Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tillämpningen av öppna sökbaserade metoder för identifiering av Acinetobacter baumannii O-länkade glykopeptider

Published: November 2, 2021 doi: 10.3791/63242
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Öppen sökning möjliggör identifiering av glykopeptider dekorerade med tidigare okända glykankompositioner. I denna artikel presenteras ett strömlinjeformat tillvägagångssätt för att genomföra öppen sökning och efterföljande glykanfokuserade glykopeptidsökningar för bakterieprover med Acinetobacter baumannii som modell.

Abstract

Proteinglykosylering erkänns alltmer som en vanlig modifiering inom bakteriella organismer, vilket bidrar till prokaryot fysiologi och optimal infektivitet hos patogena arter. På grund av detta ökar intresset för att karakterisera bakteriell glykosylering och ett behov av analysverktyg med hög genomströmning för att identifiera dessa händelser. Även om bottom-up proteomik lätt möjliggör generering av rika glykopeptiddata, gör bredden och mångfalden av glykaner som observerats i prokaryota arter identifieringen av bakteriella glykosyleringshändelser extremt utmanande.

Traditionellt gjorde den manuella bestämningen av glykankompositioner inom bakteriella proteomiska dataset detta till en i stort sett skräddarsydd analys begränsad till fältspecifika experter. Nyligen har öppna sökbaserade metoder dykt upp som ett kraftfullt alternativ för identifiering av okända modifieringar. Genom att analysera frekvensen av unika modifieringar som observerats på peptidsekvenser möjliggör öppna söktekniker identifiering av vanliga glykaner fästa vid peptider i komplexa prover. Denna artikel presenterar ett strömlinjeformat arbetsflöde för tolkning och analys av glykoproteemiska data, vilket visar hur öppna söktekniker kan användas för att identifiera bakteriella glykopeptider utan förkunskaper om glykankompositionerna.

Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan glykopeptider i prover snabbt identifieras för att förstå glykosyleringsskillnader. Med hjälp av Acinetobacter baumannii som modell möjliggör dessa metoder jämförelse av glykankompositioner mellan stammar och identifiering av nya glykoproteiner. Sammantaget visar detta arbete mångsidigheten hos öppna databassökningstekniker för identifiering av bakteriell glykosylering, vilket gör karakteriseringen av dessa mycket olika glykopreome enklare än någonsin tidigare.

Introduction

Proteinglykosylering, processen att fästa kolhydrater till proteinmolekyler, är en av de vanligaste post-translationella modifieringarna (PTM) i naturen 1,2. Över alla livets domäner har en rad komplexa maskiner utvecklats dedikerade till generering av glykoproteiner som påverkar en myriad av cellulära funktioner 1,3,4,5. Medan proteinglykosylering sker på ett antal aminosyror 6,7, är N-länkade och O-länkade glykosyleringshändelser två dominerande former som observeras i naturen. N-bunden glykosylering involverar fastsättning av glykaner till en kväveatom av asparagin (Asn) rester, medan i O-bunden glykosylering är glykaner bundna till en syreatom av serin (Ser), treonin (Thr) eller tyrosin (Tyr) rester7. Trots likheterna i rester riktade mot glykosyleringssystem resulterar skillnaderna inom glykanerna som är fästa vid proteiner i att glykosylering är den mest kemiskt olika klassen av PTM som finns i naturen.

Medan eukaryota glykosyleringssystem har glykandiversitet, är dessa system vanligtvis begränsade i antalet unika kolhydrater som används. Den resulterande mångfalden härrör från hur dessa kolhydrater är ordnade i glykaner 8,9,10,11,12. Däremot har bakteriella och arkeala arter praktiskt taget obegränsad glykandiversitet på grund av det stora utbudet av unika sockerarter som genereras inom dessa system 2,10,13,14,15,16,17. Dessa skillnader i glykandiversiteten som observerats över livets domäner utgör en betydande analytisk utmaning för karakterisering och identifiering av glykosyleringshändelser. För eukaryot glykosylering har förmågan att förutse glykankompositioner underlättat det växande intresset för glykobiologi; ändå gäller detsamma inte för bakteriell glykosylering, som fortfarande till stor del är begränsad till studier av specialiserade laboratorier. Eftersom tillgängligheten till masspektrometri (MS) instrumentering har ökat inom biovetenskaperna, är MS-baserade metoder nu den primära metoden för glykoproteomisk analys.

MS har framstått som det viktigaste verktyget för karakterisering av glykosylering, med både top-down och bottom-up-metoder som nu vanligtvis används för att karakterisera glykoproteiner6. Medan top-down proteomik används för att bedöma globala glykosyleringsmönster av specifika proteiner18,19, används bottom-up-metoder för att möjliggöra glykanspecifik karakterisering av glykopeptider, även från komplexa blandningar 6,20,21,22,23. För analys av glykopeptider är genereringen av informativ fragmenteringsinformation avgörande för karakteriseringen av glykosyleringshändelser24,25. En rad fragmenteringsmetoder är nu rutinmässigt tillgängliga på instrument, inklusive resonansjonfällabaserad kollisionsinducerad dissociation (IT-CID), kollisionsinducerad dissociation av stråltyp (CID) och elektronöverföringsdissociation (ETD). Varje tillvägagångssätt har olika styrkor och svagheter för glykopeptidanalys25,26, med betydande framsteg under det senaste decenniet när det gäller att tillämpa dessa fragmenteringsmetoder för att analysera glykosylering 6,20. För bakteriell glykosyleringsanalys har emellertid den kritiska begränsningen inte varit förmågan att fragmentera glykopeptider utan snarare oförmågan att förutsäga de potentiella glykankompositionerna i prover. Inom dessa system begränsar den okända naturen hos olika bakteriella glykaner identifieringen av glykopeptider, även med glykosyleringsfokuserade sökverktyg som nu är vanliga för analys av eukaryota glykopeptider, såsom O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 och GlycReSoft29. För att lösa detta problem krävs en alternativ sökmetod, med användning av öppna sökverktyg som framträder som ett kraftfullt tillvägagångssätt för studier av bakteriell glykosylering30.

Öppen sökning, även känd som blind eller jokerteckensökning, möjliggör identifiering av peptider med okända eller oväntade PTM 21,30,31,32. Öppna sökningar använder en mängd olika beräkningstekniker, inklusive kuraterade modifieringssökningar, databassökningar i flera steg eller bredmasstolerant sökning 33,34,35,36,37. Även om öppen sökning har stor potential har dess användning vanligtvis hindrats av den signifikanta ökningen av analystider och förlust av känslighet för detektering av omodifierade peptider jämfört med begränsade sökningar31,32. Minskningen av detektionen av omodifierade peptidspektrala matchningar (PSM) är ett resultat av de ökade falskt positiva PSM-hastigheterna associerade med dessa tekniker, vilket kräver ökad sträng filtrering för att upprätthålla de önskade falska upptäcktshastigheterna (FDR) 33,34,35,36,37 . Nyligen har flera verktyg blivit tillgängliga som avsevärt förbättrar tillgängligheten för öppen sökning, inklusive Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 och MSFragger21,41. Dessa verktyg möjliggör robust identifiering av glykosyleringshändelser genom att avsevärt minska analystiderna och implementera metoder för att hantera heterogena glykankompositioner.

Denna artikel presenterar en strömlinjeformad metod för identifiering av bakteriella glykopeptider genom öppen sökning, med användning av den gramnegativa nosokomiala patogenen, Acinetobacter baumannii, som modell. A. baumannii har ett konserverat O-länkat glykosyleringssystem som är ansvarigt för modifieringen av flera proteinsubstrat, känt som PglL-proteinglykosyleringssystemet 42,43,44. Medan liknande proteiner är inriktade på glykosylering mellan stammar, är PglL-glykosyleringssystemet mycket varierande på grund av att biosyntesen av glykanen som används för proteinglykosylering härrör från kapsellokus (känd som K-locus)44,45,46. Detta resulterar i att olika glykaner (även känd som en K-enhet), härledd från enkla eller begränsade polymeriserade K-enheter, tillsätts till proteinsubstrat 30,44,46. Inom detta arbete används användningen av det öppna sökverktyget, MSfragger, inom programvaran FragPipe, för att identifiera glykaner över A. baumannii-stammar. Genom att kombinera öppen sökning och manuell kurering kan "glykanfokuserade sökningar" genomföras för att ytterligare förbättra identifieringen av bakteriella glykopeptider. Tillsammans möjliggör denna flerstegsidentifieringsmetod identifiering av glykopeptider utan omfattande erfarenhet av karakterisering av nya glykosyleringshändelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Beredningen och analysen av bakteriella glykopeptidprover kan delas in i fyra sektioner (figur 1). För denna studie bedömdes glykosyleringen av tre sekvenserade A. baumannii-stammar (tabell 1). Proteome FASTA-databaser över var och en av dessa stammar är tillgängliga via Uniprot. Se tabell 2 för sammansättningen av buffertar som används i detta protokoll.

1. Beredning av proteinprover för proteomisk analys

  1. Isolering av proteomprover av intresse
    1. Om du använder hela celler, se till att cellerna har tvättats med en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna potentiella proteinföroreningar som finns i mediet. Snäppfry hela celler efter tvätt och förvara dem vid -80 °C tills det behövs.
    2. Om fraktionerade prover används (t.ex. membranpreparat), se till att de reagenser som används inte kommer att störa nedströms vätskekromatografi MS (LC-MS) analys50.
    3. Om tvättmedel, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, NP-40 eller lauroylsarkosin, har använts, ta bort dessa tvättmedel med acetonutfällning, SP3-provberedningsmetoder51 eller kommersiella proteomiska rengöringskolonner såsom S-fällor52. Alternativt kan du ersätta oförenliga tvättmedel med ett MS-kompatibelt eller avtagbart tvättmedel såsom natriumdeoxikolat (SDC) eller oktylgloskopiranosid.
    4. Se till att alla plastvaror och glas som ska användas för provberedning inte har autoklaverats. Autoklaverade glasvaror och plast är vanligtvis kraftigt förorenade med små molekylviktsföreningar, såsom polymerer, som lätt detekteras inom MS.
  2. Solubilisering av helcellsprover
    1. Resuspend ~ 10 mg tvättade, snäppfrysta celler i 200 μL nyberedd natriumdeoxikolatlysbuffert (SDC-lysbuffert: 4% SDC i 100 mM Tris, pH 8,5).
      OBS: Proteashämmare kan tillsättas till SDC-lysbufferten för att begränsa proteinnedbrytningen.
    2. Koka proverna i 10 min vid 95 ° C med skakning (2000 rpm på en termomixer) och låt sedan stå på is i 10 min. Upprepa denna process två gånger för att säkerställa effektiv lys och solubilisering av proverna.
      OBS: Prover kan lagras på lång sikt vid denna tidpunkt vid -80 ° C. Om den förvaras, återlösbilisera genom uppvärmning vid 95 °C före vidare bearbetning.
  3. Kvantifiera provproteinkoncentrationer med hjälp av en bicinkoninsyra (BCA) proteinanalys53. Lagra prover på is medan du gör kvantifiering för att begränsa proteinnedbrytningen.
    OBS: För total proteomanalys är 20-100 μg protein mer än tillräckligt för nano LC-MS, vilket vanligtvis kräver mindre än 2 μg proteinsmältning per analys. Framställningen av överskott av peptid möjliggör replikatanalys eller ytterligare fraktionering om djup proteomisk täckning krävs. För glykopeptidanrikningsbaserad analys med användning av hydrofil interaktionskromatografi (HILIC) krävs 100-500 μg protein.
  4. Minska och alkylera prover.
    1. Tillsätt 1/10av volymen 10x reduktions-/alkyleringsbuffert (100 mM Tris 2-karboxyetylfosfinhydroklorid; 400 mM 2-kloracetamid i 1 M Tris, pH 8,5) till prover för en slutlig koncentration av 1x och inkubera prover i mörkret i 30 min vid 45 °C med skakning vid 1 500 rpm.
      OBS: Kontrollera pH i 10x reduktions- / alkyleringsbufferten för att säkerställa ett pH på cirka 7,0-8,0 innan du lägger till proverna, eftersom ett lägre pH kommer att orsaka att SDC fälls ut.
  5. Snurra kort ner proverna och tillsätt proteaserna Trypsin / Lys-C (~ 10 μL, resuspenderade i 100 mM Tris, pH 8,5) för ett slutligt proteas: proteinförhållande på 1: 100. Inkubera smältningarna över natten vid 37 ° C med skakning vid 1 500 rpm (upp till 18 timmar). För att säkerställa fullständig proteinsmältning, använd ett Trypsin / Lys-C-proteas: proteinförhållande på 1:50 till 1:200.
  6. Släck smälter genom att tillsätta 1,25 volymer 100% isopropanol till proverna. Vortex proverna i 1 min för att blanda och snurra dem kort ner.
    OBS: Prover kan lagras vid -20 ° C för att bearbetas ytterligare senare.
  7. Försura proverna genom att tillsätta 0,115 volymer av 10% trifluorättiksyra (TFA; slutlig koncentration av ~ 1% TFA), virvla proverna och snurra dem kort ner.

2. Bearbetning av proteomprover

  1. Peptidrensning av proteomprover
    1. Förbered ett styrenedivinylbensen-omvändfassulfonat (SDB-RPS) Stop-and-go-extraktion (Stage) Tip för varje prov som tidigare beskrivits54.
      1. Empiriskt, för bindning av 50 μg peptid, punktskatta tre SDB-RPS-skivor från ett 47 mm2 SDB-RPS-membran med användning av en trubbig nål (14 G). För större peptidmängder, öka antalet skivor i enlighet därefter.
    2. Innan du använder SDB-RPS Stage Tips, förbered spetsarna genom att sekventiellt tillsätta minst tio bäddvolymer av följande buffertar och antingen snurra bufferten genom kolonnen genom centrifugering (25 ° C, 3 min, 500 × g) eller genom att trycka bufferten genom kolonnen genom att försiktigt applicera tryck med en spruta.
      1. Våt spetsarna med 150 μL 100% acetonitril.
      2. Tvätta spetsarna med 150 μL 30% metanol, 1% TFA i 18,2 MΩH2O.
      3. Balansera spetsarna med 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA balanserat med 18,2 MΩH2O.
    3. Ladda proverna (innehållande 50 % isopropanol, 1 % TFA) på SDB-RPS stegspetsar genom centrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) eller genom att försiktigt applicera tryck med en spruta.
    4. Tvätta SDB-RPS stegtips med följande buffertar genom centrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) eller genom att försiktigt trycka med en spruta.
      OBS: Ytterligare tvättar eller alternativa buffertar kan användas för att avlägsna icke-peptidföroreningar, såsom användning av etylacetat istället för isopropanol55.
      1. Tvätta spetsarna med 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA.
      2. Tvätta spetsarna med 150 μL 1% TFA i 18,2 MΩH2O.
    5. Eluera peptiderna från SDB-RPS Stage Tips med 150 μL 5% ammoniumhydroxid i 80% acetonitril genom centrifugering eller genom att försiktigt applicera tryck med en spruta. Samla proverna i enskilda rör.
      OBS: Förbered 5% ammoniumhydroxid i 80% acetonitril i en plastbehållare omedelbart före användning i en draghuv.
    6. Torka de eluerade peptiderna genom vakuumcentrifugering vid 25 °C.
      OBS: Om hilic-anrikning genomförs kan 1-10% av peptideluaterna avlägsnas vid denna tidpunkt, torkas och användas som totala proteominmatningskontroller.
  2. Anrikning av glykopeptidprover
    1. Förbered Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips som tidigare beskrivits54,56.
      1. Kortfattat, punktbeskatta en C8-skiva från ett 47 mm2 C8-membran med en trubbig nål (14 G) och packa skivan i en P200-spets för att skapa en frit. Tillsätt cirka 5 mm ZIC-HILIC-material, återutnyttjat i 50 % acetonitril, 50 % 18,2 MΩH2O, på friten genom att försiktigt applicera tryck med en spruta.
    2. Innan du använder ZIC-HILIC Stage Tips, konditionera hartset genom att sekventiellt tillsätta följande buffertar och försiktigt applicera tryck med en spruta.
      OBS: För att säkerställa integriteten hos pseudovattenskiktet på ytan av ZIC-HILIC-hartset (krävs för att berika glykopeptider) måste hartset alltid förbli vått. När du tvättar hartset, lämna alltid ~ 10 μL lösningsmedel ovanför hartset och se till att tvättarna / proverna pipetteras direkt i detta kvarvarande lösningsmedel.
      1. Balansera hartset med 20 bäddvolymer (200 μL) ZIC-HILIC elueringsbuffert (0,1% TFA i 18,2 MΩH2O).
      2. Tvätta hartset med 20 bäddvolymer (200 μL) ZIC-HILIC-beredningsbuffert (95 % acetonitril i 18,2MΩH2O).
      3. Tvätta hartset med 20 bäddvolymer (200 μL) ZIC-HILIC laddnings-/tvättbuffert (80 % acetonitril, 1 % TFA balanserat med 18,2 MΩH2O).
    3. Återutnyttja de torkade rötade proverna (från steg 2.1.6) i ZIC-HILIC laddnings-/tvättbuffert till en slutlig koncentration på 4 μg/μL (t.ex. för 200 μg peptid, återutnyttja i 50 μL ZIC-hilic laddnings-/tvättbuffert). Vortex kort i 1 min för att säkerställa att proverna återanvänds och snurrar ner i 1 min vid 2000 × g vid 25 ° C.
    4. Ladda det resuspenderade peptidprovet på en konditionerad ZIC-HILIC-kolonn.
      1. Tvätta tre gånger med 20 bäddvolymer (200 μL) ZIC-HILIC lastnings-/tvättbuffert (för 60 sängvolymtvättar totalt) genom att försiktigt applicera tryck med en spruta.
      2. Eluera glykopeptider med 20 bäddvolymer (200 μL) ZIC-HILIC elueringsbuffert i ett 1,5 ml rör genom att försiktigt applicera tryck med en spruta och sedan torka eluatet genom vakuumcentrifugering vid 25 °C.

3. LC-MS för proteom/glykopeptidberikade prover

  1. Resuspendera proverna i buffert A* (2 % acetonitril, 0,1 % TFA) till en slutlig koncentration på 1 μg/μL (t.ex. för 50 μg peptid, återutnyttja i 50 μL buffert A*).
  2. Ladda proverna på en HPLC / UPLC kopplad till en MS för att möjliggöra separation och identifiering av glykopeptider.
    OBS: Kolonnparametrarna, inklusive innerdiameter, längd, flödeshastigheter, typ av kromatografiharts och erforderliga peptidinjektionsmängder, bör optimeras för den analytiska inställning och gradientlängd som ska användas. För ett exempel på hur man kan genomföra optimering av analytiska inställningar, se57.
  3. Övervaka insamlingen av de resulterande MS-uppgifterna och se till att uppgifterna samlas in med önskade parametrar.
    OBS: För kompositionsanalys är CID-fragmentering tillräcklig. På grund av tillsatsen av glykaner till glykopeptider observeras glykopeptidjoner typiskt med en högre m / z och lägre laddningsdensitet än oglykosylerade peptider. För att säkerställa att dessa joner är observerbara, tillåt ett MS1-massintervall från 400 till 2000 m / z.
  4. Fragmentera utvalda joner med användning av CID, vilket säkerställer insamling av låga m / z-fragmentjoner som innehåller oxoniumjoner som är viktiga för karakteriseringen av glykaner.
    OBS: Fragmentering av glykopeptider med användning av CID påverkas av både peptid- och glykansekvenserna, liksom den energi som appliceras under fragmentering 25,58,59. Medan en rad olika kollisionsenergier kan användas, är en optimal strategi för fragmentering av glykopeptider användningen av stegvisa kollisionsenergier som kombinerar användningen av flera kollisionsenergier 25,59,60.
  5. Använd alternativa fragmenteringsmetoder, om sådana finns, till exempel ETD för platslokalisering eller IT-CID för att hjälpa till vid bestämning av glykankompositioner.
    OBS: Ingen av dessa fragmenteringsmetoder är väsentliga för kompositionsanalys, men kan samlas in för att möjliggöra ytterligare förhör av glykopeptider av intresse.

4. Analys av proteom/glykopeptidberikade prover

  1. Förfiltrering av datafiler för att möjliggöra sökning i FragPipe
    1. Om ETD- eller IT-CID-genomsökningar har förvärvats i datauppsättningar filtrerar du dessa genomsökningshändelser från datafilerna med MSConvert61 innan du söker med FragPipe.
      OBS: För de öppna sökparametrarna som beskrivs nedan krävs endast CID-data av stråltyp.
  2. Utföra öppna sökningar i FragPipe
    1. Öppna FragPipe och klicka på fliken Arbetsflöde . I rullgardinsmenyn för arbetsflödet väljer du alternativet Öppna sökning och klickar på Lägg till filer för att importera datafilerna som ska sökas i FragPipe (bild 2A).
    2. Klicka på fliken Databas och starta nedladdningshanteraren genom att klicka på Ladda ner. Detta gör att proteomdatabaser kan laddas ner från Uniprot med hjälp av ett Uniprot Proteome-ID. Klicka på alternativet Lägg till lockbete och föroreningar i nedladdningshanteraren för att införliva lockbete och förorenande proteiner i databaser.
    3. Om du vill ha strängare FDR-tröskelvärden klickar du på fliken Validering och ändrar värdet Filter och rapport från 0,01 till önskad FDR.
      OBS: Standardinställningarna för FragPipe säkerställer en 1% FDR på proteinnivå.
    4. Klicka på fliken MSfragger . I rutan Peak matching ökar du prekursorns masstolerans från standardvärdet 500 Da till 2 000 Da för att möjliggöra identifiering av stora modifieringar (figur 2A).
    5. Klicka på fliken Kör och definiera platsen för utdata från FragPipe. Klicka på knappen Kör för att starta sökningen.
  3. Med hjälp av psm:er som identifierats över datauppsättningar (som finns i psm.tsv-utdata från FragPipe) identifierar du potentiella glykaner genom att plotta frekvensen för observerade deltamassor i datauppsättningar (figur 3). Skapa deltamassdiagram från MSfragger-utdata med R-skript som är tillgängliga via PRIDE-anslutning PXD027820.
    OBS: Minimal efterbehandling av de öppna sökresultaten utförs inom dessa skript, eftersom huvudsyftet med dessa skript är att hjälpa till med visualisering av deltamassprofiler. Viktigt är att observationen av rikliga deltamassor ensam inte är bevis för att en modifiering är en potentiell glykan, eftersom tilldelning av deltamassor som glykaner kräver ytterligare analys av motsvarande MS2-händelser.
  4. För att möjliggöra karakterisering av glykopeptider i prover, fokusera på deltamassidentifieringar med hög konfidens, motsvarande uppdrag med höga hyperpoäng.
    1. För att hjälpa till att bedöma glykopeptidspektra, använd peptidannoteringsverktyg, såsom Interactive Peptide Spectral Annotator63, som möjliggör tilldelning av peptidassocierade joner inom spektra, vilket möjliggör manuell identifiering av de glykanassocierade jonerna (Figur 4).
      OBS: Inom de dataset som presenteras här anses hyperpoäng på >30 vara höga poäng, eftersom dessa motsvarar poäng inom topp 50% av alla identifierade glykopeptider (figur 5).
  5. Med glykopeptider med hög konfidens tilldelad, identifiera vanligt observerade glykanassocierade joner (figur 4) för att förbättra identifieringen av glykopeptider.
    OBS: Genom att införliva glykanassocierade joner i sökningar, så kallade glykanfokuserade sökningar, kan kvaliteten på glykopeptiduppdrag förbättras.
    1. Klicka på fliken MSfragger i FragPipe, införliva de bestämda deltamassorna för de observerade glykanerna i sektionerna Variabel modifieringar och Massförskjutningar . Lägg till dessa massor genom att skriva värden i sektionerna Variabelmodifieringar och Massförskjutningar med enskilda massor åtskilda med en /. Tillsätt de glykanassocierade fragmentmassorna av dessa glykaner i avsnittet Glyko/Labile mods i MSFragger.
      OBS: Figur 2B beskriver den viktigaste informationen som krävs för en glykanfokuserad sökning av A. baumannii-stammen AB307-0294.
  6. Ladda upp alla MS-data som är associerade med proteomiska studier till centraliserade proteomiska förvar som PRIDE- eller MASSIVE-förvaren.
    OBS: Alla data i samband med denna studie har deponerats i PRIDE proteomiska förvar och kan nås via PRIDE-anslutningen: PXD027820.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att illustrera nyttan av öppen sökning efter bakteriell glykopeptidanalys bedömdes den kemiska mångfalden av O-länkade glykaner inom tre stammar av A. baumannii-AB307-0294, ACICU och D1279779. De O-länkade glykopredomerna är mycket varierande mellan A. baumannii-stammar eftersom glykanerna som används för glykosylering härrör från de mycket variabla kapsellokierna 44,45,46. Denna kemiska mångfald gör A. baumannii till ett idealiskt modellsystem för öppna sökstudier. Medan glykopreteomerna hos de tre stammarna inte tidigare har bedömts, är kapselstrukturerna för två av dessa stammar, AB307-029464 och ACICU65, kända, med kapseln D1279779 ännu inte klarlagd.

I överensstämmelse med kapseln av AB307-0294 avslöjade öppen sökning av AB307-0294 två dominerande deltamassor, motsvarande 648,25 Da och 692,28 Da (figur 3A). Dessa massor matchar de kapselstrukturer som tidigare bestämts av Russo et al., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA, där QuiNAc4NR-återstoden motsvarar 2,4-diamino-2,4,6-trideoxi-glukos, modifierad med antingen 3-OH-butyrat eller en acetylgrupp64. På samma sätt är ACICU-kapseln känd för att bestå av en tetrasackarid K-enhet, tidigare identifierad som Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc-, motsvarande en förväntad massa på 843,31 Da65. Denna kapselstruktur överensstämmer med den vanligaste observerade deltamassan inom ACICU-data (figur 3B). Slutligen avslöjade öppen sökanalys av stammen D1279779 närvaron av flera deltamassor som överensstämde med 203.08, 794.31 och 1588.62 Da (Figur 3C). Medan massan 203,08 överensstämmer med massan för en enda HexNAc-rest, motsvarar 794,31 och 1588,62 okända modifieringar. Det bör noteras att massan 1588,62 är exakt dubbelt så stor som 794,31, vilket tyder på att dessa peptider är dekorerade med glykan K-enhetsdimerer, vilket tidigare har observerats inom andra Acinetobacter-glykoproteom 30,44,46.

Delta massplottar ger ett snabbt och effektivt sätt att bedöma frekvensen av observerade modifieringar inom prover. För komplexa modifieringar, såsom glykaner, ger emellertid närvaron av en deltamassa ensam inte informationen för att definiera den exakta sammansättningen av en glykan. För att underlätta bestämningen av glykankompositioner kan de resulterande MS/MS-data för PSM som tilldelats specifika deltamassor användas. Genom att fokusera på glykopeptiduppdrag med hög konfidens (i MSFragger motsvarande PSM med höga hyperscorer) kan manuell analys användas för att ytterligare karakterisera de glykaner som används av en stam för proteinglykosylering. Det bör noteras att peptidtilldelningar med hög konfidens vanligtvis innehåller robust glykaninformation som möjliggör bestämning av glykankompositioner baserade på Y-joner. Denna information kan användas för att identifiera motsvarande fragment där glykanerna har förblivit fästa vid peptider, liksom till B- och oxoniumrelaterade joner som är användbara för tilldelning av glykaner66. Detaljerade riktlinjer för hur man tilldelar glykankompositioner har tidigare beskrivits, och läsarna rekommenderas att konsultera Harvey et al.67. Med hjälp av verktyg som Interactive Peptide Spectral Annotator63 kan peptidassocierade joner enkelt identifieras, så att användarna kan bestämma identiteten hos glykanerna fästa vid peptider.

Med hjälp av Interactive Peptide Spectral Annotator bedömdes glykopeptider identifierade över dessa tre A. baumannii-prover, vilket avslöjade potentiella glykanassocierade joner. Tänk på MS/MS-spektra för Glykopeptiden AB307-0294 SAGDQAASDIATATDNASAK, dekorerad med glykanerna 648,25 och 692,28 Da (figur 4A,B); Under liknande fragmenteringsbetingelser är de glykanrelaterade jonerna mycket lika, men ändå förskjutning i massa med 44,02 Da. Analys av glykanjonerna inom dessa PSM möjliggör bekräftelse på att deltamassorna som observerats för dessa glykopeptider motsvarar trisackarider innehållande fyra olika kolhydrater: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) och HexNAc (203 Da). Det bör noteras att vid tilldelning av glykanfragment är flera monosackarider benägna att förlora vatten när de fragmenteras med CID. Detta kan ses i Glykanen i ACICU, där monosackariden Pse5Ac7Ac (316 Da) leder till generering av två framträdande glykanrelaterade fragment: MH + 299,12 och 317,13, skillnaden i massa som motsvarar massan av vatten (18,01 Da) (Figur 4C).

Vid analys av bakteriella glykaner är det dessutom vanligt att observera oväntade monosackaridmassor som motsvarar sockerarter som inte observerats inom eukaryoter. Ett exempel på detta kan ses inom glykopeptid-PSM i D1279779, där analys av den vanligaste deltamassan 794.31 Da avslöjar närvaron av en ovanlig monosackarid dHexNAc (187 Da, observerad som en MH + av 188.09, figur 4D), som tidigare har observerats inom A. baumannii O-länkade glykaner44. Medan mätningar med hög massnoggrannhet och det karakteristiska beteendet hos glykaner som labila modifieringar, som går förlorade från peptidryggraden, kan hjälpa till vid bestämning av potentiella kemiska kompositioner av glykaner, är det lämpligt att minimera övertolkningen av MS-data. Om stereokemi av specifika sockerarter eller länkinformationen för en glykan är okänd, är det bästa praxis att använda strukturellt agonistiska uppdrag, inklusive att hänvisa till monosackarider med deras specifika klasser. Ett exempel på detta är att hänvisa till 203.08 Da-rester som N-acetylhexosaminer (HexNAc) och undvika tilldelning av kopplingstyper. Vid behov rekommenderas att ytterligare tekniker används för att definiera de exakta kemiska identiteterna för en okänd modifiering, såsom användning av kärnmagnetisk resonans (NMR).

Medan öppna sökmetoder möjliggör snabb identifiering av modifierade peptider är det viktigt att notera att denna sökmetod kan förbise potentiella glykopeptider inom dataset. Inom öppna sökningar kan glykopeptider misslyckas med att identifieras av flera skäl, inklusive otillräcklig peptidfragmenteringsinformation eller straffning av den tilldelade peptiden på grund av närvaron av flera otilldelade joner inom MS2-händelsen. Det senare gäller särskilt för bakteriella glykopeptid PSM, eftersom dessa spektra kan innehålla glykanassocierade fragment som inte beaktas som standard öppna sökparametrar. Eftersom oöverträffade egenskaper påverkar poängsättningen av PSM negativt, möjliggör minimering av oöverträffade joner inom MS/MS-spektra identifiering av glykopeptider som ursprungligen uteslöts på grund av de FDR-kontrollerade minimala poängtrösklarna. För att övervinna denna begränsning kan de massor som definieras från de öppna sökningarna (figur 3) och de manuellt definierade glykanassocierade jonerna (figur 4) införlivas i sökparametrar för att förbättra identifieringen av glykopeptider. Det är viktigt att notera att dessa glykanassocierade joner kan identifieras manuellt baserat på de novo-bestämning av glykanen, förkunskaper om vanliga oxoniumjoner44,68 eller användning av verktyg som kan fånga återkommande joner inom spektra, såsom SPectral Immonium Ion Detection-verktyget69,76.

För att visa detta införlivades massorna av atypiska glykanfragment som identifierades genom öppen sökanalys i sökparametrarna i MSFragger och glykanfokuserad sökning genomfördes (de glykanfokuserade inställningarna för stammen AB307-0294 visas i figur 2B). Det bör noteras att när flera glykaner söks tillsammans, bör man vara försiktig vid valet av Y-jon och diagnostiska massor för att säkerställa att de korrekt återspeglar fragmentjonerna associerade med varje deltamassa. Även om detta kanske inte alltid är möjligt för kombinationer av Y och diagnostiska massor som utesluter varandra, såsom fragmenten av 648.25 och 692.28 glykaner av AB307-0294 (figur 4A, B), är glykanfokuserad sökning fortfarande möjlig, även om detta kan påverka sökresultatens robusthet. Glykanfokuserade sökningar ledde till en anmärkningsvärd ökning av det totala antalet glykopeptid-PSM som identifierades över alla tre A. baumannii-stammarna, vilket motsvarar en 37% ökning av ACICU, en 117% ökning av AB307-0294 och en 363% ökning av D1279779 (Figur 5A-C). För enskilda MS-händelser resulterar införandet av glykanspecifik information vanligtvis i en ökning inom den observerade hyperpoängen, även om denna ökning är mycket glykanberoende (figur 5D,E). Genom att förfina sökparametrarna med hjälp av massorna av glykaner som avslöjas genom öppen sökning och därefter införliva manuellt kuraterad glykanfragmentinformation i riktade sökningar kan en mer detaljerad analys av glykopeptider i prover erhållas.

Figure 1
Figur 1: Översikt över de viktigaste stegen i beredningen och analysen av bakteriella glykopeptider. Den framgångsrika identifieringen av bakteriella glykopeptider är beroende av generering av högkvalitativa prover som innehåller glykopeptider. Glykopeptidinnehållande prover analyseras sedan av LC-MS, och därefter används öppna sökmetoder för att identifiera potentiella glykopeptider baserade på unika deltamassor. Med hjälp av manuell härdning kan dessa deltamassor identifieras som glykaner. Slutligen, för att förbättra identifieringen av glykopeptider, kan glykaninformation införlivas i glykanfokuserade databassökningar. Förkortningar: LC-MS = vätskekromatografi kopplad till masspektrometri; OD = optisk densitet; SDB-RPS = styrenedivinylbensen-omvänd fas sulfonat; ZIC-HILIC = Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography; PSM = peptidspektrala matchningar; CID = kollisionsinducerad dissociation; ETD = dissociation av elektronöverföring. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Översikt över hur du aktiverar öppen sökning och glykanfokuserade sökningar i FragPipe. (A) Öppen sökning kan aktiveras genom att läsa in det öppna arbetsflödet på fliken Arbetsflöde i FragPipe. För att möjliggöra identifiering av glykaner större än 500 Da i storlek, öka prekursormasstoleransfönstret till 2 000 Da. (B) Glykanfokuserade sökningar efter atypiska glykaner kräver inmatning av glykaninformation på fliken MSFragger för att definiera de förväntade massorna av modifieringarna (i avsnitten Variabla modifieringar och massförskjutningar ), Y-jonerna associerade med dessa glykaner (i listan över Y-jonmassor i glyko/labilen sektion) och glycanfragmentjonerna med låg massa (i listan över diagnostiska fragmentmassor i glyko/labilsektionen ). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Deltamassdiagram med öppna sökresultat för de tre stammarna av Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU och D1279779). I överensstämmelse med kapsellokis mångfald har varje A. baumannii-stam en unik deltamassprofil med framträdande modifieringar av större än 140 Da i storlek, betecknad med de observerade deltamassorna. (A) Inom deltamasseplottet AB307-0294 motsvarar massorna 648,25 och 692,28 modifieringar som överensstämmer med -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-, där QuiNAc4NR modifieras med antingen en 3-OH-butyrat- eller acetylgrupp64. (B) Inom ACICU-deltamassdiagrammet motsvarar massorna 203,08 och 843,31 modifieringar som överensstämmer med HexNAc och Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc, respektive65. (C) Inom deltamassplottet D1279779 motsvarar massorna 203.08, 794.31 och 1588.62 HexNAc, HexNAc-217-187-187 och en dimer av HexNAc-217-187-187. Deltamassor som manuellt bedöms och bekräftas i figur 4 vara glykaner betecknade med *. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: MS / MS-karakterisering av deltamassor observerade över de tre stammarna av Acinetobacter baumannii. (A, B)  AB307-0294, (C) ACICU och (D) D1279779. Interaktiv peptidspektral annotatorassisterad kommenterad spektra av representativa glykopeptider. För varje spektrum betecknas peptidfragmentjonerna i blått och rött, medan de manuellt tilldelade glykanassocierade jonerna betecknas i grönt. Glykaner har kommenterats med hjälp av symbolnomenklaturen för glykaner med HexNAc betecknad som en kvadrat, Hex som en cirkel och atypiska monosackarider betecknade som trapezoider med massan av glykanen betecknad i trapezoiderna. Förkortning: MS/MS = tandemmasspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Jämförelse av glykopeptider identifierade över stammar av Acinetobacter baumannii med användning av öppen vs glykanfokuserad sökning. (A-C) Jämförelse av hyperpoäng och antal PSM-tilldelningar inom D1279779, ACICU och AB307-0294 med öppen och glykanfokuserad sökning. (D-F) Jämförelse av enskilda MS2-händelser som tilldelats samma peptidsekvens med hjälp av öppna och glykanfokuserade sökningar efter D1279779, ACICU och AB307-0294. Förkortning: PSM = peptidspektral matchning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

A. baumannii Stammar Uniprot Proteome-ID:er
AB307-0294 15 40006924
ACICU 47,48 300008839
D1279779 49 UP000011860

Tabell 1. Stam- och Uniprot Proteome-ID som används inom denna studie.

Buffertens namn Buffertsammansättning / pH
Buffert A* 2% acetonitril i 18,2 MΩ H2O, 0,1% trifluroättiksyra / pH 1,0
PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 och 2 mMKH2PO4 / pH 7,4
Reduktions-/alkyleringsbuffert 100 mM Tris 2-karboxyetylfosfinhydroklorid, 400 mM 2-kloracetamid i 1 M Tris / pH 7,5
SDB-RPS stegtips elueringsbuffert 5% ammoniumhydroxid i 80% acetonitril / pH 11
SDB-RPS stegtips equlibration buffert 30% metanol, 1% trifluroättiksyra, i 18,2 MΩH2O/ pH 1,0
SDB-RPS stegtips equlibration/tvättbuffert 90% isopropanol, 1% trifluroättiksyra / pH 1,0
SDB-RPS Stegtips tvättbuffert 1% trifluroättiksyra i 18,2 MΩH2O/ pH 1,0
SDC-lysbuffert 4% SDC i 100 mM Tris / pH 8,5
ZIC-HILIC elueringsbuffert 0,1% trifluroättiksyra i 18,2 MΩH2O/pH 1,0
ZIC-HILIC lastnings-/tvättbuffert 80% acetonitril, 1% trifluroättiksyra i 18,2 MΩH2O/ pH 1,0
ZIC-HILIC förberedelsebuffert 95% acetonitril i 18,2 MΩH2O/ pH 7,0

Tabell 2: Sammansättning av buffertar som används i denna studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Öppen sökning är en effektiv och systematisk metod för identifiering av okända modifieringar. Medan identifieringen av okända glykaner i bakteriella proteomprover traditionellt har varit ett tidskrävande och tekniskt specialiserat företag, möjliggör den senaste utvecklingen av verktyg som MSfragger21,41 och Byonic31,38 nu en snabb och effektiv identifiering av deltamassor för ytterligare karakterisering som potentiella glykaner fästa vid peptider. Öppen sökning av både standard- och glykopeptidberikade proteomprover kan identifiera potentiella glykopeptider (Figur 1). Gemensamheten och överflödet av glykopeptider i proteomet hos många bakteriesystem gör det möjligt att direkt detektion av dessa modifieringar utan glykopeptidanrikning6. Även om glykopeptidanrikningsmetoder vanligtvis fortfarande överträffar icke-richmentbaserade metoder för många glykosyleringssystem70, är det anmärkningsvärt att inte alla glykaner är lika mottagliga för anrikning 71,72. Detta faktum bör beaktas vid bestämning av det lämpligaste tillvägagångssättet för att identifiera glykosyleringshändelser med hjälp av öppen sökning efter ett givet biologiskt prov.

Medan öppen sökning effektivt identifierar glykaner som observerats vid en hög frekvens i ett prov, är det fortfarande ineffektivt för att identifiera glykosyleringshändelser som sällan förekommer inom dataset. I praktiken måste minst 10 PSM med identisk deltamassa finnas i proverna för att en unik deltamassa av en glykan ska kunna identifieras. Denna minsta frekvens gör det möjligt att särskilja en potentiell glykan över bakgrundsdeltamasstilldelningar (figur 3). Även om detta kriterium vanligtvis uppfylls av allmänna glykosyleringssystem som riktar sig mot flera substrat för glykosylering, kan system där ett enda protein är riktat mot glykosylering vara mindre mottagliga för detta tillvägagångssätt. I takt med att MS-instrumentens hastighet och känslighet förbättras är det troligt att detta i allt högre grad kommer att möjliggöra bedömning av glykopeptidpopulationer med lägre förekomst, vilket i sin tur kommer att öka effektiviteten hos öppna sökmetoder, förutsatt att tillräckliga kvalitetsspektra kan genereras för sällsynta/låga rikliga glykoformer.

Medan MS möjliggör effektiv identifiering av nya glykaner, är det viktigt att notera att denna insikt ensam sällan ger en fullständig strukturell karakterisering av glykopeptider / glykaner, med verktyg som NMR-spektroskopi som fortfarande är kritiska för fullständig glykankarakterisering. Såsom observerats här tillhandahöll MS kompletterande bekräftelse av K-enheter som tidigare bestämts med nmr från isolerade kapslar av A. baumannii ACICU och AB307-029464,65. För den huvudsakliga glykan som identifierades i D1279779 kunde emellertid endast information om de förmodade klasserna av monosackarider inom denna glykan tilldelas MS som inte gav någon information om kopplingstyperna eller stereokemin hos dessa sockerenheter (figur 4). När nya MS-fragmenteringsmetoder blir mer allmänt tillgängliga, såsom ultraviolett fotodissociation73,74, kan mer detaljerad strukturell karakterisering av glykopeptider vara möjlig. Försiktighet bör dock iakttas när man drar slutsatser om kopplingar eller stereokemiinformation med aktuell instrumentering. Utöver dessa överväganden har frågor nyligen väckts om lämpligheten av FDR-baserade kontroller för öppen sökning75. Således, medan öppen sökning är ett kraftfullt tillvägagångssätt, belyser dessa överväganden behovet av försiktighet vid tolkningen av glykanuppdrag baserade på öppen sökinformation ensam.

Även om detta arbete visar att öppen sökning är ett effektivt tillvägagångssätt för oövervakad identifiering av glykaner som används för bakteriell glykosylering, ger öppen sökning ensam tillgång till endast en delmängd av alla glykopeptider som finns i prover. På grund av glykanernas labila natur innehåller glykopeptid PSM vanligtvis ett varierat utbud av glykanassocierade fragment som, om de inte redovisas, kommer att påverka poängsättningen av PSM negativt. För att övervinna detta problem och möjliggöra en mer djupgående identifiering av glykopeptider kan glykaninformationen som erhålls genom öppen sökning därefter användas för att informera glykanfokuserade sökningar (figur 2B). På detta sätt kan öppen sökning, i kombination med manuell bestämning av glykanassocierade fragment, användas för att förbättra kvaliteten och kvantiteten av glykopeptider som tilldelats i prover (Figur 5). Även om förfiningen av glykopeptidsökparametrar utförs manuellt med nuvarande versioner av verktyg, såsom MSfragger, är det troligt att när fältet mognar kommer dessa steg att göras på ett automatiserat sätt. Studier har redan visat beräkningsmetoder för att identifiera upprepande joner med låg molekylvikt associerade med specifika PTM69, samt strategier för att identifiera oxoniumjoner och upprepande Y-jonmassor associerade med okända glykopeptider76. Således är det troligt att dessa steg kommer att införlivas i nya iterationer av verktyg som FragPipe, vilket gör det ännu lättare att identifiera tidigare okända glykosyleringshändelser inom bakteriella och eukaryota prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

N.E.S stöds av ett Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) och ett ARC Discovery Project Grant (DP210100362). Vi tackar Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility of The Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute för tillgång till MS-instrumentering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 G Kel-F Hub point style 3 Hamilton company hanc90514
2-Chloroacetamide Sigma Aldrich Pty Ltd C0267-100G
Acetonitrile Sigma Aldrich Pty Ltd 34851-4L
Ammonium hydroxide (28%) Sigma Aldrich Pty Ltd 338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A Pierce 23228
BCA Protein Assay Reagent B Pierce 23224
C8 Empore SPE Sigma Aldrich Pty Ltd 66882-U An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 5.33002
Isopropanol Sigma Aldrich Pty Ltd 650447-2.5L
Methanol Fisher Chemical M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) Sigma Aldrich Pty Ltd 66886-U An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate Sigma Aldrich Pty Ltd D6750-100G
ThermoMixer C Eppendorf 2232000083
trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride Sigma Aldrich Pty Ltd C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich Pty Ltd 252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture Promega V5073
Vacuum concentrator Labconco 7810040
ZIC-HILIC material Merck 1504580001 Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
  4. Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
  5. Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
  7. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
  8. Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
  9. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
  10. Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
  11. Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
  12. McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
  13. Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
  14. Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
  15. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
  16. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Reviews Microbiology. 3 (3), 225-237 (2005).
  17. Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
  18. Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
  19. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
  20. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: growing up fast. Current Opinion in Structural Biology. 68, 18-25 (2020).
  21. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  22. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
  23. Yu, A., et al. Advances in mass spectrometry-based glycoproteomics. Electrophoresis. 39 (24), 3104-3122 (2018).
  24. Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
  25. Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
  26. Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
  27. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  28. Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
  29. Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
  30. Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
  31. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
  32. Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
  33. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
  34. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  35. Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
  36. Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
  37. Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
  38. Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
  39. Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
  40. Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
  41. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  42. Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
  43. Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
  44. Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
  45. Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
  46. Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
  47. Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
  48. Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
  49. Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
  50. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  51. Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
  52. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  53. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  54. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  55. Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
  56. Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
  57. Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
  58. Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
  59. Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  60. Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
  61. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  62. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
  63. Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
  64. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
  65. Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
  66. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
  67. Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
  68. Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
  69. Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
  70. Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
  71. Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
  72. Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
  73. Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
  74. Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
  75. Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
  76. Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).

Tags

Biokemi Utgåva 177 Glykosylering,Acinetobacter baumannii Öppen sökning Posttranslationella modifieringar Proteomik
Tillämpningen av öppna sökbaserade metoder för identifiering av <em>Acinetobacter baumannii</em> O-länkade glykopeptider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L.,… More

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L., McDaniels, T. A., Scott, N. E. The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides. J. Vis. Exp. (177), e63242, doi:10.3791/63242 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter