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Biology

हाइपरपोलराइज्ड [1-13 सी] पाइरूवेट और 13सी /31पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ पृथक परफ्यूज्ड माउस हार्ट में कार्डियक मेटाबोलिज्म की जांच

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

हम हाइपरपोलराइज्ड 13सी-लेबल मेटाबोलाइट्स को निरंतर छिड़काव मोड में एक पृथक संक्रमित माउस दिल में प्रशासित करने के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप का वर्णन करते हैं। एक समर्पित 13सी-एनएमआर अधिग्रहण दृष्टिकोण ने वास्तविक समय में चयापचय एंजाइम गतिविधि की मात्रा का ठहराव सक्षम किया, और एक बहुपैरामीट्रिक 31पी-एनएमआर विश्लेषण ने ऊतक एटीपी सामग्री और पीएच के निर्धारण को सक्षम किया।

Abstract

चयापचय सेलुलर जीवन में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का आधार है। जीवित ऊतकों में चयापचय नेटवर्क कैसे कार्य करते हैं, यह बताना रोगों के तंत्र को समझने और उपचार डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। इस काम में, हम वास्तविक समय में प्रतिगामी रूप से संक्रमित माउस दिल में इन-सेल चयापचय गतिविधि का अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं और पद्धतियों का वर्णन करते हैं। मायोकार्डियल इस्किमिया को कम करने के लिए कार्डियक अरेस्ट के साथ-साथ दिल को सीटू में अलग किया गया था और एक परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोमीटर के अंदर डाला गया था। जबकि स्पेक्ट्रोमीटर में और निरंतर छिड़काव के तहत, हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट को हृदय को प्रशासित किया गया था, और बाद में हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] लैक्टेट और [13सी] बाइकार्बोनेट उत्पादन दर ने वास्तविक समय में लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज और पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज उत्पादन की दरों को निर्धारित करने के लिए काम किया। हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट की इस चयापचय गतिविधि को एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ उत्पाद चयनात्मक संतृप्त-उत्तेजना अधिग्रहण दृष्टिकोण का उपयोग करके एक मॉडल मुक्त-तरीके से निर्धारित किया गया था। 31 कार्डियक एनर्जेटिक और पीएच की निगरानी के लिए हाइपरपोलराइज्ड अधिग्रहण के बीच पी स्पेक्ट्रोस्कोपी लागू किया गया था। यह प्रणाली स्वस्थ और रोगग्रस्त माउस हृदय में चयापचय गतिविधि का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट रूप से उपयोगी है।

Introduction

कार्डियक चयापचय में परिवर्तन विभिन्न प्रकार के कार्डियोमायोपैथी से जुड़े होते हैं और अक्सर अंतर्निहित पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्रका आधार बनते हैं। हालांकि, जीवित ऊतकों में चयापचय का अध्ययन करने के लिए कई बाधाएं हैं, क्योंकि अधिकांश जैव रासायनिक परखों को ऊतक और सेल लाइसिस और / या रेडियोधर्मी अनुरेखण के समरूपीकरण की आवश्यकता होती है। इसलिए, जीवित ऊतकों में मायोकार्डियल चयापचय की जांच के लिए नए उपकरणों की आवश्यकता है। हाइपरपोलराइज्ड 13सी-लेबल सब्सट्रेट्स का चुंबकीय अनुनाद (एमआर) जीवित ऊतकों में चयापचय के वास्तविक समय माप के लिए अनुमति देता है2, आयनीकरण विकिरण के उपयोग के बिना, लेबल साइट (ओं) के एमआर सिग्नल-टू-शोर (एसएनआर) अनुपात कोपरिमाण 3 के कई आदेशों से बढ़ाकर। यहां, हम एक प्रयोगात्मक सेटअप, एक अधिग्रहण दृष्टिकोण, और पृथक माउस हृदय में तेजी से चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं और समानांतर में, सामान्य ऊतक ऊर्जावान और अम्लता के वर्तमान संकेतक। कार्डियक पीएच एक मूल्यवान संकेतक है, क्योंकि हृदय रोगों के शुरुआती चरणों और मायोकार्डियल इस्किमिया, दुर्भावनापूर्ण हाइपरट्रॉफी और दिल की विफलता जैसी स्थितियों में एसिड-बेस संतुलन बाधितहोता है।

हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] लैक्टेट और [13सी] पाइरूवेट से बाइकार्बोनेट उत्पादन लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) और पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज (पीडीएच) की उत्पादन दरों को निर्धारित करने में मदद करता है। पृथक कृंतक हृदय में हाइपरपोलराइज्ड सब्सट्रेट्स का उपयोग करके किए गए पिछले अधिकांश अध्ययनों ने या तो एलडीएच और पीडीएच की एंजाइमेटिक गतिविधि को प्राप्त करने के लिए जटिल गतिज मॉडल का उपयोग किया, या वास्तविक एंजाइम गतिविधि दर 2,4,5,6,7,8,9,10 की गणना किए बिना एक सब्सट्रेट को हाइपरपोलराइज्ड उत्पाद के सिग्नल तीव्रता अनुपात की सूचना दी। 11,12,13,14. यहां, हमने उत्पाद चयनात्मक संतृप्त-उत्तेजना दृष्टिकोण15 का उपयोग किया, जो मॉडल-मुक्त तरीके से एंजाइम गतिविधि की निगरानी के लिए अनुमति देता है 15,16। इस तरह, पूर्ण एंजाइमेटिक दरें (यानी, समय की प्रति इकाई उत्पादित उत्पाद के मोल्स की संख्या) निर्धारित की गई थीं। 31 पी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग अकार्बनिक फॉस्फेट (पाई), फॉस्फोक्रिएटिन (पीसीआर), और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के संकेतों का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। हृदय के पीएच वितरण को चिह्नित करने के लिए एक बहु-पैरामीट्रिक विश्लेषण का उपयोग किया गया था, जैसा कि ऊतक के पाई सिग्नल में विषम रासायनिक बदलाव द्वारा प्रदर्शित किया गया था।

प्रतिगामी रूप से संक्रमित माउस हार्ट (लैंगेंडॉर्फ हार्ट) 17,18,19 बरकरार धड़कते दिल के लिए एक पूर्व विवो मॉडल है। इस मॉडल में, हृदय व्यवहार्यता और पीएच को कम से कम 80 मिनट20 के लिए संरक्षित किया जाता है, और इसने लंबे समय तक इस्केमिक चोट21,22 के बाद वसूली की क्षमता दिखाई है। फिर भी, माइक्रो-सर्जरी के दौरान अनजाने में परिवर्तनशीलता दिल में ऊतक व्यवहार्यता में परिवर्तनशीलता का कारण बन सकती है। पिछले अध्ययनों ने समय के साथ इस दिल के बिगड़ने पर रिपोर्ट कीहै19; उदाहरण के लिए, प्रति घंटे 5% -10% की सिकुड़ा हुआ कार्य मेंकमी देखी गई है। एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) सिग्नल को पहले मायोकार्डियल ऊर्जावान स्थिति और व्यवहार्यता23 पर रिपोर्ट करने के लिए दिखाया गया है। यहां, हमने नोट किया कि संक्रमित हृदय कभी-कभी व्यवहार्यता स्तरों में अनजाने परिवर्तनशीलता दिखा सकता है, जैसा कि एटीपी सामग्री द्वारा प्रदर्शित किया गया है, इस तथ्य के बावजूद कि हमारे पास निर्बाध छिड़काव और ऑक्सीजन की आपूर्ति थी। हम यहां प्रदर्शित करते हैं कि हृदय की एटीपी सामग्री के लिए एलडीएच और पीडीएच दरों को सामान्य करने से इन दरों में अंतर-हृदय परिवर्तनशीलता कम हो जाती है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में हृदय प्रवेशनी, अलगाव और परिणामस्वरूप छिड़काव के लिए उपयोग की जाने वाली शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। ध्यान दें, माउस दिल को अलग करने और फैलाने के उद्देश्य से अन्य सर्जिकल दृष्टिकोण24,25 से पहले वर्णित किए गए हैं।

धड़कते दिल में एंजाइमेटिक दरों से संबंधित डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियों ( 13सी स्पेक्ट्रोस्कोपी और हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट का उपयोग करके) और हृदय की व्यवहार्यता और अम्लता ( 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके) का भी वर्णन किया गया है। अंत में, चयापचय एंजाइम गतिविधियों और ऊतक व्यवहार्यता और अम्लता को निर्धारित करने के लिए विश्लेषणात्मक पद्धतियों को समझाया गया है।

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Protocol

हिब्रू विश्वविद्यालय और हदासाह मेडिकल सेंटर की संयुक्त आचार समिति (आईएसीयूसी) ने पशु कल्याण (एमडी-19-15827-1) के लिए अध्ययन प्रोटोकॉल को मंजूरी दी।

1. क्रेब्स-हेन्सेलिट बफर तैयारी

  1. प्रयोग से एक दिन पहले, क्रेब्स-हेंसेलिट बफर (केएचबी) 26 का एक संशोधित संस्करण तैयार करें। प्रारंभ में, डबल-डिस्टिल्डएच 2ओ में 118 एमएम एनएसीएल, 4.7 एमएम केसीएल, 0.5 एमएम पाइरूवेट, 1.2 एमएम एमजीएसओ4, 25 एमएम एनएएचसीओ3, और1.2एमएम केएच 2 पीओ4 को भंग करें।
  2. इस मिश्रण को 20 मिनट के लिए 95%/5% O2/CO2 के साथ उबालें, और फिर 1.2 mM CaCl2 जोड़ें।
  3. बफर के पीएच को एचसीएल या एनएओएच के साथ 7.4 में समायोजित करें।
  4. प्रयोग के दिन, चरण 1.2 में तैयार केएचबी में 10 एमएम ग्लूकोज और 72 यू / एल इंसुलिन जोड़ें।
    नोट: इंसुलिन को छिड़काव बफर में जोड़ा जाता है जैसा कि कोलविक्ज़ एट अल .26 के काम में वर्णित है और पिछले अध्ययनों के साथ सहमति में बताया गया है कि इंसुलिन सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन27 और हाइपरपोलराइज्ड [13सी] बाइकार्बोनेट सिग्नल28 की तीव्रता को बढ़ाता है।

2. छिड़काव प्रणाली की तैयारी

  1. 200 मिलीलीटर केएचबी के एक जलाशय को 40 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें, और कार्डियक छिड़काव से पहले 1 घंटे के लिए 4एल / मिनट की प्रवाह दर पर 95% / 5% ओ 2 / सीओ2 के साथ बुलबुला रखें। प्रयोग के दौरान इस गैस मिश्रण के साथ बफर को लगातार बुदबुदाते रहें।
    1. सबसे पहले, पानी के स्नान को 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। केएचबी जलाशय डालें। 7.5 एमएल / मिनट की निरंतर प्रवाह दर पर बफर जलाशय और 10 मिमी एनएमआर ट्यूब के बीच केएचबी को फिर से परिचालित करने के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप ( सामग्री की तालिका देखें) और चिकित्सा-ग्रेड विस्तार ट्यूबों का उपयोग करें।
    2. तीन प्लेटिनम-ठीक सिलिकॉन ट्यूबों (3 मिमी यानी) को पंप से कनेक्ट करें (केएच बफर के लिए एक इनफ्लो ट्यूब और दो बहिर्वाह ट्यूब)। गर्म केएच बफर में बहिर्वाह और प्रवाह लाइनों को डालें। फिर, गर्म केएच बफर में ऑक्सीजन लाइन डालें।
    3. स्पेक्ट्रोमीटर के बोर के भीतर एनएमआर ट्यूब से प्रवाह के लिए बफर और हाइपरपोलराइज्ड एजेंट के लिए पतली पॉलीएथर ईथर कीटोन (पीईके, सामग्री की तालिका देखें) लाइनों का उपयोग करें।
  2. सुनिश्चित करें कि तापमान 37-37.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया है। नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
  3. 42 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीटिंग टेप के साथ इनफ्लो लाइन (बफर जलाशय से एनएमआर ट्यूब तक) को लपेटें।
  4. स्पेक्ट्रोमीटर के अंदर एनएमआर ट्यूब को गर्म वायु प्रवाह के साथ गर्म करें जो स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा विनियमित होता है।
  5. एनएमआर ट्यूब के अंदर तापमान को मापने के लिए एनएमआर-संगत तापमान सेंसर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। तापमान 37-37.5 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित किया जाता है।

3. अधिग्रहण के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का अंशांकन और तैयारी

  1. प्रयोग के दिन, स्पेक्ट्रोमीटर में 1,4-डायोक्सेन (सामग्री की तालिका) युक्त एक 13सी मानक नमूना डालें, और 13सी के लिए एनएमआर जांच को ट्यून और मिलान करें। फिर, 90 ° के न्यूट्रेशन कोण के साथ 1,4-डायोक्सेन के थर्मल संतुलन संकेत को दिखाने वाला एक स्पेक्ट्रम प्राप्त करें।
  2. अब 13सी मानक नमूने को 31पी मानक नमूने (सामग्री की तालिका) के साथ आदान-प्रदान करें, जिसमें डी2ओ में 105एमएम एटीपी शामिल है।
    नोट: थर्मल संतुलन फॉस्फेट संकेतों को दिखाने वाला एक स्पेक्ट्रम 50 ° के न्यूट्रेशन कोण के साथ प्राप्त किया जाता है।
  3. इनफ्लो लाइन, बहिर्वाह रेखा और तापमान जांच को 10 मिमी एनएमआर ट्यूब में डालें, और फिर ट्यूब को चुंबकीय बोर में डालें। हीटिंग टेप को 42 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें।
  4. परिसंचारी केएच बफर के 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रम का अधिग्रहण करें, जिसका उपयोग उस प्रयोग में 30 मिनट के लिए किया जाएगा, जिसमें 50 ° का न्यूट्रेशन कोण और 1.1 एस (1,640 अधिग्रहण) का टीआर हो।

4. एनएमआर ट्यूब में पशु तैयारी, शल्य चिकित्सा प्रक्रिया और हृदय का छिड़काव

  1. एक प्रेरण कक्ष में गैस संज्ञाहरण प्रणाली (सामग्री तालिका) का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 340 एमएल / मिनट पर कमरे की हवा (सामग्री की तालिका) में 3.3% आइसोफ्लुरेन के साथ एक पुरुष एचएसडी: आईसीआर (सीडी -1) माउस को एनेस्थेटाइज करें।
  2. 2.9% आइसोफ्लुरेन के साथ सामान्य संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए नाक संज्ञाहरण का उपयोग करें।
    नोट: जानवर को दर्द और असुविधा को कम करने के लिए देखभाल की जाती है।
  3. टेप के साथ जानवर के अंगों को सुरक्षित करें, एक नकारात्मक पेडल दर्द रिफ्लेक्स सुनिश्चित करें, और फिर 300 आईयू सोडियम हेपरिन इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें।
  4. सफाई सुनिश्चित करने और शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान बालों के संदूषण या रुकावट से बचने के लिए माउस की छाती की दीवार और पेट को 70% अल्कोहल के साथ अच्छी तरह से गीला करें।
  5. हेपरिन इंजेक्शन के 1 मिनट बाद, छोटी कैंची के साथ पेट की गुहा की त्वचा और मांसपेशियों को काटें।
  6. छाती को उठाने और डायाफ्राम को उजागर करने के लिए ज़िफॉइड प्रक्रिया और छाती की त्वचा के बीच छोटे घुमावदार-जबड़े हेमोस्टैट-लॉकिंग मच्छर क्लैंप रखें। डायाफ्राम के दाहिने लोब को पंचर और काट लें।
  7. छाती को मध्य रेखा के पार काटें, किनारों पर वापस लें, और फिर हटा दें।
  8. रक्त जमावट को रोकने के लिए सोडियम हेपरिन के 200 आईयू के साथ हृदय के बाएं वेंट्रिकल को इंजेक्ट करें। फिर, कार्डियक अरेस्ट प्राप्त करने के लिए 0.1 एमएल बर्फ-ठंडा 0.5 मोल / एल केसीएल इंजेक्ट करें, जैसा कि पहले वर्णित25 है। कार्डियक अरेस्ट दिल को कैनुला करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है।
  9. थाइमस की पहचान करें, और महाधमनी को उजागर करने के लिए कैंची का उपयोग करके इसे हटा दें। अवशिष्ट पसली पिंजरे के ऊतकों को हटा दें।
  10. महाधमनी आर्क की पहचान करें, और आरोही महाधमनी के चारों ओर 3-0 रेशम सीवन (सामग्री की तालिका) के साथ एक ढीली गाँठ रखने के लिए घुमावदार बल का उपयोग करें। महाधमनी से रक्त के थक्कों को हटाने के लिए बाएं वेंट्रिकल में 3 एमएल केएचबी इंजेक्ट करें।
  11. आरोही महाधमनी के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए हृदय को हीन रूप से वापस लेने के लिए घुमावदार बल का उपयोग करें।
  12. 22 जी अंतःशिरा कैथेटर (सामग्री की तालिका) के साथ सीटू में प्रवेशनी करें। कैनुलाटेड क्षेत्र में साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला लागू करें, और फिर डबल सीवन बाइंडिंग करें। हृदय में अतिरिक्त केएच बफर इंजेक्ट करें, और सत्यापित करें कि यह कैनुलाशन ट्यूब के माध्यम से बहता है।
  13. घुमावदार बल को हटा दें। आसपास के विसरा से दिल को डिस्कनेक्ट करें, और अंतःशिरा कैथेटर के माध्यम से बर्फ-ठंडे केएचबी (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ प्रतिगामी रूप से इसे प्रतिगामी रूप से भरें।
  14. अंतःशिरा कैथेटर के माध्यम से छिड़काव प्रणाली की इनफ्लो लाइन से दिल को कनेक्ट करें। 7.5 एमएल / मिनट पर गर्म बफर (37-37.5 डिग्री सेल्सियस) के साथ छिड़काव की शुरुआत पर, दिल अनायास धड़कना शुरू कर देता है।
  15. धड़कते दिल, बहिर्वाह रेखाओं और तापमान जांच के साथ एनएमआर ट्यूब को ठीक करें, और स्पेक्ट्रोमीटर के बोर में डालें, यह सुनिश्चित करें कि दिल एनएमआर जांच के केंद्र में है।

5. कार्डियक एनर्जेटिक और पीएच के लिए डेटा प्राप्त करना

  1. 50 ° के फ्लिप कोण और 1.1 s के TR के साथ लगभग 1 घंटे के लिए 31P स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।

6. डीएनपी स्पिन ध्रुवीकरण और विघटन

  1. [1-13सी] पाइरूवेट का 28.5 मिलीग्राम सूत्रीकरण तैयार करें। इस फॉर्मूलेशन में साफ एसिड में 11.1 एमएम से 14.0 एमएम ओएक्स063 रेडिकल होता है।
  2. विघटन माध्यम के 4 एमएल तैयार करें। विघटन माध्यम में टीआरआईएस-फॉस्फेट बफर होता है, जिसमें 11.2 एमएम एनएएच2पीओ4, 38.8 एमएम एनए2एचपीओ4, 33 एमएम टीआरआईएस और 2 एमएम एचसीएल होते हैं। इस मध्यम संरचना को इस तरह से समायोजित किया जाता है कि इस बफर के 4 एमएल (विघटन चरण में) में 28.5 मिलीग्राम [1-13सी] पाइरुविक एसिड फॉर्मूलेशन के अतिरिक्त, परिणामी समाधान का पीएच 7.4 होगा।
  3. निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) के अनुसार विघटन-डीएनपी (डीडीएनपी) स्पिन ध्रुवीकरण डिवाइस में स्पिन ध्रुवीकरण और तेजी से विघटन करें। लगभग 1.5 घंटे के लिए 1.45 K से 1.55 K पर [1-13C] पाइरुविक एसिड फॉर्मूलेशन के ध्रुवीकरण के लिए 94.110 GHz की आवृत्ति पर माइक्रोवेव विकिरण लागू करें।
  4. डीडीएनपी डिवाइस से हाइपरपोलराइज्ड माध्यम के 4 एमएल को एक अच्छी तरह से ऑक्सीजन युक्त समाधान के साथ जल्दी से मिलाएं जो छिड़काव माध्यम से निकटता से मेल खाने वाली संरचना प्राप्त करने के लिए हाइपरपोलराइज्ड विघटन माध्यम का पूरक है।
    नोट: 14 एमएम हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट के साथ हाइपरपोलराइज्ड इंजेक्शन के दौरान दिल को प्रभावित करने वाले माध्यम की अंतिम मात्रा 26 एमएल है। इंजेक्शन माध्यम की अंतिम संरचना (मिश्रण के बाद) में 4.7 एमएम केसीएल, 1.2 एमएम एमजीएसओ4, 70 एमएम एनएसीएल, 25 एमएम एनएएचसीओ3, 1.2 एमएम केएच2पीओ4, 10 एमएम ग्लूकोज, 1.2 एमएम सीएसीएल2, और 72 यू / एल इंसुलिन शामिल हैं।
  5. एक निरंतर प्रवाह सेटअप29 का उपयोग करके पृथक हृदय को हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट युक्त माध्यम का प्रबंधन करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि प्रयोग के दौरान किसी भी बिंदु पर हृदय छिड़काव परेशान नहीं होता है और हाइपरपोलराइज्ड माध्यम को ज्ञात दर पर और ज्ञात अवधि के लिए प्रशासित किया जाता है।

7. हाइपरपोलराइज्ड 13सी स्पेक्ट्रोस्कोपी

  1. 2.5 एमएस कार्डिनल साइन (सिंक) दालों को लागू करके उत्पाद-चयनात्मक संतृप्त-उत्तेजनादालों 15 का उपयोग करके हाइपरपोलराइज्ड 13सी डेटा प्राप्त करें, जैसा कि पहलेवर्णित 15,16 है। प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए 12 सेकंड काअंतराल प्राप्त करने के लिए 6 सेकंड के अंतराल पर लगातार [1-13सी] लैक्टेट और [13 सी] बाइकार्बोनेट को चुनिंदा रूप से उत्तेजित करें।
  2. [1-13सी] लैक्टेट का पता लगाने के लिए, [1-13सी] पाइरूवेट हाइड्रेट आवृत्ति (179.4 पीपीएम) पर चयनात्मक सिंक पल्स को केंद्रित करें, जिसके परिणामस्वरूप [1-13 सी] पाइरूवेट से [1-13 सी] लैक्टेट के सी1 संकेतों के लिए सिग्नल तीव्रता अनुपात (लाख) 0.113होता है।
  3. [13सी] बाइकार्बोनेट डिटेक्शन के लिए, चयनात्मक सिंक पल्स को 157.7 पीपीएम पर केंद्रित करें, जो [13 सी] बाइकार्बोनेट सिग्नल (161.1पीपीएम) का 214 हर्ट्ज डाउन-फील्ड है; इसके परिणामस्वरूप [1-13सी]पाइरूवेट से [13 सी] बाइकार्बोनेट के सी 1 सिग्नल के लिए 0.139का सिग्नल तीव्रता अनुपात (बीआईसी) होता है।

8. ऊतक गीले वजन और मात्रा का निर्धारण

  1. प्रयोग के अंत में, छिड़काव प्रणाली से दिल को अलग करें, और धीरे से इसे टिशू पेपर से सुखाएं। इसके बाद, ऊतक गीला वजन प्राप्त करने के लिए दिल का वजन करें।
  2. 1.05 ग्राम / सेमी 3 के घनत्व कारक का उपयोग करके हृदय की मात्रा निर्धारित करें, जैसा कि माउस हृदय30 के लिए पहले निर्धारित कियागया था।

9. एटीपी सामग्री परिमाणीकरण

  1. एटीपी मानक नमूने के एकल अधिग्रहण के γ-एटीपी सिग्नल और पृथक हृदय के 30 मिनट अधिग्रहण (1.1 एस और 1,640 अधिग्रहण का टीआर) को एकीकृत करें।
  2. हृदय के γ-एटीपी संकेत के अभिन्न अंग की तुलना मानक (सामग्री की तालिका) से करके हृदय की एटीपी सामग्री की मात्रा निर्धारित करें, जहां उत्तरार्द्ध में एक ज्ञात एकाग्रता (105 एमएम) है, और अधिग्रहण और विश्राम प्रभावों की संख्या के लिए सही है।

10. दिल के पाई सिग्नल को हल करना

नोट: ऊतक पीएच का मूल्यांकन करने के लिए, सबसे पहले कुल पाई सिग्नल (पाईटी) से दिल के पाई सिग्नल को अलग करना आवश्यक है। यह पीईटी से केएचबी पाई (पाईकेएच) के संकेत को छोड़कर किया जाताहै।

  1. केएचबी के 31पी स्पेक्ट्रम में जो एक एकल पाई सिग्नल (पाईकेएच, चित्रा 1 ए) दिखाता है, पाईकेएच सिग्नल को एक्सेल (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके लोरेंत्ज़ियन फ़ंक्शन में फिट करता है।
  2. एनएमआर जांच (वीपी, 1.375 एमएल) को दिखाई देने वाली मात्रा में अधिक केएचबी होता है जब नमूना ट्यूब में हृदय नहीं होता है। इस भरने के प्रभाव को सही करने के लिए, समीकरण 1 ए का उपयोग करके क्षीण बफर सिग्नल (पीआईबी) की गणना करें।
    Equation 1Eq. 1A
    जहां वीएच दिल की मात्रा है, जैसा कि चरण 8 में निर्धारित किया गया है।
  3. इस संकेत को समीकरण 1B के अनुसार Pit से घटाएं ताकि पूरी तरह से संक्रमित हृदय से उत्पन्न पाई संकेत प्राप्त किया जा सके (Pih, चित्र 1B)।
    Equation 2Eq. 1B

11. मल्टी-पैरामीट्रिक पीएच विश्लेषण

  1. समीकरण 231 का उपयोग करके पीसीआर के रासायनिक बदलाव के संदर्भ में पाईएच सिग्नल रासायनिक शिफ्ट वितरण को पीएच में परिवर्तित करें।
    Equation 3समीकरण 2
    जहां रासायनिक बदलाव अंतर है, पीकेए 6.72 है, δ मुक्त आधार 5.69 है, और δ मुक्त एसिड 3.27 है, जैसा कि पहले वर्णित31 है।
  2. लुत्ज़ एट अल.32 के अनुसार पाईएच रासायनिक शिफ्ट स्केल और पीएच स्केल के बीच गैर-रैखिकता के लिए परिणामी पीएच वितरण वक्र को सही करें। इस गणना के परिणामस्वरूप एक विशिष्ट पीएच वितरण चित्रा 1 सी में प्रस्तुत किया गया है।
  3. लुत्ज़ एट अल के काम के बाद सात सांख्यिकीय मापदंडों का उपयोग करके एक बहु-पैरामीट्रिक दृष्टिकोण के साथ ऊतक पीएच वितरण का विश्लेषण करें। 32. इनमें से चार पैरामीटर यहां प्रस्तुत किए गए हैं क्योंकि वे ऊतक पीएच के सबसे वर्णनात्मक प्रतीत होते हैं: 1) वैश्विक अधिकतम पीएच; 2) भारित औसत पीएच; 3) भारित औसत पीएच; और 4) पीएच प्लॉट का तिरछापन (चित्रा 1 सी)।

12. एलडीएच और पीडीएच गतिविधियों की गणना

नोट: हाइपरपोलराइज्ड मेटाबोलाइट्स [1-13 सी] लैक्टेट और [13सी] बाइकार्बोनेट की उत्पादन दर का उपयोग क्रमशः एलडीएच और पीडीएच गतिविधियों की गणना करने के लिए किया जाता है। उत्पाद चयनात्मक संतृप्त-उत्तेजना दृष्टिकोण15 में, प्रत्येक चयनात्मक उत्तेजना द्वारा केवल नए संश्लेषित हाइपरपोलराइज्ड मेटाबोलाइट्स का पता लगाया जाता है।

  1. संबंधित मेटाबोलाइट उत्पादन स्तर निर्धारित करने के लिए संदर्भ के रूप में हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट सिग्नल का उपयोग करें।
    1. हाइपरपोलराइज्ड माध्यम के साथ छिड़काव के दौरान, एनएमआर ट्यूब में [1-13सी] पाइरूवेट एकाग्रता बढ़ जाती है (वॉश-इन), फिर पठार (14 एमएम की अधिकतम एकाग्रता पर), और फिर कम हो जाती है (वॉश-आउट)।
    2. उन समय बिंदुओं की पहचान करने के लिए जिन पर पाइरूवेट एकाग्रता एक स्थिर स्तर (पठार) तक पहुंच गई थी, प्रभावी विश्राम स्थिरांक, टी एफ का उपयोग करके टी 1 विश्राम और आरएफ स्पंदन के परिणामस्वरूप सिग्नल क्षय के लिए [1-13 सी] पाइरूवेट सिग्नलको सही करें।
    3. प्रत्येक इंजेक्शन के लिए, इस प्रवाह गतिशीलता (Eq.3) को दिखाने के लिए [1-13C] पाइरूवेट क्षय वक्र को सही करने की क्षमता के आधार पर Teff को परिभाषित करें।
      Equation 4समीकरण 3
      [1-13सी] पाइरूवेट सिग्नल कहां Equation 5 है जिसे [13सी] बाइकार्बोनेट अधिग्रहण के दौरान अधिग्रहित किया गया था। यहां वर्णित प्रयोगों में औसत टीएफ 35.8 एस ± 2.3 एस (एन = 5 दिल) पाया गया था।
    4. आगे के विश्लेषण के लिए उन डेटा बिंदुओं का चयन करें जिनमें एकाग्रता अधिकतम सही [1-13सी] पाइरूवेट सिग्नल के 10% के भीतर है।
  2. समीकरण 4 ए और ईक्यू 4 बी का उपयोग करके मेटाबोलाइट उत्पादन दरों की गणना के लिए चरण 12.1 में चुने गए समय बिंदुओं के लिए [1-13 सी] लैक्टेट और [13सी] बाइकार्बोनेट उत्पादन के संबंधित डेटा का उपयोग करें, बशर्ते कि मेटाबोलाइट सिग्नल का एसएनआर 2 (विश्लेषण के लिए सीमा) से बड़ा हो। समय बिंदुओं के इस तरह के चयन का एक विशिष्ट उदाहरण चित्रा 2 बी (हाइलाइट की गई अस्थायी विंडो) में दिखाया गया है।
  3. Eq. 4A और Eq. 4B का उपयोग करके चयनित डेटा बिंदुओं में से प्रत्येक की उत्पादन दर की गणना करें:
    Equation 17Eq. 4A
    Equation 6Eq. 4B
    Equation 8 प्रत्येक समय बिंदु पर क्रमशः [1-13सी] लैक्टेट या [13सी] बाइकार्बोनेट की उत्पादन दरें कहां Equation 7 और हैं, Equation 9 और Equation 10 ऐसे कारक हैं जो क्रमशः [1-13 सी] पाइरूवेट और उत्पादों [1-13 सी] लैक्टेट या [13सी] बाइकार्बोनेट के सापेक्ष उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन कारकों को पहले क्रमशः 0.113 और 0.139,29 निर्धारित किया गया था। वीपी वह मात्रा है जो एनएमआर जांच (1.375 एमएल) द्वारा पता लगाया जाता है, टीआर दो लगातार उत्पाद चयनात्मक संतृप्त उत्तेजनाओं (प्रत्येक उत्पाद Equation 11 के लिए 12 सेकंड) के बीच समय अंतराल को दर्शाता है, और Equation 12 क्रमशः [1-13सी] लैक्टेट और [13सी] बाइकार्बोनेट के संकेत हैं, और Equation 13 Equation 14 [1-13 सी] पाइरूवेट के संकेत हैं जो [1-13 सी] लैक्टेट और [13 सी] लैक्टेट और [13सी] के दौरान प्राप्त किए गए थे। सी]बाइकार्बोनेट उत्तेजना, क्रमशः। [पायर] [1-13सी] पाइरूवेट एकाग्रता है, जो पठार चरण के दौरान 14 एमएम थी।
    1. प्रत्येक बिंदु के लिए दर निर्धारित करें और फिर प्रति हाइपरपोलराइज्ड इंजेक्शन का औसत।

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Representative Results

केएचबी के साथ और अकेले बफर से जुड़े माउस हार्ट से रिकॉर्ड किए गए 31पी स्पेक्ट्रा को चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। दिल में α-, β-, और γ-एटीपी, पीसीआर और पाई के संकेत देखे गए। पाई सिग्नल दो मुख्य घटकों से बना था: उच्च क्षेत्र (सिग्नल के बाईं ओर) में, पाई सिग्नल ज्यादातर 7.4 के पीएच पर केएचबी के कारण था; निचले क्षेत्र (सिग्नल के दाईं ओर) में, पाई सिग्नल अधिक अम्लीय वातावरण के कारण व्यापक और कम सजातीय था। बाद का पैटर्न हृदय ऊतक से उत्पन्न होता है। कार्डियक टिशू पाई सिग्नल को केएचबी (चित्रा 1 बी) के पाई सिग्नल को घटाकर निकाला जाता है और फिर पीपीएम स्केल से पीएच स्केल (चित्रा 1 सी) में परिवर्तित किया जाता है। पीएच की जांच भारित माध्य, भारित माध्य, वैश्विक अधिकतम और तिरछापन (चित्रा 1 सी) की गणना करके ऊतक पाई सिग्नल के बहु-पैरामीट्रिक विश्लेषण का उपयोग करके की जाती है।

Figure 1
चित्र 1: विशिष्ट 31P स्पेक्ट्रा, KHB और हृदय के Pi सिग्नल के बीच का अंतर, रासायनिक बदलाव से pH अक्षों में रूपांतरण, और pH वितरण के सांख्यिकीय पैरामीटर। (A) ऊपरी पैनल स्पेक्ट्रोमीटर में KHB के साथ जुड़े माउस हार्ट से प्राप्त एक विशिष्ट 31P NMR स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करता है, जबकि निचला पैनल अकेले केएचबी से प्राप्त स्पेक्ट्रम दिखाता है। डैश-चिह्नित वर्णक्रमीय क्षेत्र को पैनल बी में बढ़ाया गया दिखाया गया है। संक्षिप्तीकरण: पाई = अकार्बनिक फॉस्फेट; पीसीआर = फॉस्फोक्रिएटिन; एटीपी = एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट; एडीपी = एडेनोसिन डाइफॉस्फेट। (बी) मूल स्पेक्ट्रम काले (पाई टी) मेंदिखाया गया है; डैश्ड वक्र केवल बफर (पाई बी) से पाई सिग्नलदिखाता है। उत्तरार्द्ध को पीईटी सिग्नल के संबंधित केएचबी घटक परइसके केंद्र के साथ एक लोरेंत्ज़ियन लाइन आकार फिट करके और हृदय सम्मिलन के बाद जांच में केएचबी की मात्रा के लिए समायोजित करके प्राप्त किया गया था (ईक्यू 1 ए के अनुसार)। दिल (पाईएच) के लिए जिम्मेदार पाई सिग्नल को नारंगी रंग में दिखाया गया है, और यह पाई टी सिग्नल (समीकरण 1 बी के अनुसार) से पाईबी सिग्नल को घटाकर प्राप्तकिया जाता है। (सी) पीएच सिग्नल रासायनिक शिफ्ट वितरण का रूपांतरण (बी) में पीएच वितरण और बहु-पैरामीट्रिक पीएच विश्लेषण में। रासायनिक बदलाव और पीएच तराजू के बीच गैर-रैखिकता को पहले वर्णित32 के रूप में ठीक किया गया था। बहु-पैरामीट्रिक पीएच विश्लेषण के परिणाम ऊर्ध्वाधर रेखाओं द्वारा चिह्नित हैं। इस विशिष्ट वितरण के लिए, सांख्यिकीय मापदंडों के मान प्रदान किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हाइपरपोलराइज्ड उत्पाद चयनात्मक संतृप्त-उत्तेजना अधिग्रहण दृष्टिकोण15 के साथ, एलडीएच और पीडीएच एंजाइम गतिविधियों का पूर्ण परिमाणीकरण करना संभव है। चित्रा 2 इस निर्धारण के लिए आवश्यक अधिग्रहण और प्रसंस्करण चरणों को सारांशित करता है। तालिका 1 पांच अलग-अलग दिलों में एटीपी सामग्री और एलडीएच और पीडीएच दरों को दर्शाती है। प्रत्येक हृदय की एटीपी सामग्री के लिए एलडीएच और पीडीएच गतिविधियों को सामान्य करने से समूह भर में एलडीएच और पीडीएच मापों में परिवर्तनशीलता कम हो गई, जैसा कि तालिका 1 में एंजाइम गतिविधि कॉलम में देखा जा सकता है, जो एनएमओएल / एस / एसएमओएल एटीपी की इकाइयों में व्यक्त किए जाते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: हाइपरपोलराइज्ड 13सी एमआरएस प्रसंस्करण और [1-13सी] पाइरूवेट चयापचय का विश्लेषण। (ए) प्रतिनिधि 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रा ने 14 एमएम हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट के इंजेक्शन के दौरान उत्पाद चयनात्मक संतृप्त-उत्तेजना दृष्टिकोण के साथ प्राप्त किया। सिग्नल असाइनमेंट: 1 = [1-13सी] लैक्टेट (183.2 पीपीएम); 2 = [1-13सी] पाइरूवेट (171 पीपीएम); 3 = [13सी] बाइकार्बोनेट (161.1 पीपीएम); * = [1-13सी] पाइरूवेट फॉर्मूलेशन33 से उत्पन्न अशुद्धियाँ। (बी) ए में प्रदर्शित हाइपरपोलराइज्ड सिग्नल तीव्रता का समय पाठ्यक्रम। [1-13 सी] पाइरूवेट (ग्रे) की एकीकृत तीव्रता को टी1क्षय और आरएफ स्पंदन के लिए 32 एस (काले) के टीएफ समय स्थिरांक के साथ समायोजित किया गया था, और इससे सब्सट्रेट (वॉश-इन, पठार, वॉश-आउट) के लिए अपेक्षित प्रवाह गतिशीलता उत्पन्न हुई। आगे का विश्लेषण उस समय विंडो के भीतर डेटा बिंदुओं पर किया गया था जिसमें समायोजित [1-13सी] पाइरूवेट सिग्नल ने एनएमआर ट्यूब में एक निरंतर और अधिकतम [1-13सी] पाइरूवेट एकाग्रता दिखाई (हल्के नीले रंग में हाइलाइट किया गया)। चयनित समय बिंदुओं के लिए एलडीएच और पीडीएच (Equation 18औरEquation 19) की उत्पादन दरों की गणना समीकरण 4 ए और ईक्यू 4 बी के अनुसार की गई और फिर औसत किया गया। इस इंजेक्शन (Equation 1और Equation 1 ) के लिए औसत मान nmol / s की इकाइयों में प्रदान किए जाते हैं। प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए, समायोजित [1-13सी] पाइरूवेट, [1-13सी] लैक्टेट, और [13सी] बाइकार्बोनेट को क्रमशः 0.143, 10 और 80 से गुणा किया गया था, जो [1-13सी] पाइरूवेट सिग्नल के सापेक्ष था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

दिल नं. ATP (μmol) LDH दर (nmol/s) PDH दर (nmol/s) LDH दर (nmol/s/μmol ATP) PDH दर (nmol/s/μmol ATP)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
माध्य (SD) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
SD % माध्य 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

तालिका 1: पांच दिलों में एटीपी सामग्री और एलडीएच और पीडीएच दरें। संक्षेप: एसडी = मानक विचलन; एसडी % माध्य = माध्य से मानक विचलन का प्रतिशत।

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Discussion

हम एक प्रयोगात्मक सेटअप का प्रदर्शन करते हैं जिसे एक पृथक माउस हृदय मॉडल में हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट चयापचय, ऊतक ऊर्जावान और पीएच की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम निम्नानुसार हैं: 1) यह सुनिश्चित करना कि बफर का पीएच 7.4 है; 2) यह सुनिश्चित करना कि बफर के सभी घटक शामिल हैं; 3) हेपरिन इंजेक्शन द्वारा हृदय वाहिकाओं में रक्त के थक्के से बचना; 4) चयापचय गतिविधि (केसीएल इंजेक्शन और बर्फ-ठंडा बफर) को कम करके हृदय को इस्केमिक क्षति से बचना; 5) प्रक्रिया के किसी भी बिंदु पर दिल में हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचें; 6) ऊतक के रंग से महाधमनी के सफल प्रवेशनी को मान्य करना, जो गहरे लाल से हल्के गुलाबी रंग में बदल जाता है; 7) यह सुनिश्चित करना कि दिल को गर्म बफर में ले जाने के बाद छिड़काव निरंतर हो; 8) दिल के बगल में स्पेक्ट्रोमीटर में एनएमआर ट्यूब के अंदर तापमान की बारीकी से निगरानी करना और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रखना; 9) पूरे माप में चुंबकीय क्षेत्र समरूपता की जांच करना; और 10) आरएफ दालों के लिए सटीक और अद्यतन अंशांकन का उपयोग करना।

तकनीक के संशोधन और समस्या निवारण
हम इस अध्ययन में किए गए कुछ संशोधनों पर ध्यान देते हैं: 1) सर्जरी के लिए बर्फ-ठंडे केएचबी के साथ छिड़काव की शुरुआत दिल की रक्षा के लिए नियोजित की गई थी; और 2) बफर पीएच का सत्यापन यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि यह पैरामीटर नियंत्रण में था और परिणामों में भिन्नता का स्रोत नहीं था। यह पीएच मीटर, पीएच संकेतक स्ट्रिप्स और 31पी स्पेक्ट्रम पर पाई सिग्नल का उपयोग करके तैयारी और प्रयोग के विभिन्न चरणों में किया गया था।

परिवर्तनशीलता के स्रोत और उनके लिए सही कैसे करें
माउस दिल को 10 मिमी एनएमआर ट्यूब में फिट करने के लिए चुना गया था। हालांकि, यह छोटा दिल कम संकेत प्रदान करता है, और दिल को अलग करने और फैलाने के लिए नाजुक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया चुनौतीपूर्ण है। कुल मिलाकर, यह परिवर्तनीय ऊतक व्यवहार्यता और चयापचय गतिविधि की ओर जाता है। इस परिवर्तनशीलता को ध्यान में रखते हुए, हमने एलडीएच और पीडीएच की चयापचय दरों को एटीपी सामग्री (यानी, मोल / एस / एटीपी) में सामान्यीकृत किया। संदर्भ के रूप में एटीपी सामग्री का एक समान उपयोग पहले जेनोग्राफ्ट स्तन ट्यूमर स्लाइस29 में रिपोर्ट किया गया था। इस प्रकार का सामान्यीकरण फायदेमंद है क्योंकि यह अन्य शोधकर्ताओं के परिणामों और अन्य स्थितियों के साथ तुलना करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एटीपी राशि से ऊतक द्रव्यमान में रूपांतरण कारक का उपयोग करके, कोई प्रति ऊतक वजन (ऊतक के लिए जिसमें चयापचय होता है) एंजाइमेटिक गतिविधि प्राप्त कर सकता है।

विभिन्न पृथक हृदय तैयारी (यानी, विभिन्न जानवरों से) के बीच परिवर्तनशीलता के अलावा, ऊतक पाई (पाईएच) रासायनिक बदलाव ने इस अध्ययन में एक गैर-सजातीय वितरण दिखाया। लुत्ज़ एट अल .32 ने जेनोग्राफ्ट ट्यूमर में एक समान गैर-सजातीय वितरण का प्रदर्शन किया, और इस वितरण का विश्लेषण बहु-पैरामीट्रिक दृष्टिकोण का उपयोग करके किया गया था। इस काम में, इस पद्धति को परफ्यूज्ड माउस हार्ट में लागू किया गया था। हम ध्यान दें कि यह संभावना है कि पाईएच सिग्नल मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर पीएच पर रिपोर्ट करता है, जैसा कि पहले16 इंगित किया गया था।

अनिश्चितता
परिमाणीकरण Equation 18 Equation 19 में एक अंतर्निहित धारणा यह है कि हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट समाधान एनएमआर जांच (वीपी, ईक्यू 4 ए और ईक्यू 4 बी) द्वारा पता लगाए गए पूरे वॉल्यूम को भर रहा है। हाइपरपोलराइज्ड [1-13सी] पाइरूवेट समाधान बाह्य और इंट्रासेल्युलर डिब्बों को भरने के लिए हृदय की कोरोनरी धमनियों के माध्यम से बहता है। इसलिए, हृदय की मात्रा को हाइपरपोलराइज्ड समाधान से उसी हद तक भरा हुआ माना जाता है जिस हद तक बाकी वीपी।

हाइपरपोलराइज्ड उत्पाद चयनात्मक संतृप्ति-उत्तेजना दृष्टिकोण15,29 का उपयोग करके, एंजाइमैटिक गतिविधि को मेटाबोलाइट्स के टी1 में किसी भी भिन्नता और एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की रिवर्सबिलिटी से स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जा सकता है। यह निर्धारण मजबूत है और टी 1 और उत्तेजना प्रोफाइल में भिन्नताओं के लिए प्रतिरक्षा है और वक्र विश्लेषणके तहत क्षेत्र की तुलना में प्रयोगशालाओं में अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, जो प्रत्येक प्रयोगशाला में विशिष्ट अधिग्रहण स्थितियों और सेटअप पर निर्भर हैं।

पाइरूवेट चयापचय की जांच, जो एरोबिक और एनारोबिक चयापचय के चौराहे पर है, हाइपोक्सिया, इस्किमिया, चोट, भुखमरी और हृदय चयापचय में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, जैसे कि मधुमेह कार्डियोमायोपैथी में। हाइपरपोलराइज्ड 13सी-लेबल पाइरूवेट एनालॉग्स का चिकित्सकीय रूप से परीक्षण किया गया है 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, और इसलिए, ऐसे अध्ययनों के परिणाम ट्रांसलेशनल होने की संभावना है। सबसे महत्वपूर्ण बात, हमारा दृष्टिकोण पूरे अंग में इन-सेल एंजाइम गतिविधि की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है।

पृथक कृंतक हृदय की तैयारी और इस शोध में शामिल प्रक्रियाओं और पद्धतियों से हृदय समारोह, ऊर्जावान और चयापचय पर विभिन्न प्रकार के तनावों के प्रभाव की समझ को आगे बढ़ाने में मदद मिलेगी, क्योंकि इस मॉडल में मापा गया मापदंडों को पूरी तरह से हृदय के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। चूहे के दिल के विपरीत, माउस दिल ट्रांसजेनिक मॉडल का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

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Disclosures

कोई खुलासा नहीं किया गया है।

Acknowledgments

इस परियोजना को अनुदान समझौते संख्या 1379/18 के तहत इज़राइल साइंस फाउंडेशन से धन प्राप्त हुआ; डीएस के लिए प्रत्यक्ष पीएचडी छात्रों के लिए एप्लाइड और इंजीनियरिंग विज्ञान के लिए इजरायल के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय की जाबोटिंस्की छात्रवृत्ति नंबर 3-15892; और अनुदान समझौते नंबर 858149 (ऑल्टरनेटिव्सटूजीडी) के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

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References

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Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

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