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Bioengineering

सरलीकृत, उच्च थ्रूपुट विश्लेषण एकल-सेल संकुचितता का उपयोग कर Micropatterned Elastomers का उपयोग कर

Published: April 8, 2022 doi: 10.3791/63211
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Forcyte Biotechnologies, 2University of California, Los Angeles

Summary

यह काम फ्लोरोसेंट प्रोटीन माइक्रोपैटर्न के विज़ुअलाइज़्ड विस्थापन के आधार पर एकल-सेल संकुचनशील बलों के सरलीकृत, हाथों से परिमाणीकरण के लिए माइक्रोवेल प्रारूप में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले इलास्टोमेरिक अनुबंधयोग्य सतहों (FLECS) प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए एक लचीला प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

Abstract

सेलुलर संकुचनशील बल उत्पादन लगभग सभी कोशिकाओं द्वारा साझा की जाने वाली एक मौलिक विशेषता है। ये संकुचनशील बल उचित विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं, दोनों सेलुलर और ऊतक स्तरों पर कार्य करते हैं, और शरीर में यांत्रिक प्रणालियों को विनियमित करते हैं। कई जैविक प्रक्रियाएं बल-निर्भर हैं, जिनमें गतिशीलता, आसंजन और एकल-कोशिकाओं का विभाजन, साथ ही हृदय, मूत्राशय, फेफड़े, आंतों और गर्भाशय जैसे अंगों का संकुचन और विश्राम शामिल है। उचित शारीरिक कार्य को बनाए रखने में इसके महत्व को देखते हुए, सेलुलर संकुचन भी अतिरंजित या बाधित होने पर रोग प्रक्रियाओं को चला सकता है। अस्थमा, उच्च रक्तचाप, अपरिपक्व श्रम, फाइब्रोटिक स्कारिंग, और अंडरएक्टिव मूत्राशय यांत्रिक रूप से संचालित रोग प्रक्रियाओं के सभी उदाहरण हैं जिन्हें संभावित रूप से सेलुलर संकुचनशील बल के उचित नियंत्रण के साथ कम किया जा सकता है। यहां, हम एक उपन्यास माइक्रोप्लेट-आधारित संकुचन परख प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे फ्लोरोसेंटली लेबल वाले इलास्टोमेरिक अनुबंध योग्य सतहों (FLECS) के रूप में जाना जाता है, जो बड़े पैमाने पर स्केल किए गए तरीके से एकल-सेल संकुचन का सरलीकृत और सहज ज्ञान युक्त विश्लेषण प्रदान करता है। यहां, हम दो छह-बिंदु खुराक-प्रतिक्रिया घटता प्राप्त करने के लिए एक चरण-वार प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो प्राथमिक मानव मूत्राशय चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के संकुचन पर दो संकुचनशील अवरोधकों के प्रभावों का वर्णन करते हैं, जो एक सरल प्रक्रिया में केवल एक ही FLECS परख माइक्रोप्लेट का उपयोग करते हैं, विधि के उपयोगकर्ताओं के लिए उचित तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए। FLECS प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए, बुनियादी जैविक प्रयोगशालाओं और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी सिस्टम वाले सभी शोधकर्ताओं को इस मौलिक लेकिन मुश्किल-से-मात्रा में कार्यात्मक सेल फेनोटाइप का अध्ययन करने के लिए पहुंच प्राप्त होती है, जो बल जीव विज्ञान के क्षेत्र में प्रवेश बाधा को प्रभावी ढंग से कम करती है और संकुचनशील सेल बल की फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग करती है।

Introduction

कोशिका-जनित यांत्रिक बल पूरे शरीर में विभिन्न अंगों जैसे आंतों, मूत्राशय, हृदय और अन्य में उचित कार्य करने के लिए आवश्यक हैं। इन अंगों को आंतरिक होमोस्टेटिक स्थिति को बनाए रखने के लिए सेल संकुचन और विश्राम के स्थिर पैटर्न उत्पन्न करना चाहिए। असामान्य चिकनी मांसपेशी कोशिका (एसएमसी) संकुचन विभिन्न विकारों की शुरुआत का कारण बन सकता है, उदाहरण के लिए, आंतों की डिस्मोटिलिटी, आंतों के चिकनी मांसपेशियों के संकुचन 1 के असामान्य पैटर्न की विशेषता है, साथ ही साथ ओवरएक्टिव 2 या अंडरएक्टिव मूत्राशय 3 की यूरोलॉजिक स्थितियां। वायुमार्ग के भीतर, एसएमसी जो अनियमित संकुचन पैटर्न प्रदर्शित करते हैं, अस्थमा के हाइपररेस्पॉन्सिबिलिटी 4 को ट्रिगर कर सकते हैं, संभावित रूप से वायुमार्ग को कस सकते हैं और फेफड़ों में ऑक्सीजन के एयरफ्लो को कम कर सकते हैं। एक और व्यापक शारीरिक स्थिति, उच्च रक्तचाप, रक्त वाहिकाओं के भीतर चिकनी मांसपेशियों के संकुचन में उतार-चढ़ाव के कारण होता है5। स्पष्ट रूप से, कोशिकाओं और ऊतकों के भीतर संकुचनशील तंत्र उन बीमारियों को जन्म दे सकते हैं जिनके लिए उपचार के विकल्पों की आवश्यकता होती है। जैसा कि ये स्थितियां स्पष्ट रूप से कोशिकाओं के बेकार संकुचनशील व्यवहारों से स्टेम करती हैं, संभावित दवा उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग करते समय सेल संकुचनशील फ़ंक्शन को मापने के लिए तार्किक और आवश्यक हो जाता है।

सेलुलर संकुचन बल का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की आवश्यकता को पहचानते हुए, कई मात्रात्मक संकुचन परख विधियों को शैक्षिक शोधकर्ताओं द्वारा विकसित किया गया है, जिसमें कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) 6, माइक्रोपैटर्न्ड टीएफएम 7, फ्लोटिंग जेल assays8, और इलास्टोमेरिक माइक्रोपोस्ट assays9 शामिल हैं। इन प्रौद्योगिकियों का उपयोग कई अध्ययनों में एकल-डिश प्रारूप के साथ-साथ बहु-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में किया गया है और यहां तक कि तीन आयामी बल माप 10,11,12,13,14 के लिए भी प्रस्तावित किया गया है। हालांकि इन प्रौद्योगिकियों ने सेल फोर्स जीव विज्ञान के विशाल क्षेत्र के भीतर अग्रणी अनुसंधान को सक्षम किया है, वे सभी काफी हद तक विशिष्ट क्षमताओं और संसाधनों वाले प्रयोगशालाओं तक सीमित हैं, विशेष रूप से: टीएफएम सब्सट्रेट बनाने की क्षमता, टीएफएम विस्थापन मानचित्रों को हल करने के लिए जटिल और गैर-सहज ज्ञान युक्त एल्गोरिदम को ठीक से लागू करने की क्षमता, और अपेक्षाकृत सटीक माइक्रोस्कोपी सिस्टम जो मंच से नमूना हटाने से पहले और बाद में ली गई छवियों को पंजीकृत कर सकते हैं (सेल पृथक्करण के लिए)। इस प्रकार, एक अप्रशिक्षित शोधकर्ता के लिए, इन तरीकों का उपयोग करने के लिए प्रवेश बाधा इन प्रौद्योगिकियों को लागू करने के लिए आवश्यकताओं के व्यापक सेट को देखते हुए काफी अधिक हो सकती है। इसके अलावा, कई मौजूदा प्रौद्योगिकियों (40x उद्देश्यों या उससे अधिक) के लिए आवश्यक इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन प्रयोगात्मक थ्रूपुट को काफी सीमित कर सकता है, जबकि थोक माप प्रौद्योगिकियां बाहरी कोशिकाओं से योगदान को मुखौटा कर सकती हैं और हल्के संकुचनशील मतभेदों की खोज को रोक सकती हैं। ध्यान दें, जहां तक लेखकों को पता है, केवल कम थ्रूपुट और अर्ध-मात्रात्मक फ्लोटिंग जेल परख दृष्टिकोण शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध होने के लिए पर्याप्त रूप से परिपक्व हो गया है (चित्रा 1 देखें)।

Figure 1
चित्र1: FLECS प्रौद्योगिकी विधि की समग्र योजनाबद्ध. (A) कोशिकाओं को चिपकने वाले प्रोटीन माइक्रोपैटर्न का पालन किया जाता है जो कांच द्वारा समर्थित एक पतली इलास्टोमेरिक परत में सहसंयोजक रूप से एम्बेडेड होते हैं। (बी) विभिन्न संभावित माइक्रोपैटर्न आकृतियों का शीर्ष दृश्य और एक 'एक्स' के आकार के माइक्रोपैटर्न को अनुबंधित करने वाले सेल का एक झटका। (सी) फ्लोरोसेंट माइक्रोपैटर्न का ओवरले और एक अनुबंधित सेल की चरण कंट्रास्ट छवियां। (डी) एक एकल अनुबंध सेल की समय-पाठ्यक्रम छवियां। स्केल सलाखों = 25 μm. यह आंकड़ा पुष्करस्की एट अल 15 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

माइक्रोटेक्नोलॉजी में हाल की प्रगति के बाद, लेखकों ने एक माइक्रोप्लेट-आधारित तकनीक विकसित की है जो सैकड़ों हजारों कोशिकाओं में एकल-सेल संकुचन के मात्रात्मक माप को सक्षम करती है जिसे FLECS कहा जाता है (फ्लोरोसेंटली लेबल वाली इलास्टोमेरिक अनुबंध योग्य सतहें)15,16,17,18,19,20 , टीएफएम के विकल्प के रूप में। इस दृष्टिकोण में, फ्लोरोसेंट प्रोटीन माइक्रोपैटर्न को नरम फिल्मों में एम्बेडेड किया जाता है जो विकृत और सिकुड़ते हैं जब कोशिकाएं उन पर कर्षण बलों को लागू करती हैं, एक सहज और औसत दर्जे के तरीके से। महत्वपूर्ण रूप से, प्रोटीन माइक्रोपैटर्न कोशिका की स्थिति, आकार और प्रसार क्षेत्र को बाधित करते हैं, जिससे समान परीक्षण की स्थिति होती है। ये केवल अपने आयामी परिवर्तनों के आधार पर सरल माप की अनुमति देते हैं, जो 4x आवर्धन छवियों में भी स्थानिक रूप से अत्यधिक हल किए जाते हैं। इस विधि में एक ब्राउज़र-आधारित छवि विश्लेषण मॉड्यूल शामिल है और नाजुक हैंडलिंग प्रक्रियाओं या प्रत्ययी मार्करों के पंजीकरण की आवश्यकता के बिना संकुचनशील सेल बल के सीधे विश्लेषण को सक्षम बनाता है, जैसे कि इसे किसी भी शोधकर्ता द्वारा एक बुनियादी सेल संस्कृति सुविधा और कम आवर्धन के साथ सरल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ संचालित किया जाना चाहिए (चित्रा 2) ). यह तकनीक, जो शेल्फ-तैयार और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, को अंतिम उपयोगकर्ता को ध्यान में रखते हुए डिज़ाइन किया गया था और इसका उद्देश्य सेलुलर बल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला वैज्ञानिक के लिए प्रवेश बाधा को कम करना है।

Figure 2
चित्रा 2: एकल सेल contractility परख के लिए 24 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप की योजनाबद्ध. इस प्रारूप का उपयोग यहां वर्णित प्रयोगों में किया गया था और लेख के वीडियो भाग में चित्रित किया गया था। स्केल बार = 25 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

इस काम में, हम प्राथमिक मूत्राशय चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में सेलुलर संकुचन पर बल-मॉड्यूलेटिंग दवाओं के प्रभावों को मापने के लिए FLECS प्रौद्योगिकी मंच के 24 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस सामान्य उद्देश्य प्रोटोकॉल को विभिन्न अन्य टाइमस्केल, सेल-प्रकार, और ब्याज की उपचार स्थितियों के लिए खाते में आवश्यक रूप से अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है, और बल जीव विज्ञान में अन्य प्रश्नों के उत्तर देने के लिए स्केल किया जा सकता है।

Protocol

1. दिन 1: 24 अच्छी तरह से प्लेट की तैयारी

  1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल संस्कृति माध्यम के 20 मिलीलीटर जोड़कर प्रक्रिया शुरू करें। इस प्रयोग में, F12 हैम के आधारित माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक का उपयोग किया जाता है।
  2. परख सेल contractility के लिए डिज़ाइन किया गया एक 24 अच्छी तरह से प्लेट प्राप्त करें। पिपेट को 500 μL पर सेट करें और सेल पासिंग के लिए एक सेल छलनी प्राप्त करें।
    नोट: प्लेट अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है।
  3. प्लेट को एक हाथ में उठाकर पकड़ें और प्लेट के ऊपर से प्लास्टिक की फिल्म को धीरे से छीलने के लिए आगे बढ़ें। फिर ध्यान से प्लेट को वापस नीचे सेट करें।
  4. एक वैक्यूम एस्पिरेटर को चालू करें और फैलने से रोकने के लिए कुओं से फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) की शीर्ष परत को एस्पिरेट करें। PBS को एक समय में एक पंक्ति निकालें। एक बार जब कुएं पूरी तरह से भरे नहीं हैं, तो प्लेट को एक हाथ में पकड़ें और पीबीएस के बाकी हिस्सों को कुओं से सावधानीपूर्वक हटा दें। जल्दी से सेल संस्कृति माध्यम के 500 μL के साथ भरें। एस्पिरेटर और कुएं के नीचे के बीच संपर्क से बचने के लिए ध्यान रखें।
  5. प्लेट को धीरे से हिलाएं और यह सुनिश्चित करने के लिए पक्ष पर टैप करें कि कुएं के पूरे तल को समाधान के साथ कवर किया गया है। एक बार जब सभी कुओं को मध्यम से भर दिया जाता है, तो प्लेट को किनारे पर सेट करें।

2. दिन 1: सेल सीडिंग

  1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से मार्ग 7 या कम प्राथमिक मानव मूत्राशय चिकनी मांसपेशी (बीएसएम) कोशिकाओं के साथ संस्कृति फ्लास्क को पुनर्प्राप्त करें। माइक्रोस्कोप के तहत, सेल आकृति विज्ञान की जांच करें और यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं कम से कम 90% confluency तक बढ़ गई हैं, लेकिन 100% confluency से कम हैं।
  2. सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल का संचालन करें। एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर, कोशिकाओं को 2.5 मिनट के लिए ट्रिप्सिनाइज़ करें जब तक कि सीरम-पूरक माध्यम (10% एफबीएस) के साथ उन्हें बुझाने से पहले कोशिकाओं को अलग नहीं किया जाता है।
  3. एक बार कोशिकाओं को अलग करने के बाद, कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें और सीरम-पूरक माध्यम में सेल निलंबन को लगभग 50,000 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें। महत्वपूर्ण रूप से, कोशिकाओं को माइक्रोपैटर्न से जुड़ने के लिए कम से कम 2% सीरम की आवश्यकता होती है।
  4. सीडिंग से पहले, तेजी से एक 40 या 100 μm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ तनाव दें ताकि कोशिकाओं के झुरमुट को एकल कोशिकाओं में विभाजित किया जा सके।
  5. ध्यान से 50,000 कोशिकाओं / एमएल सेल निलंबन के 500 μL को प्लेट पर 24 कुओं में से प्रत्येक में जोड़ें, जो कुओं में विभिन्न पदों पर समाधान ड्रॉपवाइज वितरित करके P1000 पिपेट का उपयोग करता है।
  6. सेल सीडिंग के बाद, प्लेट को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें ताकि कोशिकाओं को वाष्पीकरण द्वारा उत्पन्न माइक्रोकरंट्स से प्रभावित हुए बिना सीधे माइक्रोपैटर्न पर बसने दिया जा सके। 1 घंटे के बाद, प्लेट को रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाएं इस समय के दौरान चिपकने वाले माइक्रोपैटर्न पर आत्म-इकट्ठा और फैल जाएंगी और बेसल संकुचन के स्तर को लागू करना शुरू कर देंगी।

3. दिन 2: परीक्षण दवा के अलावा

नोट: पालन की गई कोशिकाओं वाले कुओं में डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) की अंतिम एकाग्रता 1% से अधिक नहीं हो सकती है और दवा / डीएमएसओ को सीधे कोशिकाओं में नहीं जोड़ा जा सकता है, लेकिन पहले पतला किया जाना चाहिए और सेल माध्यम के मध्यवर्ती समाधान में मिलाया जाना चाहिए।

  1. डीएमएसओ के लगातार 210 μL वॉल्यूम में स्टॉक दवा के 30 μL को स्थानांतरित करके और प्रत्येक हस्तांतरण चरण के बीच पूरी तरह से मिश्रण करके एक छह-चरणीय, आठ-गुना दवा कमजोर पड़ने की श्रृंखला बनाएं। इस काम में, डीएमएसओ में 40 μM से 1 nM तक की खुराक में ब्लेबिस्टाटिन की एक छह-चरणीय, आठ-गुना कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला तैयार की जाती है।
  2. प्रत्येक स्टॉक ड्रग समाधान (चरण 3.1 से) के लिए, सेल संस्कृति माध्यम के 470 μL में दवा के 30 μL मिश्रण। मध्यवर्ती समाधान DMSO के एक 16.7 गुना कमजोर पड़ने उपज.
  3. 24 अच्छी तरह से प्लेट पर उपयुक्त अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक मध्यवर्ती समाधान के 200 μL हस्तांतरण (जो पहले से ही प्रत्येक अच्छी तरह से में माध्यम के 100 μL शामिल हैं). यह डीएमएसओ का एक अतिरिक्त छह गुना कमजोर पड़ने की पैदावार करता है।
  4. चरण 3.2 और 3.3 सामूहिक रूप से कुओं में डीएमएसओ की 1% अंतिम एकाग्रता उत्पन्न करते हैं।
  5. उचित अवधि के लिए उपचारित प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। इस प्रयोग के लिए, 30 मिनट के इनक्यूबेशन का उपयोग किया जाता है।
  6. इमेजिंग से तुरंत पहले, प्रत्येक अच्छी तरह से Hoechst 33342 लाइव परमाणु दाग समाधान जोड़ें (1: 10,000 अंतिम कमजोर पड़ने)। सेल नाभिक को लेबल करने के लिए इसे अतिरिक्त 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।

4. दिन 2: अच्छी तरह से प्लेट इमेजिंग

  1. एक माइक्रोस्कोप तक पहुँचें जो सेल नाभिक (DAPI) और micropatterns (TRITC) दोनों के लिए चैनलों की छवि के लिए सुसज्जित है।
  2. पहले केवल DMSO के साथ कक्षों की छवि.
  3. फिर एकल कोशिकाओं की पहचान करने और यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोपैटर्न और लेबल किए गए सेल नाभिक दोनों पर ध्यान केंद्रित करें और छवि बनाएं कि दोनों चैनल स्वचालित छवि विश्लेषण को सक्षम करने के लिए पूरी तरह से संरेखित हैं।
  4. प्लेट पर 24 कुओं में से प्रत्येक में कई पदों पर दोहराएं। छवियों को 4x उद्देश्य के साथ लिया जा सकता है (या इमेजिंग को तेज करने और प्रति छवि अधिकतम डेटा अंक प्राप्त करने के लिए वैकल्पिक रूप से अधिक)।
  5. छवियों को TIF फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें और डेटा का विश्लेषण करने के लिए ImageJ के साथ वेब-कनेक्टेड कंप्यूटर पर उन्हें खोलें।

5. पोस्ट प्रयोग: छवि विश्लेषण

नोट:: छवि विश्लेषण Biodock.ai पोर्टल और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर किया गया था।

  1. अधिग्रहित छवियों को कंप्यूटर पर अपलोड करें.
    1. सुनिश्चित करें कि micropattern और परमाणु छवियों के इसी जोड़े ठीक से नाम दिया जाता है।
    2. सुनिश्चित करें कि micropattern छवि नाम सभी "sharedCoreName_pt.tif" का रूप लेते हैं।
    3. सुनिश्चित करें कि नाभिक छवि नाम सभी "sharedCoreName_dapi.tif" का रूप लेते हैं।
  2. छविजे का उपयोग कर PNG करने के लिए TIF से छवियों को कनवर्ट करें।
    1. एक बार जब ImageJ खोला जाता है, तो एक समय में एक चैनल में लोड करें। इस प्रयोग के लिए, पहले ImageJ में एक स्टैक के रूप में micropattern छवियों को लोड करें।
    2. छवि > > चमक / कंट्रास्ट को समायोजित करें का उपयोग करके, माइक्रोपैटर्न पर जोर देने के लिए छवि चमक को समायोजित करें और पृष्ठभूमि को काले रंग में कम करें। इसके अलावा, छवियों को चिकना करें।
    3. छवि > प्रकार > 8-बिट का उपयोग करके, छवियों को 8-बिट में कनवर्ट करें।
    4. फिर छवि को PNG प्रकार में निर्यात करें और फ़ाइल नाम के रूप में बॉक्स स्लाइस स्तर की जाँच करें. अब एक नया फ़ोल्डर PNGs बनाएँ और एक ही नाम के साथ वहाँ PNG फ़ाइलों को सहेजें।
    5. नाभिक छवियों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  3. विश्लेषण के लिए छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में PNG छवि जोड़े अपलोड करें।
    1. खाता बनाएँ और सत्यापित करें. लेखकों के पास अकादमिक उपयोगकर्ताओं के लिए खुली पहुंच को सक्षम करने के लिए एक खाता है।
    2. लेखकों से संपर्क करके खाते को सत्यापित करें.
    3. सॉफ़्टवेयर में लॉग इन करें.
    4. बाईं ओर डेटा टैब के तहत, बैच अपलोड करें क्लिक करें.
    5. छवियों को खींचकर और विंडो में छवि जोड़े को छोड़कर आयात करें जो पॉप अप करता है और बैच को नाम देता है। क्लिक करें,OK.
    6. बैच नाम के आगे वाले बॉक्स को चेक करें और विश्लेषण करें क्लिक करें.
    7. अगली स्क्रीन पर, नीचे स्क्रॉल करें और Contractility Analysis के बगल में स्थित बॉक्स को चेक करें और चुनें क्लिक करें. पृष्ठ को नीचे करें, आवर्धन के रूप में 10x का चयन करें जिसका उपयोग ड्रॉप-डाउन मेनू से इमेजिंग के लिए किया गया था।
      1. सबमिट करें क्लिक करें. एक बार जब डेटा विश्लेषण पूरा हो जाता है, तो बैच नाम पर क्लिक करें। अगली स्क्रीन पर, पृष्ठ के दाईं ओर डेटा डाउनलोड करें क्लिक करें.
        नोट:: डाउनलोड की गई फ़ाइलों में उन छवियों को शामिल किया जाएगा जिनका विश्लेषण किया गया था, प्रत्येक छवि में औसत संकुचन की रिपोर्टिंग करने वाले सारांश परिणाम, और किसी भी छवि में पाए गए प्रत्येक माइक्रोपैटर्न का एक विस्तृत विश्लेषण, उनके आकार, पदों, कोशिकाओं की संख्या और संकुचन की रिपोर्टिंग।
      2. एक एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने और विभिन्न उपचारों की सापेक्ष शक्तियां निर्धारित करने के लिए दवा सांद्रता के खिलाफ प्लॉट संकुचन मूल्यों।

Representative Results

कुओं से प्राप्त छवियों के क्षेत्रों को केवल डीएमएसओ के साथ इलाज किया गया था और जिन्हें 40 μM ब्लेबिस्टाटिन के साथ इलाज किया गया था , उन्हें चित्र 3 में साथ-साथ दिखाया गया है। यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है कि डीएमएसओ-केवल उपचारित कोशिकाएं उस कुएं में मूत्राशय की चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (बीएसएमसी) द्वारा पालन किए गए माइक्रोपैटर्न के बहुत प्रमुख विरूपणों के आधार पर संकुचन का एक महत्वपूर्ण स्तर प्रदर्शित करती हैं। इसके विपरीत, 40 μM blebbistatin के साथ अच्छी तरह से इलाज की छवि में, महत्वपूर्ण सेल छूट 7 मनाया जाता है क्योंकि BSMCs द्वारा पालन किए गए माइक्रोपैटर्न माइक्रोपैटर्न से आकार में लगभग अप्रभेद्य होते हैं जो कोशिकाओं द्वारा पालन नहीं किए जाते हैं, जो न्यूनतम संकुचन का संकेत देते हैं। ये छवियां फ्लोरोसेंट माइक्रोपैटर्निंग विधि द्वारा पेश किए गए एकल-सेल संकुचन के सहज और स्पष्ट दृश्य प्रतिनिधित्व को प्रदर्शित करती हैं। टीएफएम-आधारित तरीकों के विपरीत, जहां एक घने सेल मोनोलेयर के नीचे बेतरतीब ढंग से वितरित कई फ्लोरोसेंट कणों का सर्वव्यापी आंदोलन सापेक्ष संकुचनशील बल को व्यक्त करने के लिए है, यहां, माइक्रोपैटर्न के समान और चिह्नित अनुबंधित ज्यामिति व्यक्तिगत कोशिकाओं के संकुचन के बारे में तत्काल और आसानी से व्याख्या योग्य गुणात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। इन्हें छवियों पर मानक बाइनरी ऑब्जेक्ट ऑपरेशन लागू करके सीधे परिमाणित किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: केवल 1% डीएमएसओ उपचार (बाएं) वाले कुओं से ली गई छवियों की साइड-बाय-साइड तुलना या ब्लेबिस्टैटिन (दाएं) के 40 μM युक्त। यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है कि ब्लेबिस्टैटिन के साथ उपचार एकल कोशिकाओं की संकुचनशीलता को काफी कम कर देता है जैसा कि बड़े, संयुक्त राष्ट्र-अनुबंधित माइक्रोपैटर्न द्वारा इंगित किया गया है। नीले नाभिक इंगित करते हैं कि कौन से माइक्रोपैटर्न कोशिकाओं से बंधे हुए हैं। स्केल बार = 25 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

माइक्रोपैटर्न और सेल नाभिक के अधिग्रहित छवि जोड़े का विश्लेषण करने के लिए ब्राउज़र-आधारित विश्लेषण मॉड्यूल को लागू करके, प्रत्येक आबादी के लिए एकल-सेल संकुचन वितरण प्राप्त किए जाते हैं जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। FLECS पद्धति 15 पर एक पूर्व रिपोर्ट में विस्तार से वर्णित, विश्लेषण प्रत्येक "एक्स" आकार के माइक्रोपैटर्न के पदों और झुकाव का पता लगाकर काम करता है, प्रत्येक माइक्रोपैटर्न के केंद्र पर सीधे पालन किए गए नाभिक की संख्या की गिनती करता है, प्रत्येक माइक्रोपैटर्न की औसत लंबाई की गणना करता है, और खाली माइक्रोपैटर्न (शून्य संकुचन संदर्भ) की औसत लंबाई के संबंध में प्रत्येक माइक्रोपैटर्न के संकुचन की पिक्सेल दूरी की गणना करता है। इसलिए, खाली माइक्रोपैटर्न संकुचन डेटा को सामान्य बनाने के लिए एक महत्वपूर्ण उद्देश्य की सेवा करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, कोशिकाएं जो माइक्रोपैटर्न से बंधती नहीं हैं, वे माइक्रोकरंट के कारण अच्छी तरह से सीमाओं पर जमा हो जाएंगी जहां वे छवि विश्लेषण को प्रभावित नहीं करेंगे। जैसा कि इन भूखंडों में देखा गया है, केवल डीएमएसओ नियंत्रण के साथ इलाज की जाने वाली सेल आबादी की अनियंत्रित संकुचनशीलता 20 पिक्सेल के रूप में उच्च के रूप में एक बड़ी सीमा तक फैली हुई है, जिसमें लगभग 10 पिक्सेल पर पाया जाने वाला केंद्र है। इस बीच, blebbistatin अनुबंध के साथ इलाज कोशिकाओं काफी कम है और उनके वितरण सिर्फ 6 पिक्सेल से अधिक के एक केंद्र के लिए नीचे धकेल दिया है. महत्वपूर्ण रूप से, छवि में पाए जाने वाले हर एक माइक्रोपैटर्न जो सेल पर बिल्कुल बांधता है, इन वितरणों में दर्शाया गया है। यह दवा उपचार के लिए विभेदक सेलुलर प्रतिक्रियाओं को व्यक्त करने के लिए विधि की क्षमता को दर्शाता है।

Figure 4
चित्रा 4: हिस्टोग्राम एकल-सेल संकुचन डेटा को दर्शाता है जो केवल 1% डीएमएसओ (नीले) या 40μM ब्लेबिस्टाटिन वाले कुओं से ली गई छवियों के विश्लेषण से प्राप्त होता है। डीएमएसओ-उपचारित कोशिकाओं का वितरण व्यापक है और ब्लेबिस्टैटिन उपचारित वितरण की तुलना में बहुत बड़े संकुचन मूल्य (~ 10 पिक्सेल) पर केंद्रित है, जो ब्लेबिस्टैटिन के साथ कोशिकाओं के उपचार के मात्रात्मक प्रभावों का प्रदर्शन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक एकल 24-अच्छी तरह से प्लेट पर सभी कुओं का उपयोग करके और प्रति अच्छी तरह से कम से कम 3 साइटों पर इमेजिंग करके, छह-बिंदु खुराक-प्रतिक्रिया वक्र एक साथ दो दवा यौगिकों के लिए उत्पन्न होते हैं। चित्रा 5 BSMCs के लिए एकाग्रता-प्रतिक्रिया डेटा को blebbistatin या cytochalasin D (दोनों ज्ञात संकुचन अवरोधक) की खुराक की एक ही सीमा के साथ इलाज से पता चलता है। जैसा कि एकाग्रता-प्रतिक्रिया प्रोफाइल से स्पष्ट है, साइटोकैलासिन डी इन कोशिकाओं में टॉनिक संकुचन का अधिक शक्तिशाली अवरोधक है। डेटा बिंदुओं के लिए एक सिग्मोइडल वक्र फिट करके, IC50 मानों की गणना प्रत्येक दवा के लिए की जा सकती है। हमारे प्रयोगों से संकेत मिलता है कि IC50 7.9 μM और 100 nM के लिए blebbistatin और cytochalasin D के लिए क्रमशः, दवाओं के संपर्क में आने के ~ 30 मिनट के बाद। महत्वपूर्ण रूप से, कुल मिलाकर, ये मान पूर्व रिपोर्टों के अनुरूप हैं, जो संकुचन अवरोधकों की शक्ति निर्धारित करने के लिए विधि की मात्रात्मक सटीकता को मान्य करते हैं7,21।

Figure 5
चित्रा 5: एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र एकल-कोशिकाओं में सेलुलर संकुचन पर ब्लेबिस्टैटिन और साइटोकैलासिन डी के प्रभावों को दर्शाते हैं। प्रत्येक डेटा बिंदु में उस स्थिति के लिए तीन छवियां शामिल हैं। एक सिग्मोइडल वक्र डेटा के प्रत्येक सेट के लिए फिट था। परिणामों से संकेत मिलता है कि साइटोकैलासिन डी अधिक शक्तिशाली है, जिसमें कम आईसी 50 मूल्य है। यह डेटा एक एकल 24-अच्छी तरह से FLECS प्लेट से संग्रहणीय है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

विभिन्न उपचार स्थितियों के तहत एक समय में सैकड़ों हजारों कोशिकाओं में संकुचन को मात्रात्मक रूप से मापने और केवल मानक माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग करने के लिए यह सरलीकृत विधि शोधकर्ताओं को सेलुलर बल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक टीएफएम के लिए एक सुलभ विकल्प प्रदान करती है। क्योंकि प्रस्तुत तकनीक नियमित रूप से आकार के फ्लोरोसेंट माइक्रोपैटर्न में परिवर्तनों का विश्लेषण करके सेल संकुचन का एक दृश्य प्रदर्शन प्रदान करती है, किसी भी दिए गए सेल द्वारा उत्पादित संकुचन के परिमाण को सहजता से समझा जाता है - माइक्रोपैटर्न जितना छोटा होता है, सेल द्वारा लगाए जाने वाले संकुचन बल उतना ही बड़ा होता है।

विशेष रूप से, आकार, प्रसार-क्षेत्र और आसंजन अणु जैसे कारकों पर नियंत्रण की पेशकश करके, जिसमें माइक्रोपैटर्न शामिल हैं (सेल संकुचन 22,23,24 को विनियमित करने के लिए जाने जाने वाले सभी कारक), प्रस्तुत तकनीक व्यवस्थित रूप से अतिरिक्त चर को समाप्त कर देती है जो सेल संकुचन अध्ययनों की व्याख्याओं को भ्रमित कर सकती है।

इस प्रयोग में, जेल में 10 केपीए कठोरता का उपयोग किया गया था और एक 70 μm (विकर्ण लंबाई) माइक्रोपैटर्न का उपयोग किया गया था जिसमें टाइप IV कोलेजन शामिल था। इन मापदंडों के अलावा, चिपकने वाले अणु को विभिन्न कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, जिलेटिन और अन्य एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। जेल की कठोरता को 0.1 kPa तक ट्यून किया जा सकता है, और MPa रेंज में ऊपर। माइक्रोपैटर्न ज्यामिति को ~ 5 μm के न्यूनतम सुविधा आकार के साथ किसी भी आकार के लिए डे नोवो डिज़ाइन किया जा सकता है। इन मापदंडों decoupled हैं और स्वतंत्र रूप से एक विशेष जैविक संदर्भ के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस तकनीक को विभिन्न चिकनी मांसपेशी कोशिका प्रकारों (प्राथमिक मानव मूत्राशय, आंतों, श्वासनली, ब्रोन्कियल, गर्भाशय, महाधमनी और धमनी), मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं और उनके विभेदित संतानों, विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट्स (फुफ्फुसीय, त्वचीय और हृदय), मायोफाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित मेसेनकाइमल फेनोटाइप के अत्यधिक चिपकने वाले और संकुचनशील सेल प्रकारों के साथ संगत होने के लिए बड़े पैमाने पर मान्य किया गया है। इसके अलावा, मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज भी माइक्रोपैटर्न पर बड़े औसत दर्जे के फागोसाइटिक बल का उत्पादन करेंगे, खासकर यदि माइक्रोपैटर्न में एक ज्ञात ऑप्सोनिन होता है। विभिन्न कैंसर लाइनों को भी विधि का उपयोग करके परखा जा सकता है।

यह विधि उन कोशिकाओं के साथ उपयोग के लिए कुछ चुनौतियां पैदा कर सकती है जो या तो अपेक्षाकृत छोटे होते हैं जैसे कि टी-कोशिकाएं और न्यूट्रोफिल, या मुख्य रूप से उपकला फेनोटाइप के साथ सेल प्रकार। इसका मुख्य कारण यह है कि विधि मापने योग्य संकुचनशील संकेत उत्पन्न करने के लिए माइक्रोपैटर्न पर मजबूत आसंजन और कोशिकाओं के पूर्ण प्रसार पर निर्भर करती है। कोशिकाएं जो कमजोर रूप से बांधती हैं, एक-दूसरे से बंधती हैं, या पूरी तरह से फैलती नहीं हैं, वे औसत दर्जे के संकुचनशील संकेतों का उत्पादन नहीं करेंगी। ये व्यवहार, जो अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं, को माइक्रोपैटर्न आकार को छोटा होने के लिए समायोजित करके, या माइक्रोपैटर्न के भीतर वैकल्पिक चिपकने वाले अणुओं का उपयोग करके कम किया जा सकता है जो उन कोशिकाओं में आसंजन और प्रसार को बेहतर ढंग से बढ़ावा देगा।

प्रौद्योगिकी के उपयोगकर्ताओं को अपने विशेष सेल प्रकार के ब्याज के लिए विभिन्न संभावित सेल संस्कृति माध्यम योगों का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करना चाहिए, क्योंकि विभिन्न घटक, विकास कारक, सीरम स्तर और पीएच संवेदनशीलता विभिन्न कोशिकाओं में चर व्यवहार को चला सकती हैं। प्रोटोकॉल का अनुकूलन किसी भी प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो के स्केलिंग से पहले होना चाहिए, और मीडिया घटकों को हमेशा ताजा, बाँझ और पूर्व बैचों के अनुरूप होना चाहिए।

आखिरकार, यदि एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन उपयोगकर्ता के लक्ष्यों के लिए आवश्यक नहीं है, या यदि लक्ष्य सेल प्रकार में न्यूनतम प्रसार क्षमता है, तो पारंपरिक टीएफएम ऐसे प्रयोगों के लिए समान रूप से या अधिक उपयुक्त हो सकता है। लेखकों का उद्देश्य और आशा यह है कि यह उपकरण सेल जीवविज्ञानियों को सेलुलर संकुचन का अध्ययन करने के लिए एक अतिरिक्त एवेन्यू प्रदान करता है, विशेष रूप से स्वचालित उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिक दवा स्क्रीन के संदर्भ में।

दवा स्क्रीन में भविष्य के उपयोग के लिए विशिष्ट, 384-अच्छी तरह से FLECS प्लेट जैसे उच्च थ्रूपुट प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है। ऐसी प्लेटों में, कई माइक्रोस्कोप पर 4x उद्देश्य अपने दृश्य के क्षेत्र में एक पूरे एकल कुएं पर कब्जा कर सकते हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी सेलुलर संकुचनशील प्रतिक्रियाओं पर कब्जा कर लिया गया है। एक उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके, एक पूरे 384-वेल प्लेट को लगभग 5 मिनट में चित्रित किया जा सकता है, जिससे यह प्रणाली अन्य विकल्पों की तुलना में नाटकीय रूप से तेज हो जाती है, और इसलिए, उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिक दवा खोज के लिए उपयुक्त होती है। दरअसल, लेखक नियमित रूप से स्वचालन का उपयोग करके ~ 50 384-वेलप्लेट (कुल मिलाकर 19,000 से अधिक कुओं) पर साप्ताहिक दवा स्क्रीन चलाते हैं।

Disclosures

आईपी एक जारी पेटेंट परिवार पर एक आविष्कारक है जो FLECS प्रौद्योगिकी के तरीकों और प्रणालियों की रक्षा करता है। I.P., Y.W., J.Z., E.C., और R.H. Forcyte Biotechnologies के सभी कर्मचारी हैं, Inc. R.D. UCLA में एक प्रोफेसर हैं और Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z., और R.D. Forcyte Biotechnologies, Inc. में वित्तीय हित रखते हैं, जो उपरोक्त पेटेंट का अनन्य लाइसेंसधारक है और FLECS प्रौद्योगिकी का व्यावसायीकरण कर रहा है।

Acknowledgments

प्रयोगशाला का काम यूसीएलए आणविक साझा स्क्रीनिंग संसाधन (एमएसएसआर) के समर्थन से आयोजित किया गया था, जहां फोर्साइट अनुसंधान गतिविधियों को प्रायोजित कर रहा है, और कैलिफोर्निया नैनोसिस्टम्स इंस्टीट्यूट (सीएनएसआई) में आवर्धक इनक्यूबेटर, जहां फोर्ट बायो टेक्नोलॉजीज, इंक एक निवासी कंपनी है। लेखक अनुरोध पर सभी अकादमिक शोधकर्ताओं को Biodock.ai FLECS विश्लेषण मॉड्यूल तक पहुंच प्रदान करेंगे। एल.एच. और आई.पी. ने इस काम में समान रूप से योगदान दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bladder smooth muscle cell culture Sciencell #4310
Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
Cell culture media Thermofisher 11765054 Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s
Cell strainer Fisher Scientific 7201432
Conical Tube Fisher Scientific 05-539-13
Culture flask Fisher Scientific  FB012941
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C8273
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Fisher Scientific D1284
Eppendorf tubes Fisher Scientific 05-402-31
Fluorescent microscope Molecular Devices ImageXpress Confocal
Forcyte-manufactured 24-well plate Forcyte Biotechnologies 24-HC4R-X1-QB12
Hoescht 3342 Live Nuclear Stain Thermofisher 62249
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP39920

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References

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Bioengineering अंक 182
सरलीकृत, उच्च थ्रूपुट विश्लेषण एकल-सेल संकुचितता का उपयोग कर Micropatterned Elastomers का उपयोग कर
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Hairapetian, L., Cortes, E., Zhao,… More

Hairapetian, L., Cortes, E., Zhao, J., Wang, Y., Huang, R., Damoiseaux, R., Pushkarsky, I. Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers. J. Vis. Exp. (182), e63211, doi:10.3791/63211 (2022).

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