Summary
Dit werk presenteert een flexibel protocol voor het gebruik van fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken (FLECS) -technologie in microwell-formaat voor vereenvoudigde, hands-off kwantificering van contractiele krachten met één cel op basis van gevisualiseerde verplaatsingen van fluorescerende eiwitmicropatronen.
Abstract
Cellulaire contractiele krachtgeneratie is een fundamentele eigenschap die door vrijwel alle cellen wordt gedeeld. Deze contractiele krachten zijn cruciaal voor een goede ontwikkeling, functioneren op zowel cellulair als weefselniveau en reguleren de mechanische systemen in het lichaam. Talrijke biologische processen zijn krachtafhankelijk, waaronder beweeglijkheid, adhesie en deling van afzonderlijke cellen, evenals samentrekking en ontspanning van organen zoals het hart, de blaas, de longen, de darmen en de baarmoeder. Gezien het belang ervan bij het handhaven van een goede fysiologische functie, kan cellulaire contractiliteit ook ziekteprocessen stimuleren wanneer ze overdreven of verstoord zijn. Astma, hypertensie, vroeggeboorte, fibrotische littekens en onderactieve blaas zijn allemaal voorbeelden van mechanisch aangedreven ziekteprocessen die mogelijk kunnen worden verlicht met de juiste controle van cellulaire contractiele kracht. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het gebruik van een nieuwe op microplaat gebaseerde contractiliteitstesttechnologie die bekend staat als fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken (FLECS), die vereenvoudigde en intuïtieve analyse van contractiliteit met één cel op een enorm geschaalde manier biedt. Hierin bieden we een stapsgewijs protocol voor het verkrijgen van twee zespunts dosis-responscurven die de effecten beschrijven van twee contractiele remmers op de samentrekking van primaire menselijke blaas gladde spiercellen in een eenvoudige procedure met behulp van slechts een enkele FLECS-testmicroplaat, om de juiste techniek aan gebruikers van de methode te demonstreren. Met behulp van FLECS-technologie krijgen alle onderzoekers met biologische basislaboratoria en fluorescerende microscopiesystemen toegang tot het bestuderen van dit fundamentele maar moeilijk te kwantificeren functionele celfenotype, waardoor de toetredingsdrempel op het gebied van krachtbiologie en fenotypische screening van contractiele celkracht effectief wordt verlaagd.
Introduction
Celgegenereerde mechanische krachten zijn essentieel voor een goede werking in verschillende organen in het lichaam, zoals de darmen, blaas, hart en anderen. Deze organen moeten stabiele patronen van celcontractie en ontspanning genereren om de interne homeostatische toestand te behouden. Abnormale gladde spiercel (SMC) contractie kan leiden tot het begin van verschillende aandoeningen, waaronder bijvoorbeeld intestinale dysmotiliteit, gekenmerkt door abnormale patronen van intestinale gladde spiercontractie1, evenals de urologische omstandigheden van overactieve2 of onderactieve blaas3. Binnen de luchtwegen kunnen SMC's die onregelmatige contractiepatronen vertonen astmatische hyperresponsiviteit4 veroorzaken, waardoor de luchtwegen mogelijk strakker worden en de luchtstroom van zuurstof in de longen afneemt. Een andere wijdverspreide fysieke aandoening, hypertensie, wordt veroorzaakt door fluctuaties in de gladde spiercontractie in bloedvaten5. Het is duidelijk dat contractiele mechanismen in cellen en weefsels kunnen leiden tot ziekten die behandelingsopties vereisen. Omdat deze aandoeningen onmiskenbaar voortkomen uit het disfunctionele contractiele gedrag van cellen, wordt het logisch en noodzakelijk om de celcontractiele functie zelf te meten bij het screenen van potentiële kandidaat-geneesmiddelen.
Erkennend de behoefte aan hulpmiddelen om cellulaire contractiele kracht te bestuderen, zijn verschillende kwantitatieve contractie-assaymethoden ontwikkeld door academische onderzoekers, waaronder tractiekrachtmicroscopie (TFM)6, micropatterned TFM7, zwevende gel-assays8 en elastomeer micropost-assays9. Deze technologieën zijn in tal van studies gebruikt in single-dish formaat en multi-well-plate formaat en zijn zelfs voorgesteld voor driedimensionale krachtmetingen10,11,12,13,14. Hoewel deze technologieën baanbrekend onderzoek binnen het uitgestrekte veld van celkrachtbiologie mogelijk hebben gemaakt, zijn ze allemaal grotendeels beperkt tot laboratoria met specifieke mogelijkheden en middelen, in het bijzonder: vermogen om TFM-substraten te fabriceren, vermogen om complexe en niet-intuïtieve algoritmen op de juiste manier toe te passen om TFM-verplaatsingskaarten op te lossen, en relatief nauwkeurige microscopiesystemen die beelden kunnen registreren die zijn genomen voor en na monsterverwijdering van het podium (voor celdissociatie). Voor een ongetrainde onderzoeker kan de toegangsdrempel om deze methoden te gebruiken dus vrij hoog zijn, gezien de uitgebreide reeks vereisten om deze technologieën toe te passen. Bovendien kan de beeldvormingsresolutie die vereist is voor veel bestaande technologieën (40x doelstellingen of meer) de experimentele doorvoer aanzienlijk beperken, terwijl bulkmeettechnologieën bijdragen van uitschieters kunnen maskeren en de ontdekking van mildere contractiele verschillen kunnen voorkomen. Voor zover de auteurs weten, is alleen de low-throughput en semi-kwantitatieve floating gel assay-benadering voldoende gerijpt om beschikbaar te komen voor onderzoekers (zie figuur 1).
Figuur 1: Algemeen schema van de FLECS-technologiemethode. (A) Cellen worden gehecht aan klevende eiwitmicropatronen die covalent zijn ingebed in een dunne elastomeerlaag ondersteund door glas. (B) Bovenaanzicht van verschillende mogelijke micropatronen en een opblazen van een cel die een 'X'-vormig micropatroon samentrekt. (C) Overlay van fluorescerende micropatronen en fasecontrastbeelden van een samentrekkende cel. (D) Tijdsverloopbeelden van een enkele samentrekkende cel. Schaalbalken = 25 μm. Dit cijfer werd aangepast met toestemming van Pushkarsky et al15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Naar aanleiding van recente ontwikkelingen in de microtechnologie ontwikkelden de auteurs een op microplaten gebaseerde technologie die kwantitatieve metingen van eencellige contractie in honderdduizenden cellen mogelijk maakt, FLECS genaamd (fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken)15,16,17,18,19,20 , als alternatief voor TFM. In deze benadering worden fluorescerende eiwitmicropatronen ingebed in zachte films die vervormen en krimpen wanneer cellen er tractiekrachten op uitoefenen, op een intuïtieve en meetbare manier. Belangrijk is dat de eiwitmicropatronen de celpositie, vorm en verspreidingsgebied beperken, wat leidt tot uniforme testomstandigheden. Deze maken eenvoudige metingen mogelijk op basis van alleen hun dimensionale veranderingen, die ruimtelijk zeer nauwkeurig worden opgelost, zelfs in 4x vergrotingsbeelden. De methode omvat een browsergebaseerde beeldanalysemodule en maakt een eenvoudige analyse van contractiele celkracht mogelijk zonder dat delicate hanteringsprocedures of registratie van fiduciaire markers nodig zijn, zodat deze door elke onderzoeker met een basiscelkweekfaciliteit en een eenvoudige fluorescerende microscoop met lage vergroting moet kunnen worden bediend (figuur 2 ). Deze technologie, die schapklaar en commercieel beschikbaar is, is ontworpen met de eindgebruiker in gedachten en heeft tot doel de toegangsdrempel voor elke laboratoriumwetenschapper om cellulaire krachtbiologie te bestuderen te verminderen.
Figuur 2: Schema van het 24-well plaatformaat voor de eencellige contractiliteitstest. Dit formaat werd gebruikt in de experimenten die hierin worden beschreven en weergegeven in het videogedeelte van het artikel. Schaalbalken = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In dit werk presenteren we een protocol voor het toepassen van het 24 well plate-formaat van het FLECS Technology-platform om de effecten van krachtmodulerende geneesmiddelen op cellulaire contractiliteit in primaire blaas gladde spiercellen te kwantificeren. Dit algemene protocol kan indien nodig worden aangepast en aangepast om rekening te houden met verschillende andere tijdschalen, celtypen en behandelingsomstandigheden van belang, en worden geschaald om andere vragen in de krachtbiologie te beantwoorden.
Protocol
1. Dag 1: Voorbereiding van de 24 putplaat
- Begin de procedure door 20 ml van het celkweekmedium toe te voegen aan een conische buis van 50 ml. In dit experiment wordt het medium op basis van F12 Ham gebruikt, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Verkrijg een 24-putplaat die is ontworpen om de contractiliteit van cellen te testen. Stel de pipet in op 500 μL en verkrijg een celzeef voor celpassageing.
OPMERKING: De plaat is op aanvraag verkrijgbaar bij de auteurs. - Til de plaat op en houd deze in één hand en ga verder met het voorzichtig pellen van de plastic film van de bovenkant van de plaat. Zet de plaat vervolgens voorzichtig weer neer.
- Schakel een vacuümaspirator in en zuig de bovenste laag fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) uit de putten om morsen te voorkomen. Verwijder de PBS rij voor rij. Zodra de putten niet meer helemaal vol zijn, houdt u de plaat in één hand en verwijdert u voorzichtig de rest van de PBS uit de putten. Snel vullen met 500 μL celkweekmedium. Zorg ervoor dat u contact tussen de aspirator en de bodem van de put vermijdt.
- Schud de plaat voorzichtig en tik op de zijkant om ervoor te zorgen dat de hele bodem van de put bedekt is met oplossing. Zodra alle putten zijn gevuld met medium, zet u de plaat aan de zijkant.
2. Dag 1: Cel zaaien
- Haal de kweekkolf met passage 7 of lagere primaire humane blaas gladde spiercellen (BSM) uit de incubator van 37 °C. Controleer onder een microscoop de celmorfologie en zorg ervoor dat cellen zijn gegroeid tot ten minste 90% confluentie, maar minder dan 100% confluentie.
- Voer het celdissociatieprotocol uit. In een steriele bioveiligheidskast, trypsiniseer de cellen gedurende 2,5 minuut totdat de cellen zijn losgemaakt voordat ze worden geblust met serum-aangevuld medium (10% FBS).
- Zodra cellen zijn gedissocieerd, gebruikt u een hemocytometer om de cellen te tellen en de celsuspensie te verdunnen tot ongeveer 50.000 cellen / ml in serum-aangevuld medium. Belangrijk is dat cellen ten minste 2% serum nodig hebben om zich aan de micropatronen te hechten.
- Voorafgaand aan het zaaien, snel persen van de celsuspensie door een celzeef van 40 of 100 μm in een conische buis van 50 ml met een serologische pipet om klonten cellen in enkele cellen op te breken.
- Voeg voorzichtig 500 μL van de 50.000 cellen/ml celsuspensie toe aan elk van de 24 putten op de plaat met behulp van een P1000-pipet door de oplossing druppelsgewijs over verschillende posities in de putten te doseren.
- Laat de plaat na het zaaien van de cel 1 uur op kamertemperatuur staan om de cellen direct op de micropatronen te laten bezinken zonder beïnvloed te worden door microstromen die door verdamping worden gegenereerd. Plaats de plaat na 1 uur een nacht in een incubator van 37 °C. De cellen zullen zichzelf assembleren en verspreiden over de kleefmicropatronen gedurende deze tijd en beginnen basale contractieniveaus uit te oefenen.
3. Dag 2: Toevoeging van testgeneesmiddel
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie dimethylsulfoxide (DMSO) in de putten met aangehechte cellen mag niet hoger zijn dan 1% en geneesmiddel/DMSO kan niet rechtstreeks aan de cellen worden toegevoegd, maar moet eerst worden verdund en gemengd tot een tussenoplossing van celmedium.
- Maak een zesstaps, achtvoudige medicijnverdunningsreeks door 30 μL van het voorraadgeneesmiddel over te brengen in opeenvolgende 210 μL volumes DMSO en grondig te mengen tussen elke overdrachtsstap. In dit werk wordt een zesstaps, achtvoudige verdunningsreeks van blebbistatine bereid in doses variërend van 40 μM tot 1 nM, in DMSO.
- Meng voor elke voorraadgeneesmiddeloplossing (vanaf stap 3.1) 30 μL geneesmiddel in 470 μL celkweekmedium. De tussenoplossing levert een 16,7-voudige verdunning van DMSO op.
- Breng 200 μL van elke tussenoplossing over naar de juiste put op de 24-putplaat (die al 100 μL medium in elke put bevat). Dit levert een extra zesvoudige verdunning van DMSO op.
- Stap 3.2 en 3.3 leveren gezamenlijk een eindconcentratie dmso van 1% op in de putten.
- Plaats de behandelde plaat gedurende de juiste duur in een incubator van 37 °C. Voor dit experiment wordt een incubatie van 30 minuten gebruikt.
- Voeg onmiddellijk voorafgaand aan de beeldvorming Hoechst 33342 levende nucleaire vlekoplossing toe aan elke put (1:10.000 uiteindelijke verdunning). Laat het nog eens 15 minuten incuberen om de celkernen te labelen.
4. Dag 2: Beeldvorming van de putplaat
- Krijg toegang tot een microscoop die is uitgerust om de kanalen voor zowel de celkernen (DAPI) als de micropatronen (TRITC) in beeld te brengen.
- Stel eerst alleen de cellen met DMSO in beeld.
- Richt u vervolgens op en beeld zowel de micropatronen als de gelabelde celkernen in om afzonderlijke cellen te identificeren en ervoor te zorgen dat beide kanalen perfect zijn uitgelijnd om geautomatiseerde beeldanalyse mogelijk te maken.
- Herhaal dit op meerdere posities in elk van de 24 putten op de plaat. Foto's kunnen worden gemaakt met 4x objectief (of optioneel hoger om de beeldvorming te versnellen en maximale gegevenspunten per afbeelding te verkrijgen).
- Exporteer de afbeeldingen als TIF-bestanden en open ze op een computer met internetverbinding met ImageJ om de gegevens te analyseren.
5. Post-experiment: Beeldanalyse
OPMERKING: Beeldanalyse is uitgevoerd met behulp van Biodock.ai portal- en beeldvormingssoftware.
- Upload de verkregen afbeeldingen naar een computer.
- Zorg ervoor dat overeenkomstige paren van micropattern en nucleaire beelden de juiste naam hebben.
- Zorg ervoor dat de namen van micropatternafbeeldingen allemaal de vorm "sharedCoreName_pt.tif" aannemen.
- Zorg ervoor dat kernafbeeldingsnamen allemaal de vorm "sharedCoreName_dapi.tif" aannemen.
- Converteer afbeeldingen van TIF naar PNG met ImageJ.
- Zodra ImageJ is geopend, laadt u in één kanaal tegelijk. Voor dit experiment laadt u eerst micropatternafbeeldingen als een stapel in ImageJ.
- Gebruik Afbeelding > > helderheid/contrast aanpassen, de helderheid van de afbeelding aanpassen om de micropatronen te benadrukken en de achtergrond tot zwart te reduceren. Maak daarnaast de beelden glad.
- Gebruik Afbeelding > Typ > 8-bits en converteer de afbeeldingen naar 8-bits.
- Exporteer vervolgens de afbeelding naar png-type en vink het vakje segmentniveau aan als bestandsnaam. Maak nu een nieuwe map PNG's en sla de PNG-bestanden daar op met dezelfde naam.
- Herhaal dit proces voor kernafbeeldingen.
- Upload PNG-afbeeldingsparen naar de beeldverwerkingssoftware voor de analyse.
- Maak het account aan en valideer het. De auteurs hebben een account om open toegang voor academische gebruikers mogelijk te maken.
- Valideer het account door contact op te nemen met de auteurs.
- Log in op de software.
- Klik op het tabblad Gegevens aan de linkerkant op Batch uploaden.
- Importeer de afbeeldingen door afbeeldingspaarpen te slepen en neer te zetten in het venster dat verschijnt en de batch een naam te geven. Klik op OK.
- Schakel het selectievakje naast de batchnaam in en klik op Analyseren.
- Blader op het volgende scherm omlaag en vink het selectievakje naast Contractiliteitsanalyse aan en klik op Selecteren. Selecteer onderaan de pagina 10x als de vergroting die is gebruikt voor beeldvorming in een vervolgkeuzemenu.
- Klik op Verzenden. Zodra de gegevensanalyse Voltooid is, klikt u op de batchnaam. Klik in het volgende scherm op Gegevens downloaden aan de rechterkant van de pagina.
OPMERKING: De gedownloade bestanden bevatten afbeeldingen die zijn geanalyseerd, samenvattende resultaten die gemiddelde krimp in elke afbeelding rapporteren en een gedetailleerde analyse van elk micropatroon dat in een afbeelding is gedetecteerd, met vermelding van hun grootte, posities, aantal gehechte cellen en contractie. - Zet contractiewaarden uit tegen geneesmiddelconcentraties om een concentratie-responscurve te genereren en de relatieve potenties van verschillende behandelingen te bepalen.
- Klik op Verzenden. Zodra de gegevensanalyse Voltooid is, klikt u op de batchnaam. Klik in het volgende scherm op Gegevens downloaden aan de rechterkant van de pagina.
Representative Results
Regio's van de beelden verkregen uit putten die alleen met DMSO werden behandeld en die welke werden behandeld met 40 μM blebbistatine worden naast elkaar weergegeven in figuur 3. Het kan duidelijk worden waargenomen dat dmso-only behandelde cellen een significant niveau van contractie vertonen op basis van de zeer prominente vervormingen van de micropatronen die worden vastgehouden door blaas gladde spiercellen (BSMC's) in die put. Omgekeerd wordt in het beeld van de goed behandeld met 40 μM blebbistatine significante celontspanning waargenomen7 omdat de micropatronen die door BSMC's worden aangehangen bijna niet te onderscheiden zijn van de micropatronen waaraan cellen zich niet hechten, wat wijst op minimale contractie. Deze beelden tonen de intuïtieve en duidelijke visuele weergave van eencellige contractiliteit die wordt geboden door de fluorescerende micropatterning-methode. In tegenstelling tot TFM-gebaseerde methoden, waarbij de omnidirectionele beweging van talrijke fluorescerende deeltjes willekeurig verdeeld onder een dichte celmonolaag bedoeld is om relatieve contractiele kracht over te brengen, bieden hier de uniforme en gemarkeerde samengetrokken geometrieën van de micropatronen onmiddellijke en gemakkelijk interpreteerbare kwalitatieve informatie over contractie van individuele cellen. Deze kunnen direct worden gekwantificeerd door standaard binaire objectbewerkingen op de afbeeldingen toe te passen.
Figuur 3: Vergelijkingen naast elkaar van foto's gemaakt van putten die slechts 1% DMSO-behandeling bevatten (links) of die 40 μM blebbistatine bevatten (rechts). Het kan duidelijk worden waargenomen dat behandeling met blebbistatine de contractiliteit van de afzonderlijke cellen aanzienlijk vermindert, zoals aangegeven door de grotere, niet-samengetrokken micropatronen. Blauwe kernen geven aan welke micropatronen door cellen worden gebonden. Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Door de browsergebaseerde analysemodule toe te passen om de verkregen beeldparen van micropatronen en celkernen te analyseren, worden voor elke populatie eencellige contractiliteitsverdelingen verkregen zoals weergegeven in figuur 4. In detail beschreven in een eerder rapport over de FLECS-methodologie15, werkt de analyse door de posities en oriëntaties van elk "X" -vormig micropatroon te lokaliseren, het aantal kernen te tellen dat direct over het midden van elk micropattern wordt gehouden, de gemiddelde lengte van elk micropatroon te berekenen en de pixelafstand van de contractie van elk micropattern te berekenen met betrekking tot de gemiddelde lengte van lege micropatronen (nulcontractiereferentie). Daarom dienen de lege micropatronen een belangrijk doel voor het normaliseren van de contractiegegevens. Belangrijk is dat cellen die niet binden aan de micropatronen zich ophopen op de putgrenzen als gevolg van microstromen waar ze de beeldanalyse niet zullen beïnvloeden. Zoals te zien is in deze plots, beslaat de onverstoorbare contractiliteit van de celpopulatie die alleen wordt behandeld met DMSO-controles een groot bereik tot 20 pixels, met een centrum van ongeveer 10 pixels. Ondertussen trekken cellen die met blebbistatine worden behandeld aanzienlijk minder samen en wordt hun verdeling naar een midden van iets meer dan 6 pixels geduwd. Belangrijk is dat elk micropattern in het beeld dat precies op de cel bindt, in deze verdelingen wordt weergegeven. Dit toont het vermogen van de methode om differentiële cellulaire reacties op medicamenteuze behandelingen over te brengen.
Figuur 4: Histogrammen met eencellige contractiliteitsgegevens verkregen uit de analyse van beelden gemaakt van putten die slechts 1% DMSO (blauw) of 40μM blebbistatine bevatten. De verdeling van met DMSO behandelde cellen is breed en gecentreerd op een veel grotere contractiewaarde (~ 10 pixels) dan de met blebbistatine behandelde verdeling, wat de kwantitatieve effecten van de behandeling van cellen met blebbistatine aantoont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Door alle putten op een enkele 24-putplaat te gebruiken en ten minste 3 locaties per put af te beelden, worden zespunts dosis-responscurven tegelijkertijd gegenereerd voor twee geneesmiddelverbindingen. Figuur 5 toont de concentratie-responsgegevens voor BSMC's die zijn behandeld met hetzelfde dosisbereik van blebbistatine of cytochalasine D (beide bekende contractiliteitsremmers). Zoals blijkt uit de concentratie-responsprofielen, is cytochalasine D de krachtigere remmer van tonische contractie in deze cellen. Door een sigmoïdale curve aan te passen aan de gegevenspunten, kunnen IC50-waarden voor elk medicijn worden berekend. Onze experimenten geven aan dat de IC50 respectievelijk 7,9 μM en 100 nM zijn voor blebbistatine en cytochalasine D, na ~ 30 minuten blootstelling aan de geneesmiddelen. Belangrijk is dat deze waarden over het algemeen consistent zijn met eerdere rapporten, waardoor de kwantitatieve nauwkeurigheid van de methode om de potentie van contractieremmers te bepalen7,21 wordt gevalideerd.
Figuur 5: Concentratie-responscurven die de effecten van blebbistatine en cytochalasine D op cellulaire contractiliteit in enkele cellen weergeven. Elk gegevenspunt bestaat uit drie afbeeldingen voor die voorwaarde. Een sigmoïdale curve was geschikt voor elke set gegevens. De resultaten geven aan dat cytochalasine D krachtiger is, met een lagere IC50-waarde . Deze gegevens zijn te verzamelen vanaf een enkele 24-well FLECS-plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Deze vereenvoudigde methode om kwantitatief contractie te meten in honderdduizenden cellen tegelijk onder verschillende behandelingsomstandigheden en met behulp van alleen standaard microscopie-instrumenten biedt een toegankelijk alternatief voor traditionele TFM voor onderzoekers om cellulaire krachtbiologie te bestuderen. Omdat de gepresenteerde technologie een visuele weergave van celcontractie biedt door veranderingen in regelmatig gevormde fluorescerende micropatronen te analyseren, wordt de omvang van de contractie geproduceerd door een bepaalde cel intuïtief begrepen - hoe kleiner het micropattern, hoe groter de contractiele kracht die door de cel wordt uitgeoefend.
Met name door controle te bieden over factoren zoals vorm, verspreidingsgebied en adhesiemolecuul waaruit de micropatronen bestaan (alle factoren waarvan bekend is dat ze de celcontractiliteit reguleren22,23,24), elimineert de gepresenteerde technologie systematisch aanvullende variabelen die interpretaties van celcontractiestudies kunnen verstoren.
In dit experiment werd 10 kPa stijfheid gebruikt in de gel en een 70 μm (diagonale lengte) micropattern bestaande uit type IV collageen. Naast deze parameters kan het lijmmolecuul worden vervangen door verschillende collageen, fibronectine, gelatine en andere extracellulaire matrix (ECM). De stijfheid van de gel kan worden afgestemd tot 0,1 kPa en tot in het MPa-bereik. De micropatterngeometrie kan de novo worden ontworpen om elke vorm te zijn met een minimale functiegrootte van ~ 5 μm. Deze parameters zijn ontkoppeld en kunnen onafhankelijk worden geoptimaliseerd voor een bepaalde biologische context.
Deze technologie is uitgebreid gevalideerd om compatibel te zijn met zeer klevende en contractiele celtypen van een mesenchymaal fenotype, waaronder verschillende gladde spierceltypen (primaire menselijke blaas, intestinale, tracheale, bronchiale, baarmoeder, aorta en arteriële), mesenchymale stamcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen, verschillende fibroblasten (pulmonale, dermale en cardiale), myofibroblasten en endotheelcellen. Bovendien zullen van monocyten afgeleide macrofagen ook een grote meetbare fagocytische kracht op de micropatrionen produceren, vooral als het micropatroon bestaat uit een bekend opsonine. Verschillende kankerlijnen kunnen ook worden getest met behulp van de methode.
De methode kan enkele uitdagingen opleveren voor het gebruik met cellen die relatief klein zijn, zoals T-cellen en neutrofielen, of celtypen met een overwegend epitheelfenotype. De belangrijkste reden hiervoor is dat de methode vertrouwt op sterke hechting en volledige verspreiding van cellen over het micropatroon om het meetbare contractiele signaal te genereren. Cellen die zwak binden, aan elkaar binden of zich niet volledig verspreiden, produceren geen meetbare contractiele signalen. Dit gedrag, dat relatief zeldzaam is, kan worden verzacht door de grootte van het micropatroon aan te passen om kleiner te zijn, of door alternatieve kleefmoleculen in de micropatronen te gebruiken die de hechting en verspreiding in die cellen beter bevorderen.
Gebruikers van de technologie moeten zorgvuldig verschillende mogelijke celkweekmediumformuleringen evalueren voor hun specifieke celtype van belang, omdat verschillende componenten, groeifactoren, serumspiegels en pH-gevoeligheden variabel gedrag in verschillende cellen kunnen veroorzaken. Optimalisatie van het protocol moet voorafgaan aan het schalen van experimentele workflows en mediacomponenten moeten altijd vers, steriel en consistent zijn met eerdere batches.
Uiteindelijk, als eencellige resolutie niet nodig is voor de doelen van een gebruiker, of als het doelceltype een minimale verspreidingscapaciteit heeft, kan traditionele TFM even geschikt of meer geschikt zijn voor dergelijke experimenten. Het doel en de hoop van de auteurs is dat deze tool een extra mogelijkheid biedt voor celbiologen om cellulaire contractie te bestuderen, met name in de context van geautomatiseerde fenotypische medicijnschermen met hoge doorvoer.
Specifiek voor toekomstig gebruik in medicijnschermen kunnen platen met een hogere doorvoer worden gebruikt, zoals een 384-well FLECS-plaat. In dergelijke platen kunnen 4x objectieven op veel microscopen een hele put in hun gezichtsveld vastleggen, zodat alle cellulaire contractiele reacties worden vastgelegd. Door gebruik te maken van een high-throughput imaging-systeem kan een volledige 384-well plaat in ongeveer 5 minuten worden afgebeeld, waardoor dit systeem aanzienlijk sneller is dan andere opties en daarom geschikt is voor het ontdekken van fenotypische geneesmiddelen met hoge doorvoer. Inderdaad, de auteurs voeren routinematig wekelijkse medicijnschermen uit op ~ 50 384-wellplates (in totaal meer dan 19.000 putten) met behulp van automatisering.
Disclosures
I.P. is een uitvinder van een uitgegeven patentfamilie die de methoden en systemen van FLECS-technologie beschermt. I.P., Y.W., J.Z., E.C. en R.H. zijn allemaal werknemers van Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. is professor aan de UCLA en medeoprichter van Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z. en R.D. hebben financiële belangen in Forcyte Biotechnologies, Inc., die de exclusieve licentiehouder is van de bovenstaande patenten en FLECS Technology commercialiseert.
Acknowledgments
Het laboratoriumwerk werd uitgevoerd met de steun van de UCLA Molecular Shared Screening Resource (MSSR), waar Forcyte onderzoeksactiviteiten sponsort, en de Magnify Incubator aan het California NanoSystems Institute (CNSI), waar Forcyte Biotechnologies, Inc. een gevestigd bedrijf is. De auteurs verlenen op verzoek toegang tot de Biodock.ai FLECS-analysemodule aan alle academische onderzoekers. L.H. en I.P. hebben evenveel bijgedragen aan dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
| Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
| Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
| Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
| Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |
References
- Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced. Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).
- Peyronnet, B., et al. A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment. European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).
- Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance. Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).
- Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity. Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).
- Brozovich, F. V., et al. Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders. Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Rokhzan, R., et al. high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function. Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).
- Park, C. Y., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces. Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).
- Huang, Y., et al. Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells. Scientific Reports. 9, 539 (2019).
- Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLOS ONE. 6, 17833 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Pushkarsky, I. FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).
- Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).
- Orfanos, S., et al. Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).
- Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers. PLOS ONE. 9, 106091 (2014).
- Yoo, E. J., et al. Gα12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).
- MacGlashan, D., Vilariño, N. Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).
- Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization. Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Wang, N. Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading. Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).
- Ye, G. J. C., et al. The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent. Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).
