使用超极化 [1-13C]丙酮酸及 13C/31P 核磁共振波谱法研究离体灌注小鼠心脏的代谢

摘要

我们描述了一种实验装置，可用于在持续灌注模式下向离体灌注的小鼠心脏输注超极化¹³C标记的代谢物。采用专门的¹³C核磁共振（NMR）采集方法，可实时定量测定代谢酶活性；同时通过多参数³¹P-NMR分析，测定组织中的ATP含量和pH值。

摘要

代谢是细胞生命活动中重要过程的基础。阐明代谢网络在活体组织中的功能机制，对于理解疾病机理和设计治疗方案具有关键意义。本文描述了一种实时研究逆行灌流小鼠心脏中细胞内代谢活性的实验流程与方法。心脏被分离 原位 与心脏骤停同时进行以最大限度减少心肌缺血，并在核磁共振（NMR）波谱仪内进行灌注。在波谱仪内并持续灌注条件下，超极化[1-¹³C]丙酮酸被给予心脏，随后的超极化[1-¹³C]乳酸和[¹³C]碳酸氢盐的生成速率用于实时测定乳酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶的活性。该代谢活性基于超极化[1-¹³采用无模型的产物选择性饱和激发采集方法，通过核磁共振波谱法对C]丙酮酸进行定量分析。 ³¹采用磷-31谱（P spectroscopy）在超极化采集过程中监测心脏能量代谢和pH值。该系统在研究健康及病变小鼠心脏代谢活性方面具有独特优势。

引言

心脏代谢的改变与多种心肌病相关，且常常构成潜在病理生理机制的基础¹。然而，研究活体组织中的代谢存在诸多障碍，因为大多数生化检测需要对组织进行匀浆、细胞裂解和/或放射性示踪。因此，迫切需要开发新工具以研究活体组织中的心肌代谢。利用超极化¹³C标记底物进行磁共振（MR）检测，可通过将标记位点的MR信噪比（SNR）提高数个数量级，实现对活体组织代谢的实时测量²，且无需使用电离辐射³。本文介绍了一种用于研究离体小鼠心脏快速代谢的实验装置、数据采集方法和分析方法，同时并行提供有关组织总体能量状态和酸度的指标。心肌pH值是一个重要的指标，因为在心肌缺血、不良性肥厚和心力衰竭等心脏疾病和病理状态的早期阶段，酸碱平衡即已发生紊乱⁶。

超极化[1-¹³C]乳酸和[¹³C]碳酸氢根由超极化[1-¹³C]丙酮酸生成，有助于测定乳酸脱氢酶（LDH）和丙酮酸脱氢酶（PDH）的生成速率。以往大多数在离体啮齿类动物心脏中使用超极化底物的研究，要么采用复杂的动力学模型来推导LDH和PDH的酶活性，要么仅报告超极化产物与底物的信号强度比值，而未计算实际的酶活性速率^2,

方案

希伯来大学和哈达萨医学中心的联合伦理委员会（IACUC）批准了动物福利方面的研究方案（MD-19-15827-1）。

1. 克雷布斯-亨塞尔特缓冲液的配制

1. 实验前一天，配制改良的克雷布斯-亨塞尔特缓冲液（Krebs-Henseleit buffer, KHB）²⁶。首先，将 118 mM NaCl、4.7 mM KCl、0.5 mM 丙酮酸钠、1.2 mM MgSO₄、25 mM NaHCO₃ 和 1.2 mM KH₂PO₄ 溶解于双蒸水（H₂O）中。
2. 用 95%/5% O₂/CO₂ 混合气体对该溶液通气 20 分钟，然后加入 1.2 mM CaCl₂。
3. 用 HCl 或 NaOH 将缓冲液的 pH 值调节至 7.4。
4. 实验当天，在步骤 1.2 配制的 KHB 中加入 10 mM 葡萄糖和 72 U/L 胰岛素。
   注意：胰岛素的添加方法参照 Kolwicz 等人²⁶ 的研究，并与既往研究一致，这些研究表明胰岛素可增强心肌收缩功能²⁷ 以及....

结果

的 ³¹灌注KHB的鼠心及仅缓冲液的31P谱图如图所示 图1A在心脏中观察到α-、β-和γ-ATP、PCr及Pi的信号。Pi信号由两个主要组分构成：较高场强区域（信号左侧）的Pi信号主要来源于pH为7.4的KHB；较低场强区域（信号右侧）的Pi信号更宽且不均一，源于更酸性的环境。后一种模式来自心肌组织。通过减去KHB的Pi信号，可提取心肌组织的Pi信号图1B）然后将 ppm 标度转换为 pH 标度（图1C）。通过计算组织无机磷（Pi）信号的加权均值、加权中位数、全局最大值和偏度，进行多参数分析以研究pH值。图1C).

讨论

我们展示了一种实验装置，旨在研究离体小鼠心脏模型中高极化[1-¹³C]丙酮酸的代谢、组织能量学及pH值。

该方案中的关键步骤如下：1）确保缓冲液的pH值为7.4；2）确保缓冲液中包含所有组分；3）通过注射肝素防止心脏血管内血液凝固；4）通过降低代谢活性（注射KCl并使用冰冻缓冲液）避免心脏缺血损伤；5）在整个操作过程中避免向心脏引入气泡；6）通过观察组织颜色变化（由深红色变为浅粉色）验证主动脉插管成功；7）当心脏转移至温热缓冲液后，确保灌注持续进行；8）密切监测位于心脏旁核磁共振谱仪中NMR管内的温度，并维持在37 °C；9）在整个测量过程中检查磁场均匀性；10）使用准确且经过校准的射频脉冲参数。

技术的改进与故障排除
本研究中采用了以下几项改进措施：1）手术后使用冰冻的KHB缓冲液进行灌注，以保护心脏；2）在整个实验过程中对缓冲液的pH值进行了验证，以确保该参数处于可控状态，不会成为结果变异的来源。这些验证在制备和实验的各个步骤中进行，使用了pH计、pH指示试纸.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
HyperSense DNP 极化仪	Oxford Instruments	52-ZNP91000	HyperSense，3.35 T，临床前溶解型动态核极化（DNP）超极化系统
核磁共振波谱仪	RS2D		NMR Cube，5.8 T，配备10 mm宽带探头
蠕动泵	Cole-Parmer	07554-95
温度探针	Osensa	FTX-100-LUX+	与核磁共振兼容的温度探针
Somnosuite 低流量麻醉系统	Kent Scientific
导管、管路与缝合线
铂固化硅胶管	Cole-Parmer	HV-96119-16	L/S 16 内径 3.1 mm
细聚醚醚酮（PEEK）管路	Upchurch Scientific		内径 0.040”
静脉导管	BD Medical	381323	22 G
丝线缝合线	Ethicon	W577H	线径 3-0
化学品与药品
[1-13C]丙酮酸	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-8077-1
氯化钙	Sigma-Aldrich	21074	CAS: 10043-52-4
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528	CAS: 50-99-77
肝素钠	Rotexmedica	HEP5A0130C0160
37% 盐酸	Sigma-Aldrich	258148	CAS: 7647-01-0
门冬胰岛素（诺和锐）	Novo Nordisk
异氟烷	Terrel
硫酸镁	Sigma-Aldrich	793612	CAS: 7487-88-9
氯化钾	Sigma-Aldrich	P4504	CAS: 7447-40-7
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P9791	CAS: 7778-77-0
碳酸氢钠	Gadot Group		CAS: 144-55-8
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9625	CAS: 7647-14-5
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	655104	CAS: 1310-73-2
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S7907	CAS: 7558-79-4
磷酸二氢钠二水合物	Merck	6345	CAS: 13472-35-0
TRIS（生物技术级）	Amresco	0826	CAS: 77-86-1
三苯甲基自由基 OX063	GE Healthcare AS	NC100136	OX063
核磁共振标准品
13C 标准样品	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-72A	苯-D6 中含 40% 对二氧六环
31P 标准样品	实验室自制		D2O 中含 105 mM ATP 和 120 mM 苯基磷酸
软件
Excel 2016	Microsoft
MNova	Mestrelab Research