Summary
Здесь мы представляем экономичный и эффективный метод выделения и генерации дендритных клеток высокой чистоты костного мозга у мышей после 7 дней культивирования с 10 нг / мл GM-CSF / IL-4.
Abstract
Спрос на дендритные клетки (ДК) постепенно увеличивается по мере продвижения иммунологических исследований. Тем не менее, DC редко встречаются во всех тканях. Традиционный метод выделения ДК в первую очередь включает индуцирование дифференцировки костного мозга (БМ) в ДК путем введения больших доз (>10 нг/мл) гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора/интерлейкина-4 (GM-CSF/IL-4), что делает процедуру сложной и дорогостоящей. В этом протоколе, используя все BM-клетки, культивируемые в среде 10 нг/мл GM-CSF/IL-4, после 3-4 полукультурных обменов, было собрано до 2,7 x 107 клеток CD11c+ (DC) на мышь (две бедренные кости) с чистотой 80%-95%. После 10 дней в культуре экспрессия CD11c, CD80 и MHC II увеличилась, тогда как количество клеток уменьшилось. Количество клеток достигло пика после 7 дней культивирования. Более того, этот метод занял всего 10 минут, чтобы собрать все клетки костного мозга, и большое количество ДК было получено после 1 недели культивирования.
Introduction
Дендритные клетки (DC) являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками (APC) для активации наивных Т-клеток и индуцирования специфических цитотоксических реакций Т-лимфоцитов (CTL) против инфекционных заболеваний, аллергических заболеваний и опухолевых клеток 1,2,3. ДК являются основным связующим звеном между врожденным иммунитетом и адаптивным иммунитетом и играют важную роль в иммунологической защите и поддержании иммунной толерантности. За последние 40 лет многие исследователи стремились определить подмножества ДК и их функции при воспалении и иммунитете. Согласно этим исследованиям, ДК развиваются вдоль миелоидных и лимфоидных линий из клеток костного мозга. Опухолевые вакцины приобрели значительные вехи в последние годы и имеют многообещающее будущее. Механически опухолевые вакцины модулируют иммунный ответ и предотвращают рост опухоли, активируя цитотоксические Т-лимфоциты с использованием опухолевых антигенов. Вакцина на основе ДК играет важную роль в иммунотерапии опухолей и была идентифицирована как одна из наиболее перспективных противоопухолевых терапий 1,4. Кроме того, ДК широко используются при тестировании новых молекулярно-целевых препаратов и ингибиторов иммунных контрольных точек5.
Исследователям срочно необходимо большое количество РС высокой чистоты для дальнейшего изучения роли РС. Тем не менее, ДК редко встречаются в различных тканях и крови, составляя только 1% клеток крови у людей и животных. Культура in vitro дендритных клеток костного мозга (BMDC) является важным методом получения большого количества клеток DC. Между тем, протокол Лутца для генерации ДК из костного мозга широко используется исследователями6. Хотя протокол эффективен в получении клеток постоянного тока, он является сложным и дорогостоящим, предполагающим добавление высоких концентраций цитокинов и лизис эритроцитов.
В этом исследовании мы сообщаем о методе выделения почти всех клеток костного мозга из костного мозга мыши (BM) и индуцирования дифференцировки в BMDC после 7-9 дней инкубации in vitro с более низкой концентрацией GM-CSF и IL-4. Эта процедура занимает всего 10 минут, чтобы собрать почти все клетки костного мозга и приостановить их в полной среде. Короче говоря, мы предоставляем эффективный и экономичный метод культивирования для BMDC в этом исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Нанкинского медицинского университета.
1. Выделение костного мозга и подготовка БМ-клеток
- Жертвоприношение мышей C57BL/6 (18-22 г, 6-8 недель) через удушьеCO2 . Зафиксируйте мышь на операционном столе мыши. Дезинфицируйте поверхности 70% этанолом.
- Отрежьте кожу ноги, чтобы обнажить мышцы и бедренную артерию. Зажмите и оторвите бедренную артерию с помощью двух щипцов, затем потяните проксимальный конец к животу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не перерезайте бедренную артерию напрямую. В противном случае это вызовет чрезмерное кровотечение и загрязнит поле зрения. - Обрежьте все мышцы вокруг бедренной кости.
- Медленно вытяните нижние конечности мыши наружу, пока не раздастся звук вывиха тазобедренного сустава и не будет виден выпадение головки бедренной кости.
- Отделите нижние конечности от тела с помощью ножниц вдоль внутренней части головки бедренной кости.
- Отрежьте задние ноги от конца коленного сустава, чтобы получить свободную и полную бедренную кость.
- Удалите мышцы, прикрепленные к бедренной кости, с помощью марли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не рвите мышцы напрямую. Бедренная кость мышей деликатная, ее целостность необходимо поддерживать. - Погрузить бедренную кость в 75% спирт на 2-5 мин.
2. Индукционная культура BMDC
- Остаток спирта промыть ПБС. Используйте гемостатические щипцы для зажима средней и нижней части бедренной кости и другой набор для зажима нижнего конца бедренной кости. Гемостатические щипцы прикладывают латерально к бедренной кости, а бедренную кость отделяют от эпифизарной линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпифизарная линия не так хорошо видна до тех пор, пока бедренная кость не сломается. Все это и последующие шаги выполняются в стерильной среде. - Используйте шприц объемом 1 мл (игла: 0,6 мм х 25 мм) для проникновения в полость костного мозга от разрыва эпифизарной линии и вращения иглы для проникновения в головку бедренной кости и через полость костного мозга. Пульсируйте и промывайте полость костного мозга, используя 1 мл полной среды, содержащей GM-CSF / IL-4, пока кость не станет белой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная культуральная среда: 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин, 55 мкМ β-меркаптоэтанола, 10 нг/мл GM-CSF и 10 нг/мл IL-4. - Повторно суспендировать все клетки в 24 мл полной питательной среды (~5 x 105 клеток/мл). После смешивания всю среду высыпали на 6-луночную пластину с 4 мл/лунку, затем инкубировали при 37 °C с 5% CO2 в течение 2 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости лизировать эритроциты. - Замените всю среду через 2 дня средой, содержащей GM-CSF/IL-47. На четвертый, шестой и восьмой дни замените половину среды полной средой, содержащей 10 нг/мл GM-CSF/IL-4.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляются взвешенные клетки, такие как эритроциты и лимфоциты. - Делайте снимки каждый день, чтобы зафиксировать рост клеток. Начиная с шестого дня, собирайте один колодец клеток в день, чтобы подсчитать количество клеток и обнаружить экспрессию CD11c, CD80 и MHC II 6,7.
3. Проточное цитометрическое детектирование экспрессии CD11c, CD80 и MHC II
- После промывки ДК PBS повторно суспендируют 1 х 106 клеток в 100 мкл буфера FACS, добавляют 0,5 мкг антимышечного антитела CD16/32 и инкубируют в течение 10 мин на льду для блокирования неспецифических участков антигенов.
- Добавьте 1 мкг Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 мкг PE-CD80 и 0,04 мкг антител APC-MHC II и инкубируйте на льду в течение 30 мин.
- Центрифуга при 1000 х г в течение 3 мин при 4 °C, удалите супернатант, добавьте 1 мл 4% параформальдегида, зафиксируйте в течение 30 мин при 4 °C и повторно суспендируйте в 300 мкл буфера FACS.
- Выполняют проточную цитометрию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки 1 x 10 7-1,7 x 107 были извлечены из двух бедренных костей и повторно суспендированы в 24 мл среды, прежде чем их посадили в 6-луночную пластину (рисунок 1A). Через 2 дня неадгезивные клетки удаляли путем полного изменения питательной среды. Перед изменением среды наблюдалось значительное количество взвешенных клеток (рисунок 1B). После 3 дней культивирования начали формироваться мелкоклеточные колонии. На шестой день размер и количество колоний значительно увеличились. На седьмой день количество клеток достигло пика (22 х 106-27 х 106), а затем постепенно снижалось (рисунок 2А). Поверхность клеток DC стала шероховатой с более длинными псевдоподиями, демонстрируя типичную зрелую морфологию клеток DC (рисунок 2B). Проточный цитометрический анализ показал, что отношение CD11c положительных к общему количеству клеток составило 71% на шестой день, тогда как соотношение увеличилось до 96,1% на десятый день (Рисунок 2C,2D).
Для оценки экспрессии костимулирующих молекул CD11c, CD80 и MHC II были совместно окрашены8. Как показано на рисунке 3A, экспрессия CD11c, CD80 и MHC II постепенно увеличивалась с увеличением времени культивирования с 6-го по 10-й день. Кроме того, проточный цитометрический анализ показал постепенное увеличение пропорций CD11c и CD80 с двойным положительным результатом, CD11c и MHCII с двойным положительным (рисунок 3B, 3D) и тройным положительными клетками (рисунок 3C, 3D).
Рисунок 1: Репрезентативные изображения РС в разное время культуры. (А) Блок-схема культивирования BMDC. (B) Репрезентативные изображения РС в разные культурные времена. Клетки костного мозга суспендировали в 24 мл питательной среды с 10 нг/мл GM-CSF и IL-4 и засеяли в 6-луночную пластину. БФ, до смены питательной среды; AF, после смены культуральной среды. Красная стрела, колония DC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количество и чистота ДК в разное время культивирования. (А) Общее количество клеток во всех питательных средах. (B) Репрезентативные изображения DC. (C,D) Цитометрическое и графическое представление анализа доли DC. Положительные клетки были отсортированы по CD11c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспрессия костимулирующих молекул в ДК. (A) Экспрессия CD11c, CD80 и MHC ΙΙ в DC. (B) Проточный цитометрический анализ доли CD11c и CD80 двойных положительных, CD11c и MHC ΙΙ двойных положительных и тройных положительных клеток. (С, Г) Проточный цитометрический анализ с 6-го дня 10-го дня и графическое представление для отображения статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Люди и мыши имеют различные подмножества постоянного тока, включая классические ДК (кДК, включая cDC1s и cDC2s), плазмоцитоидные ДК (pDC) и моноцитарные ДК (MoDC)9,10,11. Общепризнано, что cDC1s регулируют цитотоксические ответы Т-лимфоцитов (CTL) на внутриклеточные патогены и рак, а cDC2 регулируют иммунные реакции на внеклеточные патогены, паразитов и аллергены12. Значительное количество ДК может быть получено in vitro из клеток-предшественников BM у мышей в присутствии GM-CSF и IL-4 6,13,14. Чистота и количество ДК играют ключевую роль в успешной иммунотерапии ДК. Исследователи показали, что две дозы от 1 х 105 до 1 х 106 ДК могут вызывать эффективные цитотоксические ответы Т-лимфоцитов (CTL) в модели ксенотрансплантата 15,16,17,18. Это означает, что необходимо культивировать большое количество ДК высокой чистоты для дальнейшего изучения роли ДК в иммунотерапии опухолей.
Традиционным методом получения клеток костного мозга является разрезание двух концов бедренной кости и промывание средой 6,7. В этом исследовании мы инновационно использовали физиологические анатомические структуры для разрыва бедренной кости. Гемостатические щипцы использовались для зажима нижнего конца бедренной кости и перемещения ее в боковом направлении. Эпифизарная линия физиологически слаба, что делает их восприимчивыми к переломам при стрессе19. После отделения бедренной кости от эпифизарной линии в полости костного мозга остается небольшое количество кости. Игла может легко проникать из кости в полость костного мозга. Метод прост в эксплуатации, защищает драгоценные клетки костного мозга и обеспечивает клеточную основу для культивирования большого количества ДК. Мы культивировали РС, используя комбинацию 10 нг/мл GM-CSF и 10 нг/мл IL-4, что в большей степени способствует созреванию РС, чем только GM-CSF. Лабер и Сон сообщили, что совместное использование GM-CSF и IL-4 в среде ДК индуцировало более высокую экспрессию маркеров созревания, таких как IFN-ɣ, TNF-α и IL-6, и повышенную антигенпрезентативную способность 7,20,21. Son et al. также предположили, что комбинация GM-CSF и IL-4 способствует созреваниюDC 7,21.
В этом исследовании мы непосредственно культивировали собранные клетки костного мозга без лизирования эритроцитов и разделяли их градиентным центрифугированием, что может привести к потере клеток и, в конечном счете, к снижению собранных ДК. До того, как среда была изменена, в системе культуры было несколько суспендирующих клеток, включая эритроциты, Т-клетки, В-клетки и гранулоциты. Во время совместной культивирования эти клетки могут продуцировать цитокины, способствующие созреванию ДК.
С точки зрения ограничений, этот протокол использовал только две бедренные кости мыши, исключая меньшие большеберцовые кости, что приводило к потере некоторых мезенхимальных стволовых клеток. Короче говоря, мы разработали экономически эффективный и действенный протокол для выделения и генерации дендритных клеток костного мозга у мышей, который занимает всего 10 минут для разделения клеток костного мозга. Большое количество высокочистых ДК было собрано после 6-7 дней инкубации с 10 нг/мл GM-CSF и IL-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов и что им нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Программой Тяньцзиньского научно-технического плана (20JCQNJC00550), Тяньцзиньским научно-техническим проектом здравоохранения (TJWJ202021QN033 и TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
