Summary
Une méthode non marquée et non radio-isotopique pour tester l’activité de l’uracile-ADN glycosylase a été mise au point à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour l’analyse directe du produit contenant un site apurinique/apyrimidinique. Le test s’est avéré assez simple, spécifique, rapide et facile à utiliser pour la mesure de l’ADN glycosylase.
Abstract
L’uracile-ADN glycosylase (UDG) est un composant clé de la voie de réparation de l’excision de base pour la correction de l’uracile formé à partir de la désamination hydrolytique de la cytosine. Ainsi, il est crucial pour le maintien de l’intégrité du génome. Une méthode très spécifique, non étiquetée et non radio-isotopique a été développée pour mesurer l’activité UDG. Un duplex d’ADN synthétique contenant un uracile spécifique au site a été clivé par UDG, puis soumis à une analyse de spectrométrie de masse à temps de vol MALDI-TOF MS (MalDI-TOF MS) assistée par laser assistée par matrice. Un protocole a été établi pour préserver le produit du site purinique/apyrimidinique (AP) dans l’ADN sans rupture de brin. La variation de la valeur m/z du substrat au produit a été utilisée pour évaluer l’hydrolyse de l’uracile par UDG. Un substrat G:U a été utilisé pour l’analyse cinétique UDG donnant le Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s et Kcat = 9,31 s-1. L’application de cette méthode à un essai d’inhibiteur de l’uracile glycosylase (UGI) a donné une valeur IC50 de 7,6 pM. La spécificité de l’UDG utilisant l’uracile à différentes positions dans les substrats d’ADN simple brin et double brin a démontré différentes efficacités de clivage. Ainsi, cette méthode SIMPLE, rapide et polyvalente MALDI-TOF MS pourrait être une excellente méthode de référence pour diverses glycosylases d’ADN monofonctionnelles. Il a également le potentiel d’être un outil pour le dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.
Introduction
Bien que l’uracile soit une base normale dans l’ARN, il s’agit d’une lésion commune et hautement mutagène dans l’ADN génomique. L’uracile peut résulter d’une désamination hydrolytique spontanée/enzymatique d’une désoxycytidine. Dans chaque cellule vivante, cette désamination se produit 100 à 500 fois par jour dans des conditions physiologiques1,2. Si ces altérations ne sont pas réparées, il peut y avoir un changement dans la composition de la séquence d’ADN, provoquant une mutation. Comme l’uracile dans l’ADN préfère s’apparier avec le dATP pendant la réplication, si la cytosine se désamine en uracile, dans deux événements de réplication, il y aura une nouvelle mutation de transition G:C à A:T dans la moitié de l’ADN de la descendance3.
Parmi les stratégies cellulaires pour maintenir la stabilité génétique, la réparation de l’excision de base (BER) est un mécanisme essentiel qui répare les bases endommagées, telles que l’uracile, dans l’ADN4. Le BER est un processus hautement conservé sur le plan de l’évolution. Il existe deux voies BER générales : la voie à patch court menant à un tractus de réparation d’un seul nucléotide et la voie à long patch qui produit un tractus de réparation d’au moins deux nucléotides5. Le BER est un mécanisme coordonné qui se déroule en plusieurs étapes. La première étape du BER est l’hydrolyse enzymatique de la base nucléotidique endommagée par une glycosylase d’ADN spécifique aux dommages pour générer un site intermédiaire purinique/apyrimidinique (AP)6. Ceci est suivi par le clivage de l’épine dorsale sucre-phosphate sur le site AP par une endonucléase, le nettoyage des extrémités de l’ADN par une lyase, le remplissage de l’espace par une ADN polymérase et le scellement de l’entaille finale par une ligase5.
L’uracile-ADN glycosylase (UDG) hydrolyse l’uracile à partir de l’ADN contenant de l’uracile pour le BER chez Escherichia coli. Les tests UDG conventionnels utilisant de l’ADN radiomarqué impliquant différentes techniques de séparation6,7,8,9,10,11,12,13 prennent généralement beaucoup de temps, demandent beaucoup de main-d’œuvre, avec des réactifs d’étiquetage coûteux, des procédures compliquées et nécessitent une formation et une pratique intensives pour réduire les risques d’exposition aux matières radioactives. Des dosages fluorométriques d’oligonucléotides ont été développés en remplacement du marquage des radio-isotopes14, en plus des balises moléculaires et de la technologie de transfert d’énergie par résonance de Förster15,16,17,18,19,20. Cependant, un étiquetage spécifique est requis pour toutes les méthodes susmentionnées. Récemment, des tests de biocapteurs sans étiquette21,22,23 et des méthodes colorimétriques basées sur la formation d’un G-quadruplex24,25,26 ont été développés. Cependant, plusieurs paires A:U ou séquences spécialement conçues dans les sondes compliquent la définition de l’unité enzymatique.
MALDI-TOF MS est une technologie qui pourrait être d’une grande utilité dans l’analyse de l’ADN. Les applications développées comprennent le génotypage du polymorphisme mononucléotidique27,28, l’analyse de nucléotides modifiés29 et l’identification intermédiaire de réparation de l’ADN30,31,32,33,34. Maldi-TOF MS devrait être facilement adopté pour l’analyse de l’ADN glycosylase afin de détecter les produits d’ADN contenant du site AP. Cependant, les sites AP dans l’ADN sont sujets à la rupture des brins dans de nombreuses conditions expérimentales33. Un test UDG est présenté ici en utilisant MALDI-TOF MS pour mesurer directement la production du site AP sans bruit de rupture de brin significatif. Cette méthode sans étiquette est facile à utiliser et présente un potentiel élevé pour l’application pharmaceutique du dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.
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Protocol
1. Préparation du substrat/gabarit
- Concevez un substrat d’uracile / gabarit duplex avec une teneur équilibrée en G + C d’environ 50 ± 10% et une température de fusion minimale de 50 ° C pour la région duplex.
REMARQUE : Une différence de nucléotide entre les substrats de 18 nt et les gabarits de 19 nt (tableau 1 et figure 1) permet une meilleure interprétation du signal MS et un recuit approprié. Le brin modèle sert d’ADN complémentaire pour générer des incohérences A-U ou G-U (tableau 1), mais peut également être utilisé comme signal de référence dans les mesures de SEP. L’utilisation d’oligonucléotides synthétiques purifiés par CLHP est satisfaisante pour cette étude. - Dissoudre l’ADN dans 1 mM d’EDTA et 10 mM de Tris-HCl(pH 8,0 à 25 °C) (TE) à une concentration de 100 μmol/L comme bouillon et conserver à -20 °C. Diluer cette matière de 20 μL avec TE jusqu’à un volume final de 800 μL (dilution 25 fois à 4 μmol/L). Mesurer l’absorbance de la solution d’ADN dans un spectrophotomètre UV visible à λ = 260 nm pour s’assurer de la concentration assignée par le fabricant. Par exemple : A260 = 0,204 pour 4 μmol/L de U+9 et A260 = 0,192 pour 4 μmol/L de T1 (tableau 1).
- Effectuer l’analyse MALDI-TOF MS (sections 4-6) pour le contrôle de la qualité des oligonucléotides en inspectant les signaux de crête uniques aux valeurs m/z désignées ainsi qu’en vérifiant que le rapport signal/bruit est >100 (Figure 1B et Figure 1D).
2. Dosage de l’ADN glycosylase
- En utilisant un substrat G:U de duplex T1/U+9 (tableau 1 et figure 1A) pour la réaction de glycosylase, par exemple, dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL, ajouter 70 μL de H2O, 10 μL de tampon de réaction UDG 10x, 5 μL de stock T1 et 5 μL de stock U+9 (étape 1.2.).
REMARQUE: Choisissez le bon type de micropipette et suivez les instructions du fabricant pour gérer le volume requis. Par exemple, utilisez une pipette de 2 μL pour distribuer 0,1 à 2 μL de liquide, utilisez une pipette de 10 μL pour distribuer 2 à 10 μL de liquide et utilisez une pipette de 100 μL pour distribuer 20 à 100 μL de liquide afin d’assurer l’exactitude et la précision des résultats. Le volume décrit du mélange de réactifs est pour 10 essais; ajuster le volume pour le nombre de réactions souhaité. Le tampon de réaction 1x UDG contient 1 mM d’EDTA, 1 mM de dithiothréitol et 20 mM de Tris-HCl (pH de 8,0 à 25 °C). Voir le tableau des matériaux pour la source du tampon de réaction UDG 10x. - Fermez solidement le tube; incuber au bain-marie pendant 30 min à 65 °C, puis pendant 30 min à 37 °C, et enfin sur glace pendant 3 min pour assurer un recuit correct du duplex substrat/gabarit.
- Dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL, ajouter 49 μL de tampon de réaction UDG glacé 1x et 1 μL d’UDG (5 000 unités/mL; voir la Table des matériaux), en diluant à 0,1 unité/μL. Effectuez des dilutions en série avec 1x tampon UDG aux concentrations enzymatiques souhaitées de 0,05, 0,02 ou 0,01 unité/μL. Conservez toujours l’UDG dilué sur de la glace.
REMARQUE: Dans une réaction de 10 μL, 0,1 unité d’UDG peut cliver plus de 30 pmol d’uracile d’un duplex T1 / U + 9 en 3 min. - Dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL, ajouter 9,0 μL de mélange de substrat à partir de l’étape 2.2 et pré-préchauffer le tube à 37 °C. Ajouter 1,0 μL de l’UDG dilué de l’étape 2.3. Utilisez une minuterie pour chronométrer la réaction et faites glisser le tube pour mélanger le contenu.
REMARQUE: Pour un test de définition d’unité, le temps d’incubation est de 30 min. Pour un essai cinétique, utilisez une analyse temporelle de 0,5, 1, 2, 3, 5 min pour obtenir le taux initial. Pour un test d’inhibition de l’UGI, chronométrez la réaction pendant 15 min. - Centrifuger les tubes avec le mélange réactionnel pendant 3-5 s à 3 200 × g à température ambiante. Ensuite, transférez immédiatement la réaction à 37 °C.
- Fin de la réaction
- Préparer des solutions de base de 0,25 M HCl et 0,23 M Tris. Dans un tube à essai de 15 mL, ajouter 10 mL d’une solution de 1 mM d’EDTA et 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0 à 25 °C) pour imiter 1x tampon de réaction UDG. Acidifiez avec 1 mL de 0,25 M HCl et vérifiez avec un pH-mètre pour vous assurer que le pH est d’environ 2 ± 0,5. Neutraliser avec 1 mL de base Tris de 0,23 M et vérifier avec un pH-mètre un pH final de 6,5 ± 0,5.
REMARQUE: L’utilisation de bandelettes de test de pH est un moyen rapide et facile de reconfirmer les niveaux de pH du mélange de réactifs. - Ajouter 1 μL de 0,25 M HCl pour acidifier le mélange réactionnel de 10 μL afin d’inactiver l’enzyme et le placer sur de la glace pendant 6 min. Ajouter 1 μL de base Tris de 0,23 M pour neutraliser les produits à base d’ADN afin d’éviter la rupture du site AP par une exposition prolongée à l’acide. Ajouter 13 μL TE pour augmenter le volume du mélange de produits pour le transfert de puce matricielle , puis placez-le sur de la glace.
REMARQUE: Le produit AP est chimiquement instable et doit être analysé par MALDI-TOF MS dans les 2 jours. Après un stockage prolongé de plus d’une semaine, l’accumulation d’une partie importante des ruptures de brins se produit en raison de réactions d’élimination β/δ des produits AP (Figure 1D-G).
- Préparer des solutions de base de 0,25 M HCl et 0,23 M Tris. Dans un tube à essai de 15 mL, ajouter 10 mL d’une solution de 1 mM d’EDTA et 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0 à 25 °C) pour imiter 1x tampon de réaction UDG. Acidifiez avec 1 mL de 0,25 M HCl et vérifiez avec un pH-mètre pour vous assurer que le pH est d’environ 2 ± 0,5. Neutraliser avec 1 mL de base Tris de 0,23 M et vérifier avec un pH-mètre un pH final de 6,5 ± 0,5.
- Transférer tous les produits de réaction UDG de 25 μL des tubes de microcentrifugation vers une plaque de microtitrage de 384 puits.
REMARQUE: Des concentrations élevées de cations, tels que le sodium ou le potassium dans les tampons, génèrent des interférences dans l’analyse MALDI-TOF MS et nécessitent donc un dessalement. Comme le tampon de réaction UDG d’E. coli contient de très faibles concentrations de cations, le dessalement n’est pas nécessaire. Cependant, modifiez ce protocole pour mesurer d’autres réactions d’ADN glycosylase contenant des cations métalliques qui nécessitent un dessalement comme décrit précédemment35.
3. Transférer les produits de réaction UDG sur une puce matricielle
- Ouvrez la porte du distributeur de nanolitres (voir le tableau des matériaux) et chargez la plaque de microtitrage de 384 puits de l’étape 2.7 sur le support de plaque du pont.
- Insérez le réseau de puces matricielles dans la position correspondante de la plaque de reconnaissance. Placez la plaque de reconnaissance chargée sur le pont de traitement du distributeur de nanolitres et fermez la porte.
- Appuyez sur le bouton d’exécution de l’écran de transfert et attendez que l’instrument commence à distribuer des échantillons de la plaque de microtitrage de 384 puits à la puce matricielle.
- Utilisez l’option de l’onglet Vision pour afficher l’image de la puce et les volumes de distribution pour chaque endroit pendant la distribution. Assurez-vous que le volume tacheté sur la puce est compris entre 5 et 10 nL.
4. Configurez les paramètres de dosage sur le spectromètre de masse
- Utilisez le programme d’application (voir la table des matériaux) pour préparer un fichier .xlsx contenant la valeur m/z prévue du signal pour l’importation.
REMARQUE : Les paramètres du fichier I.xlsx (Tableau 2) sont des exemples de paramètres pour le test UDG du substrat G:U dans la section 2. - Utilisez le programme d’application pour créer et définir un nouveau test UDG en cliquant avec le bouton droit sur l’option Importer le groupe de tests au format Designer et en sélectionnant le fichier .xlsx dans la liste déroulante (par exemple, FICHIER I.xlsx de l’étape 4.1).
- Cliquez avec le bouton droit sur le bouton Customer:Project:Plate et cliquez en haut de l’arborescence déroulante des options pour établir une nouvelle plaque de test. Dans la boîte de dialogue, tapez un nom de fichier (par exemple, CTT20210620 pour le code de laboratoire et la date du test), puis dans la liste déroulante Type de plaque , sélectionnez le type de plaque à 384 puits et appuyez sur OK. Recherchez une plaque vierge à afficher à droite de l’écran.
- Cliquez sur l’option Test ; sélectionnez le test (par exemple, FICHIER I.xlsx) dans la liste déroulante.
- Pour affecter le test sélectionné (par exemple, FICHIER I.xlsx) à chaque position de point d’échantillon sur la plaque, déplacez le curseur sur chaque position de la plaque vierge, cliquez pour mettre en surbrillance le puits, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner Ajouter Plex.
- Utilisez un ordinateur de bureau ou un ordinateur portable pour préparer une liste de travail en format .xlsx sans en-tête (p. ex., 0620.xlsx du tableau 3) pour tous les échantillons sur la puce de l’étape 2.7. Cliquez sur le bouton Ajouter un nouvel exemple de projet ; sélectionnez le fichier (par exemple, 0620.xlsx) dans la liste déroulante pour importer la liste de travail.
- Recherchez tous les exemples de codes de test dans la liste de travail (par exemple, à partir de 0620.xlsx) à gauche de l’écran. Cliquez sur l’exemple de code dans la liste de travail et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la position correspondante de la plaque pour lier les tests à chaque position.
5. Fonctionnement du spectromètre de masse
- Utilisez le programme d’application pour relier le spectromètre de masse (voir le tableau des matériaux) à la puce d’échantillon (de la section 3) à analyser.
- Cliquez sur le paramètre par défaut. Dans la boîte de dialogue, tapez un nom de fichier à partir de l’étape 4.3 (par exemple, CTT20210620) ; dans le nom de l’expérience, tapez l’ID de la puce dans le code-barres de la puce et enregistrez les paramètres.
- Démarrez le programme de contrôle du spectromètre de masse (voir le tableau des matériaux).
- Appuyez sur le bouton d’entrée/ sortie du spectromètre de masse et laissez le pont s’étendre. Retirez le porte-puce et insérez l’échantillon de puce de l’étape 3.4 dans le porte-puce. Placez le porte-puce chargé sur le pont étendu et appuyez sur le bouton d’entrée/sortie pour que la puce d’échantillon pénètre dans l’instrument.
- Double-cliquez sur l’icône Acquérir du programme d’application. Dans la fenêtre Acquérir , cliquez sur l’onglet Exécution automatique pour démarrer l’instrument et acquérir des spectres de masse à partir des échantillons de la puce.
6. Visualisation des spectres de masse et analyse des données
- Exécutez le programme d’analyse des données (voir la table des matériaux).
- Parcourez l’arborescence de la base de données et sélectionnez l’ID de puce à l’étape 5.2. Cliquez pour mettre en surbrillance un puits cible sur la puce, puis cliquez sur l’icône de spectre pour afficher le spectre de masse.
- Cliquez avec le bouton droit de la souris pour choisir Boîte de dialogue de personnalisation afin de recadrer une plage de spectre spécifique dans une nouvelle fenêtre. Cliquez sur l’axe X pour taper les limites supérieure et inférieure de m/z, puis appuyez sur OK pour afficher le spectre de plage spécifié, y compris les signaux d’intérêt.
REMARQUE: La quantité d’ADN est proportionnelle à l’intensité maximale à chaque unité de valeur m / z. - Mesurez la hauteur de crête des valeurs m/z des signaux correspondant au substrat U, au produit AP et au modèle. Cliquez sur le pic et affichez la hauteur du pic dans le coin supérieur gauche de l’écran.
REMARQUE: Un spectre de 1 600 largeur / 1 200 unité est une dimension raisonnable pour l’inspection sur un écran d’ordinateur ainsi que pour la tenue de dossiers. - Pour enregistrer le spectre pour la tenue de dossiers, cliquez avec le bouton droit sur Exporter et sélectionnez Type de fichier JPEG dans la liste déroulante. Cliquez sur Destination et Parcourir le disque pour sélectionner le périphérique de stockage dans la liste déroulante (par exemple, le disque flash E:). Tapez le nom du fichier (par exemple, 0620_1-2.jpg) et cliquez sur Exporter.
- Si nécessaire, imprimez un fichier JPEG exporté et mesurez manuellement la hauteur de crête à l’aide d’une règle.
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Representative Results
Modèles et substrats
En prenant des oligonucléotides synthétiques avec U au centre (U + 9) associés à un gabarit G à titre d’exemple (Figure 1A), un contrôle à blanc des quantités équimolaires de substrat contenant du gabarit et de l’uracile peut être utilisé pour le contrôle de la qualité de la pureté des oligonucléotides synthétiques (Figure 1B; les signaux correspondent au m / z désigné et au faible bruit de fond). Pour l’analyse des données sur la SEP, les hauteurs maximales ont été mesurées (figure 2). On s’attendait à ce que l’ADN modèle de 19 nt reste inchangé après l’hydrolyse de la glycosylase; par conséquent, le signal pourrait servir de référence pour la quantification du produit AP (Figure 1C).
Conditions de réaction et spectres de masse
Ce dosage de l’ADN glycosylase est simple et facile à réaliser en utilisant un oligonucléotide non marqué pour une réaction standard afin d’obtenir des résultats propres et fiables (Figure 1). La gamme de spectres MS doit couvrir tous les signaux générés par les substrats, les modèles et les produits de réaction (Figure 1B). La différence de 1 nt entre le substrat et le gabarit correspondant a produit un profil de signal bien séparé pour le gabarit et le substrat (figure 1B). Les amorces équimolaires U+9 et T1 ont montré des intensités de crête similaires sans différences significatives. Une digestion extensive de l’UDG (0,5 unité pour une réaction de 30 minutes) a démontré un clivage complet de l’uracile. Le signal du produit AP était également bien séparé de celui du substrat contenant de l’uracile (Figure 1C d+9 Produit AP m/z = 5447,6 versus Figure 1B U+9 substrat m/z = 5541,6). La technique d’ionisation MALDI relativement légère36 utilisée dans cette étude a minimisé les signaux associés aux ruptures de brins induites par la réaction de β-élimination sur les sites AP37, qui n’étaient pas significatifs dans les spectres de masse. Dans l’ensemble, le fond de réaction est très propre sans bruit perceptible (Figure 1C).
Dans des conditions équimolaires, l’intensité relative du signal du produit AP était comparable à celle du substrat U en utilisant le gabarit T1 comme référence (Figure 1B, U+9/T1 versus d+9/T1). Ainsi, le calcul de l’activité UDG est basé sur l’entrée exacte du substrat contenant du U (50 pmol ou 20 pmol) selon Eq (1).
Activité UDG = (signal du produit AP) / (Signal du substrat U + signal du produit AP) × [U] (1)
Paramètres cinétiques UDG déterminés par le test MALDI-TOF MS
Comme le montre la figure 2, tout au long de la réaction de 3 minutes, les réactions UDG de 0,01 unité à 0,1 unité ont démontré une dépendance à la dose et au temps. Une concentration de 3,2 pM (0,1 unité par réaction de 100 μL) a été utilisée pour la détermination des paramètres cinétiques, Km et kcat, pour un substrat G:U (tableau 1). Les aliquotes de la réaction UDG ont été enlevées et trempées pendant 30 s et 60 s. Les données cinétiques ont été obtenues dans des conditions où le substrat contenant de l’uracile était digéré à moins de 50 % et cinq concentrations de substrat allant de 10 à 200 nM ont été soumises à une analyse. Le cours du temps à l’état présteadit a montré une excellente linéarité pour l’analyse des taux. Un exemple de diagramme de vitesse de réaction est illustré à la figure 3A, où les intensités relatives du signal MS du produit et du substrat sont converties en concentration (nM). La vitesse de réaction UDG (v) est présentée comme nM du site AP produit par seconde. Le Km et le Vmax ont été calculés à partir d’un diagramme lineweaver-Burk (figure 3B). Les paramètres cinétiques UDG dérivés du test MALDI-TOF MS ont donc été déterminés comme étant Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM s-1 et Kcat = 9,31 s-1. Les valeurs sont comparables aux résultats des essais précédents de libération de 3H-uracile où Km = 40 nM et Kcat = 13,3 s-138.
Le duplex G:U+9 a été soumis à des tests de sensibilité UDG. L’unité mesurée par le test MALDI-TOF MS a été tracée par rapport à l’unité définie par le fabricant par une méthode conventionnelle de libération de 3H-uracile38. Comme le montre la figure 3C, l’unité mesurée par MALDI-TOF MS était proportionnelle à l’unité définie de 0,001 unité à 0,02 unité avec l’équation de corrélation y = 0,933x + 0,0003 et le coefficient de détermination R2 = 0,9974. La limite de détection est de 0,001 unité comme coefficient de variation = 9,2%, ~ 5 fois le rapport signal/bruit. Ainsi, ce test MALDI-TOF MS offre une sensibilité suffisante car l’UDG est principalement utilisé au niveau de l’unité39.
Spécificité du substrat de l’UDG
L’une des caractéristiques de ce test UDG MALDI-TOF MS est qu’il est sans étiquette, ce qui rend une grande polyvalence pour la conception du substrat. Cette fonctionnalité est très utile pour analyser la spécificité du substrat de l’UDG. Comme le montre le tableau 1, l’uracile peut être inséré à n’importe quel endroit près de l’extrémité 5' ou 3' de l’ADN simple brin ou double brin pour un test de spécificité. Pour la spécificité du substrat, il est bien connu que l’UDG est très actif dans l’élimination de l’uracile de l’ADN simple brin38. En effet, comme le montre le tableau 1, l’excision d’uracile du substrat simple brin (ssU) a été réduite de 3,7 fois lorsqu’elle a été recuite sur le brin d’ADN complémentaire, formant un duplex G:U. Pour le duplex A:U couramment utilisé6,7,8, la vitesse de réaction a été encore réduite de près de 10 fois par rapport à ssU. L’UDG n’a pas agi sur l’U à l’extrémité de l’ADN (substrats du tableau 1 de G:U+1, G:U-1 et G:U-2), ce qui est cohérent avec les études précédentes40,41. Fait intéressant, U aux 2e et 3e positions du terminus 5' présentait un taux catalytique UDG plus élevé que le U au centre de 2 fois et 1,5 fois, respectivement (Tableau 1, G:U+2 et G:U+3 par rapport à G:U). UDG a excisé U 3-nt de l’extrémité 3' avec 8% d’activité en moins que le U au centre (Tableau 1, G:U-3 contre G:U).
Inhibition de l’inhibiteur de l’uracile glycosylase de la réaction UDG
L’inhibiteur de la glycosylase de l’uracile (UGI) est une protéine du bactériophage, qui inhibe E. coli UDG par liaison réversible aux protéines avec une stœchiométrie de 1:142. L’inhibition de l’activité UDG par l’UGI est illustrée à la figure 4. En présence de 0,05 unité (100 pM) d’UGI, l’activité de 0,05 unité d’UDG (8 pM) a été inhibée à un niveau indétectable. L’IC50 était de 7,6 pM. Ainsi, le test UDG MALDI-TOF MS peut être facilement modifié en un test de dépistage de masse pour la découverte d’inhibiteurs d’autres glycosylases d’ADN.
Figure 1 : Système modèle pour un dosage de l’ADN glycosylase. (A) Le brin de lésion contenant une seule uridine (U+9) a été recuit dans un gabarit (T1), formant une incompatibilité G:U (gras). L’uracile-ADN glycosylase détecte et élimine l’uracile, formant un site AP (d). Lorsqu’il est soumis à MALDI-TOF MS, la différence de valeurs m/z entre l’ADN contenant de l’U et les produits AP peut être résolue comme indiqué à la section B. (B) Un ADN de 18 nt contenant une seule uridine (U+9) recuite dans un gabarit de 19 nt (T1) (tableau 1) a été testé comme un blanc enzymatique de 50 pmol de substrat dans 40 μL de tampon réactionnel et soumis à une analyse MS. (C) Une digestion enzymatique presque complète de 50 pmol de substrat dans une réaction de 10 μL utilisant 0,5 unité d’UDG à 37 °C pendant 30 min. (D) Un ADN de 18 nt contenant une seule uridine (U+3) recuite à un blanc enzymatique T1 de substrat de 50 pmol dans un tampon de réaction de 40 μL a été soumis à une analyse MS. (E) Une digestion enzymatique presque complète de 50 pmol de substrat U+3 dans une réaction de 10 μL utilisant 0,5 unité d’UDG à 37 °C pendant 30 min pour produire d+3 et soumise à une analyse MS dans les 30 h. (F) La condition de réaction était la même que dans E sauf que le produit d+3 était dans 0,1 M NaOH à 95 °C pendant 30 min pour déclencher une réaction d’élimination bêta produisant un produit fragmenté B15 et soumis à une analyse de la SEP. G) La condition de réaction était la même que dans E, sauf que le produit d+3 a été conservé à -20 °C pendant plus de 7 jours; une fraction de j+3 convertie en produits fragmentés B15. Ce chiffre est modifié à partir de 43. Abréviations : nt = nucléotide ; MS = spectrométrie de masse; MALDI-TOF MS = Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time of flight MS; AP = apurinique/apyrimidinique; UDG = Uracil-ADN glycosylase; T1 = 19 nt modèle contenant G; U+9 = substrat contenant de l’U de 18 nt; d+9 = 18 nt AP produit contenant un site; U+3 = substrat contenant de l’U de 18 nt; d+3 = 18 nt AP produit contenant un site; B15 = 15 nt produit fragmenté à élimination bêta. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse de l’évolution temporelle de l’activité UDG à différentes concentrations enzymatiques. L’ADN du substrat, 50 pmol, contenant une lésion G:U a été incubé avec 0,01, 0,02, 0,05 et 0,1 unité d’UDG à 37 °C. Des aliquotes (10 μL) ont été prélevées dans le mélange réactionnel à 0, 0,5, 1, 2 et 3 min et trempées avec un volume égal de phénol/chloroforme. (A) Spectres de masse MALDI-TOF illustrant la dépendance de concentration des substrats G:U de traitement par UDG. (B) La quantité de produit a été tracée en fonction du temps. UDG: 0,01 (triangles fermés avec ligne continue), 0,02 (triangle ouvert avec ligne pointillée), 0,05 (cercle fermé avec ligne continue) et 0,1 unité (cercles ouverts avec ligne continue). Les données sont les moyennes de trois déterminations indépendantes, et les barres d’erreur représentent 1 S.D. Ce chiffre est modifié à partir de 43. Abréviations : nt = nucléotide ; MALDI-TOF = Temps de vol de désorption/ionisation laser assisté par matrice; AP = apurinique/apyrimidinique; UDG = Uracil-ADN glycosylase; T = 19 nt modèle contenant G; U = 18 nt substrat contenant de l’U; PA = 18 nt AP produit contenant un site. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Détermination des paramètres cinétiques de l’UDG à l’aide de l’analyse MALDI-TOF. Courbe de Michaelis-Menten et tracés lineweaver-Burk pour déterminer le Km et le kcat pour l’excision de l’uracile catalysée par l’enzyme UDG de l’Uracile à partir de l’ADN. Le dosage de l’ADN glycosylase MALDI-TOF MS a été effectué en utilisant 0,1 unité d’UDG et différentes concentrations (10, 30, 60, 100, 200 nM) de substrats dans une réaction de 100 μL pendant 30 s et 60 s. (A) Courbe de Michaelis-Menten générée à partir de trois expériences indépendantes. Les barres d’erreur représentent 1 SD. (B) Graphique Lineweaver-Burk pour le test; les interceptions indiquées permettent le calcul Km et Vmax. (C) Dosage UDG par analyse MALDI-TOF MS par rapport à l’unité assignée par le fabricant. L’activité enzymatique a été mesurée par élimination de l’uracile formant un site AP dans une réaction de 10 μL contenant 50 pmol (0,56 μg) de G:U dans un duplex d’ADN de 18/19 nt pendant 30 min à 37 °C. L’UDG a été dilué avec un tampon [50% de glycérol, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM de NaCl, 0,5 mM d’EDTA, 1 mM de dithiothréitol] sur de la glace. Une unité a été définie comme la quantité d’enzyme qui a catalysé la libération de 60 pmol d’uracile par minute. Les barres d’erreur montrent l’écart-type de six expériences. Ce chiffre est modifié à partir de 43. Abréviations : nt = nucléotide ; MALDI-TOF = Temps de vol de désorption/ionisation laser assisté par matrice; UDG = Uracil-ADN glycosylase; AP = apurinique/apyrimidinique; V, vitesse de réaction nM/s. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Courbe d’inhibition enzymatique de l’UDG par addition d’UGI. La courbe d’inhibition a été déterminée à l’aide de réactions de 20 μL avec 0,05 unité d’UDG (8 pM) et 50 pmol de substrat pendant 15 min en présence d’UGI de 0,001 unité (5 pM) à 0,1 unité (200 pM). Les données sont les moyennes de trois déterminations indépendantes, et les barres d’erreur représentent 1 S.D. Les données correspondent à un calculateur IC50 en ligne (voir la table des matériaux). Ce chiffre est modifié à partir de 43. Abréviations : UDG = Uracil-DNA glycosylase ; UGI = inhibiteur de l’uracile glycosylase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Substrats d’ADN | Oligonucléotidesa | Séquence d’ADNb | Taux initialc | k chat | |
| (pmol/sec) | (s-1) | ||||
| ssU+9 | U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | 0,560 ± 0,098 | 35 | |
| ssU+3 | U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | 0,756 ± 0,083 | 47.3 | |
| ssU-3 | U-3 | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | 0,448 ± 0,087 | 28 | |
| G:U | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,149 ± 0,046 | 9.31 | |
| U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| A:U | T2 | 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' | 0,053 ± 0,018 | 3.31 | |
| U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+3 | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,256 ± 0,044 | 16 | |
| U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+2 | T3 | 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,567 ± 0,016 | 35.4 | |
| U+2 | 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+1 | T4 | 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | NDd | ND | |
| U+1 | 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U3'-3 | T5 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' | 0,138 ± 0,015 | 8.63 | |
| U-3 | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | ||||
| G:U3'-2 | T6 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' | ND | ND | |
| U-2 | 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3' | ||||
| G:U3'-1 | T7 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' | ND | ND | |
| U-1 | 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3' | ||||
Tableau 1 : Compositions des substrats et spécificités de l’UDG. Ce tableau montre l’ADN contenant de l’U de 18 nt désigné par u±N. Le '+' indique le comptage de la position de l’uracile à partir du terminus 5', et le '-' indique le comptage de la position de l’uracile à partir du terminus 3'. Par exemple, U+9 est la 9ème position du terminus 5', U-3 est la 3ème position du terminus 3'. Le modèle complémentaire de 19 nt de T1 à T7 serait associé à l’ADN contenant du U formant des incohérences G:U ou A:U comme indiqué. Les bases d’uracile sont en gras. Les réactions utilisaient 50 pmol de substrats U, 0,05 unité d’UDG, dans 10 μL comme décrit dans la section 2 du protocole. Ce tableau est modifié à partir de 43. Abréviations : UDG = ADN uracile glycosylase ; nt = nucléotide; ND, non détectable.
| 2ème PCRP | 1er PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | Tm | PcGC (en anglais seulement) | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | appel EXT1_ | EXT1_ MASSE |
| NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 5789.8 | GCCAACGTCCGGACTGGTC | |||
| NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 5541.6 | GACCAGTCUGGACGTTGG | |||
Tableau 2 : FICHIER I.xlsx fichier. Les paramètres ont été utilisés pour les figures 1B, C et 2A; 0 min d’entrées. Le système MALDI-TOF MS utilisé dans cette étude a été conçu spécifiquement pour analyser le polymorphisme mononucléotidique par une extension nucléotidique unique de l’amorce étendue dans la région de la variation de la séquence génique amplifiée. Pour le test UDG, seuls six champs ont été utilisés lors de la préparation du groupe d’essai FILE I. Abréviations: WELL = le numéro de puits attribué au test; TERME = mélange de résiliation; SNP_ID = nom de la séquence d’entrée du polymorphisme nucléotidique unique; 2nd-PCRP = amorce d’amplicon avant; 1er-PCRP = amorce d’amplicon inversé; AMP_LEN = longueur de l’amplicon; UP_CONF = score d’amplification uniplexe; MP_CONF = score d’amplification multiplexe; Tm = température de fusion; PcGC = pourcentage de teneur en GC; PWARN = codes d’avertissement de conception d’essai; UEP_DIR = direction de l’extension de l’amorce; UEP_MASS = masse d’amorce non étendue; UEP_SEQ = séquence d’amorce non étendue; EXT1_CALL = nom donné au pic de masse de l’analyte 1; EXT1_MASS = masse de l’analyte 1.
| 0620_1-2 |
| 0620_1-3 |
| 0620_1-4 |
| 0620_1-5 |
| 0620_1-6 |
| 0620_1-7 |
| 0620_1-8 |
Tableau 3 : fichier 0620.xlsx. Ces paramètres ont été utilisés pour les réactions d’inhibition de l’UGI dans la figure 4A. Abréviation : UGI = inhibiteur de l’uracile glycosylase.
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Discussion
Cet article fournit une procédure détaillée pour l’utilisation d’une méthode de dosage UDG MALDI-TOF MS pour détecter directement les produits d’ADN contenant de l’AP. Les principaux avantages de cette méthode sont que les substrats contenant de l’uracile sont sans étiquette, évolutifs, faciles à travailler et offrent une plus grande flexibilité dans la conception du substrat.
L’extraction phénol/chloroforme recommandée par le fournisseur UDG permet l’inactivation de l’enzyme pour empêcher la dégradation de l’ADN du produit. Cependant, le protocole d’extraction du phénol implique une séparation de phase fastidieuse des produits chimiques dangereux. Une autre méthode de terminaison acide utilisant HCl pour abaisser le pH de la réaction à 2 ± 0,5 a également inactivé efficacement l’UDG. Une neutralisation ultérieure avec la base Tris pourrait prévenir les dommages à l’ADN. Lorsque le produit AP a été soumis à une analyse MS dans les 30 heures, il n’y avait aucun signe de perte de base ou de modification dans les spectres de masse (figure 1E). Le tampon Tris dans les réactions a été fourni avec l’UDG commercial. Cependant, diverses amines, y compris Tris, peuvent inciser les sites AP via l’élimination bêta, bien qu’à des concentrations élevées de réactifs44. Certaines alternatives, telles que HEPES et tampon phosphate, peuvent être envisagées pour éviter le risque de clivage du site AP par élimination bêta.
En tant que méthode de référence UDG potentielle, un duplex de substrat G:U centré (Tableau 1, T1/U+9) est recommandé comme substrat standard pour les raisons suivantes : 1. pour la pertinence physiologique, G:U est supérieur à A:U car la désamination de la cytosine dans les paires G:C entraîne des lésions G:U. 2. Bien que E. coli UDG démontre une plus grande spécificité pour hydrolyser l’U à partir de l’ADN simple brin, la réparation d’une lésion U dans l’ADN simple brin est rare. 3. Pour tous les substrats G:U testés, G:U+2 et G:U+3 ont démontré des taux de réaction plus élevés que G:U+9. Cependant, une lésion de désamination de l’ADN adjacente à une rupture de brin est rare. Pour imiter les lésions natives, placer un G:U au centre du duplex d’ADN serait plus approprié.
Fait intéressant, la méthode MALDI-TOF MS a généré des paramètres cinétiques UDG, et les unités enzymatiques de la réaction G:U (Figure 3A-C) étaient très similaires aux résultats dérivés conventionnellement en utilisant 3H-uracil38. Cependant, le substrat G:U unique dans cette étude est très différent de l’ADN du bactériophage PBS1 précédemment décrit avec plusieurs erreurs de synthèse de l’ADN A:U38. De plus, l’UDG a montré une activité 3 fois plus élevée avec G:U qu’avec le substrat A:U (Tableau 1, Km et Kcat de G:U versus A:U). Ce résultat apparemment contradictoire peut être attribué à la séquence d’ADN du substrat PBS1 contenant 36% de U sous la forme de multiples lésions A:U45 contre seulement 3% de U dans le G: Substrat en U (tableau 1). Pendant ce temps, l’UDG est une enzyme très « processive », c’est-à-dire qu’un seul événement de liaison protéine-ADN provoque plusieurs clivages d’uracile12. La découverte d’une corrélation un-à-un presque parfaite entre ces deux méthodes UDG fait de cette méthode MS une option attrayante au lieu du test radio-isotopique traditionnel.
Cette approche est facilement évolutive. Toutes les réactions UDG de cette étude ont été effectuées manuellement à l’aide de micropipettes et de tubes de microcentrifugation, avec environ 30 tests effectués un jour donné. Ainsi, moins d’un dixième de la capacité du réseau de puces au format de plaque de 384 puits pour le système MALDI-TOF MS (voir le tableau des matériaux) décrit dans les sections 3 à 5 a été utilisé. En revanche, l’adaptation d’un système de pipetage automatisé pour une microplaque de 384 puits pourrait facilement augmenter le rendement quotidien de cette approche en utilisant la méthode de terminaison acide. Ainsi, 300 réactions UDG prendraient ~1 h. Le système MALDI-TOF MS (voir le tableau des matériaux) pouvait produire des données de spectres de masse pour jusqu’à 300 réactions en 1 h. Par conséquent, un processus simplifié nécessiterait 2 h pour compléter 300 tests UDG MALDI-TOF MS.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Centre intégré de génomique fonctionnelle du NCFPB (Taipei, Taïwan) et le Laboratoire de pharmacogénomique du NRPB (Taipei, Taïwan) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie, Taiwan, R.O.C. [numéro de subvention MOST109-2314-B-002 -186 à K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 à S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 à W.-h.F.]. H.-L.C. est récipiendaire d’une bourse de doctorat de l’Université nationale de Taiwan. Financement de la redevance pour le libre accès : Ministère des sciences et de la technologie, R.O.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
References
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