Summary
Den nåværende protokollen gir instruksjonsinformasjon for bruk av tobakk hornorm Manduca sexta i cannabinoid forskning. Metoden som er beskrevet her inkluderer alle nødvendige forsyninger og protokoller for å overvåke fysiologiske og atferdsmessige endringer i insektmodellen som svar på cannabidiol (CBD) behandling.
Abstract
Med økt oppmerksomhet på cannabinoider i medisin, har flere pattedyrmodellorganismer blitt brukt til å belyse sine ukjente farmasøytiske funksjoner. Imidlertid forblir mange vanskeligheter i pattedyrforskning, noe som nødvendiggjør utviklingen av ikke-pattedyrmodellorganismer for cannabinoidforskning. Forfatterne foreslår tobakk hornworm Manduca sexta som et nytt insektmodellsystem. Denne protokollen gir informasjon om å forberede det kunstige kostholdet med varierende mengder cannabidiol (CBD), sette opp et dyrkingsmiljø og overvåke deres fysiologiske og atferdsmessige endringer som svar på CBD-behandling. Kort sagt, etter å ha mottatt hornormegg, ble eggene tillatt 1-3 dager ved 25 °C på en 12:12 lys mørk syklus for å klekkes før de ble tilfeldig fordelt i kontroll (hvetekimbasert kunstig diett; AD), kjøretøy (AD + 0,1% mellomkjedet triglyseridolje; MCT-olje) og behandlingsgrupper (AD + 0,1% MCT + 1 mM eller 2 mM CBD). Når media var forberedt, ble første instar larver individuelt plassert i et 50 ml reagensrør med en trespydpinne, og deretter ble reagensrøret dekket med en osteklut. Målinger ble tatt i 2-dagers intervaller for fysiologiske og atferdsmessige responser på CBD-administrasjonen. Denne enkle dyrkingsprosedyren gjør det mulig for forskere å teste store prøver i et gitt eksperiment. I tillegg gjør de relativt korte livssyklusene det mulig for forskere å studere effekten av cannabinoidbehandlinger over flere generasjoner av en homogen befolkning, slik at data kan støtte en eksperimentell design i høyere pattedyrmodellorganismer.
Introduction
I løpet av de siste årene har offentlig oppmerksomhet vært sentrert om cannabinoider på grunn av deres terapeutiske potensial, inkludert behandling av epilepsi1, Parkinsons sykdom2, multippel sklerose3 og ulike former for kreft4,5,6 med cannabidiol (CBD). Siden Cannabis er legalisert som en landbruksvare i landbruksforbedringsloven av 2018, har offentlig lov 115-334 (2018 Farm Bill), Cannabis og dens cannabinoidderivater i næringsmiddel-, kosmetikk- og farmasøytisk industri eksponentielt økt. I tillegg har kliniske isolasjoner av enkeltkannabinoider og cannabinoidblandinger blitt testet med hell hos mennesker7, cellelinjer5,8 og forskjellige dyremodellsystemer9,10.
En klinisk studie vil være ideell for validering av effekt og bivirkninger av cannabinoider på en bestemt sykdom. Det er imidlertid mange utfordringer i kliniske studier, inkludert etisk/IRB-godkjenning, rekruttering og oppbevaring av fagene11. For å overvinne disse hindringene ble ulike menneskelige cellelinjer brukt fordi menneskeavledede cellelinjer er kostnadseffektive, enkle å håndtere, kan omgå de etiske problemene og gi konsistente og reproduserbare resultater da cellelinjene er en 'ren populasjon av celler som ikke har krysskontaminering av andre celler og kjemikalier'12.
Alves et al. (2021)13 testet CBD på en doseavhengig måte i placental trophoblasts, som er spesialiserte celler i morkaken som spiller en viktig rolle i embryoimplantasjon og interaksjon med den decidualiserte mors livmor14. Resultatene deres viste at CBD forårsaket tap av celle levedyktighet, forstyrrelser i cellesyklusprogresjon og apoptoseinduksjon. Disse observasjonene viser de potensielle negative virkningene av cannabisbruk av gravide kvinner13. På samme måte ble en rekke cellelinjer også brukt til å undersøke de farmakologiske effektene av CBD i menneskelige sykdommer, spesielt ulike former for kreft. In vitro-studiene viste vellykket antikrefteffekter i bukspyttkjertelen15, bryst8 og kolorektal kreftceller16. Men mens de er allment tilgjengelige og enkle å håndtere, er spesifikke cellelinjer som HeLa, HEK293 utsatt for genetiske og fenotypiske endringer på grunn av endringer i vekstforholdene eller håndteringen17.
I cannabisforskning har ulike dyremodellsystemer, alt fra små dyr som mus18, marsvin19 og kanin19 til store dyr som hunde20, piglet21, monkey22, horse23, blitt brukt til å utforske ukjente terapeutiske effekter. Mus har vært det mest foretrukne dyremodellsystemet for cannabinoidforskning på grunn av deres anatomiske, fysiologiske og genetiske likhet med mennesker24. Mest signifikant har mus CB1/2 reseptorer i nervesystemet, som er tilstede hos mennesker. De har også en kortere livssyklus enn mennesker, med enklere vedlikehold og rikelig genetiske ressurser, og dermed gjør det mye lettere å overvåke effekten av cannabinoider gjennom en hel livssyklus. Pattedyrsystemet er mye brukt og har med hell vist at CBD lindrer anfallsforstyrrelser1, posttraumatisk stresslidelse9, orale sår25 og demenslignende symptomer10. Musemodellen har også gjort det mulig å studere individer i et samfunn som er ekstremt vanskelig hos store dyr og mennesker26.
Til tross for alle fordelene med dyremodellsystemet, er det fortsatt kostbart og krever intensivbehandling under legemiddeladministrasjon og datainnsamling. I tillegg er det granskning av bruk av mus i forskning på grunn av irreproducibility og dårlig recapitulation av menneskelige forhold på grunn av begrensninger i eksperimentell design og rigor27.
Med den økende etterspørselen etter medisinske / prekliniske studier av cannabinoider, er det nødvendig med et ikke-pattedyrmodellsystem. Hvirvelløse modeller ga tradisjonelt særegne fordeler i forhold til virveldyrmodeller. De betydelige fordelene inkluderer enkelhet og lave kostnader ved å oppdra mange prøver og gjøre det mulig for forskere å overvåke flere generasjoner genetisk homogene populasjoner28. En nylig studie viste at fruktfluen, Drosophila melanogaster, var et effektivt insektmodellsystem for å undersøke farmakologiske funksjoner av cannabinoider i modulerende fôringsatferd29. Blant insektmodellsystemene fokuserte forfatterne på tobakkshornorm, Manduca sexta, også kjent som Carolina sfinxmot eller haukmot, som et nytt insektmodellsystem for cannabinoidforskning.
Manduca sexta tilhører familien til Sphingidae. Insektet er det vanligste plante i det sørlige USA, hvor de spiser på solanaceous planter. Insektmodellen har en lang historie i forskning innen insektfysiologi, biokjemi, nevrobiologi og legemiddelinteraksjonsstudier. Manduca sextas forskningsportefølje inkluderer et utkast til genomsekvens, noe som gir en molekylær forståelse av essensielle cellulære prosesser30. En annen avgjørende fordel med dette modellsystemet er dens store størrelse, og når mer enn 100 mm i lengde og 10 g i vekt i 18-25 dager med larvutvikling. Den store størrelsen gjør det mulig for forskere å enkelt overvåke morfologiske og atferdsmessige endringer i sanntid som svar på CBD-behandlingen. Også på grunn av størrelsen ble elektrofysiologiske responser undersøkt med buknervesystemet, inkludert ganglia dissekert fra larver uten høyoppløselige mikroskopinnstillinger. Den unike funksjonen gjør det mulig for forskere å lett undersøke akutte og langsiktige svar på administrerte cannabinoid(er).
Til tross for en slik allsidighet har M. sexta bare nylig blitt utforsket for sin egnethet som en eksperimentell modell for Cannabis- og cannabinoidstudier. I 2019 brukte forfatterne insektmodellsystemet for første gang for å adressere hypotesen om at Cannabis har utviklet seg til å produsere Cannabidiol for å beskytte seg mot insekt plantelevende dyr30,31. Resultatet viste tydelig at plantene utnyttet CBD som en fôring avskrekkende og hemmet veksten av skadedyrsinsektet M. sexta caterpillar, samt forårsaker økt dødelighet31. Studien demonstrerte også de reddende effektene av CBD til berusede etanollarver, og identifiserte den potensielle kjøretøyeffekten av etanol som bærer av CBD. Som vist undersøkte insektmodellsystemet effektivt de terapeutiske effektene av cannabinoider innen 3-4 uker med mindre arbeidskraft og kostnader enn andre dyresystemer. Selv om insektmodellen mangler cannabinoidreseptorer (dvs. ingen CB1/2-reseptorer), gir modellsystemet et verdifullt verktøy for å forstå de farmakologiske rollene til cannabinoider gjennom en cannabinoidreseptoruavhengig måte.
Forfatterne av denne studien har tidligere jobbet med tobakkshornorm som modellsystem for cannabinoidforskning31. Etter nøye vurdering av fordelene og risikoen ved å bruke M. sexta, har vi gitt en metode som involverer riktig omsorg og forberedelse av diett for prekliniske studier som gir muligheter for fremtidig preklinisk laboratoriebruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hornworm forberedelse og cannabidiol behandling
- Oppnå 150-200 levedyktig M. sexta egg og hvete bakteriebaserte kunstige dietter (se Tabell over materialer).
- Legg hornormeggene i en polystyren Petri-tallerken med et hvetekimbasert kunstig kosthold (AD) lag og overfør eggene til et insektoppdrettskammer (se Materialbord) opprettholdt ved 25 °C med 40%-60% relativ fuktighet.
- La tobakk hornworm egg i 1-3 dager å klekke inne i insekt oppdrettskammeret opprettholdt ved 25 °C med 40%-60% relativ fuktighet.
- Forbered cannabidiol (CBD) lagerløsning (200 mM) ved å legge til 1,26 g >98% renhet CBD isolerer i 20 ml EtOH (200 bevis) eller 100% medium kjede triglyserider (MCT) olje (se Tabell over materialer).
MERK: CBD-isolasjon er lysfølsom, så håndter i mørket. - Tilsett 5 ml og 10 ml av den 200 mM CBD-lagerløsningen til henholdsvis 1000 g AD for å bringe de endelige konsentrasjonene av diettene 1 mM og 2 mM CBD.
MERK: Sørg for at dietten og CBD-lagerløsningen er godt blandet til en helt homogen blanding dannes. Bland AD som inneholder lager av CBD i en plastpose i minst 45 minutter for hånd.
FORSIKTIG: Kaffeblanderen eller andre metallkvern så ut til å være ineffektive. - Dispenser 20 g av de tre mediene, kontrollen (AD), kjøretøyet (AD + 0,1% av EtOH- eller MCT-olje) og CBD som inneholder medier (AD + 0,1% av EtOH eller MCT-olje + 1 mM / 2 mM CBD) til bunnen av 50 ml-røret.
- Fordel tilfeldig første instar larver (~ 2 mm lange) individuelt i et 50 ml reagensrør og dekk med perforert lokk eller osteklut (se Materialfortegnelser).
MERK: Plasser røret opp ned og vokse insekter ved et insektoppdrettskammer opprettholdt 25 °C med 40%-60% relativ fuktighet. - Dyrk dem inne i et insektoppdrettskammer (se Materialbord) opprettholdt ved 25 °C med en lys-/mørk syklus på 12 timer.
2 . M. sexta larvalvekst, kostholdsforbruk og dødelighetsmålinger
- Mål larveveksten (dvs. størrelse og vekt) med en analytisk balanse og dødelighet ved 2-dagers intervaller etter å ha blitt overført til individuelle beholdere til pupering er anerkjent som den mørkebrune fargen på et herdet eksokuttikallag.
- Registrer den første massen (i gram) av hver gruppe larver før du introduserer larver til sine respektive dietter og trekk larvens masse ved hver måling fra den første massen for å bestemme massegevinster mellom larver utviklingsstadier til larvene fullfører puppetrinnet.
- Registrer antall dager mellom instar utviklingsstadier for å forstå forskjeller i utviklingsrammen mellom stadier av larvervekst til pupering på hver diett.
MERK: Skrap av fekalmaterialet fra beholderen for å unngå muggforurensning. Samle saken for fremtidig testing avhengig av eksperimentformål (f.eks. beregning av CBD-akkumuleringshastighet, mikrobiell profilering). Det er viktig å forsiktig håndtere insektet i de skjøre periodene med apolyse eller ecdysis. Når du tar ut av larver fra en beholder, ta forsiktig tak i insektets hoveddel med en flat spiss og brede tang og ikke kraft til å fjerne det ytre laget av hud når et insekt er i ferd med å kaste.
- Mål diettforbruket31 ved å veie dietttapet av beholderen mellom første instar larver og pupering. Registrer de første gram diett i begynnelsen av eksperimentet og trekk den opprinnelige mengden fra den gjenværende mengden diett da larvene kom inn i hele puppetrinnet.
MERK: Fekalmaterialet bør utelukkes fra diettmålingen. Fekal materie og annet rusk (dvs. hudskjul) kan lett fjernes fra mediet ved å plassere beholderen opp ned. - For mobilitetsmålinger, la det utsatte insektet akklimatisere kammermiljøet i minst 5 minutter og spore avstandene31 som tre grupper av femte instar insekter (80-100 mm i lengde) reiste ved hjelp av et automatisert, datastyrt fryktkondisjoneringskammer (se Materialtabell).
- Analyser mobilitetsresponsen31 gjennom video som er spilt inn 60 bilder/s i 5 minutter ved hjelp av en bevegelsesdeteksjonsprogramvare (se Tabell over materialer) som genererer en bevegelsesindeks.
3. Statistisk analyse
- Analyser forskjellene i larvveksten (dvs. størrelse og vekt) og bevegelsesindeksen ved enveis ANOVA med Tukeys post-test32.
- Bruk log-rank (Mantel-Cox) test33 for sammenligninger av overlevelseskurver.
MERK: Alle de statistiske analysene ble utført ved hjelp av statistisk analyseprogramvare (se Materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manduca sexta som modellsystem for å undersøke cannabinoider toksisitet
Figur 1 viser nøkkelkomponentene i CBD-eksperimentet ved hjelp av tobakkhornorm Manduca sexta. Et stort antall insekter (>20) ble individuelt oppdrettet ved 25 °C på en 12 t:12 t = lys: mørk syklus. Insektenes størrelse, vekt og dødelighet ble målt med 2-dagers intervaller for å overvåke for kort- og langtidsresponser etter høydose CBD (2 mM) behandling.
Figur 2 viser de negative effektene av CBD på insektets vekst og utvikling. Insektene oppdrettet på et kunstig kosthold (AD) viste den beste vekstytelsen. Kjøretøykontrollen som brukte 0,1% mellomkjedet triglyseridolje (MCT) som oppløsningsmiddel for CBD-isolasjon viste også normal vekst uten skadelige effekter. Imidlertid induserte en høy dose CBD (2 mM) vekttap (figur 2C) og førte til en høyere dødelighet enn for kontroll- og kjøretøygrupper (figur 2D).
På dag 24 var den gjennomsnittlige størrelsen på larvene som ble matet på AD 63,9 mm (n = 20-22). Imidlertid var størrelsen på larver oppdrettet på AD som inneholder 2 mM CBD 50,7 mm, som var ~ 21% mindre enn larvene som vokste på AD (rød linje i figur 2C)31. På dag 24 var gjennomsnittlig vekt av larve oppdrettet på AD 6,5 g, som var 2,2 ganger større enn larver oppdrettet på AD med 2 mM CBD (n = 12-16, p < 0,00001)31. Spesielt økte den høye dosen cbd (2 mM) signifikant dødeligheten opp til 40%, mens kontroll- og kjøretøygruppene bare viste en 20% dødelighet (figur 2D)31. Resultatene indikerte at den høye dosen cbd (2 mM) i kostholdet er skadelig for insektutvikling og korrelerer med økt dødelighet.
Manduca sexta som et modellsystem for å utforske ukjente terapeutiske funksjoner av cannabinoider
Figur 2 viste at insektmodellsystemet effektivt overvåker eventuelle skadelige effekter av CBD ved å overvåke deres morfologiske og fysiologiske endringer. Det foreløpige resultatet indikerte at >1% etanol (EtOH) er negativt relatert til vekst, mobilitet, diettforbruk og overlevelsesrate. For å undersøke om CBD forbedrer insektets mobilitet og fôringsatferd i etOH-berusede M. sexta larver, ble den totale mengden diett konsumert av insekter og avstanden de reiste i 10 minutter målt fra insekter dyrket under tre fôringsforhold (AD, AD + 1% EtOH og AD + 1% EtOH + 1 mM CBD). Figur 3A viser at M. sexta larver oppdrettet på AD som inneholder 1 mM CBD konsumert minst 3,1 ganger større diettmasse enn de som er oppdrettet på EtOH-lagt diett31. Imidlertid var diettforbruket av insekter oppdrettet på 2 mM CBD-tilsatte medier ikke signifikant forskjellig fra larver oppdrettet på EtOH-bare dietter (p > 0,05)31.
Larval mobilitet ble også sporet for å undersøke om CBD påvirket deres mobilitet når de var beruset med EtOH. Den mobile indeksen presenteres som prosentandelen (%) av frysing. Figur 3B sammenligner mobilindeksen til M. sexta larver oppdrettet på forskjellige forhold. Resultatene viser at 1% EtOH-behandlede larver ikke påvirket mobiliteten (p > 0,05). CBD-administrasjonen på 1 mM påvirket heller ikke mobiliteten (p > 0,05)31. De 2% EtOH-behandlingene viste seg å være dødelige for M. sexta larver; Derfor ble det ikke registrert noen mobilitetsindeks. Med tillegg av den høye dosen cbd (2 mM) i AD som inneholder 2% EtOH, forble mobiliteten lav (80% fryse)31.
Figur 1: Den oppsummerte prosessen med å bruke tobakkshornorm Manduca sexta caterpillars i cannabidiol studie. (A) Hornworm egg klekket ut i en separat stor beholder med et lag av kunstig diett. (B) En sprøyte ble brukt til å fylle beholderen for å forhindre at dietten fester seg til sidene av beholderne. (C) En andre instar tobakk hornorm i en 50 ml reagensrør med osteklær. (D) En tredje instar tobakk hornworm. (E) Hornormlengde (mm) og vekt (g) ble målt på en skala. (F) Femte instar tobakk hornorm som gjennomgår ecdysis og klar for pupering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av Cannabidiol (CBD) på veksten og dødeligheten av tobakkhornorm Manduca sexta. (A) Tobakk hornorm larver på 5th, 3rd instar, og tidlig pupering. Størrelsen (B), vekten (C) og dødeligheten (D) av M. sexta når matet på kunstig kosthold (AD), AD + 0,1% av mellomkjedet triglyserid (MCT) og AD + 0,1% av MCT + 2 mM CBD. For statistiske analyser av insektvekst og overlevelsesrate ble det brukt en enveis ANOVA med Tukeys multisammenligningstest (n = 20-22, p < 0,05) og Mantel-Cox-test (n = 20-22, p < 0,05). Figuren er tilpasset fra Referanse31. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effektene av Cannabidiol (CBD) på insektfôringsatferd og mobilitet. (A) Kostholdsforbruk av tobakkhornorm larver oppdrettet på kunstig kosthold (AD), AD + 1-2% etanol (EtOH) og AD + 1-2% av EtOH + 1-2mM CBD (enveis ANOVA, Tukeys multippel sammenligning ved p < 0,05). (B) Insekt mobilitet. Mobiliteten er avbildet som frys %. indikerer p < 0,01. Figuren er tilpasset fra Referanse31. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fôringsstudien viste at høye doser CBD (2 mM) hemmet insektets vekst og økt dødelighet31. Insektmodellen viste også følsomhet for etanol; CBD avgiftet imidlertid effektivt etanoltoksisiteten, og økte overlevelsesraten, diettforbruket og matsøkeatferden til lignende nivåer som kontrollgruppen (figur 3A, B)31. Det beskrevne insektmodellsystemet består av tre kritiske trinn: (1) sikre at M. sextas egg klekkes jevnt i størrelse og timing, (2) forbereder vekstmediene som er homogent blandet med cannabinoider til en målrettet konsentrasjon, og (3) opprettholder vekstmediet for å være fri for soppforurensning samtidig som det opprettholder ideelt fuktighetsnivå på 40% -60%. Insektmodellsystemet gjorde det mulig for oss å ta opp problemstillingen innen 25 dager, fra medieforberedelse til datainnsamling og tolkning. Viktigst av alt produserte insektsystemet konsistente resultater fra store prøver.
For å sikre suksessen til de dyrkede M. sexta larver, er det viktig å opprettholde den relative fuktigheten på 40% -60% inne i beholderen. Hvis en beholder ikke klarer å holde høy luftfuktighet, vil et kunstig kosthold som inneholder cannabinoidene bli tørket raskt, noe som forårsaker tidlig eksperimentavslutning på grunn av insektenes død. Men i et lukket system gir høy luftfuktighet en ideell tilstand for sopputbruddet, noe som er vanskelig å utrydde. Forfatterne foreslår å bruke et perforert lokk eller osteklut for å levere tilstrekkelig luftcirkulasjon samtidig som vanntapet fra media minimeres. I et naturlig miljø foretrekker larverne å mate på abaxialsiden av et blad der fuktigheten er høyere mens de presenterer færre trichomes enn bladets overflateareal34. Dermed var det usedvanlig nyttig å plassere en beholder opp ned mens du ga et tilfluktssted eller krypende trepinne. Dette bidrar også til å fjerne fekal materie fra medieområdet og gjør det enkelt å samle avfallet for ytterligere analyser.
Siden cannabinoidreseptorer er fraværende i invertabrater35, kan det hende at tobakkshornormen M. sexta ikke er egnet for terapeutiske studier formidlet av endocannabinoid-systemet. Men med de mange fordelene som er demonstrert i pilotstudien vår, bør insektet betraktes som et nytt modellsystem for å undersøke de farmakologiske funksjonene til cannabinoider, spesielt studier som involverer ikke-CB-reseptormediert farmakokinetikk. Den relativt korte livssyklusen til M. sexta gjør det mulig for forskere å forstå virkningene av et cannabinoidholdig kosthold over flere generasjoner, noe som gir mulighet for et eksperimentelt design i høyere pattedyrmodellorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Institute of Cannabis Research ved Colorado State University-Pueblo og Vitenskaps- og IKT-departementet (2021-DD-UP-0379) og Chuncheon city (Hemp R&D og industrialisering, 2020-2021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
- Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
- Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
- Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
- Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
- Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
- de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
- Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
- Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
- Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
- Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
- Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
- Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
- Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
- Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
- Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
- Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
- Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
- Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
- Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
- Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
- He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
- Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
- McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M.
