Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Summary

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

Zebra balığı larvaları, döllenmeden sadece birkaç gün sonra yüksek rejeneratif kapasiteye sahip tamamen işlevsel bir merkezi sinir sistemine (CNS) sahiptir. Bu, bu hayvan modelini omurilik yaralanması ve rejenerasyonunu incelemek için çok yararlı kılar. Bu tür lezyonları indüklemek için standart protokol, gövdenin dorsal kısmını manuel olarak transekte etmektir. Bununla birlikte, bu teknik kapsamlı eğitim gerektirir ve ek dokulara zarar verir. Lazerle indüklenen lezyonlar için bu sınırlamaları aşmak için bir protokol geliştirildi ve eğitimsiz bir operatör için bile birçok hayvan üzerinde ve farklı seanslar arasında omurilik transeksiyonunun yüksek tekrarlanabilirliği ve bütünlüğüne izin verdi. Ayrıca, doku hasarı esas olarak omuriliğin kendisi ile sınırlıdır ve cilt, kas ve CNS gibi farklı dokulara zarar vermenin kafa karıştırıcı etkilerini azaltır. Ayrıca, omuriliğin hemi-lezyonları mümkündür. Lazer hasarından sonra doku bütünlüğünün daha iyi korunması, elektrofizyoloji gibi ek analizler için gerekli olan daha ileri diseksiyonları kolaylaştırır. Bu nedenle, bu yöntem manuel olarak ulaşılamayan yaralanma derecesinin hassas kontrolünü sağlar. Bu, gelecekte bu güçlü modelde yeni deneysel paradigmalara izin verir.

Introduction

Memelilerin aksine, zebra balığı (Danio rerio) yaralanmadan sonra merkezi sinir sistemlerini (CNS) ^onarabilir1. Zebra balığı larvalarının omurilik rejenerasyonu için bir model olarak kullanılması nispeten yenidir. Onarımın altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli olduğu ^{kanıtlanmıştır2}. Bunun nedeni, manipülasyon kolaylığı, kısa deneysel döngü (her hafta yeni larvalar), dokuların optik şeffaflığı ve larvaların in vivo floresan mikroskobu için ideal olan küçük boyutudur.

Omurilik rejenerasyonu durumunda, larva kullanmanın iki ek avantajı, iyileşme hızı, yetişkinler için birkaç haftaya kıyasla birkaç gün ve manuel teknikler kullanarak yaralanmaları indükleme kolaylığıdır. Bu, son araştırmalar da dahil olmak üzere birçok ^{çalışmada3,4,5} başarıyla ^{kullanılmıştır6,7}. Genel olarak, bu anlamlı veri üretiminin artmasına, deneysel protokollerin yüksek uyarlanabilirliğine ve deneysel maliyetlerin azalmasına neden olur. Döllenmeden sonraki 5 günden daha genç larvaların kullanımı, hayvan araştırmalarında 3R ilkelerini izleyerek hayvanların kullanımını da ^azaltır8.

Zebra balığı larvalarında omurilik yaralanmasından sonra, enflamatuar yanıt, hücre proliferasyonu, nörogenez, hayatta kalan veya yeni üretilen hücrelerin göçü, fonksiyonel aksonların reformu ve nöral süreç devrelerinin ve omurga dokularının küresel olarak yeniden şekillendirilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreç meydana gelir6,7,9,10 . Başarılı bir şekilde organize edilmek için, bu süreçler bir dizi hücre tipi, hücre dışı matris bileşenleri ve biyokimyasal sinyaller arasında ince bir şekilde düzenlenmiş bir etkileşimi ^içerir11,12. Omurilik gibi karmaşık bir dokunun bu önemli yeniden yapılanmasının ayrıntılarını çözmek, hassas ve kontrollü deneysel yaklaşımların kullanılmasını ve geliştirilmesini gerektirir.

Zebra balıklarında omurilik rejenerasyonunu incelemek için kullanılan birincil deneysel paradigma, rezeksiyon, bıçaklama veya kriyoyaralanma yoluyla doku hasarını indüklemek için cerrahi araçlar ^{kullanmaktır3,13}. Bu yaklaşımlar, herhangi bir yeni operatör için zaman alıcı olan ve kısa vadeli projelerde kullanılmalarını engelleyebilecek mikrocerrahi becerilerinde özel eğitim gerektirme dezavantajına sahiptir. Ayrıca, genellikle rejenerasyonu etkileyebilecek çevre dokulara zarar verirler.

Başka bir yaklaşım da kimyasal olarak14 veya genetik ^{manipülasyonlarla15} hücre hasarını indüklemektir. İkincisi, yüksek oranda hedeflenmiş hasara izin verir. Bununla birlikte, böyle bir teknik, herhangi bir deney yapmadan önce, her benzersiz bir hücre tipi hedeflendiğinde yenilenen yeni transgenik balıklar üretmek için uzun hazırlık çalışmaları gerektirir.

Bu nedenle, rejenerasyonda çeşitli çalışmalara uygun, hedefe yönelik ancak çok yönlü lezyonlara izin veren bir yönteme ihtiyaç vardır. Bir çözüm, ilgilenilen dokuda lokalize hasarı indüklemek için bir lazer kullanmaktır16,17,18,19,20. Gerçekten de, lazere bağlı doku hasarının kullanımı, birçok avantajı olan omurilik lezyonlarının oluşturulması için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır. Bu tür lazer manipülasyon modülleri ile donatılmış mikroskoplar, zamansal kontrolün ekstra yararı ile hücre ablasyonunun gerçekleşeceği özelleştirilmiş şekilli bir alanın belirlenmesine izin verir. Lezyonun boyutu ve pozisyonu böylece herhangi bir soruyu ele almak için uyarlanabilir.

Çoğu lazer lezyon sisteminin eksik özelliği, bir dizi larva için yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde yaralanmalara neden olma olasılığıdır. Burada, zebra balığı larvalarında yarı otomatik hassas ve kontrollü lezyonları indüklemek için otomatik larva kullanımı için tasarlanmış mikroakışkan bir platforma dayanan orijinal bir protokol ^{açıklanmaktadır21}. Dahası, burada sunulan sistemde, larvalar, hayvanın rostrokaudal ekseni etrafında serbest dönmesine izin veren bir cam kılcal damara yerleştirilir. Kullanıcı, larvaların hangi tarafının lazere sunulacağını seçebilirken, floresan görüntülemenin lazer ışınını tam olarak hedeflemesine ve lezyondan sonraki hasarı değerlendirmesine izin verebilir.

Burada açıklanan protokol, UV lazerle donatılmış bir eğirme diski (bundan böyle VAST sistemi olarak anılacaktır) ile birleştirilmiş yarı otomatik bir zebra balığı larva görüntüleme sistemi ile birlikte kullanılmaktadır. Bununla birlikte, protokolün ana noktaları ve tekniğin iddialarının çoğu, iki fotonlu lazer tarama mikroskopları, UV lazerle sağlanan dönen disk mikroskopları (FRAP modülü) veya fotoğraf manipülasyonu için lazer modüllü video mikroskoplar dahil olmak üzere hücre ablasyonu yapabilen bir lazerle donatılmış herhangi bir sistem için geçerlidir. VAST sistemi ile geleneksel numune işleme arasındaki temel farklardan biri, ikincisi için, larvaların 96 delikli bir plakaya yüklenmesi yerine, cam kapaklar / cam tabanlı Petri tabakları üzerine düşük erime noktalı agarozda monte edilmesinin gerekli olmasıdır.

Bu yöntemin sunduğu faydalar, rejenerasyon sürecinde hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında yenilikçi araştırmalar için fırsatlar sunmaktadır. Ayrıca, yüksek veri kalitesi, multidisipliner bir bağlamda nicel araştırmalara izin verir.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, İngiltere İçişleri Bakanlığı'nın onayıyla ve yönetmeliklerine göre, PP8160052 proje lisansı altında gerçekleştirilmiştir. Proje, Edinburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Deneysel analizler için, her iki cinsiyetten 5 güne kadar olan zebra balığı larvaları aşağıdaki mevcut transgenik çizgilerden kullanılmıştır: Tg (Xla.Tubb: DsRed; mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaaktin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) ve Tg (mnx1: gfp) (transgenik zebra balığı hatlarının üretimi ile ilgili Ek Dosya 1'e bakınız). Otomatik zebra balığı larva işleme platformunu kullanan protokolün bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm özel yazılımlar, komut dosyaları ve ayrıntılı deneysel protokoller https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ mevcuttur.

1. Numune hazırlama

1. Döllenme sonrası 5 saatte, embriyoları doğru gelişim aşaması için ^{sıralayın21}. Ölü yumurtaları ve zayıf gelişmiş ve aşırı gelişmiş embriyoları atın.
2. Döllenme sonrası 3 günde (dpf), 90 mm'lik bir Petri kabında 50 mL balık tesisi suyuna 2 mL% 0.4 aminobenzoik-asit-etil-ester ekleyerek larvaları uyuşturun. Bir sorun olması durumunda cilt pigmentasyonunu önlemek için feniltiourea (PTU) ile yetiştirilen hayvanları kullanın (bkz. materyal tablosu), bu protokolde açıklanan 3 dpf larvalarında omurilik yaralanmaları için geçerli değildir.
   NOT: Bu nispeten yüksek anestezik konsantrasyon, lazer darbesini takiben larvaların hareketlerini önlemek için kullanılır.
3. Embriyoları floresan muhabir ekspresyonu için tarayın (Ek Dosya 1).
   NOT: Yaralanmanın etkinliğini değerlendirmek için omurilik (veya diğer ilgi çekici yapı) için bir floresan muhabir sıklıkla gereklidir. Tg (Xla.Tubb: DsRed) kullanımı omuriliğin tanımlanmasına yardımcı olur.
4. Seçilen larvaları, kuyu başına 300 μL balık tesisi suyu ile VAST sisteminde kullanılmak üzere 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Doğrudan 90 mm Petri kabından anestezi içeren ortamı kullanın. Kuyu başına sadece bir larva olduğundan emin olun. Lezyonlu larvaları toplamak için fazladan bir boş 96 kuyucuklu plaka hazırlayın.
   NOT: Başka bir lazer lezyon sistemi kullanıyorsanız, larvaları uygun bir gözlem odasında% 1 Düşük Erime Noktası (LMP) agaroz jeline monte edin.

2. Mikroskop hazırlama

1. Ablasyon için lazer de dahil olmak üzere tüm sistem bileşenlerini (VAST, mikroskop, lazer, PC) açın.
2. Donanım tamamen başlatıldıktan sonra, mikroskop yazılımını, ImageJ / Fiji'yi, piton entegre geliştirme ortamını (IDE) ve bu platformu kullanıyorsanız otomatik zebra balığı görüntüleme (VAST sistemi) yazılımını başlatın (bkz.
3. Aşağıdaki adımları izleyerek VAST yazılımını kurun.
   1. VAST yazılımı başlatıldığında, ilk pencerede Plate'i seçin ve Bitti düğmesine tıklayın (Şekil 2A). Kılcal damarın boş ve temiz olup olmadığını soran başka bir küçük pencere açılacaktır. İçinde herhangi bir hava kabarcığı varsa kılcal damarın görüntüsüne bakarak doğrulayın. Değilse, Evet'e tıklayın. Herhangi bir kabarcık varsa, Hayır'a tıklayın ve 2.3.2-2.3.3 adımını izleyin (Şekil 2B).
   2. Büyük Parçacık (LP) Örnekleyici penceresinde, hava kabarcıklarını gidermek için Prime'a tıklayın (Şekil 2C).
   3. Ana yazılım penceresine gidin (kılcal görüntü ile) ve resme sağ tıklayın. Açılır menüden Boş kılcal görüntüyü kaydet'i seçin (Şekil 2B).
   4. LP Örnekleyici penceresinde, Dosya menüsüne gidin ve Komut Dosyası Aç seçeneğini belirleyin. Gerçekleştirilecek denemeye karşılık gelen komut dosyasını içeren bir dosya seçin.
   5. Ana VAST yazılım penceresinde Dosya'ya gidin ve Denemeyi Aç'ı seçin. Planlanan denemeye karşılık gelen deneme dosyasını seçin.
      NOT: Otomatik boşaltma ve Atıklara toplu çıkış kutularının işaretli OLMADIĞINDAN emin olun.
4. Görüntüleme için mikroskop yazılımını kurun.
   1. Donanımı başlatmak için mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın (bkz. Bu işlem, sisteme bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.
   2. Edinme ayarlarına gidin ve larvalarda ifade edilen floroforu görüntülemek için mikroskopu kurun. Odak hacminin, omuriliğin veya hedeflenen dokunun tüm derinliğini lezyona uğratmak için optik eksen boyunca yeterince uzadığından emin olmak için 10x NA 0.5 su daldırma hedefi kullanın.
5. Lazer lezyonları için ImageJ/Fiji'yi kurun.
   1. Dosya menüsüne gidin, komut dosyası penceresini açmak için Yeni/Komut Dosyası'nı seçin.
   2. Yeni pencerede, Dosya menüsüne gidin ve lazer lezyonu komut dosyasını (Manual_MP_Operation.ijm) yüklemek için Aç'ı seçin.
6. Python IDE'yi ayarlayın.
   1. Python IDE'yi başlatın.
   2. Dosya menüsüne gidin ve lazeri yönetmek üzere komut dosyasını yüklemek için Dosya Aç'ı seçin (Watch_for_ROIs_py3.py).
   3. Çalıştır menüsüne gidin ve komut dosyasını çalıştırmak için Hata Ayıklama Yapmadan Çalıştır'ı seçin. Lazer zayıflatıcı başlatılırken TERMINAL panelindeki bir dizi iletinin bir miktar gürültüyle birlikte göründüğünden emin olun (Şekil 2D).

3. VAST sisteminde lazer lezyonlarının yapılması

1. VAST yazılımının ana penceresindeki ok düğmelerine tıklayarak sahneyi hareket ettirerek kılcal damarı mikroskop hedefine göre ortalayın (Şekil 2B).
2. Göz merceklerinden bakarak ve mikroskopun iletilen ışığını kullanarak kılcal damarın tepesine odaklanın.
   DİKKAT: Kılcal damar çok kırılgandır ve hedefe dokunulduğunda kırılabilir. İçeri ve dışarı odaklanırken mikroskop düğmesini yavaşça hareket ettirin.
3. 96 delikli plakaları, VAST sisteminin LP Örnekleyicisinin plaka tutucusuna yerleştirin. Larva içeren plakayı sol tutucuya ve toplama plakasını sağa yerleştirin. Plakaların doğru yönlendirildiğinden emin olun: A1 kuyusu, tutucunun sol ön köşesinde olmalıdır.
4. VAST yazılımında, LP Örnekleyici penceresinde, Plaka Şablonu düğmesine tıklayın ve larva içeren tüm kuyucukları seçin. Pencereyi doğrulamak ve kapatmak için Tamam düğmesine tıklayın (Şekil 2C).
5. LP Örnekleyici penceresinde, larva yüklemeye başlamak için Plakayı Çalıştır düğmesine tıklayın.
   NOT: Bir süre sonra, larva kılcal damarda pozisyonda (deney tanım dosyasında önceden tanımlanmış) görünür olmalı ve omuriliğe zarar vermelidir. VAST tepsi ışığı, larvayı mikroskop hedefine bakan yanal tarafla ayarlamak için birkaç rotasyondan sonra kapanacaktır.
6. Mikroskop yazılımına gidin ve larvaları görüntülemek için Canlı düğmesine tıklayın.
7. Mikroskop odak düğmesini omurilik merkezi kanalı görünene kadar çevirin.
   NOT: Önce iletilen ışığı kullanarak odaklamak ve ardından floresan ile rafine etmek daha kolay olabilir.
8. Floresan bir anlık görüntü alın ve görüntüyü özel bir klasöre kaydedin.
9. Görüntüyü ImageJ'de açın ve gerekirse kontrastı ayarlayın ( ImageJ'deki Image/Adjust/Brightness/contrast... menüsünü kullanarak).
10. İlgi Çekici Bölge (ROI) çizgi aracına tıklayın ve omuriliğe ortalanmış kısa bir çizgi (20 μm) çizin (Şekil 3A).
11. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin.
12. ImageJ komut dosyasını yükleyin ve Çalıştır düğmesine tıklayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Tekrarlama - 2; Örnek - 1; Genişlik - 40 mikron; Zayıflama - 89 (Tam lazer gücü) (Şekil 3C).
13. Lazer atış sırası tamamlandığında, görüntüleme yazılımında floresan görüntülemeye geçin ve gerekirse odağı ayarlayın.
    NOT: Lazere maruz kalma sırasında kuyruk yer değiştirmesi nedeniyle odakta bir kayma sıklıkla gözlenir.
14. Yeni bir anlık görüntü alın ve kaydedin.
15. Bu yeni görüntüyü ImageJ'de açın ve omuriliğin kendisinden (~ 80 μm) daha büyük olması gereken, notochord'un üst kısmındaki omuriliğin ventral tarafının altından başlayıp omurilik ile cilt arasındaki boşlukta sona erecek şekilde dorsal tarafa doğru giden yeni bir çizgi çizin (Şekil 3B).
16. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin.
17. ImageJ komut dosyası penceresine gidin ve Çalıştır düğmesine tıklayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Tekrarlama - 2; Örnek - 1; Genişlik - 40 mikron; Zayıflama - 89 (Tam lazer gücü).
18. (Daha uzun) lazer atış sırası bittikten sonra, floresan görüntüleme ve odaklama ile transeksiyon kalitesini doğrulayın. Lezyon bölgesinde hiçbir hücre veya aksonun bozulmadan kalmadığından emin olun, bu da karanlık veya soluk ve homojen bir floresan alan olarak görünmelidir (Şekil 3D, alt panel).
19. Lezyonlu larvaları, ana VAST yazılım penceresine gidip Topla düğmesine tıklayarak boş 96 delikli plakaya (orijinal kuyununkiyle aynı kuyu koordinatlarına sahip) toplayın .
20. Pencerenin sol alt köşesindeki Tepsi Işığı onay kutusunu tıklatarak VAST sistem ışığını tekrar açın.
21. Yaralanacak her yeni larva için adım 3.3-3.17'yi tekrarlayın.

4. Lezyon sonrası elleçleme ve ek deneyler

1. Larvaları 96 kuyucuklu plakadan mümkün olan en kısa sürede çıkarın ve larvaların lezyon sonrası iyileşmesi için taze balık tesisi suyu ile temiz bir Petri kabına aktarın. Petri kabını 28 ° C'de bir inkübatöre koyun.
   NOT: Hasar genellikle lezyondan sonraki ilk saat içinde yayılmaya devam eder. Bu nedenle lezyonun gerçek boyutu, yaklaşık 1 saatlik bir gecikmeden sonra floresan görüntüleme ile değerlendirilmelidir.

5. Sorun Giderme

1. VAST sisteminin tüplerinde ve kılcal damarlarında hava kabarcıkları varsa, bunları çıkarmak için LP Örnekleyici penceresindeki Prime düğmesine tıklayın.
2. Başarısız lezyonları göz önünde bulundurun (lezyon bölgesinde kalan floresandan değerlendirildiği gibi, beklenen kalıntı ve homojen arka plan dışında), aşağıda belirtilen çeşitli nedenlerden kaynaklanabilir.
   1. Düşük lazer gücü: Bu olduğunda, daha yüksek bir değerle deneyin.
      NOT: VAST sistemi bir boya lazeri ile donatılmıştır. Bu, lazer ışığı üretimi için kullanılan boya çözeltisinin konsantrasyonunun zamanla değişebileceği ve lazer gücünde bir azalmaya yol açabileceği anlamına gelir. Yeni bir çözümle değiştirmek genellikle sorunu ^çözer22.
   2. Kötü kalibrasyon: Bu olduğunda, lazer sisteminin kalibrasyonunu ve gücünü adım 5.2.2.1-5.2.2.4'e göre doğrulayın. Doğru şekilde kalibre edilmezse, lazer istenen yere yönlendirilmez, böylece başarısız lezyonlara veya komşu dokularda istenmeyen hasara yol açar.
      1. Kılcal haznenin üstüne bir ayna kaydırağı yerleştirin. Kaplanmış tarafa odaklanın (hedefe bakmalıdır). Daha kolay odaklanmak için slaytta önceki bir varsayılanı kullanın.
      2. Bir kalibrasyon betiği kullanarak bir lazer ablasyon paterni uygulayın.
      3. Desenin kalitesini değerlendirin. Noktalar veya çizgiler keskin görünmeli ve bulanık olmamalıdır.
      4. Lazer gücünün önceki seanslara göre değişip değişmediğini değerlendirmek için artan güce sahip bir rampa kullanın.
   3. Lezyonlar sırasında larva hareketi: Larvalar anesteziye farklı tepki verir; böylece lazer lezyonu işlem sırasında kuyruğun hareketlerini tetikleyerek başarılı bir transeksiyonun önlenebilmesini sağlar. Bu olduğunda, çevredeki dokulara zarar vermekten kaçınırken tamamlamak için lazer lezyonu adımlarının ekstra bir yinelemesini yapın.
   4. Kötü odaklanma: Bu gerçekleştiğinde, en iyi sonuçları almak için merkezi kanalın ortasına odaklanın.
   5. ROI çizimi, pozisyonu ve boyutu: ROI'nin konumu ve boyutu, başarılı transeksiyonlar için kritik öneme sahiptir. ROI, omurilikten daha büyük olmalı ve omuriliğin merkezine odaklanmalıdır. Bunu çözmek için, ROI'yi omuriliğin ventral tarafından çekmeye başlayın ve başarılı bir transeksiyon elde etmek için dorsal tarafa doğru yukarı çıkın. Bu muhtemelen ablasyon prosedürü sırasında lazer atışlarının sırası tarafından tetiklenen kuyruk hareketlerinden kaynaklanmaktadır.

Representative Results

Omurilik transeksiyonunun doğrulanması
Protokolün tam omurilik transeksiyonuna izin verip vermediğini değerlendirmek için yapısal ve fonksiyonel araştırmalar yapıldı.

İlk olarak, lezyon bölgesindeki floresan kaybının lazer aydınlatmadan floresan fotobeyazlatma değil, nöronal doku hasarından kaynaklandığını doğrulamak için, asetillenmiş tübüline karşı bir antikor kullanarak immün boyama (bakınız Materyal Tablosu ve Ek Dosya 1) yapıldı. Lezyonun kaudal ve rostral tarafları arasındaki aksonların tam bir bozulması gözlendi ve omuriliğin tam transeksiyonunu doğruladı (Şekil 4B). Başarılı bir omurilik transeksiyonu, lezyon bölgesi boyunca kalan nöronal projeksiyonu bırakmamalıdır (başarısız bir lezyon örneği için Şekil 4C'ye bakınız). Bu teknik kullanılarak omurilik lazer lezyonlarının başarı oranının %75 olduğu tahmin edilmektedir (16 hayvanda dört eksik transeksiyon).

Lazer lezyon sonrası fonksiyon kaybı kalsiyum görüntüleme kullanılarak araştırıldı. Bozulmamış balıklarda, spontan koordineli nöronal ağ aktivitesi, tüm omurilik boyunca floresan zirveleri üretir. Başarılı bir transeksiyon, lezyonun her iki tarafı arasında bu aktivitenin yayılmasını kesecektir. Omurilik transeksiyonunun kalitesini kontrol etmek için tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) larvalarına 3 dpf'de lazer lezyonları uygulandı. Yeni bir çok kuyulu plakada toplandıktan sonra larvalar hafifçe anestezi altına alındı. Yaralanma sonrası 3 saatten itibaren konfokal mikroskopta floresan hızlandırılmış kayıtlar yapmak için düşük erime noktalı agarozda bir cam kapak kayması üzerine monte edildiler. Lezyon bölgesinin kaudal tarafında aktivite kaybı gözlendi. Gerçekten de, floresanın nicelleştirilmesi, balığın spontan aktivitesine bağlı sivri uçların sadece yaralanmadan sonra rostral tarafta mevcut olduğunu, ancak bozulmamış balıklarda eşdeğer rostral ve kaudal pozisyonlarda koordineli bir şekilde meydana geldiğini göstermektedir (Şekil 4D, E). Yaralanmadan sonra kaudal taraftaki düşük kalıntı sinyal, muhtemelen rostral taraftaki kas kasılmasının neden olduğu kuyruk hareketine tepki olarak duyusal nöronların (muhtemelen omuriliğin kaudal tarafındaki Rohon-Sakal duyusal ^{nöronlarının23}) aktivitesinden kaynaklanıyordu.

Lazer lezyonlarının neden olduğu rejenerasyon süreçleri
Yaralanma sonrası 24 saat sonra (hpi), yara kapanmaya başladı ve 48 saat sonra omuriliğin başlangıç yapısının kısmi restorasyonuna yol açtı (Şekil 5D). Kalsiyum görüntüleme kullanılarak, 48 hpi sonrası kısmi fonksiyonel yeniden bağlantı doğrulandı (Şekil 5E,F). Kaudal alandaki sivri uçların genliği ile rostral alan (Şekil 5G) arasındaki oranın hesaplanması (yazarlar tarafından Bağlantı Restorasyon İndeksi olarak adlandırılmıştır), omurilik rejenerasyonu sırasında beklendiği gibi 3, 24 ve 48 hpi arasında bir artış göstermiştir.

Lazer lezyonları immün yanıtı tetikler
Makrofaj (mpeg1:GFP+ hücreler) alımı tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) larvaları lazer lezyonları kullanılarak lazer lezyonlarından sonra gözlendi (Şekil 5H,I). Bu, zebra balığı larvalarında omuriliğin başarılı bir şekilde yenilenmesi için makrofajların temel rolünü gösteren manuel lezyonları kullanan yazarlar tarafından yapılan önceki çalışmalarla ^{tutarlıdır6,24}. Bu gözlem, lazer hasarından sonra bağışıklık reaksiyonlarının incelenebileceğini ve doku hasarının meydana geldiğini doğruladığını göstermektedir.

Lazer lezyonları ve manuel lezyonlar omurilikte artmış nörojenezi tetikler
Önceki çalışmalar, omurilik yaralanmasını takiben ortaya çıkan nörogenezi incelemek için manuel lezyonları ^{kullanmıştır6,15}. Lazer lezyonları bu fenomeni incelemek için değerli bir araç olabilir. Daha önce yayınlanmış bir deney, lezyonsuz kontrollere kıyasla manuel omurilik yaralanmasını takiben artmış nörogenez ^{göstermiştir15}. Burada tg(mnx1:gfp) balıkları motor nöronlar olarak kullanılmış ve floresan olarak etiketlenmiştir. Larvalarda GFP'nin görünürlüğünü arttırmak için anti-GFP antikor boyama yöntemi kullanıldı. Bu, yeni üretilen nöronları etiketleyen EdU ^boyama25 (Ek Dosya 1'e bakınız) ile birleştirildi. EdU, 3 dpf'deki bir yaralanmanın hemen ardından eklendi, yani EdU ile etiketlenmiş herhangi bir hücrenin yaralanma sonrası üretildiği anlamına geliyor. Bu nedenle, kolokalize boyama gösteren hücreler, omurilik yaralanmasından sonra doğan yeni motor nöronları temsil eder. Yaralanma bölgesinin her iki tarafındaki veya lezyonsuz kontrollerde (iki 50 μm pencerede yakalanan) yaralanma bölgesinin konumuna ve büyüklüğüne karşılık gelen bir alanda kolokalize hücrelerin sayısı sayıldı ve ortalama kolokalize hücre sayılarındaki fark tek yönlü ^ANOVA26 kullanılarak analiz edildi.

Bu protokol, her lezyon yönteminin nörogenez üzerindeki etkilerini karşılaştırmak için manuel ve lazer lezyonlu larvalarda kullanıldı (Şekil 6). Etiketli hücre sayısında manuel ve lazer lezyonları arasında fark gözlenmedi. Lezyonsuz balıklar, her iki lezyon koşulunda da lezyonlu balıklardan daha az çift etiketli hücre göstermiştir (Şekil 6D). Bu, manuel lezyonlu balıklarda lezyonsuz balıklara kıyasla artmış nörogenezin arttığını gösteren önceki bulgularla ^{tutarlıdır15}.

Bu sonuçlar kalsiyum görüntüleme ve asetillenmiş tübülin boyama sonuçlarını desteklemektedir, çünkü lazer hasarı manuel lezyonla karşılaştırılabilir bir rejenerasyon yanıtı ortaya çıkarmaktadır. Bu, lazer lezyonunun sadece hücrelerdeki floresanı ağartmakla kalmayıp, aynı zamanda manuel bir lezyonun yaptığı aynı hücresel yanıtları tetikleyen bir yaralanmaya neden olduğunu gösterir.

Lazer lezyonları, manuel lezyonlara göre daha az cilt ve kas hasarına neden olur.
Manuel lezyonlar genellikle büyük miktarda kas ve cilt hasarına neden olur. Buna karşılık, lazer lezyonları omuriliğe daha spesifik olarak hedeflenebilir ve diğer dokulara verilen hasarı azaltabilir. Bunu göstermek için, manuel ve lazer lezyonlarını gerçekleştirmek için Tg (beta-aktin: utrophin-mCh) larvaları kullanıldı. Bu çizgi, omurilik hücrelerinin ve kas liflerinin görselleştirilmesine izin veren bir F-aktin bağlayıcı proteini floresan olarak etiketler. Larvalar daha sonra canlı olarak monte edildi ve görüntülendi (Şekil 7A, B). Şekil 7A , omuriliğin hasarını göstermektedir. Hem lazer hem de manuel lezyon koşullarında yaralanma bölgesinde ütrofin eksikliği, her iki lezyon yönteminin de omurilikteki hücrelere zarar verdiğini düşündürmektedir. Şekil 7B kas hasarını göstermektedir. Lezyonsuz durumda miyotomlara açık bir chevron benzeri yapı vardır ve aktin lifi demetleri görülebilir. Manuel lezyon durumunda miyotom şeklinde gözle görülür bir bozulma vardır ve daha az aktin lifi mevcuttur. Bu, önemli kas hasarını gösterir. Bununla birlikte, lazer lezyonu durumunda, miyotomun chevron yapısı korunur. Kas liflerinde bir miktar hasar vardır, ancak bu, manuel lezyon durumundaki dörde kıyasla bir veya iki miyotom içinde bulunur. Ek olarak, Şekil 7C'de stereo mikroskopla çekilen görüntülerde gösterildiği gibi, lazer lezyon durumunda, manuel lezyon durumuna kıyasla küçük bir cilt hasarı vardır.

Toplamda, bu sonuçlar tekrarlanabilir, yarı otomatik lazer lezyonlarının zebra balıklarında nöral rejenerasyonu incelemek için güçlü bir araç olma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.

Şekil 1: Yarı otomatik lazer yaralanma iş akışının şeması. Döllenmeden üç gün sonra (dpf), larvalar 96 kuyucuklu bir plakaya yüklenir ve otomatik larva işleme platformuna yerleştirilir. Daha sonra, her larva, görüntüleme ve lazer lezyonu için dik bir mikroskop üzerinde 10x NA 0.5 lens altına yerleştirilmiş bir kılcal damara yüklenir. Lezyonlardan sonra, larvalar toplama ve daha ileri deneyler için yeni bir 96 kuyucuklu plakaya boşaltılır. Üstte, lazer lezyonundan önce ve sonra tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larvalarının iletilen ve floresan görüntüleri (ölçek çubuğu = 50 μm). Larvalar rostral sola ve sırta yönlendirilir (tüm figürler için). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Yarı otomatik zebra balığı larvaları görüntüleme sistemi ve lazer kontrol sistemi için yazılım başlatma . (A) Başlangıçta VAST yazılımı. (B) VAST yazılımının ana penceresi boş kılcal damarı gösterir. (C) Boş bir plaka şablonuna sahip LP Örnekleyici penceresi. (D) Python IDE'nin Watch_for_ROIs_py3.py komut dosyası çalışırken görünümü. Turuncu dikdörtgen, lazer zayıflatıcının başlatılması sırasında görüntülenen mesajlarla terminal sekmesini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larva üzerinde lazer lezyon sekansı örneği. (A) ImageJ araç çubuğundan çizgi ROI aracını seçtikten sonra 20 μm'lik bir çizgi kullanarak lazer lezyonunun ilk adımı. (B) Omuriliğin tamamen transeksiyonu için 80 μm'lik bir hat ile ikinci adım. (C) ImageJ'den lazeri kontrol etmek için kullanılan komut dosyasının görünümü. (D) Lazer lezyonları sırasında görüntülerin sıralanması. Üst: lezyondan önce; Orta: ilk adımdan hemen sonra; Alt: ikinci adımdan hemen sonra (ölçek çubuğu = 50 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Asetillenmiş tübülin immün boyama (A-C) ve kalsiyum görüntüleme (D,E), lazer lezyonunun omurilik dokusunun devamlılığını tamamen bozduğunu göstermektedir. (A) Sağlam omurilik. (B) Omuriliğin tam transeksiyonu, omurilik dokusunun hem dorsal-ventral hem de medial-lateral eksenler boyunca tamamen bozulmasını gösterir. (C) Tamamlanmamış transeksiyon. (ölçek çubuğu = 50 μm). (D) Bir tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) 3 dpf larva üzerinde transekte omurilik. Dikdörtgenler, lezyonun rostral (mavi) ve kaudal (turuncu) taraflarındaki floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan ROI'leri göstermektedir. (E) Rostral ve kaudal analiz ROI'lerinde floresan yoğunluğunun zaman içinde değiştiğinin grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Lazer hasarı bir immün yanıt ortaya çıkarır ve başarılı anatomik ve fonksiyonel iyileşmeye yol açar. (A-D) Bir tg (Xla.Tubb: DsRed) 3dpf larvasının lazer lezyonundan önce ve sonra farklı zamanlarda maksimum yoğunluk projeksiyon floresan görüntüleri: 3 saat (B) sonra, 24 saat sonra (C) ve 48 saat sonra (D). (E-G) Fonksiyon restorasyonunu değerlendirmek için kalsiyum görüntüleme kullanımı. (E) Lezyonlu tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) larva analiz ROI'leri ile. (F) Rostral ve kaudal analiz ROI'lerinde floresan yoğunluğunun zaman içinde değiştiğinin grafiği. (G) Lezyon sonrası 3, 24, 48 saatte kaudal ve rostral spike genlikleri arasındaki oranın (Bağlantı Restorasyon İndeksi) ölçülmesi (N=3). (H-I) Lezyon sonrası immün yanıtın karakterizasyonu. (H) 6 hpi'de makrofajların (mpeg1+ hücre, yeşil) birikimini gösteren lezyonsuz (sol) ve lezyonlu (sağda) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp larvasının floresan görüntüleri. (I) Yaralı ve sağlam larvalarda lezyon sonrası 6 saatte makrofajların sayısının ölçülmesi (N = 3) (ölçek çubukları = 50 μm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Lezyona bağlı motor nöron üretimi lazer ve manuel lezyon arasında karşılaştırılabilir. (A-C) ApoTome mikroskopundan alınan görüntüler tg (mnx1: gfp) EdU boyaması ile 5 dpf larva, lazer lezyonu (A), manuel lezyon (B) ve lezyonsuz (C) koşullarda. Ok uçları, her iki işaretçi için de çift etiketli hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (A'-C') Beyaz kutularla gösterilen çift etiketli hücrelerin daha yüksek büyütülmesi. (D) Her larvadaki kolokalize hücrelerin sayısı için hücre sayımlarının miktarı. Yaralanma bölgesinin her iki tarafına 50 μm pencere yerleştirildi ve tüm Z-yığını görüntülerinde kolokalize hücreler sayıldı. Tek yönlü ANOVA, Tukey'in posthoc ^testi27 ile gerçekleştirildi. Lazer ve manuel lezyonlar arasında anlamlı fark yoktur (p=0.909). Lazer lezyonu (2.4 kat değişim, p = 0.011) ve manuel lezyona (2.3 kat değişim, p = 0.018) kıyasla lezyonsuz kontrollerde anlamlı olarak daha az mnx1:gfp+/EdU+ hücre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Lazer lezyonu manuel lezyona göre daha az kas ve cilt hasarına neden olur. (A-B) Lezyonsuz, manuel lezyon ve lazer lezyon durumlarında tg(beta-aktin:utrophin-mCherry) 3 dpf larvalarının tek Z-yığın görüntüleri, 20x büyütmede konfokal mikroskopta alınır. Beyaz oklar yaralanma bölgesini gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (A), omuriliğin ve notokordun görülebildiği Z-yığınlarını gösterir. SC omuriliği etiketler ve NC notokordu etiketler. (B) kas liflerinin görünür olduğu Z-yığınlarını gösterir. (C) Lezyonsuz, manuel lezyon ve lazer lezyon durumlarında 3 dpf larvanın stereo mikroskobu ile görüntüler alındı. Larvalar tungsten tel pimleri kullanılarak bir platforma sabitlendi (lazer lezyon görüntüsünde görülebilir). Kara kutu lezyon bölgesini gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Protokolün deneysel ayrıntıları. Transgenik zebra balığı hatlarının oluşumu, manuel omurilik yaralanmaları, asetillenmiş tübülin immünohistokimyası, Hb9/EdU boyama, görüntüleme ve görüntü işleme ve analizi anlatılmaktadır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Zebra balıklarında rejenerasyon sırasında oyunda olan süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bu hayvan modeli, biyomedikal araştırmalara, özellikle omurilik yaralanmalarına birçok fayda ^sağlar1. Çalışmaların çoğu, iyi eğitimli bir operatör gerektiren ve çoklu doku hasarına neden olan manuel lezyonları içermektedir. Burada lezyon özellikleri üzerinde kontrol sağlayan ve çevre dokulara verilen hasarı azaltan bir lazer lezyon protokolü sunulmaktadır. Ayrıca, bu teknik nispeten eğitimsiz deneyciler tarafından başarıyla kullanılabilecek kadar kolaydır.

Protokoldeki kritik adımlar, lazerin kalibrasyonu ve yatırım getirilerinin tanımlanmasıdır. Uygulamada, kalibrasyon çok kararlıdır (aylarca bile) ve yatırım getirisinin doğru boyutu ve konumu belirlendikten sonra, bu tekniğin kullanımı kolaydır. Protokol, lezyonların belirli ekipmanlarda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamasına rağmen, lazer lezyonlarının faydalarının çoğu, dönen disk mikroskobu gibi farklı sistemler için mevcuttur.

Bu protokolün ana sınırlamaları, omuriliğin floresan raporlayıcısını kullanma ihtiyacı ve lezyonları gerçekleştirmek için gereken zamandır (~ 5 dakika / balık). İkincisi, daha az hayvan gerektiren yüksek tekrarlanabilirlik ile telafi edilir. Bununla birlikte, manuel lezyonlar, birçok lezyonlu hayvana ihtiyaç duyulan ilaç testi gibi uygulamalar için hala uygundur. Burada gösterildiği gibi, lezyona bağlı nörogenezin derecesi lazer ve manuel lezyonlar arasında karşılaştırılabilir.

Bununla birlikte, lazer yaralanması, bazıları sunulan benzersiz faydalarla ilgili olan muazzam potansiyel uygulamalara sahiptir. Örneğin, dönen bir kılcal damar, lezyonların çok çeşitli pozisyonlarda kontrollü bir şekilde gerçekleştirilmesine izin verir. Örneğin, Bhatt ve ^ark.15'in çalışmasında da gösterildiği gibi, Mauthner hücrelerinde tek nöron aksotomisini indüklemek için kullanılabilir (veriler gösterilmemiştir). Bu, manuel lezyonlar kullanılarak mümkün olmazdı.

Sonuçlar ayrıca, hasarın esas olarak omuriliğe dahil olduğunu ve çevre dokulara minimum zarar verdiğini göstermektedir. Bu, bir lazer lezyonunu takiben görülen hücresel yanıtların, diğer hasarlı dokulardan sinyal vermek yerine, özellikle omuriliğe atfedilme olasılığının daha yüksek olduğu anlamına gelebilir. Ayrıca, lazer lezyonlu larvaların deneyler için daha fazla hazırlığa dayanabileceği anlamına da gelebilir. Örneğin, elektrofizyoloji için diseksiyon, ^{forseps28,29,30} kullanılarak gövde derisinin çıkarılmasını içerir; bu^, zaten hassas olan yaralanma bölgesine yerleştirilen yüksek mekanik basınca neden olur ve aksonal bağlantıların tekrar kırılma riski taşır. Lazer lezyonlu larvalarda görülen deri ve kas dokusunun bütünlüğü, lezyon bölgesini daha fazla hasardan koruyabilir ve elde edilen rejenerasyon seviyesinin daha doğru bir şekilde temsil edilmesine neden olabilir.

Ayrıca, lazer yaralanmasından sonra hasarın daha iyi lokalizasyonu, manuel lezyonları kullanırken daha ince süreçleri maskeleyebilen farklı rejenerasyon süreçleri arasındaki bağlantının genişlemesini sınırlar. Burada tarif edilen larva zebra balığında deneysel yaralanmaya yaklaşım, nicel biyoloji, biyolojik fizik ve hesaplamalı biyoloji bağlamında bir dizi yeni araştırma açabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0	Carl Zeiss
ImageJ/FIJI	Open-Source
Visual Studio Code	Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope	Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens	Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras	Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880	Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1	Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1	Carl Zeiss
UV laser	Micropoint
VAST BioImager	Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish	Thermo-Fisher	101R20
96-well plate	Corning	3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit	Invitrogen	C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040
phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488	Jackson	703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3	Jackson	715-165-150
Mouse anti-GFP	Abcam	AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody	Sigma	T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp)		N/A	First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)		N/A	First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)		N/A	Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)		N/A	Established by David Greenhald, University of Edinburgh