterne for de respektive fluorophorer, så den ene er henfaldet, før den anden er ophidset. I den viste dobbeltmærkede prøve er begge fluorheste tilstrækkeligt tæt på at gennemgå Förster Resonance Energy Transfer (FRET) fra den "grønne" donorfluoriort til den "røde" acceptorfluohore. Således kan rød fluorescens emission påvises i "prompt" tidsvinduet ved excitation af den grønne donor. I den anvendte opsætning (supplerende note 2) anvendes der to detektorer for hver farve, en orienteret parallelt med excitationsstråleretningen (betegnet "p") og den anden vinkelrette (betegnet "s"). (C) Tre forskellige autokorrelationsfunktioner kan bestemmes i et PIE-eksperiment: Korrelation af i) grønne kanalsignaler i prompttidsvinduet (ACFgp), ii) røde kanalsignaler i prompttidsvinduet (ACFrp) og iii) røde kanalsignaler i forsinkelsestidsvinduet (ACFrd). (D) To forskellige krydskorrelationsfunktioner kan bestemmes: iv) Krydskorrelationen "PIE"(CCFPIE) med grønne kanalsignaler i prompttidsvinduet korreleret med de røde kanalsignaler i forsinkelsesvinduet, hvor amplituden af denne kurve er relateret til co-diffusion af fluorophorer; og v) krydskorrelationen "FRET" (CCFFRET) med de grønne kanalsignaler i prompttidsvinduet, der er korreleret med de røde kanalsignaler i samme promptvindue her formen af denne kurve til tider hurtigere end diffusion er relateret til FRET-induceret intensitet ændringer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Kalibrering
Figur 2A-B viser en kalibreringsmåling af henholdsvis de singlyderende grønne og røde fluorophorer. På basis af en pasform med eq. 1 og den kendte diffusionskoefficient Dgrøn26 og Drød27 beregnes detektionsvolumens form ( z0 og w 0) og størrelsen ( Veff) på detektionsvolumen ved hjælp af eq. 2a-c. Fit resultater fra ACFgp fra den grønne fluorophore og ACFrd fra den røde fluorophore er sammenfattet i figur 2C. Begge fluorophorer udviser en ekstra afslapningstidskonstant på henholdsvis 8,6 μs (18%) og 36 μs (15%). Den molekylære lysstyrke (eq. 5a-b) af den grønne og røde fluorophore udgør henholdsvis 12,5 kHz pr. molekyle og 2,7 kHz pr. molekyle.

For en pålidelig vurdering af den konfokale volumenstørrelse og form samt den molekylære lysstyrke anbefales det at udføre 3-5 målinger pr. kalibreringseksperimenter og en fælles (eller global) pasform af alle gentagelser.

Krydstale α (Figur 2D, eq. 3) og den direkte excitation af acceptor af den grønne laser δ (Figur 2E, eq. 4) for dette fluorophore par ligger på ~ 15% og ~ 38%, henholdsvis.

Figure 2
Figur 2: Kalibreringsmålinger af frit diffus grøn og rød kalibreringsstandard. (A-B) Repræsentativ 60 s måling af en 2 nM grøn (A) og en kalibreringsstandardmåling på 10 nM rød (B), der er monteret på 3D-diffusionsmodellen, herunder en ekstra afslapningstid (eq. 1). Tabellen i panelet (C) viser fit-resultaterne og den afledte parameter baseret på eq. 2a-c og eq. 5a-b. * Diffusion koefficienter blev taget fra litteratur26,27. (D) Bestemmelse af krydstale α af det grønne signal i de røde kanaler (eq. 3). Excitationsspektret af den grønne standard er vist i cyan, emissionsspektret i grønt. Excitation laser linjer på 485 nm (blå) og 561 nm (orange) er vist som stiplede linjer. Gennemsigtige grønne og magentabokse viser det indsamlede emissionsområde (supplerende bestemmelse 2). (E) Bestemmelse af den direkte excitation δ af den røde fluorhest ved 485 nm laser (eq. 4). Farvekoden er identisk med (D), lys og mørk orange viser henholdsvis excitation og emissionsspektret af den røde standard. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at bestemme og kalibrere overlapningen af den grønne og røde excitationsvolumen anvendes en dobbeltmærket DNA-dobbeltstreng (Figur 3A) som beskrevet ovenfor. Her er fluorophorerne fordelt 40 bp fra hinanden, således at der ikke kan forekomme FRET mellem de grønne og røde fluorophorer, der er fastgjort til enderne af DNA-dobbeltstrengene. Figur 3B viser autokorrelationerne fra både fluorophorer i grøn (ACFgp) og magenta (ACFrd) og PIE-cross-korrelationen CCFPIEi cyan. Bemærk venligst, at signalet i de grønne kanaler i prompttidsvinduet for CCFPIE er korreleret med signalet i de røde kanaler i forsinkelsestidsvinduet16.

Her opnås en gennemsnitlig diffusionskoefficient for DNA-strengen af DDNA = 77 μm²/s. Yderligere oplysninger om beregningen findes i den trinvise protokol, supplerende note 4. Denne værdi opnås ved at indsætte den kalibrerede grønne og røde detektionsvolumenstørrelse (Figur 2) og de respektive diffusionstider for ACFgp og ACFrd af DNA-strengen (Figur 3C) i ligning 2a. Ved hjælp af de opnåede korrektionsværdier rGR og rRG og ved hjælp af eq. 6 senere kan mængden af co-diffusion, dvs. dobbeltmærkede molekyler (eller proteinkomplekser i tilfælde af co-transfection af to forskellige proteiner) bestemmes ud fra celleprøverne.

Figure 3
Figur 3: Kalibrering af det grøn-røde overlapvolumen ved hjælp af en DNA-prøve. (A) Den DNA-streng, der anvendes til kalibrering, bærer en grøn og en rød kalibreringsfluoriphe med en afstand på 40 bp imellem. Interdyeafstanden skal være tilstrækkelig stor til at udelukke FRET mellem fluorophorerne. (B) Repræsentativ 60 s måling af en 10 nM DNA-opløsning. Autokorrelationer fra både fluorophorer i grøn (ACFgp, grøn standard) og magenta (ACFrd, rød standard) og PIE-crosscorrelation, CCFPIE, med blåt. Tabellen i panelet (C) viser de fit-resultater, der er baseret på 3D-diffusionsmodellen, herunder et yderligere afslapningsudtryk (eq. 1) og den afledte parameterdiffusionskoefficient for DNA, DDNA (eq. 2a), størrelsen og formen af overlapningsvolumenet (eq. 2a-c) og korrektionsforhold rGR og rRG (eq. 6 ). Bemærk, at værdierne for den grønne og røde detektionsvolumen (mærket med *) er taget fra de enkelte fluorhestes pasform, der er vist i figur 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Eksperimenter med levende celler
I det følgende afsnit præsenteres analysen af levende celleeksperimenter for forskellige β2AR-konstruktioner. Da β2AR er et membranprotein, er dets diffusion i vid udstrækning begrænset til en todimensionel diffusion (Figur 4A) langs cellemembranen (undtagen transport- eller genanvendelsesprocesser til eller fra membranen) 2. Med begrænsningen til 2D diffusion formfaktoren s = z 0/w0 i eq. 1 bliver forældet resulterer i en forenklet diffusion model (eq. 9).

Konstruktioner med en enkelt etiket: β2AR-IL3-eGFP og NT-SNAP-β2AR
Figur 4 viser eksemplariske målinger af enkeltmærkekonstruktionen β2AR-IL3-eGFP (Figur 4B), hvor eGFP indsættes i den intracellulære løkke 3, og konstruktionen NT-SNAP-β2AR (Figur 4C), hvor SNAP-mærket er bøjet til N-endestationen i β2AR. SNAP-mærket er mærket med et membran-uigennemtrængeligt SNAP-overfladesubstrat. De repræsentative kurver viser gennemsnittet på 4-6 gentagne målinger med anskaffelsestider på 120 - 200 s hver. De respektive autokorrelationer ACFgp og ACFrd af eGFP og SNAP-signalet er monteret på en todimensionel, todimensionel diffusionsmodel (eq. 9). Med hensyn til hurtig dynamik, eGFP viser kun den forventede triplet blinkende på tR1 ~ 9 μs, mens SNAP-signalet kræver to afslapning gange, en på den typiske triplet blinkende tid på tR1 ~ 5 μs og en anden på tR2 ~ 180 μs.

Fluorophorernes molekylære lysstyrke i levende celler er 0,8 KHz (eGFP) og 1,7 kHz (SNAP) pr. molekyle under de givne excitationsforhold (eqs. 5a-b). Koncentrationen af de mærkede β2AR-konstruktioner, der er indarbejdet i cellemembranen, skal være i nano-molarområdet og kan bestemmes af det gennemsnitlige antal molekyler (eq. 9, figur 4C) og størrelsen af det respektive konfokale volumen for den grønne og røde kanal (figur 2) ved hjælp af eq. 8.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ måling af enkeltmærkekonstruktioner. (A) I denne undersøgelse blev membranreceptoren β2AR anvendt som eksempel. I modsætning til de fluorophorer og DNA-streng, der anvendes til kalibrering, som frit kunne flyde gennem detektionsvolumen, diffuse membranproteiner hovedsageligt sideværts langs membranen, beskrevet som 2-dimensionel diffusion. (B, D) ACFgp og ACFrd af enkelt-label konstruktioner β2AR-IL3-eGFP (B) og NT-SNAP-β2AR (D). Vist er gennemsnittet af 4-6 målinger hver indsamlet for 120 - 200 s. Tabellen i panelet (C) viser dataenes fit-resultater til den todimensionelle diffusionsmodel, herunder yderligere afslapningsvilkår (eq. 7). Klik her for at se en større version af dette tal.

Dobbeltmærket konstruktion: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
I den dobbeltmærkede konstruktion NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (kort NT-SNAP) indsættes eGFP i den intracellulære løkke 3, og SNAP-mærket, der er bøjet til N-endestationen for β2AR (Figur 5A). I denne konfiguration er eGFP på indersiden af membranen og SNAP på ydersiden med for store afstande til FRET. I et ideelt tilfælde ville denne konstruktion vise 100% co-diffusion af den grønne og røde fluorophore, og ingen FRET signal. Figur 5B-D viser to målinger af NT-SNAP i to celler på to forskellige måledage. Ved montering af ACFgp og ACFrd af den "bedre" måling vist i figur 5B med eq. 7 og CCFPIE med eq. 9, afslører 50- 60 molekyler i fokus for ACFgp og ACFrd, mens Napp, således 1/G0(tc) ~ 114 for CCFPIE (Figur 5C ). Koncentrationen af mærkede receptorer ligger i ~100 nM-området som bestemt med eq. 8. For at bestemme den gennemsnitlige koncentration af dobbeltmærkede molekyler beregnes for det første forholdet G0(tc) (repræsenteret ved henholdsvis 1/N(app)) af CCFPIE til ACFgp og ACFrd(eq. 6). Dernæst sammenlignes disse værdier, rGRcell= 0,43 og rRGcell = 0,53, med de værdier, der opnås ved DNA-målingen (rGR,DNA= 0,51 og rRG,DNA = 0,79 på denne måledag). Ved hjælp af reglen om proportioner reflekterer en rGRcell= 0,43 fra EGFP-signalets ACFgp til en brøkdel af co-diffusion (rGRcell/ r GR,DNA ) på 0,84, hvor denne værdi for det andet tilfælde af ACFrd af SNAP-substratets signal udgør 0,67. Den gennemsnitlige koncentration af den dobbeltmærkede NT-SNAP-konstruktion kan endelig beregnes på basis af eq. 10. I modsætning hertil er koncentrationen af receptorer i målingen vist i figur 5D fra en anden dag ret lav, og dataene meget støjende, således at pasformsområdet er begrænset op til ~ 10 μs. Derudover observeres kun en lav mængde co-diffusion (15 - 26%).

Figure 5
Figur 5: Nt-SNAP-β2AR-IL3-eGFP-konstruktion. (A) I den dobbelte konstruerede konstruktion indsættes eGFP i den intracellulære løkke 3 og snap-mærket, der er fastgjort til N-terminus for β2AR (NT-SNAP). (B, D) ACFgp, ACFrd og CCFPIE af to målinger af den dobbeltmærkede konstruktion. Dataene er egnet til en todimensionel diffusionsmodel (eq. 9, CCFPIE) og omfatter yderligere afslapningsbetingelser (eq. 7, ACFgp og ACFrd). Tabellen i panelet (C) viser fit-resultaterne og den afledte parameterkoncentration (eq. 8), forholdet mellem korrelationsforstærkningen ved nul korrelationstid (G0(tc)) og fraktionen af co-diffusing molekyler (eq. 10). Bemærk, at målingerne blev erhvervet på forskellige dage, og derfor blev der anvendt lidt anden faktor for amplitudkorrektionen (B: rGR,DNA = 0,51 og rRG,DNA = 0,79; D: rGR,DNA = 0,51 og rRG,DNA = 0,56). Klik her for at se en større version af dette tal.

Dobbelt-mærket konstruktion gennemgår FRET: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
I den dobbeltmærkede konstruktion β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (Figur 6A) indsættes eGFP i den intracellulære løkke 3 identisk med NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP-konstruktionen med SNAP-mærket fastgjort til C-endestationen. Her er begge etiketter på samme side af cellernes plasmamembran, således at fluorophorerne er i nærheden, således at FRET forekommer som angivet af den slukkede eGFP-levetid (supplerende note 5). I betragtning af fleksibiliteten i relativt ustrukturerede proteinregioner som C-terminus34 og mindst to forskellige proteinkonformationer af GPCR35,"høj FRET" (HF) eller "lav FRET" (LF), kan dynamiske ændringer i FRET-effektiviteten som følge af eGFP-SNAP-afstandsændringer observeres og identificeres ved et antikorrelationsudtryk i CCFFRET (orange kurve i figur 6B ). FRET udsving har vist sig at være antikorreleret, da receptoren kun kan være i én tilstand ad gangen, enten HF eller LF. Fælles (eller global) passer af alle fem korrelation kurver (Figur 6B) afslører ~ 70% af langsomt diffuserende molekyler på ~ 100 ms, mens resten diffuses med ~ 1 ms. Alle autokorrelationer og CCFFRET viser afslapningsvilkår ved 37 μs og 3 μs; de korrelationer, der domineres af rødt signal (ACFrp, ACFrd og CCFFRET), viser en ekstra langsom komponent ~ 50 ms (Figur 6C).

FRET-inducerede ændringer på CCFFRET under forskellige forhold (figur 6D) påvises ved en række simuleringer af et tostatssystem med en udsvingstid på 70 μs mellem LF- og HF-tilstande. Når du skifter fra LF til HF-tilstand, observeres ændringer i det antikorrelerede signal i prompttidsvinduet: Det grønne signal falder, og det røde signal øges (omvendt for HF -> LF-skiftet). Hvis HF-LF-skift sker på tidsskalaer hurtigere end diffusionstiden, med andre ord i molekylets opholdstid i fokus, kan satsen udledes af antikorrelationen i CCFFRET6,31,36. Bemærk, at dynamiske processer langsommere end diffusionstiden ikke kan observeres i FCS.

I denne demonstration blev der antaget to forskellige FRET-scenarier, der viser enten en moderat eller maksimal ændring i FRET-effektiviteten mellem de to stater. Simuleringerne blev udført ved hjælp af Burbulator37 og overveje fravær eller tilstedeværelse af triplet blinkende og stigende mængde donor krydstale i de røde kanaler. Diffusionsudslet blev modelleret som en bimodal fordeling med 30% af hurtigt diffuserende molekyler ved tD1 = 1 ms og resten af molekylerne, der spredte sig langsomt med tD2 = 100 ms. I alt blev 107 fotoner simuleret i et 3D Gaussian-formet volumen med w0 = 0,5 μm og z0 = 1,5 μm, en kassestørrelse på 20 og NFCS = 0,01.

Figur 6E-F viser simuleringsresultaterne for den FRET-inducerede krydskorrelation CCFFRET for moderat (Figur 6E) og maksimal FRET-kontrast ( Figur6F) i mangel (faste linjer) og tilstedeværelsen af triplet blinkende (stiplede linjer). Den FRET-inducerede antikorrelation kan let ses i figur 6F. Effekten "dæmpning" ved tilføjelse af en ekstra triplet-tilstand reducerer korrelations amplituden (Figur 6E-F)38,39.

Figure 6
Figur 6: Simulering af dobbeltmærkede prøver, der viser dynamisk FRET. (A) Dobbeltmærket β2AR med en eGFP indsat i den intracellulære løkke 3 og et C-terminal SNAP-tag. Begge fluorophorer er tæt nok til at gennemgå FRET og vise ændringer i FRET effektivitet, hvis receptoren gennemgår protein dynamik. (B) Autokorrelation (ACFgp, ACFrp og ACFrd, passer til eq. 7) og krydskorrelationskurver (CCFFRET (eq. 7) og CCFPIE (eq. 9)) af en eksempelmåling. Tabellen i panelet (C) viser tilpasningsresultaterne. (D-F) For at vise eksperimentel parameters indflydelse på det forventede, FRET-inducerede antikorrelationsudtryk blev der udført 12 simuleringer, hvor ændringen i FRET-effektiviteten (lille eller stor), forskellig mængde donorkrydstale i acceptorkanalerne (0%, 1% eller 10%) og fraværet og tilstedeværelsen af triplet blinking blev modelleret. Ligevægtsfraktionen i begge FRET-stater blev antaget til 50:50, og deres valutakurser justeret således, at den opnåede afslapningstid tR = 70 μs. Flere detaljer om simuleringerne se i teksten. (E) CCFFRET af simuleringsresultaterne med en moderat FRET-kontrast og i mangel af krydstale (mørk orange), 1% krydstale (orange) og 10% krydstale (lys orange). Faste linjer viser resultater i mangel af triplet, stiplede linjer i nærværelse af triplet. (F) CCFFRET af simuleringsresultaterne med maksimal FRET-kontrast. Farvekoden er identisk med (E). Klik her for at se en større version af dette tal.

Men i simuleringen mest ligner de eksperimentelle betingelser (α = 10%, 15% triplet blinkende og moderat FRET kontrast, stiplet gul linje i figur 6E), antikorrelation sigt er næsten formindsket. Figur 7 viser resultatet af at analysere disse simulerede data ved hjælp af de oplysninger, der er kodet i foton ankomsttid histogrammer (dvs. fluorescens levetid) ved hjælp af Fluorescens Lifetime Correlation Spektroskopi (FLCS)17,19 eller art-filtreret FCS (fFCS)18. Her anvendes fluorescenslevighedsleverne for de kendte HF- og LF-arter (figur 7A) til at generere vægte eller "filtre" (Figur 7B), som anvendes under korrelationsproceduren. I de opnåede arter-auto- og krydskorrelationskurver (Figur 7C-D) kan antikorrelationen tydeligt observeres.

Figure 7
Figur 7: Levetidsfiltreret FCS kan bidrage til at afdække de proteindynamikbaserede udsving i FRET-effektiviteten i prøver med høj krydstale, signifikant triplet blinkende eller andre fotofysiske eller eksperimentelle egenskaber, der maskerer den FRET-inducerede antikorrelation i CCFFRET. Her er tilgangen vist eksemplarisk for de data, der er vist i figur 6E for simuleringen, der indeholder 10% krydstale og 5% triplet blinkende. (A) Normaliserede fluorescensintensitet henfaldsmønstre for de to FRET-arter (lys og mørkegrøn for henholdsvis høj og lav FRET) og IRF (grå). Mønsteret for den parallelle detektionskanal vises i faste linjer, stiplede linjer for vinkelret detektionskanal. (B) Vægtningsfunktionen eller "filteret" blev genereret på basis af de mønstre, der er vist i (A), farvekoden er identisk med (A). Bemærk, at kun signalet i de grønne detektionskanaler, og dermed FRET-induceret donorslukning, betragtes her. (C) Der opnås fire forskellige artsselektive korrelationer: art-autocorrelationer af den lave FRET-tilstand (sACFLF-LF, mørkegrøn) og den høje FRET-tilstand (sACFHF-HF, lysegrøn) og de to artskorrelationer mellem den lave FRET til den høje FRET-tilstand (sCCFLF-HF, mørk orange) og omvendt (sCCFHF-LF , orange). SCCF viser tydeligt antikorrelationen i μs-området. Stiplede sorte linjer viser pasformerne. sACF var i form med eq. 9 og sCCF med eq. 11. Tabellen i panelet (D) viser tilpasningsresultaterne. Klik her for at se en større version af dette tal.

CCFPIE amplitud til at studere Protein-Protein Interaktion (PPI)
Endelig er en almindelig use case for PIE-baserede FCS i levende celler at studere samspillet mellem to forskellige proteiner. Her er udlæsningsparameteren CCFPIE'samplitud , eller mere præcist forholdet mellem autokorrelations amplituderne ACFgp og ACFrd og amplituden af CCFPIE. For at vise effekten af øget co-diffusion på CCFPIEer der udført simuleringer baseret på de to enkeltmærkede konstruktioner, β2AR-IL3-eGFP og NT-SNAP-β2AR (Figur 8A). Figur 8B viser, hvordan amplituden af CCFPIE øges, når fraktionen af co-diffusing molekyler ændringer fra 0% til 100%. Bemærk, at en krydstale på 1 % af grønt signal ind i de røde kanaler i forsinkelsestidsvinduet blev tilføjet med diffusionskomponenterne, der ellers var modelleret som vist ovenfor.

Figure 8
Figur 8: CCFPIE kan bruges til at studere samspillet mellem to proteiner. (A) Her blev en co-transfection undersøgelse af β2AR-IL3-eGFP med NT-SNAP-β2AR (med en "rød" SNAP-etiket) simuleret. (B) For en stigende mængde co-diffusing molekyler (0% (mørkeblå) -> 100% (lyseblå)) amplitude G(t)stiger. Diffusionsudsormet blev igen modelleret som en bimodal fordeling med 30% af hurtigt diffuserende molekyler ved tD1 = 1 ms og resten af molekylerne, der spredte sig langsomt med tD2 = 100 ms. Derudover blev der tilføjet 1 % krydstale af grønt signal i det røde forsinkelsestidsvindue. Klik her for at se en større version af dette tal.

Symbol Betydning (fælles enhed)
α krydstale af den grønne fluorophore efter grøn excitation i de røde detektionskanaler (%)
a1 fraktion af første diffusion komponent i bimodal diffusion model af membran receptorer
af total amplitude af antikorrelationsbegrebet
aR amplitud af fotofysik / triplet blinkende
b baseline /offset af en korrelationskurve
B molekylær lysstyrke af et fluorophore ((kilo-)antal pr. molekyle og andet)
BG baggrund (f.eks. fra en passende referenceprøve: ddH2O, buffer, uoversendt celle osv.)
c koncentration
CR antal (KHz- eller (kilo)antal pr. sekund)
δ direkte excitation af den røde fluorophore efter grøn excitation (%)
D diffusionskoefficient (μm²/s)
G(tc) korrelationsfunktion
N antal molekyler i fokus
NA Avogadro's nummer (6,022 * 1023 Mol-1)
rGR, rRG amplitudforhold mellem grøn eller rød autokorrelationsfunktion og den PIE-baserede krydskorrelationsfunktion
s formfaktor for konfokalt volumenelement
tc c korrelationstid (normalt i millisekunder)
tD diffusionstid (normalt i millisekund eller mikrosekund)
tR afslapningstid for fotofysik (normalt i mikrosekund)
tT afslapningstid for triplet blinkende (normalt i mikrosekund)
w0 halv bredde af konfokalt volumenelement (μm)
z0 halv højde af konfokalt volumenelement (μm)

Tabel 1: Liste over variabler og forkortelser. For brug af symboler og definition i fluorescens og FRET eksperimenter anbefales retningslinjerne for FRET community40.

SUPPLERENDE FILER:

SuppNote1_Coverslip rengøring.docx Klik her for at downloade denne fil.

SuppNote2_Confocal installationsprogrammet.docx Klik her for at hente denne fil.

SuppNote3_Data eksportere.docx Klik her for at hente denne fil.

SuppNote4_FCCS kalibreringsanalyse ved hjælp af ChiSurf.docx Klik her for at hente denne fil.

SuppNote5_Fluorescence levetid histogrammer.docx Klik her for at downloade denne fil.

S6_Scripts.zip Klik her for at downloade denne fil.

S7_Excel_templates.zip Klik her for at hente denne fil.

Discussion

FCS-teknikker i GPCR gør det muligt at vurdere mobiliteten og samspillet mellem receptorer inde i levende celler41. Fordelen ved FRET-FCS-teknikken er, at sammen med mobilitet kan den kropslige dynamik i GPCR'er undersøges. Det er imidlertid en udfordring at udføre FRET-FCS i levende celler og kræver celler, der viser et lavt (eller maksimalt moderat) udtryk for det fluorescerende mærkede protein af interesse, en velkalibreret opsætning og en god pipeline til at analysere data. Her diskuteres først de kritiske punkter i prøveforberedelse og forsøgsprocedure vedrørende de biologiske, spektroskopiske og tekniske synspunkter.

Kritiske eksperimentelle trin omfatter minimering af baggrund og autofluorescence (ved hjælp af omfattende renset coverslips og phenol-røde frie medier), optimering af transfection betingelser (f.eks mængden af plasmid DNA og tid efter transfection) for at opnå lave udtryksniveauer og effektiv mærkning. Det er naturligvis også vigtigt at sikre, at det mærkede proteins funktion ikke hæmmes. I livecelleeksperimenter træffes beslutningen om mærkningsstrategien og etiketpositionen således ofte til fordel for fluorescerende proteiner eller SNAP/CLIP-tag, der er fastgjort til det fleksible N- eller C-endestation42,43. Alternative mærkningsstrategier som indsættelse af en unaturlig aminosyre med en reaktiv sidekæde til mærkning med en organisk fluorophore er dukket op i de sidste år44.

For pie-FCS med to farver, hvor kun samspillet mellem to molekyler af interesse skal undersøges, kan fluorophorerne vælges blandt en lang række etablerede fluorescerende proteiner eller SNAP/CLIP substrater. Her bør spektroskopi-klog målet være at vælge et par sådan, at lidt krydstale eller direkte acceptor excitation forekomme. Derudover skal de valgte fluorophores være photostable og vise lidt eller ingen blegning under de valgte eksperimentelle forhold. Det anbefales at vælge fluorophorer i det røde spektralområde, da (1) autofluorescencebaggrunden fra cellen reduceres, og (2) excitationslyset er af længere bølgelængde, hvilket er mindre fototoksisk14. Photobleaching kan minimeres ved at gennemføre en såkaldt "power series" først, hvor lasereffekten øges trinvist, og den molekylære lysstyrke observeres. Den optimale excitation intensitetsområde ligger i den lineære rækkevidde af resultaterne45.

Hvis de to etiketter formodes at rapportere også om protein kropsbygning dynamik gennem FRET så valget af tilgængelige fluorophores er mere begrænset. Her skal den mulige minimale/maksimale afstand mellem de to fluorheste estimeres på forhånd, f.eks. baseret på tilgængelige strukturer eller molekylær størrelse, og et fluorophorepar udvalgt med en rimelig Förster radius R0, således at FRET faktisk kan forekomme20.

Her blev eGFP og et SNAP-tag valgt til mærkning, og SNAP-mærket blev mærket med enten et intracellulært eller et membran-uigennemtrængeligt overfladesubstrat. Spektret svarer til dem, der er vist i figur 2C-D. Denne kombination af fluorophorer viser høj krydstale af eGFP i de røde detektionskanaler og direkte acceptor excitation af SNAP-substratet ved den grønne excitation i prompt timevinduet og resulterer i et betydeligt "falsk" signal i de røde kanaler i prompttidsvinduet. Ideelt set bør begge værdier, krydssnak og direkte acceptor excitation ikke overstige 5%5,6,38. Med en Förster-radius på 57 Å er den dog ideel til at sondere afstanden mellem etiketterne i β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP konstruktion, som kan evalueres ud fra den slukkede eGFP-levetid (supplerende note 5).

Teknisk set bør enheden, hvad angår ethvert fluorescensspektroskopieksperiment, være godt justeret og have passende excitationskilder, emissionsfilter og følsomme detektorer. For at undgå artefakter fra detektor efterpulsing på μs tidsskala, mindst to detektorer af hver farve bør være til stede, som kan være krydskorreleret. I moderne tidskorreleret enkeltfotontællingselektronik spiller detekteringskortets døde tid i ns-tidsintervallet næppe en rolle på grund af de uafhængige routingkanaler, men det kan kontrolleres som foreslået af Müller et al. 16, forudsat at tidsintervallet ligger i sub-μs/ns-tidsintervallet. Derudover skal hver detektionskanal fordobles,dvs. Mens den gennemsnitlige fluorescenslevetid kan estimeres ved hjælp af ikke-polariseret fluorescensdetektering, skal emissionen opsamles polariseringafhængig til analyse af afstanden (~fordeling) mellem fluorophorerne. Dette skyldes, at effektiviteten af energioverførslen i FRET afhænger af orienteringen af de to fluorophorer. Mere detaljerede oplysninger kan findes her20,28,47. Endelig er afstanden mellem prompt- og forsinkelsespulsen i PIE-eksperimenter kritisk og bør vælges således, at fluorescensintensiteten af fluorophorerne stort set er blevet henfaldet (figur 1B). En fælles regel er at placere de to impulser 5x fluorescens levetid fra hinanden, dvs for eGFP med en fluorescens levetid på 2,5 ns afstanden skal være 12,5 ns på mindst22.

Efter at have detaljeret beskrevet alle overvejelser for forsøgsproceduren diskuteres dataene og dens analyse mere detaljeret. Som nævnt i protokolafsnittet skal justeringen af opsætningen kontrolleres dagligt, herunder analysen af kalibreringsmålingerne. De data, der er vist i figur 2A-C, viser f.eks. en yderligere afslapningskomponent i 8-40 μs-området. Typisk triplet blinkende af den grønne kalibrering fluorophore er kendt for at forekomme i 2-10 μs rækkevidde13,15,48. Den langsomme afslapningskomponent, der kræves i alle kurver i DNA-prøven (Figur 3C), for langsom til faktisk triplet blinkende, kan stamme fra interaktioner mellem DNA med fluorophores39. Denne komponent forventes dog ikke i CCFPIE, og sandsynligvis stammer fra resterende krydstale. Det er således meget tilrådeligt at udføre analysen af kalibreringsprøverne umiddelbart før du fortsætter til celleeksperimenterne for at bedømme kvaliteten af dagens tilpasning.

Korrekt kalibrering af den konfokale overlapningsvolumen kræver en prøve med 100% co-diffusion af den grønne og røde etiket. Her anvendes fluorescerende mærket dobbeltstrenget DNA. Begge DNA-strenge kan skræddersys til at have de ønskede fluorophorer i den ønskede afstand fra hinanden. De designede tråde kan udglødes med højt udbytte. Good Laboratory Practice anbefaler imidlertid, at dna-strengenes integritet og mærkningsgrad kontrolleres ved hjælp af agarosegelelektroforese og måling af absorptionsspektret. Udbyttet af den dobbeltstrengede samling bør også kontrolleres, da denne kalibreringsmåling i kritisk grad afhænger af den antagelse, at der er en 100% co-diffusion af greenen med den røde etiket. Hvis antagelsen ikke er gyldig , skal korrektionsfaktorer muligvis anvendes16,22. I kalibreringsmålingerne i figur 2 og figur 3blev der opnået et detektionsvolumen på henholdsvis 1,4 fL og 1,9 fL i den grønne og røde kanal. Denne størrelsesforskel forventes for en opsætning med næsten diffraktionsbeskriberede excitationsvolumener (supplerende note 2). Under denne tilstand skaleres størrelsen af excitationsvolumenet med excitationsbølgelængden. Dette forklarer igen de forskellige korrelations amplituder , der er observeret i figur 3B. De afledte korrektionsfaktorer rGR = 0,56 og rRG = 0,72 korrekte for denne størrelse uoverensstemmelse og potentielle ikke-perfekte overlapning af de to excitation mængder3,4.

Figur 4, Figur 5, Figur 6og Figur 7 viser arbejdsgangen i en PIE-F(C)CS-baseret undersøgelse, der har til formål at forstå kropsbygningsproteindynamikken. For det første tjener de to enkeltmærkede konstruktioner β2AR-IL3-eGFP og NT-SNAP-β2AR som kontrolforanstaltninger til at karakterisere fluorophoreegenskaberne i celler i mangel af de respektive andre fluorophore (figur 4). Dernæst fungerer den dobbeltmærkede konstruktion NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP med et SNAP-tag mod cellens ydre og en eGFP på den cytoplasmatiske side som en "100% co-diffusion" control (Figur 5). Den sidste konstruktion, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, bærer både fluorophores på den cytoplasmatiske side og tæt nok sammen til at gennemgå FRET. Her, igen en 100% co-diffusion ville forventes i takt med anti-korreleret intensitet udsving i de grønne og røde kanaler signal i prompt time window, dvs efter donor excitation, på grund af protein dynamik påvirker FRET effektivitet31,32,33. Denne dynamik kan vise sig at være antikorrelation i CCFFRET (Figur 6-7).

Alle GPCR β2AR konstruktioner viser bimodal diffusion på cellemembranen (Figur 4A). Mens β2AR-IL3-eGFP kun viser den forventede triplet blinkende (Figur 5B)13,15, NT-SNAP-β2AR viser en ekstra langsom afslapningstid (Figur 5C-D). Det er sandsynligt, at tR2 kan stamme fra ubundet SNAP-substrat. Dette kunne belyses ved yderligere forsøg, f.eks. ved også at måle diffusionen og fotofysiske egenskaber ved det anvendte SNAP-substrat i en vandig opløsning. Bemærk, at et ligetil eksperiment for at skelne mellem diffusions- og afslapningstider er at ændre pinhole af den confocal setup, dvs. øge det effektive volumen: Mens diffusionstider øges med stigende effektive mængder, er afslapningsbetingelser uændrede13. Ved bestemmelse af koncentrationen af fluorescerende protein (FP) baseret på fit-resultaterne skal du være opmærksom på, at FPs generelt gennemgår en modningsproces, hvor kromophe endelig dannes12. Denne modningstid kan variere fra FP til FP ud over fotofysik, der afhænger af det lokale kemiske miljø13,15. Således undervurderes den faktiske proteinkoncentration, der er til stede i den prøve, der er rapporteret af FCS, normalt, hvilket kan korrigeres, hvis andelen af ikke-fluorescerende FPs kan bestemmes i forsøget. Endelig er det tilrådeligt at kontrollere fluorophorespektret i levende celler for at korrigere værdierne for α og δ, hvis det er nødvendigt, da de fleste fluorophorer reagerer følsomt over for deres miljø13,15,48. Baggrunden for at trække fra bestemmes af det signal, der indsamles i ikke-transfected celler. Derudover skal autokorrelationen mellem den respektive anden farvekanal og CCFPIE kontrolleres for at kunne identificere falske signaler (supplerende note 4 - figur 30).

De to målinger fra NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (Figur 5D), hvor fluorophorerne er placeret på forskellige sider af membranen, blev erhvervet på forskellige dage og viser statistikkens betydning i tidsfornødmet enkeltmolekyle fluorescens. Her kan de forskellige resultater skyldes den forskellige grad af mærkning: I en celle resulterede den højere grad af mærkning og gennemsnit af målinger i relativt lav støj (Figur 5B), mens der fra den anden celle kun kunne indsamles to målinger (Figur 5A). Ud over at indsamle en tilstrækkelig mængde data er det afgørende at evaluere resultaterne rettidigt og måske optimere mærkningsstrategien. Når man designer forsøgene, er det vigtigt at huske, at FRET er følsom, men begrænset til afstande op til 10 nm og "blind" ellers. I vores tilfælde er denne "blindhed" angivet af den uændrede eGFP fluorescenslevetid (supplerende note 5). I β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-konstruktion (figur 6A)kan FRET identificeres fra den slukkede eGFP-levetid (supplerende note 5). Der observeres dog ikke noget antikorrelationsudtryk (figur 6B), hvilket betyder, at FRET enten ikke svinger eller på en tidshorisont langsommere end diffusionstidspunktet. Der kræves op til tre yderligere afslapningsbetingelser i ACFgp, ACFrp, ACFrd og CCFFRET (Figur 6C). Den langsomme komponent i ACFrp, ACFrd og CCFFRET kan skyldes accepteller blegning og naturligvis påvirker den opnåede værdi af den langsomme diffusion findes i disse kurver (~ 350 ms sammenlignet med 117 ms i ACFgp). tD i den røde kanal formodes at være lidt større end i den grønne kanal på grund af de forskellige størrelser confocal mængder (Figur 2) - men kun med en faktor, der kan sammenlignes med størrelsesforskellen. Den meget hurtige afslapningstid på 3 μs afspejler triplet blinkende af fluorophores13,15,48, mens den langsommere afslapningstid på 37 μs kan skyldes FRET: Tilsvarende, som FRET fremkalder en antikorrelation i CCFFRET, positive korrelationer forventes i autocor relations31,32,33. Tilstedeværelsen af dette udtryk som "positiv" i CCFFRET og dets tilstedeværelse i ACFrd kan forklares med den høje krydstale og bør yderligere belyses. Bemærk, at CCFPIE er flad på korte korrelationstider som forventet.

På den anden side skal det bemærkes, at forekomsten af FRET i et interessesystem fører til ikke-lineære virkninger på korrelationskurverne6. Den molekylære lysstyrke fx af et molekyle skaleres ind i korrelation amplituden kvadreret og hver FRET-tilstand (og de altid nuværende molekyler uden en aktiv receptor) viser forskellige molekylære lysstyrke. Faktisk, FRET nedsætter den tilsyneladende koncentration af grønne molekyler opdaget (dvs. øger ACFgp amplitud) og antallet af røde molekyler (bestemt fra rød-prompt) er overvurderet5. Begge virkninger påvirker mængden af interaktion, der stammer fra både CCFFRET og CCFPIE. Men global analyse som vist f.eks. for den intramolekyliske dynamik i Calmodulin 31,32 eller Syntaxin33 kan afsløre proteindynamikken. Når den er omhyggeligt kalibreret, kan den gennemsnitlige FRET-effektivitet udvindes fra den relative CCFPIE- og ACF-amplitud22, mens de begrænsende tilstande kan bestemmes ud fra analysen af donorfluescensenslevfordelingen33.

I betragtning af, at FRET-kontrasten i levende celleeksperimenter med store fluorheste som eGFP sandsynligvis vil være endnu lavere end antaget for simuleringerne i figur 6, og at acceptorens direkte excitation ikke blev tilføjet i simuleringen, kan det forklare, hvorfor identifikationen af antikorrelationen i levende celleforsøg er meget udfordrende. Et lovende analysealternativ er baseret på høst af de oplysninger, der er kodet i foton ankomsttid histogrammer (Figur 1B) tilgængelig på grund af den tidskorrelerede enkeltfotontælling af dataindsamling29,30. Hvis fluorescenslevighedslevetiden (~mønstre) for de to (eller flere) arter (FRET) inde i prøven kendes (Figur 7A), kan der vælges "filter" eller vægte, som anvendes under korrelationsprocessen (Figur 7B)17,18,19. De således opnåede korrelationskurver repræsenterer ikke længere korrelationen mellem detektionskanaler, men snarere auto- eller krydskorrelationerne mellem to forskellige (FRET) arter, der således omdøbes til arter-ACF (sACF) eller art-CCF (sCCF). Hvis du anvender denne tilgang på de simulerede data med moderat FRET-kontrast, genoprettes antikorrelationsudtryktet (Figur 7C-D). Det skal dog bemærkes, at afslapningstider kan opnås, men forholdet til amplitud er tabt18. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt i levende celleforsøg, f.eks. for at studere samspillet mellem EGFR og dets antagonist49 eller for at adskille fluorescensen fra proteiner, der er knyttet til eGFP-varianter med usædvanligt korte og lange fluorescenslevetid50.

Mens PIE-baserede FRET målinger i rensede proteiner i vid udstrækning bruges til at studere protein dynamik3622, i levende celler det fokuserer på at forstå protein-protein interaktioner. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at studere reguleringen af MAP kinase aktivitet i gær51 eller for at løse samspillet mellem membranproteiner med deres cytosolic bindende partner som opsummeret i denne seneste artikel52. Her kan der opstå komplikationer, når der stadig er betydelig krydstale af grønne fluorheste i forsinkelsestidsvinduet for de røde kanaler eller rødt signal i de grønne kanaler i prompttidsvinduet. Førstnævnte kan skyldes en utilstrækkelig forsinkelse af den røde puls med hensyn til den grønne puls, mens begge effekter skyldes for stærkt overlappende excitation og emission spektre af de valgte fluorophores. Det anbefales at kontrollere de respektive enkeltmærkede konstruktioner omhyggeligt og korrekt for falsk-positive CCFPIE amplituder, især i celler, hvor autofluorescence med meget kort fluorescens levetid kan være en anden komplicerende faktor22.

Afslutningsvis har FRET-FCS-tilgangen, der er beskrevet her, et stort potentiale til at forstå proteinproteininteraktioner og proteindynamikker i levende celler i nær fysiologiske koncentrationer. I denne protokol blev der fokuseret på de nødvendige kalibreringsmålinger og den nødvendige kvantitative analyse, der skal udføres under levende cellemålinger. Til dette formål blev forskellige levende cellemålinger vist suppleret med simuleringer. Simuleringerne giver den generelle forståelse her, da parameter kunne varieres systematisk med skræddersyede fit-modeller, der beskriver de respektive datas specifikke mobilitet og fotofysiske egenskaber. Analysen blev udført med open source-softwareværktøjer med en omfattende trinvis protokol og skabeloner, der er nemme at tilpasse. Endelig vil de tekniske fremskridt og dermed tilgængeligheden af ready-to-buy stabile PIE-FCS-systemer sammen med udbredelsen af open source-software til dataanalyse gøre denne teknik mere og mere tilgængelig for et større forskningssamfund til sidst at optrævle proteininteraktion og dynamik i levende celler med højeste følsomhed.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette projekt blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, projektnummer 374031971, Project INF) til J.B. og K.G.H.

Vi takker Rudolf Virchow Center for økonomisk støtte og Core Unit Fluorescens Imaging for teknisk support. Derudover takker vi Ashwin Balakrishnan for grundig korrekturlæsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses Qioptiq, Rhyl, UK G063126000 Optics
2x Band pass filters Brightline AHF, Tübingen, Germany HC 525/50 and HC 600/52 Filter
2x Dichroic beam splitter AHF, Tübingen, Germany HC BS F38-573 Filter
6-well culture plate Nunc Thermo Scientific (Waltham, USA) 140675 Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20000 Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20003 Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany WK-XYB-PZ-IX71 Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for  25 mm round coverslips Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A7816 Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) Laser Components GmbH, Olching, Germany SPCM-AQR-14 Single photon counting detector
Beamsplitter Newport, Darmstadt, Germany 10FC16PB.3 Filter
Biorender (Software) Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada) --- Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line ATCC CCL-61 Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software) Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA --- tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf
Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s
Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 472476-2.5L Reagent
DMSO AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) A3672,0250 Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance) IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) --- Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) P04-41250, P04-41650 Reagent
Ethanol (absolute) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 34852-1L-M Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 % Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 200964-5G Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom  (Berlin, Germany) S 0615 Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q Excelitas Technologies, Ontario, Canada XI120-Q-5060 Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9105S Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9112S Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 111640 Reagent
Laser Controller Picoquant, Berlin, Germany 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm) Picoquant, Berlin, Germany 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) Optics
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) 11668-019 Reagent
MFD suite (Software) AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany --- Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany AC254-150-A-ML Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 640110 Reagent
Olympus IX 71 stand Olympus, Hamburg, Germany IX2-ILL100 Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 31985-047 Reagent
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 049M4857V Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 14190144 Reagent
Pinhole (50 µM) Newport, Darmstadt, Germany PNH-50 Pinhole
PMT Hybrid-40 Picoquant, Berlin, Germany 932200 (PMA Hybrid 40) Single photon counting detector
Python scripts (Software) Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany --- Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) AHF, Tübingen, Germany F73-421PH Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator Picoquant, Berlin, Germany 02126 Optics
Sodium Hydroxide (NaOH) Carl Roth (Karlsruhe, Germany) 6771.1 Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) Picoquant, Berlin, Germany 931073 (SPT64-1+2 single user ) Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 Picoquant, Berlin, Germany 930010 (Hydraharp 400) Optics
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) T4299-100ml Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany ACN127-020-A First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) Olympus, Hamburg, Germany UPLSAPO60XW Objective

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  2. Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
  3. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  4. Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
  5. Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
  6. Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS--friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
  7. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826 (2020).
  8. Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
  9. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
  10. Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364 (2020).
  11. Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
  12. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
  13. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
  14. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  15. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
  16. Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
  17. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
  18. Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
  19. Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
  20. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  21. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  22. Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
  23. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  24. Thompson, N. L. Topics in Fluorescence Spectroscopy. Lakowicz, J. R. , Plenum Press. 337-378 (1991).
  25. Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
  26. Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
  27. Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
  28. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  29. Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106 (2007).
  30. Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113 (2008).
  31. Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
  32. Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
  33. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  34. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  35. Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
  36. Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206 (2014).
  37. Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
  38. Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
  39. Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
  40. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  41. Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
  42. Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
  43. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743 (2013).
  44. Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
  45. Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
  46. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104 (2005).
  47. Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
  48. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
  49. Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
  50. Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
  51. Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
  52. Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).

Tags

Biokemi udgave 178
Dual-Color Fluorescens Krydskorrelation Spektroskopi til undersøgelse protein-protein interaktion og protein dynamik i levende celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hemmen, K., Choudhury, S.,… More

Hemmen, K., Choudhury, S., Friedrich, M., Balkenhol, J., Knote, F., Lohse, M. J., Heinze, K. G. Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells. J. Vis. Exp. (178), e62954, doi:10.3791/62954 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter