Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Summary

Bakterier utskiller nanometerstore ekstracellulære vesikler (EV) som bærer bioaktive biologiske molekyler. EV-forskning fokuserer på å forstå deres biogenese, rolle i mikrobe-mikrobe og vertsmikrobe-interaksjoner og sykdom, samt deres potensielle terapeutiske anvendelser. En arbeidsflyt for skalerbar isolering av elbiler fra ulike bakterier presenteres for å lette standardisering av EV-forskning.

Abstract

Ulike bakteriearter utskiller ~ 20-300 nm ekstracellulære vesikler (EV), bestående av lipider, proteiner, nukleinsyrer, glykaner og andre molekyler avledet fra foreldrecellene. Elbiler fungerer som intra- og inter-arter kommunikasjonsvektorer samtidig som de bidrar til samspillet mellom bakterier og vertsorganismer i sammenheng med infeksjon og kolonisering. Gitt de mange funksjonene som tilskrives elbiler i helse og sykdom, er det en økende interesse for å isolere elbiler for in vitro og in vivo studier. Det ble antatt at separasjonen av elbiler basert på fysiske egenskaper, nemlig størrelse, ville lette isoleringen av vesikler fra forskjellige bakteriekulturer.

Isolasjonsarbeidsflyten består av sentrifugering, filtrering, ultrafiltrering og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) for isolering av elbiler fra bakteriekulturer. Et pumpedrevet tangentielt strømningsfiltreringstrinn (TFF) ble innlemmet for å forbedre skalerbarheten, noe som muliggjør isolering av materiale fra liter startcellekultur. Escherichia coli ble brukt som et modellsystem som uttrykker EV-assosiert nanoluciferase og ikke-EV-assosiert mCherry som reporterproteiner. Nanoluciferase ble målrettet mot elbilene ved å fusjonere sin N-endestasjon med cytolysin A. Tidlige kromatografifraksjoner inneholdende 20-100 nm EV med tilhørende cytolysin A-nanoLuc var forskjellige fra de senere fraksjonene som inneholdt de frie proteinene. Tilstedeværelsen av EV-assosiert nanoluciferase ble bekreftet ved immungullmerking og transmisjonselektronmikroskopi. Denne arbeidsflyten for EV-isolasjon gjelder for andre humane tarmassosierte gram-negative og gram-positive bakteriearter. Avslutningsvis muliggjør kombinering av sentrifugering, filtrering, ultrafiltrering / TFF og SEC skalerbar isolering av elbiler fra forskjellige bakteriearter. Å bruke en standardisert isolasjonsarbeidsflyt vil lette komparative studier av mikrobielle elbiler på tvers av arter.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV) er nanometerstore, liposomlignende strukturer som består av lipider, proteiner, glykaner og nukleinsyrer, utskilt av både prokaryote og eukaryote celler¹. Siden de tidlige studiene som visualiserer frigjøring av elbiler fra gramnegative bakterier², har antall biologiske funksjoner som tilskrives bakterielle EV (20-300 nm i diameter) stadig vokst de siste tiårene. Deres funksjoner inkluderer overføring av antibiotikaresistens³, biofilmdannelse⁴, quorumsføling⁵ og toksinlevering⁶. Det er også økende interesse for bruk av bakterielle elbiler som terapi, spesielt i vaksinologi⁷ og kreftbehandling⁸.

Til tross for den økende interessen for EV-forskning, er det fortsatt tekniske utfordringer når det gjelder isoleringsmetoder. Spesielt er det behov for isolasjonsmetoder som er reproduserbare, skalerbare og kompatible med ulike EV-produserende organismer. For å skape et enhetlig sett med prinsipper for planlegging og rapportering av EV-isolasjon og forskningsmetoder, publiserer og oppdaterer International Society for Extracellular Vesicles MISEV-posisjonspapiret⁹. Videre gir EV-TRACK-konsortiet en åpen plattform for rapportering av detaljerte metoder for EV-isolasjon som brukes i publiserte manuskripter for å øke åpenheten¹⁰.

I denne protokollen ble tidligere metoder brukt for isolering av elbiler fra pattedyrcellekultur tilpasset^11,12 for å muliggjøre isolering av elbiler fra bakteriecellekultur. Vi søkte å bruke metoder som muliggjør EV-isolasjon fra en rekke mikrober, som kan skaleres, og balansere EV-renhet og utbytte (som diskutert i MISEV-posisjonspapiret⁹). Etter fjerning av bakterieceller og rusk ved sentrifugering og filtrering, konsentreres kulturmediet enten ved sentrifugalanordning ultrafiltrering (for et volum på opptil ~ 100 ml) eller pumpedrevet TFF (for større volumer). EV-er isoleres deretter av SEC ved hjelp av kolonner som er optimalisert for rensing av små elbiler.

Figur 1: Skjematisk oversikt over arbeidsflyt for bakteriell EV-isolasjon. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikkel; TFF = tangentiell strømningsfiltrering; SEC = størrelse eksklusjonskromatografi; MWCO = molekylvekt cut-off. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En mus-commensal stamme av Escherichia coli (dvs. E. coli MP1¹³) ble brukt som en modellorganisme og modifisert for å uttrykke EV-assosiert nanoluciferase ved fusjon til cytolysin A, som tidligere rapportert¹⁴. Metodene som brukes her kan behandle minst opptil flere liter bakteriekulturer og effektivt skille EV-assosiert fra ikke-EV-assosierte proteiner. Endelig kan denne metoden også brukes til andre gram-positive og gram-negative bakteriearter. Alle relevante data fra de rapporterte eksperimentene ble sendt til kunnskapsbasen EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)¹⁰.

Protocol

MERK: Sørg for at alt arbeid som involverer bakterier og rekombinant DNA følger beste praksis for biosikkerhetsoppsamling som passer for biosikkerhetsfarenivået for hver stamme. Arbeidet skal utføres i samsvar med lokale, nasjonale og internasjonale biosikkerhetsforskrifter.

1. Bakteriestammer og dyrkingsforhold

MERK: Bakteriestammer som ble brukt i denne studien var Escherichia coli MP1¹³, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve og Bifidobacterium dentium.

1. For E. coli, bruk en steril sløyfe for å inokulere enkeltkolonier i 250 til 1000 ml Luria-Bertani (LB) buljong og inkubere aerobt i en ristende inkubator ved 300 o / min og 37 ° C i 48 timer før du behandler kulturen. For rekombinant E. coli MP1-stamme som inneholder p114-mCherry-Clyluc (tilleggsmetode og supplerende figur S1), tilsett kloramfenikol til LB-agar og buljong ved en endelig konsentrasjon på 17 μg / ml.
2. For A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve og B . dentium, strek på Brain heart infusion (BHI) agar plater og inkubere anaerobt inne i et vinyl anaerobt kammer. Inokulere enkeltkolonier i 100 ml forhåndsredusert BHI-buljong og inkubere i 48 timer anaerobt.

2. Isolasjon av elbiler

1. Klargjøring av bakteriekulturmedium ved sentrifugering og filtrering
   1. Overfør bakteriecellekulturene inokulert i trinn 1 for å rengjøre 250 ml eller 500 ml polypropylen sentrifugeflasker ved helling. Sentrifuge flaskene i en storkapasitetsrotor med fast vinkel ved 4 °C og 5000 × g i 15 minutter. Overfør supernatanten til rengjør sentrifugeflasker ved forsiktig helling, og sentrifuger igjen ved 10 000 × g i 15 minutter.
      MERK: Gjenbruk flaskene etter biosikkerhetsmessig rengjøring og dekontaminering.
      1. Hvis store pellets av bakterielle celler er tilstede etter den andre sentrifugeringen, gjenta sentrifugeringen i en ren flaske for å fjerne celler ytterligere.
   2. Overfør supernatanten til en 0,22 μm polyetersulfon vakuumdrevet filteranordning av passende størrelse ved helling. Filtrer ved å koble filtreringsenheten til en vakuumveggforsyning. Hvis filtreringshastigheten synker betydelig, flytter du bare ufiltrert materiale til en ny enhet. Oppbevar det filtrerte mediet ved 4 °C over natten, og fortsett protokollen neste dag om ønskelig.
      MERK: Sentrifugeringene ovenfor tillater vanligvis behandling av ~ 2x det angitte volumet av cellekultur gjennom hver enhet. For eksempel kan en enkelt 500 ml filterenhet filtrere ~ 1,000 ml pre-sentrifugert kultur. Disse enhetene brukes vanligvis ikke på nytt. Bruk av sprøytefiltre på dette trinnet anbefales ikke uten optimalisering, da betydelige tap ble notert med de testede modellene. Dette er et potensielt stoppested.
   3. Kontroller for fullstendig fjerning av levedyktige celler på dette punktet ved å spre en aliquot av den filtrerte supernatanten på egnede agarplater og sørg for fravær av kolonier etter inkubasjon under optimale forhold for bakteriestammen. Hvis bakterier oppdages, optimaliser prosedyren ovenfor ytterligere ved å utføre ytterligere sentrifugering og / eller filtreringer.
2. Konsentrasjon av det filtrerte mediet
   1. Hvis du arbeider med volumer betydelig > 100 ml, fortsett til trinn 2.2.2. Hvis du arbeider med volumer på ~ 100 ml, last 90 ml filtrert kulturmedium på reservoaret med en respektive kapasitet 100 kDa molekylvekt cutoff (MWCO) sentrifugal ultrafiltreringsanordning ved bruk av serologiske pipetter. Balanser alltid med en matchende ultrafiltreringsanordning, og sentrifuger i svingende bøtterotor ved 4 °C og 2000 × g i intervaller på 15-30 minutter, til volumet av mediet i toppreservoaret er konsentrert til <0,5 ml.
      1. Fyll opp reservoaret med eventuelt gjenværende filtrert kulturmedium. Hvis du "fyller på", fjerner du gjennomstrømningen i bunnen av enheten og balanserer eventuelle enheter på nytt.
         MERK: Det ble observert at det maksimale volumet av filtrert kulturmedium som kan konsentreres ved hjelp av disse enhetene, er <2 ganger det anbefalte volumet.
      2. Hvis viskositeten til det konsentrerte mediet i reservoaret økes synlig (mørkt, tyktflytende materiale), fortynnes med fosfatbufret saltvann (PBS) og konsentreres ved sentrifugering for å fortynne ikke-EV-proteiner som er mindre enn MWCO på 100 kDa.
         MERK: Dette er et potensielt stoppested.
      3. Overfør det konsentrerte mediet til et rør med lav proteinbinding, oppbevar ved 4 °C over natten, og fortsett protokollen neste dag om ønskelig.
   2. Hvis du arbeider med volumer betydelig > 100 ml, velger du en TFF-enhet av passende størrelse (100 kDa MWCO) for å imøtekomme volumet som skal behandles.
      MERK: Filtreringsenheter for behandling av 100 ml til >1,000 ml er kommersielt tilgjengelige. Lokal tilgjengelighet, kostnad og kompatibilitet med pumpen og slangen/tilkoblingene vil diktere hvilke modeller som vil være mest nyttige. Opptil 2 liter kulturmedium ble behandlet med enheten som er angitt i materialtabellen før filteret måtte rengjøres (se trinn 2.3 nedenfor for rengjøringsprotokollen).
      1. Monter en filtreringskrets med # 16 lavbinding / lavutvaskingsrør, 1/8 tommers slange-barb til Luer-adaptere, TFF-enheten og en peristaltisk pumpe, som angitt i tilleggsfigur S2.
         MERK: Utfør TFF i et biosikkerhetsskap for å minimere risikoen for å forurense EV-preparatet med miljøbakterier.
      2. Ved romtemperatur begynner du å sirkulere det filtrerte, kondisjonerte mediet ved ca. 200 ml/min (minimum 100 ml/min). Bestem riktig turtall som tilsvarer ønsket strømningshastighet ved å pumpe 200 ml PBS inn i et gradert fartøy. Når du sirkulerer filtrert, betinget medium, samler du molekylene < 100 kDa som krysser ultrafiltreringsmembranen som avfall i en separat beholder.
         MERK: Eksemplet nedenfor vil anta et startvolum på 2 L kultur.
      3. Fortsett å sirkulere det betingede mediet til volumet er redusert til ~ 100-200 ml. Flytt til mindre fartøy etter behov. Fortynn 2 ganger med PBS, og fortsett å sirkulere med pumpen, konsentrer deg ned til 75-100 ml. Fortynn 2 ganger med PBS, og fortsett å sirkulere til et siste volum på 25 ml. Fortynn 2 ganger med PBS og fortsett å sirkulere til <10 ml.
      4. Løft fôrslangen ut av prøvereservoaret, og fortsett å pumpe for å rense filteret og gjenopprette den maksimale mengden prøve.
         MERK: Dette er et potensielt stoppested.
      5. Overfør den konsentrerte prøven til et konisk rør og oppbevar over natten ved 4 °C om ønskelig. Alternativt kan du fortsette med protokollen.
      6. Flytt den konsentrerte prøven til en 15 ml kapasitet på 100 kDa MWCO sentrifugal ultrafiltreringsanordning. Sentrifuge i en svingende bøtterotor ved 4 °C og 2000 × g i intervaller på 15-30 minutter til volumet av mediet i toppreservoaret er konsentrert til <2 ml.
         MERK: Dette er et potensielt stoppested.
      7. Overfør det konsentrerte mediet til et lavproteinbindende rør, og oppbevar ved 4 °C over natten, fortsett protokollen neste dag om ønskelig.
3. Rengjøring av TFF-enheten (valgfritt)
   MERK: Filtreringshastigheten reduseres når TFF-enheten begynner å "tette seg" under prosessen (begroing). Om nødvendig kan filterenheten rengjøres for å lette filtrering av ytterligere prøver i samme rensingskjøring. Selv om det er teoretisk mulig, har et renset TFF-filter ikke blitt brukt til en annen rensingskjøring for å unngå krysskontaminering.
   1. For å rengjøre, fjern alle slanger og lokk fra TFF-enheten og tøm eventuell gjenværende væske.
   2. Bruk den peristaltiske pumpen og slangen til å oversvømme både de indre og ytre delene av TFF-enheten (dvs. via de parallelle og vinkelrette portene i modellen som er oppført i materialtabellen) med ~ 100 ml destillert vann. Fjern alle slanger/lokk og tøm TFF-enheten.
   3. Sett lokk på de ytre (vinkelrette, filtrate) portene og sirkuler 250 ml 20 % etanol i destillert vann ved >200 ml / min i 10 minutter gjennom det indre rommet. Avløp, flom med destillert vann, og avløp igjen som ovenfor.
   4. Sirkuler 250 ml 0,5 N fersk NaOH-løsning i 30 minutter gjennom det indre rommet og avløp igjen.
   5. Koble alle slanger og lokker til innløps-, utløps- og filtratportene, som i supplerende figur S2, og sirkuler 0,5 N NaOH-oppløsningen igjen til et volum NaOH > 1 ml^{/ cm 2} filteroverflate gjennomsyrer filtermembranen og samles opp som filtrat / avfall.
   6. Skyll TFF-enheten med destillert vann som ovenfor. Bruk TFF-enheten umiddelbart eller oversvømme enheten med ~100 ml 20 % etanol og oppbevares over natten ved 4 °C.
      MERK: Hvis det oppbevares i etanol, må du tømme, skylle med vann, drenere og sirkulere 250 ml PBS gjennom enheten til et volum på >1 ml / cm² filteroverflate gjennomsyrer filtermembranen og samles som filtrat / avfall for å fjerne gjenværende etanol før prøvebehandling.
4. Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC)
   MERK: SEC brukes til å øke renheten av EV og fjerne ikke-vesikulært protein.
   1. Bruk en liten SEC-kolonne (10 ml sengevolum) for isolering av elbiler fra <100 ml utgangsmateriale og en større kolonne (47 ml sengevolum) for isolering av elbiler fra >100 ml utgangsmateriale.
      MERK: Eksemplet nedenfor viser volumer for den større kolonnen, med volumer for den mindre kolonnen i parentes.
   2. Ta SEC-kolonnen og PBS til romtemperatur over flere timer. Stabiliser SEC-kolonnen i vertikal stilling ved hjelp av et standard laboratoriestativ og holder. Alternativt kan du bruke kommersielle kromatografikolonnestativer.
   3. Før du kobler til SEC-kolonnen, må du hydrere prøvereservoaret ved å la 5 ml PBS strømme gjennom friten og inn i en avfallsbeholder. Skru av innløpshetten til SEC-kolonnen, legg til 2 ml PBS i prøvereservoaret, og koble reservoaret forsiktig til kolonnen når PBS drypper ut gjennom frit (gjelder ikke for små SEC-kolonner).
      MERK: Dette forrige trinnet forhindrer at luftbobler blir fanget øverst i SEC-kolonnen. Hvis luften er fanget, fjern reservoaret, trykk på kolonnen for å få luftboblen ut, og gjenta tilkoblingsprosedyren. For den mindre kolonnen fjerner du bare toppen av SEC-kolonnen og fester prøvebeholderen.
   4. Legg til 47 ml (10 ml) PBS til prøvereservoaret og fjern merket nederst i SEC-kolonnen. Tillat at all lastet prøvebuffer flyter gjennom kolonnen for likevekt. Kast gjennomstrømningen.
   5. Legg inn maksimalt 2 ml (0,5 ml) prøve på prøvereservoaret, kast gjennomstrømningen og la prøven komme helt inn i kolonnen.
   6. Tilsett umiddelbart PBS i prøvereservoaret eller beholderen med et volum på 14,25 ml minus prøvevolumet (3 ml minus prøvevolumet, for den lille kolonnen). La løsningen strømme gjennom kolonnen og kast dette beløpet som er lik kolonnens tomromsvolum.
      MERK: For en typisk prøve på 2 ml vil mengden PBS som skal tilsettes prøvereservoaret eller beholderen være 12,25 ml.
   7. Plasser et 2 ml lavbindende mikrorør rett under SEC-kolonnen. Tilsett umiddelbart 2 ml (0,5 ml) PBS i prøvereservoaret og la det komme inn i kolonnen. Merk denne første 2 ml (0,5 ml) gjennomstrømningen som fraksjon 1. Fortsett å legge til 2 ml (0,5 ml) om gangen til prøvereservoaret for å samle hver påfølgende fraksjon.
      MERK: De fleste bakterielle elbiler eluerer i de første 5 fraksjonene. Under optimalisering ble de første 12 fraksjonene samlet inn.
   8. Oppbevar fraksjonene ved 4 °C for kortvarig lagring (dager) eller -80 °C for langtidsoppbevaring.
   9. Rengjøring og lagring av de gjenbrukbare SEC-kolonnene
      MERK: SEC-kolonnene beskrevet i denne protokollen kan gjenbrukes opptil 5 ganger i henhold til produsenten. Hvis strømningshastigheten til SEC-kolonnene avtar etter <5 bruk, anbefaler produsenten å sentrifugere de konsentrerte prøvene ved 10 000 x g i 10 minutter for å fjerne eventuelle aggregater før SEC. Last deretter supernatanten til denne sentrifugeringen på SEC-kolonnen for EV-isolasjon.
      1. For å rengjøre og lagre SEC-kolonnen etter hver bruk, legg til 2 ml (0,5 ml) på 0,5 M NaOH og la den komme helt inn i kolonnen. Kjør 100 ml (20 ml) 20 % etanol gjennom kolonnen og oppbevar den ved 4 °C til neste bruk. Før neste bruk, balansere etanolen til romtemperatur som ovenfor, og bytt den med PBS-buffer ved å kjøre ytterligere 150 ml (30 ml) PBS gjennom kolonnen.
      2. For å rengjøre og umiddelbart gjenbruke SEC-kolonnen etter hver bruk, legg til 2 ml (0,5 ml) på 0,5 M NaOH og la den komme helt inn i kolonnen. Kjør omtrent 150 ml (30 ml) PBS-buffer for å vaske bort NaOH. Når pH i eluat er lik PBS (~ 7), kan en ny prøve lastes inn.

3. Kvalitetskontroll av EV-forberedelse

1. Sterilitet testing
   MERK: Siden disse elbilene kommer fra bakteriekulturer, er det viktig å sikre sterilitet før nedstrøms bruk.
   1. Oppnå 100 μL (20 μL) av fraksjonene som skal brukes i analyser og inokulere 3 ml av mediet som brukes til å dyrke kildebakteriene. Kultur under de respektive optimale forholdene i minst 3 dager og observere for turbiditet. Alternativt kan du bruke fraksjonsprøvene på agarplater som inneholder mediet som brukes til å dyrke de produserende bakteriene og se etter kolonidannelse.
      MERK: Hvis bakteriell forurensning oppdages, anbefales det ikke å bruke EV-preparatet til eksperimentering. Gjenta i stedet isolasjonen, pass på å minimere risikoen for bakteriell forurensning ved å (a) utføre tilstrekkelig sentrifugering / filtrering av betinget bakterielt cellekulturmedium, (b) bruke rene flasker, slanger, filtre og kromatografikolonner, og (c) bruke passende aseptiske teknikker.
2. Kvantifisering av proteiner
   MERK: Et høysensitivt, fluorescensbasert proteinkvantifiseringssett ble brukt (se materialtabellen). Settet fungerer med et matchende proprietært fluorimeter ved eksitasjons- / utslippsbølgelengder på 485/590 nm.
   1. Få alle reagenser, standarder og prøver til romtemperatur.
   2. Forbered en hovedblanding av proteinreagens og buffer ved å tilsette 1 μL av reagenset til 199 μL buffer for hver prøve og standard som skal analyseres. Ved å bruke tynnveggede 0,5 ml PCR-rør, tilsett 10 μL standard + 190 μL masterblanding til hvert standardrør.
      MERK: For å være innenfor analyseområdet, avhenger mengden av hver fraksjon som skal tilsettes hvert prøverør av det forventede proteinutbyttet av rensingen. Vanligvis ble 5 μL av hver fraksjon + 195 μL masterblanding brukt. Det endelige volumet av prøve + masterblanding må være 200 μL.
   3. Vortex analyserørene, og inkuber i minst 15 minutter ved romtemperatur i mørket.
   4. Mål standardene på riktig proprietært fluorimeter (se materialtabellen) ved å velge alternativet Proteinanalyse ved hjelp av pilknappene og trykke på GO-knappen for å bekrefte. Følg instruksjonene på skjermen, sett inn hvert standardrør og trykk på GO.
   5. Sett inn det eksperimentelle prøverøret; trykk GO for å lese; og noter resultatet som vises, som er den faktiske proteinkonsentrasjonen i analysebufferen / prøveblandingen. Hvis du vil oppnå proteinkonsentrasjonen i prøven, bruker du piltastene til å velge alternativet Beregn prøvekonsentrasjon, trykker GO og bruker piltastene til å velge prøvevolumet som er lagt til analysebufferen for den gitte prøven. Trykk GO og registrer prøveproteinkonsentrasjonen. Gjenta dette trinnet for hver prøve som skal analyseres.
3. Partikkeltelling og størrelsesfordeling
   MERK: Microfluidics resistive pulse sensing (MRPS) ble brukt til å kvantifisere EV-konsentrasjon og størrelsesfordeling.
   1. Fortynn prøvene i PBS supplert med 1% Tween-20 som har blitt filtrert gjennom et 0,02 μm sprøytefilter til en proteinkonsentrasjon på ca. 0,1 μg / ml.
      MERK: Målet med fortynning er å nå en forventet partikkelkonsentrasjon i området 10¹⁰ partikler/ml i EV-holdige fraksjoner. Den optimale fortynningen må kanskje bestemmes empirisk. Det forventes få elbiler for senere fraksjoner (utover brøk 6). Dermed vil partikkelkonsentrasjonen trolig være <10¹⁰ partikler/ml til tross for analyse ved lave fortynninger.
   2. Legg 3 μL av hver prøve inn i mikrofluidikkpatronen til engangsbruk med en mikropipette, sett sylinderampullen inn i MRPS-instrumentet og trykk på metallknappen med en blå opplyst kant.
   3. Klikk Go ! på anskaffelsesprogramvaren og vent til prøven blir analysert av instrumentet. Skaff 1000 til 10 000 partikkelhendelser for å minimere den tekniske statistiske analysefeilen. På dette tidspunktet klikker du Stopp og avslutt kjøring for å fullføre eksempelinnhentingen.
      MERK: Sammen med rådatafilene sender instrumentet ut et sammendragsregneark som viser partikkelkonsentrasjonen i prøven. Korriger denne verdien i henhold til prøvefortynningen som er gjort.
   4. Ved hjelp av analyseprogramvare laster du inn rådata og genererer tilpassede grafer med størrelsesfordeling.

4. Lagring av elbiler

1. Aliquot individuelle eller samlede fraksjoner til 25-50% av den individuelle fraksjonsstørrelsen (avhengig av størrelsen på kolonnen som brukes) i lavproteinbindende rør og lagres ved -80 ° C for å unngå fryse-tine sykluser.
   MERK: Ulike applikasjoner kan kreve mindre eller større aliquots avhengig av forventet mengde brukt i hvert eksperiment. Dette må bestemmes empirisk. De ikke-EV-holdige fraksjonene kan kasseres hvis de ikke er relevante for forskningsmålene.

5. Transmisjonselektronmikroskopi

1. Negativ farging
   1. Tilsett 5 μL av EV-prøven til det karbonbelagte kobber 400 nettgitteret og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Vask prøvesiden med 5 dråper 5 mM Tris-buffer (pH 7,1) og deretter med 5 dråper destillert vann.
   2. Flekkprøveside med 5 dråper 2% uranylacetat. Fjern ekstra flekker med filterpapir, og la risten tørke helt i flere timer eller over natten. Visualiser prøvene med et elektronmikroskop operert ved 80 kV.
2. Merking av immungold
   1. Påfør 10 μL EV-suspensjon på et formvar / karbon 400 nettgitter og inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask rutenettet i PBS tre ganger, og påfør deretter 4% paraformaldehyd i 10 minutter for å fikse prøven. Vask rutenettene fem ganger med PBS.
   2. Blokker rutenettet med tre vasker av PBS som inneholder 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Påfør deretter 10 μL av et primært antistoff i 40 minutter ved romtemperatur (her 1 μg / ml nluc antistoff). Vask tre ganger igjen med PBS inneholdende 0,1% BSA.
   3. Tilsett 10 μL sekundært gullmerket antistoff i rutenettet og inkuber i 40 minutter ved romtemperatur. Vask rutenettene tre ganger med PBS.
      MERK: Her ble et geit anti-mus antistoff konjugert med 10 nm gull nanopartikler brukt etter fortynning 1:10 i blokkeringsbuffer. Hvis gullmerking skjuler EV-visualisering, kan sekundære antistoffer med mindre gullnanopartikler (f.eks. 5 nm) brukes i stedet.
   4. Fest rutenettet med 10 μL 2,5% glutaraldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Vask tre ganger i PBS. Utfør negativ farging med 2% uranylacetat (10 μL) i 15 minutter. Bygg prøvene i 10 μL 0,5% uranylacetat og 0,13% metylcelluloseoppløsning i 10 minutter.
   5. La prøvegitterene tørke over natten ved romtemperatur før avbildning på elektronmikroskopet.
   6. På mikroskopinnhentingsprogramvaren bestemmer du eksponeringen empirisk for å oppnå optimal kvalitet på bildet (f.eks. 0,80851 s i dette oppsettet) og justerer det ved å skrive inn denne verdien i alternativboksen eksponeringstid . Velg alternativet 80 kV , og klikk på Start anskaffelse for å ta bildet.

Representative Results

For å vurdere hvilke SEC-kromatografifraksjoner som ble beriket for elbiler, ble SEC-kolonnen lastet med 2 ml E. coli MP1-betinget kulturmedium som hadde blitt konsentrert 1,000 ganger av TFF, og sekvensielle fraksjoner ble samlet inn. Ved hjelp av MRPS ble det funnet at brøk 1-6 inneholdt flest elbiler (figur 2A). Påfølgende fraksjoner inneholdt svært få elbiler, bestående i stedet for EV-frie proteiner (figur 2B). Elbiler var hovedsakelig <100 nm i diameter (figur 2C). TEM bekreftet EV-anrikning og størrelse, spesielt i brøk 2-6 (figur 2D).

For ytterligere å sikre at metodene var i stand til å skille elbiler fra ikke-EV-assosierte proteiner, ble det generert en rekombinant stamme av E. coli MP1 som uttrykker et cytolysin A-nanoluciferase-fusjonsprotein og fritt (ikke-smeltet) mCherry (skjematisert i figur 3A). Cytolysin A fusjonsproteiner ble tidligere vist å assosiere med E. coli EV¹⁴. For å overvåke mCherry-fluorescens ble 100 μL aliquots fra hver kromatografifraksjon overført til brønnene på en 96-brønnplate. Deres fluorescens ble målt i en mikroplateleser ved bruk av henholdsvis 580 nm og 620 nm som absorpsjons- og utslippsbølgelengder.

Tilsvarende, for luminescensmåling, ble en 20 μL aliquot av hver fraksjon blandet med et likt volum av Lucifrase-analyseløsningen i en 384-brønnplate, inkubert i 15 minutter, og synlig lysluminescens ble målt. Det ble observert at EV-berikede fraksjoner (fraksjon 2-7) hadde høy nanoluciferaseaktivitet som kan sammenlignes med senere fraksjoner, men bare et svært lavt fluorescerende signal fra ikke-EV-assosiert mCherry (figur 3B). Bakgrunnssignal fra en like stor mengde negative kontroll-EV-er (isolert fra en matchet bakteriestamme som mangler nanoluciferase-uttrykk) var >1,000 ganger lavere i EV-fraksjoner. Signalet fra den positive kontrollen (en nanoluciferase-uttrykkende bakteriell cellepellets) var omtrent 1000 ganger høyere enn fra EV-fraksjonene (ikke vist). Sistnevnte ble normalisert til det opprinnelige volumet av cellekulturmateriale som ga henholdsvis de analyserte cellene eller EV-ene. EV-assosiasjonen av nanoluciferase ble bekreftet i fraksjon 2-5 ved immungoldmerking (figur 3C), og observerte merkingen i de små ~ 20 nm EV-ene som ble isolert.

Til slutt, for å vurdere anvendeligheten av denne protokollen til andre bakteriearter, ble EV isolert fra ~ 100 ml kulturer av følgende forskjellige anaerobe bakterier: A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve og B . dentium fremstilt i BHI kulturmedium. Som en kontroll ble elbiler isolert fra det ferske BHI-kulturmediet. Mens EV-utbyttet varierte etter art, ble det igjen observert at tidlig kromatografifraksjon 1-4 ble beriket for elbiler (figur 4A). Det komplekse BHI-mediet inneholdt også partikler i EV-størrelse, om enn ved <25% av det totale EV-utbyttet i disse preparatene (figur 4A, svarte søyler). Elbiler av disse bakteriene ble også funnet å være primært < 100 nm i størrelse (figur 4B).

Figur 2: Representativ E. coli MP1 EV-eluering i tidlige kromatografifraksjoner. (A) Partikkeltelling ved MRPS i sekvensielle 2 ml kromatografifraksjoner. SEC-inngangen var 2 liter bakteriekultur supernatant konsentrert til 2 ml. Heltrukket linje representerer gjennomsnitt; skyggelagt område betegner SEM. (B) Proteinkonsentrasjon i hver fraksjon. (C) Størrelsesfordeling av fraksjon 3 EV målt ved MRPS. Heltrukket linje representerer gjennomsnitt; skyggelagt areal representerer 95 % KI. Merk at instrumentet ikke kan kvantifisere partikler <50 nm. (D) Transmisjonselektronmikrografier av sekvensielle, samlede kromatografifraksjoner og friskkulturmedium (kontroll). Alle bildene ble tatt i samme skala (100 nm). Wide-field TEM-bilder er vist i supplerende figur S3. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikkel; MRPS = mikrofluidikk resistiv pulsføling; SEC = størrelse eksklusjonskromatografi; SEM = standardfeil i gjennomsnittet; KI = konfidensintervall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Separasjon av E. coli MP1 EV fra EV-frie proteiner ved SEC. (A) Skjematisk av E. coli MP1 som uttrykker rekombinant mCherry (rød) i cytoplasma og periplasm-trafficking cytolysin A-nanoLuciferase fusjonsprotein (gule diamanter). (B) nanoLuciferase bioluminescensaktivitet og mCherry-fluorescens ble overvåket i sekvensielt eluerte kromatografifraksjoner. Vertikal stiplet linje representerer grensen for EV-berikede fraksjoner basert på analyser i figur 2. (C) EV-fraksjoner (F2-5) var immungold merket etter farging med anti-nanoLuciferase antistoff. Cyan pilspisser peker på gullkonjugert sekundært antistoff som kolokaliseres med små elbiler. Kontroll-elbiler fra wildtype E. coli MP1 hadde ubetydelig, ikke-spesifikk farging. Begge bildene ble tatt med samme skala (100 nm). Wide-field TEM-bilder er vist i supplerende figur S4. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikkel; SEC = størrelse eksklusjonskromatografi; F = brøk; TEM = transmisjonselektronmikroskopi; ClyA-nLuc = cytolysin A-nanoLuciferase fusjonsprotein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Isolering av elbiler fra ulike bakteriearter. Indikerte arter ble dyrket i 48 timer i BHI-medium under anaerobe forhold. Elbiler ble isolert ved ultrafiltrering + SEC. (A) EV-konsentrasjon i de første 4 SEC-fraksjonene, målt ved MRPS. Gjennomsnittlig ± SEM. Svarte søyler representerer partikler som oppdages i en gruppe ferskt BHI-medium (kontroll). (B) Størrelsesfordeling av elbiler i brøk 2. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikkel; MRPS = mikrofluidikk resistiv pulsføling; SEC = størrelse eksklusjonskromatografi; BHI = hjernehjerteinfusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur S1: p114-mCherry-Clyluc plasmid. (A) Kart over p114-mCherry-Clyluc plasmid. (B) Sekvens av J23114-mCherry-clyA-nluc-regionen. Fiolett, J23114 Promotør; Rosa, mCherry-genet ; Grå, clyA-genet ; Grønn, Linker sekvens; Oransje, nLuc-genet . Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Tangentiell strømningsfiltrering (TFF) oppsett skjematisk. Slangen med piggslanger var koblet til TFF-enheten, som vist. Matestrømslangen begynner nedsenket i det filtrerte, kondisjonerte kulturmediumbeholderen, fortsetter gjennom den peristaltiske pumpen og kobles til TFF-enhetens innløpsport. Returstrømmen begynner ved TFF-enhetens utløpsport og slutter over overflaten av det filtrerte, betingede kulturmediet. Eventuelt kan en tilbaketrykksklemme (f.eks. en skrumutter + bolt eller enkel papirklemme) brukes til å øke filtreringshastigheten. Når pumpen sirkulerer det kondisjonerte mediet, fører utviklet trykk i TFF-enheten til ultrafiltrering og fjerning av komponenter <100 kDa gjennom filtratet / avfallsstrømningsslangen, som kan samles i et eget kar for avhending (magenta). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Widefield transmisjon elektronmikrografier. TEM-bilder av sekvensielle, samlede kromatografifraksjoner og friskkulturmedium (kontroll) vist i figur 2D. Bildene viser at E. coli MP1 ekstracellulære vesikler eluerer i tidlige kromatografifraksjoner. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S4: Widefield TEM-bilder for figur 3C. EV-fraksjonene (F2-5) var immungullmerket etter farging med anti-nano-Luciferase antistoff. Cyan pilspisser peker på gullkonjugert sekundært antistoff som kolokaliseres med små elbiler. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsmetode: For rekombinant E. coli MP1-stamme som inneholder p114-mCherryClyluc. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I protokollen ovenfor beskrives en metode som er skalerbar og pålitelig isolerer elbiler fra forskjellige gramnegative/positive og aerobe/anaerobe bakterier. Det har flere potensielle stoppesteder gjennom hele prosedyren, selv om det er bedre å unngå å ta lengre tid enn 48 timer å isolere elbiler fra betingede bakteriekulturmedier.

For det første består den av dyrking av bakterier for å generere betinget bakteriekulturmedium. Det ble funnet at å øke kulturtiden til minst 48 timer og bruke det optimale vekstmediet bidrar til å maksimere EV-utbyttet. Det er sannsynlig at hver bakterieart må optimaliseres med hensyn til disse to parametrene. Volumet av bakteriekulturen er også viktig for å sikre at tilstrekkelige elbiler isoleres for ønsket applikasjon. For in vitro-studier er elbilene vanligvis isolert fra minimum 100 ml, mens for in vivo-studier er elbiler vanligvis isolert fra >1 liter kulturmedium. Igjen, EV-produksjonsegenskapene til hver bakteriestamme og den nødvendige EV-mengden for nedstrømsanalyser vil diktere det minste startkulturvolumet.

Når betinget kulturmedium er tilgjengelig, må celler og store ikke-EV-rusk fjernes. Det ble funnet at sentrifugering er et kritisk skritt i denne prosessen. Som nevnt i protokollen ovenfor ble det utført to økende g-force sentrifuger. Av og til utføres ytterligere 10.000 × g sentrifugering hvis det ble bemerket at pelleten til det andre spinnet ikke er kompakt. Deretter utføres steril filtrering av denne supernatanten gjennom et 0, 22 μm filter. Utilstrekkelig sentrifugering fører til tilstopping og dårlig ytelse av dette filtreringstrinnet. Det ble bemerket at å fortsette å filtrere supernatanten etter at filtreringshastigheten er betydelig redusert, kan føre til filterfeil og forurensning av EV-preparatet med foreldrebakteriene. Løsningen på vedvarende tilstopping av filteret er å re-sentrifugere og / eller refiltrere supernatanten, noe som sikrer sterilitet. De beskrevne sentrifugerings- og vakuumdrevne filtreringstrinnene ble testet for opptil totalt 4 liter bakteriekultur. Ytterligere oppskalering av EV-isolasjon kan kreve endringer. For eksempel kan begge disse trinnene potensielt erstattes med sekvensiell pumpedrevet filtrering ved hjelp av kompatible filterenheter med redusert porestørrelse, ned til 0,22 μm. Dette gjenstår imidlertid å bli testet.

I den nåværende protokollen beskrives to variasjoner, avhengig av startvolumet av bakteriekulturen. For volumer < 100 ml, bruk sentrifugal ultrafiltreringsanordninger for å konsentrere kulturmediet. MWCO er kritisk i disse trinnene. For pattedyrs elbiler ble >300 kDa MWCO tidligere brukt^11,12. Dette resulterte imidlertid i svært dårlige EV-utbytter fra bakterier, antagelig på grunn av den mindre størrelsesfordelingen. Det anbefales derfor å bruke 100 kDa MWCO. En mindre MWCO kan også brukes, men er forbundet med lengre sentrifugeringstider og mindre fjerning av små molekylvektforurensninger, noe som øker prøveviskositeten. Det er også nyttig å ha forskjellige størrelser av ultrafiltreringsenheter på 100 kDa MWCO for å konsentrere forskjellige startvolumer av prøve gjennom protokollen.

Alternativt, for prøvestørrelser betydelig >100 ml, bruk pumpedrevet TFF for å konsentrere prøven; igjen, å bruke en 100 kDa MWCO er kritisk. Denne metoden tillater behandling av store mengder kulturmedium på en halvautomatisert måte. Det er viktig å skaffe en TFF-enhet i passende størrelse for startkulturvolumet. Enheten som brukes er vurdert ved behandling av opptil 200 ml materiale av produsenten. Det var mulig å behandle opp til ca 2 L. Imidlertid ble det observert et alvorlig fall i filtreringshastigheten ved forsøk på å behandle større volumer, noe som krever at prosessen stoppes og enheten rengjøres før ytterligere behandling. Dermed vil egenskapene til hver bakteriekultur og mengden utgangsmateriale diktere den nødvendige størrelsen på TFF-enheten. Videre er den oppnåelige pumpehastigheten en annen viktig parameter for TFF. Ved lave hastigheter på ~ 100 ml / min var det nødvendig å øke mottrykket i TFF-enheten ved hjelp av en klemme, som angitt i tilleggsfigur S2, for å lette filtrering, noe som øker begroingshastigheten til filteret. Slangen ble gjenbrukt opptil 2 ganger etter passende dekontaminering og autoklavering.

Når prøven er konsentrert, kan den deretter lastes på en SEC-kolonne for å isolere elbilene. Kommersielle kolonner optimalisert for liten EV-isolasjon ble brukt. For små startprøver, bruk kolonner med 0,5 ml lastevolum, og bruk kolonnene med 2 ml lastevolum for større startprøver opp til 2 L. Det er sannsynlig at behandlingen av startkulturer >2 L vil kreve større kolonner. Produsenter av EV-optimaliserte kolonner tilbyr for tiden SEC-kolonner som er i stand til å akseptere > 100 ml konsentrert materiale.

Ulike metoder brukes til å karakterisere de isolerte elbilene, hvorav de fleste er allment tilgjengelige. Normalisering var basert på proteinkonsentrasjonen for de fleste analyser fordi dette ikke påvirkes av manglende evne til andre kvantifiseringsmetoder (nemlig partikkelkvantifisering av teknologier som MRPS) for å oppdage svært små EV <50 nm. MRPS og andre nanopartikkelkvantifiseringsteknologier forblir nyttige i den relative kvantifiseringen av elbiler blant de forskjellige fraksjonene.

Et kritisk aspekt ved MRPS-kvantifisering er fortynningsnivået. Når de er fortynnet på riktig måte, bør frekvensen av oppdagede elbiler fortsette å øke til deteksjonsgrensen i de fleste tilfeller, da instrumentet ikke kan kvantifisere partikler <50 nm. Utilstrekkelig fortynning vil føre til høy instrumentstøy, noe som vil generere en artefakt klokkeformet kurve med en topp på >65 nm (ved bruk av den anbefalte C-300 mikrofluidikkpatronen). Under analyse av størrelsesfrekvensfordelingsdata observeres det fortsatt noen ganger en artefakttopp mellom 50 nm (den absolutte deteksjonsgrensen for instrumentet) og 60 nm, til tross for tilstrekkelig fortynning. Dette skyldes sannsynligvis tilstedeværelsen av et betydelig antall svært små bakterielle elbiler (som visualisert i TEM, figur 2D) som er under grensen for nøyaktig deteksjon av MRPS og igjen fører til instrumentstøy. I dette tilfellet utelukker du datapunkter som er mindre enn den observerte "toppen", som blir den de facto nedre grensen for kvantifisering av den gitte prøven.

Som beskrevet i denne protokollen, kan kvantifiseringen av EV-overflod, total proteinkonsentrasjon og overflod av ikke-EV-proteiner i de eluerte kromatografifraksjonene hjelpe brukerne med å bestemme hvilke fraksjoner som skal brukes til nedstrøms analyser. For eksempel ble det påvist små elbiler i samlede brøker 7-8 (figur 2D); Forekomsten var imidlertid lavere enn i de umiddelbart foregående fraksjonene, mens den totale proteinkonsentrasjonen (figur 2B) var høyere. Dette kan tyde på at fraksjon 7-8 inneholder høyere mengder ikke-EV-assosierte proteiner og kan dermed ikke være ønskelig for visse nedstrøms applikasjoner.

Oppsummert er en allsidig EV-isolasjonsprotokoll som er avhengig av kommersielt tilgjengelige materialer beskrevet her. Betydningen av denne metoden sammenlignet med mye brukte ultracentrifugeringsbaserte metoder er at den består av trinn som enkelt kan reproduseres av forskjellige brukere og er svært skalerbare. Dette er spesielt viktig for å lette genereringen av tilstrekkelig materiale for in vivo-studier . Det ble brukt til å isolere elbiler fra kulturer på 100 ml til 2 liter. Gitt det brede spekteret av tilgjengelige TFF-enheter, er det mulig at denne protokollen kan tilpasses større rensinger med noen modifikasjoner. Isolasjonsprotokollen som er beskrevet, er primært basert på de fysiske egenskapene til elbiler, nemlig deres størrelse, og er sannsynligvis anvendelig for bakteriearter utover de som er beskrevet i denne studien.

En begrensning av protokollen som er beskrevet, er at den favoriserer isolering av små elbiler, spesielt < 100 nm, som vist i de representative resultatene. Tidligere rapporter beskriver også tilstedeværelsen av større bakterielle elbiler^15,16. Isolering av større bakterielle elbiler kan kreve endringer av protokollen ovenfor, for eksempel ved å bruke SEC-kolonner optimalisert for større elbiler. Slike SEC-kolonner er også kommersielt tilgjengelige. Videre kan andre protokoller sannsynligvis oppnå høyere EV-renhet (for eksempel tetthetsgradient ultracentrifugering eller immunisolasjon). Disse metodene mangler imidlertid gjennomstrømningen og skalerbarheten til metodene beskrevet i denne studien. Endring av denne protokollen med ytterligere rensetrinn i fremtiden kan ytterligere øke utbyttet og renheten av preparater, noe som kan være viktig for eksperimentelle og terapeutiske anvendelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	3430	it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron microscopy sciences	15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter	Beckman Coulter	392077	Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge	Beckman Coulter		No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Brain Heart infusion (BHI) broth	Himedia	M2101	After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge	Spectradyne
Chloramphenicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Electron microscope	FEI company	Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (gift)		commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter	ThermoFisher	010-0151-05	used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper	Electron microscopy sciences	FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)	Electron microscopy sciences	16100
Hematin	ChemCruz	207729B	Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader	Tecan		This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus	Takara	638909	For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller	Difco	244620
L-Cysteine Hydrochloride	J.T. Baker	2071-05	It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-08	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-24	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft	Cole Palmer	EW-06435-16	low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3)	MP	102259	Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System	Promega	N1110	This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer	NEB	M0482	DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes	Eppendorf	30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack	Izon		for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer	ThermoFisher		Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit	ThermoFisher	Q33211	Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x Microplate reader	Molecular Devices		This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate	Electron microscopy sciences	22400
Vinyl anaerobic chamber	Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES	Sartorius	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)	MilliporeSigma	WHA68093002	to filter MRPS diluent