Summary
Burada, mikromanipülasyon yoluyla sol ön inen koroner arterin hassas ligasyonu ile farelerde miyokard enfarktüsü veya miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarını indükleyebilen basit ve tekrarlanabilir bir yöntem tanımlanmıştır.
Abstract
Akut miyokard enfarktüsü, mortalitesi yüksek yaygın bir kardiyovasküler hastalıktır. Miyokardiyal reperfüzyon hasarı, kalp reflowunun yararlı etkilerine karşı koyabilir ve sekonder miyokard hasarına neden olabilir. Miyokard enfarktüsü ve miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının basit ve tekrarlanabilir bir modeli araştırmacılar için iyi bir araçtır. Burada, mikromanipülasyon yoluyla sol ön inen koroner arterin (LAD) hassas ligasyonu ile bir miyokard enfarktüsü (MI) modeli ve MIRI oluşturmak için özelleştirilebilir bir yöntem açıklanmaktadır. LAD'nin doğru ve tekrarlanabilir ligatür konumlandırması, kalp hasarı için tutarlı sonuçlar elde edilmesine yardımcı olur. ST segmenti değişiklikleri, model doğruluğunu belirlemeye yardımcı olabilir. Miyokard hasarını değerlendirmek için serum kardiyak troponin T (cTnT) seviyesi, miyokardiyal sistolik fonksiyonu değerlendirmek için kardiyak ultrason ve enfarktüs boyutunu ölçmek için Evans-Blue/trifenil tetrazolyum klorür boyaması kullanıldı. Genel olarak, bu protokol prosedür süresini kısaltır, kontrol edilebilir enfarktüs boyutunu sağlar ve farenin hayatta kalmasını iyileştirir.
Introduction
Akut miyokard enfarktüsü (AMİ) dünya çapında yaygın bir kardiyovasküler hastalıktır ve yüksek mortalite taşır1. Teknolojilerdeki gelişmeler, hastaları için erken ve etkili revaskülarizasyonu mümkün kılmaktadır. Bazı hastalarda bu tedavilerden sonra miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı (MIRI) oluşabilir2. Bu nedenle, eylem mekanizmalarını ve MI/MIRI'nin nasıl iyileştirileceğini anlamak büyük önem taşımaktadır. Fareler, düşük maliyetleri, hızlı üreme süreleri ve genetik değişiklik yapma kolaylıkları nedeniyle model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır3. Bilim adamları, 4,5,6,7,8,9 numaralı hayvanlarda MIRI ve MI'yı modellemek için farklı yöntemler geliştirdiler. Bu strateji araştırmayı teşvik eder, ancak kullanılan farklı kriterler ve yöntemler, araştırma ekipleri arasında sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır.
Farelerde MI, izoproterenol10, kriyoyaralanma 11,12 veya koterizasyon13 ile indüklenmiştir. MI, izoproterenol tarafından kolayca indüklenebilir, ancak patofizyolojik süreç klinik MI'dakinden farklıdır. Kriyoyaralanmaya bağlı MI, zayıf tutarlılığa sahiptir, sol ön inen koroner arter (LAD) çevresinde aşırı miyokardiyal hasara neden olur ve kolayca aritmiye neden olabilir. Koterizasyona bağlı MI, miyokard enfarktüsünün doğal sürecinden oldukça farklıdır ve yanma alanındaki enflamatuar reaksiyon daha yoğundur; Ek olarak, cerrahi yaklaşımın teknik zorlukları vardır. Ayrıca, girişimsel teknikle balon blokajı veya embolizasyon veya tromboz yöntemi kullanarak minipiglerde MI modeli geliştiren bazı laboratuvarlar14 bulunmaktadır. Tüm bu yöntemler doğrudan koroner arter tıkanıklığına neden olabilir, ancak koroner anjiyografi cihazlarına ve hepsinden önemlisi fare koroner arterlerinin çok ince olmasına ihtiyaç duyulması bu ameliyatları pratik olmaktan çıkarır. MIRI için, farklı modeller arasındaki farklar, solunum cihazları / mikromanipülasyon kullanmak veya 5,6 kullanmamak gibi oldukça mütevazıydı.
Burada, daha önce yayınlanmış 4,5,6,7,8,9,15 yöntemlerinden uyarlanan MI ve MIRI modelini indükleyebilecek basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, LAD'nin ligasyon yoluyla doğrudan bloke edilmesiyle patofizyolojik süreçleri simüle edebilir. Ayrıca, ligasyonu hafifleterek, bu model aynı zamanda reperfüzyon hasarını da simüle edebilir. Bu protokolde, LAD görselleştirmesi için bir diseksiyon mikroskobu kullanılır. Daha sonra, araştırmacı LAD'yi kolayca tanımlayabilir. Daha sonra, LAD'nin doğru bağlanması, tekrarlanabilir ve öngörülebilir kan tıkanıklığına ve ventriküler iskemiye yol açar. Ayrıca, elektrokardiyografi (EKG) değişiklikleri, mikroskop altında gözlenen LAD'nin renk değişikliklerine ek olarak iskemi ve reperfüzyonu doğrulamak için kullanılabilir. Bu strateji, daha kısa bir prosedür süresine, daha düşük cerrahi komplikasyon riskine ve daha az deneysel fareye ihtiyaç duyulmasına yol açar. Troponin-T testi, kardiyak ultrason ve trifenil tetrazolyum klorür (TTC) boyama yöntemleri de açıklanmaktadır. Genel olarak, bu protokol MI/MIR mekanizmasının yanı sıra ilaç keşfi çalışmaları için de yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları, Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (Wuhan, Çin) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
NOT: Model olarak erkek C57BL/6J fareler (8-10 hafta) kullanılmıştır. Fareler yiyecek ve suya serbestçe erişebilir ve belirli patojen içermeyen koşullarda yetiştirilir. Oda, kontrollü sıcaklık (22 °C ± 2 °C) ve nem (%45-%65) altında tutulur. Fareler, bu kurum tarafından belirlenen yönergelere göre Tongji Tıp Fakültesi (Wuhan, Çin) Hayvan Bakım Tesisinde 12 saatlik aydınlık / karanlık bir ortama maruz bırakılır. Steril mikrocerrahi aletler ve cerrahi malzemeler kullanın. İşlem boyunca cerrahi eldiven ve maske takılması gerekmektedir. Deneysel iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- Cerrahi prosedür boyunca önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığı (37 °C) olan dikdörtgen bir ameliyat masası (OT) kullanın (Şekil 1B). Prosedüre başlamadan önce tahtayı ultraviyole ışık ve% 70 alkol ile dezenfekte edin.
- İhtiyaç duyulan anestezik ilaçların dozunu hesaplamak için tüm fareleri doğru bir şekilde tartın. Daha sonra, fareleri intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile uyuşturun. Ayak parmağını kıstırma ve göz kırpma reflekslerine geri çekilme refleksinin yokluğunda uygun anestezi derinliğini sağlayın.
- Gözlerin aşırı ısınmasını önlemek için fareyi başın altına gazlı bezle OT'ye sırtüstü yerleştirin. Kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
- Sol prekordiyal göğsündeki kürkü elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin. Önceden traş edilmiş göğüs kafesinde tüy dökücü bir krem kullanın ve steril bir pamuklu çubukla ~1 dakika boyunca eşit şekilde masaj yapın. Fazla gevşek kürkü gazlı bezle silin.
- Alanı temizlemek için povidon-iyot ve ardından %70 alkol kullanın. Göğüs kafesi gazlı bezle örtün.
- Ağzı hafifçe açık tutmak ve kanülasyonu kolaylaştırmak için üst kesici dişlerin altında 4-0'lık bir dikiş kullanın ve bağlantı noktasına (OT'nin burun üzerindeki kenarına yakın) sabitleyin.
- Gövdeyi düz tutmak için kuyruğu çekin ve kuyruğu bant kullanarak OT'ye sabitleyin. Dört uzvu sabitleyin ve diğer bağlantı noktalarında sıkın. Daha da önemlisi, ön uzuvları aşırı germeyin; Aksi takdirde solunum yetmezliği meydana gelebilir.
- Çeneyi açmak ve dili kaldırmak için kavisli forseps ve forseps kullanın. Boğazı ve glottisi net bir şekilde görselleştirmek için bir aydınlatıcı kullanın.
- 22-G'lik bir kanülü, körelmiş ve kesik bir iğne ile ağızdan boğazın ~1 cm aşağısında trakeaya nazikçe sokun. Dili tutmak için bir elinizi kullanın, künt forseps ile hafifçe yukarı doğru hareket ettirin ve aynı anda tüpü trakeaya nazikçe yerleştirmek için diğer elinizi kullanın. Tüpü yemek borusuna sokmamaya dikkat edin.
- İğneyi yavaşça çıkarın. Ventilatöre bağlanmadan önce tüpü suya yerleştirerek kabarcıkların oluşması için entübasyonu kontrol edin.
- Endotrakeal tüpü 120/dk'ya ve tidal volüm 250 μL'ye ayarlanmış bir ventilatöre bağlayın.
NOT: Ventilatör ayarı vücut ağırlığına göre ayarlanır (genel olarak, daha yüksek bir vücut ağırlığı, daha yüksek bir tidal hacim gerektirir). - Bilateral simetrik göğüs genişlemesini kontrol ederek entübasyonu doğrulayın. Ardından, borunun düşmesini önlemek için bağlantı OT'ye bantla sabitlenir.
- EKG elektrotlarını pençelere yerleştirin ve EKG kayıt cihazına bağlayın. Prosedür boyunca kardiyak elektrofizyolojiyi izleyin.
2. Torakotomi
- Göğüs kafesindeki gazlı bezi çıkarın. Üç ovma döngüsü kullanarak kesi alanları için% 70 alkol ile tekrar dezenfekte edin. Ardından, cerrahi bölgenin kontaminasyonunu azaltmak için fareyi cerrahi alan üzerinde bir delik bulunan steril bir cerrahi örtü ile örtün.
- Steril bir neşter ile sol orta klaviküler çizgi boyunca eğik bir cilt insizyonu (0.8-1.0 cm) yapın.
- Altındaki kaburgaları ortaya çıkarmak için deri altı dokuların künt diseksiyonunu yapın. Damarlara, kaburgalara ve akciğerlere zarar vermemeye dikkat edin. Steril pamuk aplikatörleri kullanarak kanamayı durdurun.
- Üçüncü interkostal boşlukta yaklaşık 6-8 mm'lik bir kesi tanımlayın ve yapın. Ardından, göğüs boşluğunu açmak için kıyılar arası boşluktaki dokuların künt diseksiyonunu gerçekleştirin. İç torasik artere zarar vermemeye dikkat edin.
- İnterkostal boşluğu yaymak için forseps kullanın. Önceden sterilize edilmiş ev yapımı ekartörleri (Şekil 1C) göğüs kafesine yerleştirin ve kesiği ~6 mm genişliğe yaymak için geri çekin. Ekartörleri lastik bantlarla OT'ye takın.
- Kalbi tamamen ortaya çıkarmak için çevredeki dokuları dikkatlice çıkarın. Kalbi incitmeden perikardları kavisli forseps ile nazikçe çekin. Artık kalbin net bir görüntüsü mevcuttur.
3. LAD ligasyonu
NOT: LAD, apeksin yakınından ve sol ventrikülden aşağıya doğru dik uzanan ince kırmızı bir çizgi olarak görünür. LAD parlak kırmızı renktedir, bu yüzden onu bir damarla karıştırmamaya dikkat edin. Genellikle ligasyon bölgesi sol kulak kepçesinin ~1-2 mm altındadır. Bu ligasyon pozisyonu, sol ventriküldeki iskeminin yaklaşık% 40-50'sini üretecektir. Daha yüksek bir konum, daha geniş bir enfarktüs bölgesi oluşturacaktır. Daha uzak bir bölge daha küçük bir enfarktüs bölgesi oluşturacaktır.
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve LAD görselleştirmesi için odaklanmış ve uygun bir ışığı yönlendirin. LAD'yi geçici olarak büyütmek için seçilen ligasyon pozisyonunun altındaki bölgeye hafifçe bastırın (her seferinde ≤5 s). LAD'yi bu şekilde yeniden kontrol edin.
- 8-0'ı geçmek için konik bir iğne (3/8, 2,5 x 5) kullanın diseksiyon mikroskobu altında LAD'nin altındaki ipek bağ. İğne derinliğine dikkat edin: sol ventriküle giremeyecek kadar derin ve LAD'ye zarar vermemek için çok sığ değil.
- Bağı gevşek bir çift düğümle bağlayın. Döngü çapı yaklaşık 2-3 mm'dir.
- 2-3 mm'lik bir PE-10 tüpünü artere paralel bir halkaya yerleştirin.
- Bağ halkasını arter ve hortumun etrafına gelene kadar hafifçe sıkın. Ardından, halkayı bir kayma düğümü ile sabitleyin. Aşırı sıkma basıncı ile miyokard duvarına zarar vermemeye dikkat edin.
NOT: Sahte işlem grubu için ligasyon yapılmaz. - LAD'de kan akışının kesildiğini onaylayın: ligasyondan sonra LV'nin ön duvarında daha soluk bir renk gözlemleyin. Ek olarak, birkaç kalp atımı içinde belirgin ST yükselmesi de oklüzyon16'yı gösterir. Kalıcı ligasyon gerekiyorsa (örneğin, MI), PE-10 borusunu çıkarın ve LAD'yi doğrudan bir düğümle bağlayın. Aşağıdaki adım 4.3'te belirtildiği gibi kalan prosedüre devam edin.
- Ekartörleri kesiden çıkarın. Ardından, yarayı geçici olarak bir bulldog kelepçesi ile kapatın. İskemi süresi deneysel tasarıma göredir. Farenin ventilatöre bağlı kalmaya devam ettiğinden emin olun.
4. Reperfüzyon
- İskemi süresi sona erdiğinde, bulldog kelepçesini çıkarın ve insizyonu açmak ve kalbi (özellikle ligasyon bölgesini) ortaya çıkarmak için ekartörleri tekrar yerleştirin.
- Slipknot'u çözün ve PE-10 borusunu çıkarın. Bu adımda, rengin 20 saniye içinde pembe-kırmızıya döndüğünü gözlemleyerek kan akışının restorasyonunu onaylayın. Aynı zamanda, EKG'yi dikkatlice izleyin: ST yükselmesinin potansiyel bir çözünmesi de reperfüzyonu düşündürür.
- 8-0'dan ayrıl sonraki Evans-Blue ve TTC boyama için yerinde ligatür. Diğer durumlarda, bu adımda dikişi çıkarın.
- Ekartörleri çıkarın ve üçüncü ve dördüncü kaburgaları 4-0 naylon dikişle dikerek kesiyi kapatın. Akciğere zarar vermemeye dikkat edin. Dikiş düğümlerini bağlarken göğse hafifçe bastırarak göğüs boşluğunda sıkışmış olabilecek havayı dışarı itin.
- Kas tabakalarını sürekli dikişlerle kapatın. Cildi 4-0 naylon sütürle kapatın; Sürekli dikişler ve kesintili dikişler kabul edilebilir.
5. Ameliyat sonrası bakım
- Anesteziden iyileşme belirtileri, örneğin kuyruğun veya bıyıkların hareketi için fareyi dikkatlice gözlemleyin. Bundan sonra, fare genellikle yaklaşık 150 bpm'lik bir solunum hızıyla normal bir solunum düzenine devam eder. Tüpü yavaşça çıkararak fareyi ekstübe edin.
- Solunum sıkıntısı olmadığından emin olmak için fareyi 3-5 dakika daha izleyin.
- Fare nefes almaya başladıktan sonra 100 μL buprenorfin (0.1 mg/mL, s.c.) uygulayın. Sonraki 24 saat boyunca, her 4-6 saatte bir ek bir doz sağlayın. Ameliyattan 2 gün önce ve ≤7 gün sonra içme suyunda 0.2 mg / mL'lik bir çözelti olarak ek ağrı kesici olarak ibuprofen sağlayın.
- Fareler anesteziden sonra hipotermiye eğilimli olduklarından, ısı yalıtım battaniyeleri kullanarak fareleri sıcak tutun ve ölüm riskini azaltın.
6. Prosedürden sonra doğrulama
- Troponin-T testi
- Retroorbital pleksuslardan kan örnekleri toplayın ve serumları santrifüjle izole edin (3.000 × g, 10 dakika, oda sıcaklığı).
- Troponin-T testi için 20 μL serumu 100 μL'ye salin solüsyonu ile seyreltin. Numunelerin geri kalanını -80 °C'de saklayın.
- Troponin T'yi (cTnT) üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir kit kullanarak tespit edin.
- Kardiyak ultrason
NOT: Kardiyak ultrason, deneysel tasarıma göre ameliyattan önce ve sonra farklı aşamalarda kardiyak fonksiyon ve duvar hareketi anormalliklerini değerlendirmek için kullanılır17,18. Ventriküler duvar kalınlığı, ventriküler hacim, ventrikül kavite çapı, ejeksiyon fraksiyonu ve kısa eksen kısalma fraksiyonu gibi farklı parametreler ölçülür.- Fareleri intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile uyuşturun.
- Göğsü elektrikli tıraş bıçağıyla tıraş edin. Kürk temizleme kremi kullanın ve eşit şekilde masaj yapın. Fazla gevşek kürkü gazlı bezle silin.
- Fareyi OT'nin üzerine yerleştirin ve dört uzvu yapışkan bantla sabitleyin.
- Ultrason probunu (30 MHz) kalbin ön bölgesine sternuma ~ 30° açıyla yerleştirin. Bu görünümdeki prob, kalbin uzun ekseni ile hizalanmıştır. Ultrasonu B Moduna ayarlayın; Sol ventrikül, sol atriyum, mitral kapak ve çıkan aort net olarak tanımlanabilir. Sonraki analiz için veri elde etmek üzere video yakalamayı kullanın.
- Dönüştürücüyü saat yönünde 90° döndürerek, sol ve sağ ventrikülleri net bir şekilde tespit etmek için papiller kaslar seviyesinde bir parasternal kısa eksen görünümü elde edin. Ardından kardiyak fonksiyonu ve morfometriyi değerlendirmek için B-Modu ve M-Modu'nu kullanın.
- Sol ventrikül diyastol sonu çapını (Dd), sistolik sonu çapını (Ds) ve interventriküler septal kalınlığı ultrason görüntülerinde karşılık gelen yeri belirterek hesaplayın.
NOT: Makine, sol ventrikül diyastol sonu hacmini (LVEDV) ve sistolik sonu hacmini (LVESV) manuel olarak hesaplar. Ayrıca makine, FS = (Dd-Ds)/Dd × %100 ve EF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV × %100 formüllerini kullanarak kesirli kısalma (FS) ve ejeksiyon fraksiyonu (EF) değerlerini hesaplayacaktır. Ardışık beş kardiyak döngü seçin ve ortalama değerlerini elde edin.
- Miyokard enfarktüsü boyutunun ölçülmesi
NOT: Evans-Blue/TTC boyama, doku canlılığını değerlendirebildiği için enfarktüs boyutunu ölçmek için kullanılır19. Yara izi küçüleceği için reperfüzyondan sonraki 72 saat içinde boyanması önerilir. Bu adım, hayvana intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 200 mg / kg pentobarbital sodyum ile ötenazi yapıldıktan sonra gerçekleştirilir.- 2.2-2.5 adımlarındaki önceki prosedürleri izleyerek kalbi tekrar açığa çıkarın. Ardından, istenen reperfüzyon süresinin sonunda adım 4.3'te belirtilen sütür tarafından doğrulanan ilk bölgede LAD'yi yeniden bağlayın.
- Aortu kanül edin ve ardından kalbi 0.3 mL% 1 Evans Blue çözeltisi ile perfüze edin. İskemik olmayan bölgenin miyokardları mavi renktedir. Perfüzyondan sonra aortu makasla keserek kalbi hızla çıkarın.
- Ardından, kalbin atmasını durdurmak için kalbi KCl solüsyonunda (30 mM) yıkayın. Çevresindeki yağ dokusu çıkarıldıktan sonra -20 °C'de ≥4 saat saklayınız.
- Keskin bir neşter kullanarak kalbi enine yönde 1 mm kalınlığında beş dilim halinde kesin. Dilimleri tartın ve ardından 37 °C'de 40 dakika boyunca %2 TTC ile inkübe edin.
NOT: İnkübasyondan sonra, enfarktüslü bölgeler beyaz olarak ayrılırken, enfarktüslü olmayan bölgelerdeki canlı dokular kırmızı kalır. - Dilimleri gece boyunca %4 formaldehit ile sabitleyin.
NOT: Bu eylem, enfarktüs alanı ile enfarktüs olmayan alan arasındaki kontrastı artıracaktır. Ayrıca dilimleri küçültecektir. - Dilimleri bir dijital kamerayla fotoğraflayın. Ardından, grafik yazılımı kullanarak risk altındaki alanı (AAR), enfarktüs alanını ve iskemik olmayan bölgeyi hesaplayın.
NOT: Evans-Blue/TTC çift boyamadan sonra mavi alan "normal" alandır. Kalan alanlar (beyaz ve kırmızı dahil) "iskemi riski" alanlarıdır: beyaz alan miyokard enfarktüsü alanıdır (IA) ve kırmızı alan iskemik (ancak enfarktüs olmayan) alandır. Kalp dilimlerinin boyutlarının tutarsızlığı dikkate alınarak, sonuçlar ağırlığa göre ayarlanır.
Atamak:
A1-A5 Enfarktüs bölgesi alanı / Kalp dilimi alanı için;
B1-B5 Enfarktüs olmayan bölge alanı / Kalp dilimi alanı için;
Kalp diliminin ağırlığı için W1-W5.
Sonra:
Enfarktüslü miyokardın toplam ağırlığı: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
Enfarktüssüz miyokardın toplam ağırlığı: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
AAR'nin toplam ağırlığı = (G1 + G2 +G3 + G4 + G5) - (G1 × A1 + G2 × A2 + G3 × A3 + G4 × A4 + G5 × A5)
Nihayet:
Miyokard iskemisi alanı, sol ventriküldeki AAR yüzdesi olarak hesaplanır:
Miyokard enfarktüsü alanı, AAR'deki IA yüzdesi olarak hesaplanır:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. Araştırmacı, çalışma başlatıldıktan sonra deneysel tasarıma göre zaman düğümlerini planlayabilir. LAD ligasyonunun süresi araştırma amacına göredir. MI için, araştırma reperfüzyon adımını göz ardı edebilir. Kardiyak ultrason, non-invaziv olduğu için çalışmanın farklı aşamalarında mevcuttur, Evans-Blue / TTC boyama ise sadece fare feda edildiğinde gerçekleştirilebilir. Fibroz ve ventriküler yeniden şekillenmeye odaklanan araştırmalar için gözlem süresi çok daha uzundur.
Deney sürecinin bir kısmı için tipik görüntüler, endotrakeal entübasyon, cilt insizyonu, torakotomi, LAD tanımlama, LAD ligasyonundan reperfüzyona kadar Şekil 2A'da gösterilmektedir. Miyokardiyal iskemi ve reperfüzyonu doğrulamak için, düğüm çözüldüğünde ligasyon ve ST elevasyonunun çözülmesinden sonra önemli ST elevasyonu olan temsili EKG görüntüleri Şekil 2B'de gösterilmektedir.
Tüm farelerden kan örnekleri alındıktan sonra, enfarktüsü doğrulamak için troponin-T testi yapılabilir. Şekil 3A , sham gruplarıyla karşılaştırıldığında MIRI ve MI gruplarında önemli bir cTnT artışını göstermektedir. Şekil 3B , sahte grup ve MIRI grubu arasında kalbin beş ardışık enine kesiti için Evans-Blue ve TTC'nin çift boyanmasını göstermektedir. Mavi alan normal alanı, beyaz alan miyokard enfarktüsü alanını ve kırmızı alan iskemik ancak enfarktüs olmayan alanı gösterir. Şekil 3C , sham grubu ve MI grubu arasındaki kardiyak ultrasonun uzun eksenli görüntülerini temsil etmektedir. Yazılım uygulamaları, Şekil 3C'deki sahte grup için MI grubundakine kıyasla daha yüksek bir ejeksiyon fraksiyonu değeri gibi farklı fonksiyonel parametreleri hesaplamak için kullanılabilir.
Şekil 1: Cerrahi düzenek. (A) Deneysel zaman çizelgesine genel bakış. (B) Önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığı ve EKG elektrotları için bağlantıya sahip çalışma masası. (C) Ev yapımı ekartörler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Deneysel süreç ve EKG değişiklikleri. (A) Endotrakeal entübasyon, cilt insizyonu, torakotomi, LAD tanımlama, LAD ligasyonu ve reperfüzyon görüntüleri sırasıyla 1, 2, 3, 4, 5 ve 6'da gösterilmiştir. (B) Ligasyon ve reperfüzyondan sonra MI ve MIRI'nin tipik EKG görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Prosedürden sonra doğrulama. (A) Şam, MIRI 24 saat ve MI 3 d grupları arasında kardiyak troponin ekspresyonu. (B) Sahte ve MIRI 24 saat grupları için Evans -Mavi/ TTC çift boyama. (C) Sahte ve MI grupları için kardiyak ultrason. LVID; d, diyastol sonu sol ventrikül iç boyutu; LVID; s, sistolik sol ventrikül iç boyutu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda, klinik ve bilimsel araştırmalarda MI ve MIRI için modellerin oluşturulması hızla gelişmiştir20,21. Bununla birlikte, eylem mekanizmaları ve MI/MIRI'nin nasıl iyileştirileceği gibi çözülmesi gereken bazı sorular var. Burada, MI ve MIRI'nin bir murin modeli oluşturmak için değiştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Birkaç önemli nokta dikkatlice düşünülmelidir.
İlk kilit nokta endotrakeal entübasyondur. Bazı prosedürler 6,9 servikal cildin kesilmesini, doku ayrılmasını ve ardından trakeayı görüntülemek için sternohyoideus kasının açığa çıkarılmasını içerir. Bu şekilde, araştırmacı trakeaya tüp yerleştirilmesini görselleştirebilir. Bu, solunum sıkıntısı riskini azaltmak için iyi bir adımdır. Mevcut yöntemde, araştırmacı bir aydınlatıcı altında nefes alarak glotisin kapanıp açılmasını net bir şekilde görselleştirebilir ve ardından tüpü trakeaya kolayca yerleştirebilir. Bu nedenle, enflamatuar sinyal araştırmalarında önemli olan cilt travmasını ve potansiyel enfeksiyonları azaltmak için servikal bir kesi yapılmaz. Görsel laringoskoplar klinik trakeal entübasyonda yaygın olarak kullanılmaktadır: belki farelerde de kullanılabilirler. Mares ve ark.22, hayvanın burnuna ve ağzına yerleştirilen non-invaziv bir maske aracılığıyla uygulanan oksijenle %5 izofluran indüksiyonundan sonra %2 izofluran inhalasyonu ile gerçekleştirilen endotrakeal entübasyon olmadan sürekli maske inhalasyon anestezisini bildirmiştir. Doku hasarlarını önleyebilir ve anestezinin güvenliğini ve etkinliğini artırabilir. Bununla birlikte, özel bir inhalasyon anestezi makinesine ihtiyaç vardır. Ayrıca, uçucu anestezikler operatöre fiziksel zarar verebilir.
İkinci ve en önemli kilit nokta, LAD'nin tanımlanması ve bağlanmasıdır. LAD tanımlama ve ligasyonundaki her hata tutarsız sonuçlara yol açacaktır: ya ölümle sonuçlanan çok büyük enfarktüs boyutu ya da başarısızlıkla sonuçlanan çok küçük enfarktüs boyutu. LAD'yi tanımlamak ve ligasyonunu doğrulamak için çeşitli yöntemler uygulanabilir. Burada, LAD'yi bulmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanılır. LAD genellikle apeksin yakınından ve sol ventrikülden aşağıya doğru dik uzanan ince kırmızı bir çizgi olarak görünür. LAD'yi geçici olarak büyütmek için (her seferinde ≤5 s) seçilen ligasyon pozisyonunun altındaki bölgeye hafifçe basarak, LAD tekrar kontrol edilebilir. Ligasyondan sonra, LAD oklüzyonu sol ventrikülün ön duvarında daha soluk bir renk ve birkaç kalp atışı içinde belirgin ST yükselmesi ile doğrulanır. Daha sonra, ligasyon çözülür ve reperfüzyon, 20 saniye içinde pembe-kırmızıya geri dönen bir renk değişikliği ve EKG üzerine ST yükselmesinin potansiyel çözünmesi ile doğrulanır. Son olarak, miyokard hasarını değerlendirmek için troponin-T testi, TTC boyaması ve kardiyak ultrason kullanılır. Bu çoklu sigortalar ve karşılıklı doğrulamalar, deneysel sonuçları son derece güvenilir kılmaktadır. Ayrıca, mikromanipülasyon daha yüksek doğruluk ve daha az komplikasyon (örneğin kanama) ortaya çıkarır. Bir diğer önemli konu, farelerin kan damarlarının normal olduğu varsayımıdır, ancak aslında bazı koroner arterler büyük ölçüde değişir ve hatta kollateral dolaşım bile23,24 sunabilir. Bu nedenle, ligasyonların aynı seviyede olduğu kabul edilse bile enfarktüs boyutları bazen tutarlı değildir. Mikroskobun avantajları burada sergilenmektedir. Ligasyon sadece deneyime veya anatomik işaretlere dayalı olarak yapılamaz: LAD ve yönü ligasyondan önce açıkça doğrulanmalıdır, aksi takdirde sonuçlar güvenilmez olacaktır. Bazı deneylerde6,8, fareler, kalbe maruz kaldıktan sonra sol ventrikülün ön duvarını ve koroner arterleri gözlemleme kolaylığı için sağ lateral dekübit pozisyonundadır.
Bu modelin iki ana sınırlaması vardır. İlk olarak, LAD ligasyonu sağ koroner arterin tıkanıklığını simüle edemez. Aslında, hayvanlar arasındaki anatomik farklılıklarnedeniyle 25, LAD genellikle farelerde ve sıçanlarda kalbin tepesine kadar uzanır ve sol circumflex dalları gelişmez, bu nedenle farelerde ve sıçanlarda modeller LAD ligasyonu ile kurulur. Tavşanlar ve domuzlar gibi büyük ve orta büyüklükteki hayvanlar için LAD nispeten kısadır, oysa sol sirkumfleks arter kalbin geniş bir alanını kaplar, bu nedenle modeli oluşturmak için sol sirkumfleks arterin ligasyonu seçilir. Sicard ve ark.26 , farelerde sağ koroner arteri bağlayarak sağ ventrikül disfonksiyonunu ve biventriküler etkileşimi araştırmak için bu sınırlamayı giderebilecek yeni bir yöntem bildirmiştir. İkinci sınırlama, koroner arter anatomisindekideğişkenlik 27 ve cerrahın deneyimi nedeniyle tutarsız bir enfarktüs boyutudur. Yukarıda tartışıldığı gibi, mikroskop, ligasyondan önce LAD'yi ve yönünü doğrulayarak tutarlılığı artırmak için çok önemlidir ve deneyimli bir araştırmacı için, vasküler anatominin tam bir değerlendirmesi yapıldıktan sonra ligasyon pozisyonunun ayarlanması çok önemlidir.
Diğer bazı konulardan bahsetmeye değer. Örneğin, torakotomi ve iğne delme, kaçınılmaz olarak kaslarda ve miyokardda hafif hasara neden olur ve bu da iltihaplanma üzerinde etkileri olabilir. Ayrıca analjezik ajanların MI28 üzerine etkileri olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle, inflamasyonu veya MI üzerindeki etkilerini analiz ederken bu faktörler dikkate alınmalıdır. Sorun giderme için, farelerin ölümüne yol açabilecek birkaç faktör vardır. Örneğin, miyokard enfarktüsü, anestezik kaza ve kanama ile ilgili komplikasyonlar. Ayrıca, tutarsız sonuçlar esas olarak uygun olmayan ligasyon pozisyonlarından kaynaklanmaktadır: çok yüksek bir ligasyon pozisyonu, farelerin ölümüne bile çok büyük enfarktüs boyutuna neden olur; bu arada, LAD'nin yanlış tanımlanması model hatasına neden olur. Bu yöntemde bazı detayların iyileştirilmesi gerekiyor. Örneğin, prosedür sırasında sıcaklığı izlemek için bir rektal prob yerleştirilebilseydi daha iyi olurdu. Son olarak, deneyci, hayvan çalışmaları ile klinik gerçekler arasındaki farkları, özellikle de 30 dakikalık iskemi süresinin klinik için oldukça kısa olduğunu akılda tutmalıdır. Araştırmacıyı, iskemi süresi de dahil olmak üzere deney tasarımlarına göre adımları düzenlemeye teşvik ediyoruz. Ancak bu şekilde bu protokol, MI/MIRI'nin mekanizması ve tedavisi ve ilaç keşfi ile ilgili çalışmalar için yararlı olabilir.
Kısacası, MIRI ve MI için basit ve üreme amaçlı bir murin modeli sağlanmıştır. Bu model, MI/MIRI mekanizmalarının incelenmesi ve terapötik araştırmalar için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82070317, 81700390 Jibin Lin'e, 8210021880 Bingjie Lv'ye ve 82000428 Boyuan Wang'a) ve Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2017YFA0208000'den Shaolin He'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Ibanez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van de Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3896 (2012).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51329 (2014).
- Xu, Z., McElhanon, K. E., Beck, E. X., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods in Molecular Biology. 1717, 145-153 (2018).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52206 (2014).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: An improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55353 (2017).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59591 (2019).
- Li, X., et al. Cardioprotective effects of Puerarin-V on isoproterenol-induced myocardial infarction mice is associated with regulation of PPAR-Y/NF-Kappa B pathway. Molecules. 23 (12), 3322 (2018).
- Vanden Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Wang, D., et al. A cryoinjury model to study myocardial infarction in the mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), e59958 (2019).
- Brooks, W. W., Garibaldi, B. A., Conrad, C. H. Myocardial injury in the mouse induced by transthoracic cauterization. Laboratory Animal Science. 48 (4), 374-378 (1998).
- Tao, B., et al. Preclinical modeling and multimodality imaging of chronic myocardial infarction in minipigs induced by novel interventional embolization technique. EJNMMI Research. 6 (1), 59 (2016).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circulation Research. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of myocardial ischemia and reperfusion injury in mice using surface pad electrocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54814 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. High-frequency high-resolution echocardiography: First evidence on non-invasive repeated measure of myocardial strain, contractility, and mitral regurgitation in the ischemia-reperfused murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e1781 (2010).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2100 (2010).
- Shibata, R., et al. Adiponectin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through AMPK- and COX-2-dependent mechanisms. Nature Medicine. 11 (10), 1096-1103 (2005).
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Frank, A., et al. Myocardial ischemia reperfusion injury: From basic science to clinical bedside. Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 16 (3), 123-132 (2012).
- Mares, R. G., et al. Studying the innate immune response to myocardial infarction in a highly efficient experimental animal model. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 573-585 (2021).
- Fernandez, B., et al. The coronary arteries of the C57bl/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, R., Hess, D. T., Reynolds, J. D., Stamler, J. S. Hemoglobin S-nitrosylation plays an essential role in cardioprotection. Journal of Clinical Investigation. 126 (12), 4654-4658 (2016).
- Sorop, O., et al. Experimental animal models of coronary microvascular dysfunction. Cardiovascular Research. 116 (4), 756-770 (2020).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: A novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Kato, R., Foex, P. Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury: An update for anesthesiologists. Canadian Journal of Anaesthesia. 49 (8), 777-791 (2002).
