Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lysstyrede fermentementer til mikrobiel kemisk og proteinproduktion

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/63269
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3,4
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University
* These authors contributed equally

Summary

Optogenetisk kontrol af mikrobiel metabolisme giver fleksibel dynamisk kontrol over fermenteringsprocesser. Protokollen her viser, hvordan man opretter blålysregulerede fermenteringener til kemisk og proteinproduktion på forskellige volumetriske skalaer.

Abstract

Mikrobielle cellefabrikker tilbyder et bæredygtigt alternativ til fremstilling af kemikalier og rekombinante proteiner fra vedvarende råmaterialer. Imidlertid kan overbelastning af en mikroorganisme med genetiske modifikationer reducere værtsfitness og produktivitet. Dette problem kan overvindes ved hjælp af dynamisk kontrol: inducerbar ekspression af enzymer og veje, typisk ved hjælp af kemiske eller næringsbaserede tilsætningsstoffer, for at afbalancere cellulær vækst og produktion. Optogenetik tilbyder en ikke-invasiv, meget indstillelig og reversibel metode til dynamisk regulering af genekspression. Her beskriver vi, hvordan man opsætter lysstyrede fermenteringener af konstruerede Escherichia coli og Saccharomyces cerevisiae til fremstilling af kemikalier eller rekombinante proteiner. Vi diskuterer, hvordan man anvender lys på udvalgte tidspunkter og doser for at afkoble mikrobiel vækst og produktion for forbedret gæringskontrol og produktivitet samt de vigtigste optimeringsovervejelser for de bedste resultater. Derudover beskriver vi, hvordan man implementerer lysstyring til laboratorieskala bioreaktorforsøg. Disse protokoller letter vedtagelsen af optogenetiske kontroller i konstruerede mikroorganismer for forbedret gæringsydelse.

Introduction

Optogenetik, kontrol af biologiske processer med lysresponsive proteiner, tilbyder en ny strategi til dynamisk kontrol af mikrobielle fermentementer til kemisk og proteinproduktion1,2. Byrden ved konstruerede metaboliske veje og toksiciteten af visse mellemprodukter og produkter forringer ofte cellevæksten3. Sådanne belastninger kan føre til dårlig ophobning af biomasse og nedsat produktivitet3. Denne udfordring kan løses ved tidsmæssigt at opdele fermenteringen i en vækst- og produktionsfase, som afsætter metaboliske ressourcer til henholdsvis biomasseakkumulering eller produktsyntese4. Vi viste for nylig, at overgangen fra vækst til produktion i denne tofasede gæring kan induceres med ændringer i belysningsforholdene5,6,7. Lysindgangens høje tunbarhed, reversibilitet og ortogonalitet8 giver unikke fordele ved lysstyrede fermenteringener, der er vanskelige eller umulige at replikere med kemiske induktorer, der anvendes til dynamisk kontrol af konventionelle tofasede fermenteringener4,9,10,11.

Det blå lys responsive EL222 protein afledt af Erythrobacter litoralis er blevet brugt til at udvikle flere optogenetiske kredsløb til metabolisk teknik i Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 indeholder et lys-ilt-spændingssensor (LOV) domæne, der gennemgår et konformationsskift ved aktivering af blåt lys (465 nm), som gør det muligt at binde sig til sin beslægtede DNA-sekvens (C120)13. Sammensmeltning af EL222 til det virale VP16-aktiveringsdomæne (VP16-EL222) resulterer i en blålysresponsiv transkriptionsfaktor, der reversibelt kan aktivere genekspression i S. cerevisiae7 og andre organismer14 fra den syntetiske promotor PC120. Flere kredsløb baseret på EL222 er blevet udviklet og anvendt til kemisk produktion i S. cerevisiae, såsom det grundlæggende lysaktiverede OptoEXP-system7, hvor genet af interesse udtrykkes direkte fra PC120 (figur 1A). Bekymringer om lysindtrængning ved de høje celletætheder, der typisk opstår i produktionsfasen af fermenteringer, motiverede os imidlertid til at udvikle omvendte kredsløb, der induceres i mørket, såsom OptoINVRT- og OptoQ-INVRT-kredsløbene (figur 1B) 5,7,13. Disse systemer udnytter galactose (GAL) eller dikinsyre (Q) reguloner fra henholdsvis S. cerevisiae og N. crassa, der styrer deres tilsvarende repressorer (GAL80 og QS) med VP16-EL222, for at undertrykke genekspression i lyset og stærkt inducere det i mørket. Kombination af OptoEXP- og OptoINVRT-kredsløb resulterer i tovejskontrol af genekspression, hvilket muliggør tofasede fermenteringer, hvor vækstfasen induceres med blåt lys, og produktionsfasen med mørke (figur 2A)5,7.

Brug af lys i stedet for mørke til at fremkalde genekspression i produktionsfasen ville i høj grad udvide mulighederne for optogenetiske kontroller, men ville også kræve at overvinde lysindtrængningsbegrænsningerne for de høje celletætheder, der typisk opstår i denne fase af gæringen. Til dette formål har vi udviklet kredsløb, kendt som OptoAMP og OptoQ-AMP, der forstærker transkriptionsresponsen på stimulering af blåt lys. Disse kredsløb bruger vildtype eller overfølsomme mutanter af VP16-EL222 til at kontrollere produktionen af transkriptionsaktivatorerne Gal4p eller QF2 af henholdsvis GAL- eller Q-regulonerne, hvilket opnår øget følsomhed og stærkere genekspression med lys12,13 (figur 1C). OptoAMP-kredsløb kan opnå fuldstændig og homogen lysinduktion i 5 L bioreaktorer ved en optisk densitet (målt ved 600 nm; OD600) værdier på mindst 40 med kun ~0,35% af belysningen (5% lysdosis på kun ~7% af bulkoverfladen). Dette viser en højere grad af følsomhed sammenlignet med OptoEXP, som kræver tæt på 100 % belysning12. Evnen til effektivt at inducere genekspression med lys ved høje celletætheder åbner nye muligheder for dynamisk kontrol af fermenteringer. Dette omfatter driftsgæringer i mere end to tidsmæssige faser, såsom trefasede fermentementer, hvor vækst-, induktions- og produktionsfaser etableres med unikke lysplaner for at optimere kemisk produktion (figur 2B)12.

Figure 1
Figur 1: Optogenetiske kredsløb til dynamisk styring af S. cerevisiae. OptoEXP-, OptoINVRT- og OptoAMP-kredsløbene er baseret på det lysfølsomme VP16-EL222-system. (A) I OptoEXP-kredsløbet forårsager eksponering for blåt lys en konformationsændring og dimerisering af VP16-EL222, som udsætter et DNA-bindende domæne og muliggør transkription fra PC120. Figuren er blevet modificeret fra Zhao et al.7. (B) OptoINVRT-kredsløb udnytter GAL-regulonerne (vist) eller Q-regulonerne til at fremkalde udtryk i mørket. I GAL-baserede kredsløb udtrykkes VP16-EL222 og GAL4 konstitutivt, mens PC120-drevudtryk for GAL80-repressoren (i Q-baserede kredsløb erstattes GAL4 og GAL80 af henholdsvis QF2 og QS, og en syntetisk QUAS-holdig promotor anvendes i stedet for en GAL-promotor). I lyset forhindrer Gal80p aktivering af genet af interesse fra PGAL1. I mørket udtrykkes GAL80 ikke og nedbrydes hurtigt ved at smelte det sammen til et konstitutivt degrondomæne (lille brunt domæne), hvilket gør det muligt at aktivere PGAL1 af Gal4p. Figuren er blevet modificeret fra Zhao et al.5. (C) OptoAMP-kredsløb bruger også VP16-EL222 til at styre GAL(vist) eller Q-regulonerne. I disse kredsløb udtrykkes GAL80-repressoren (eller QS) konstitutivt og smeltes sammen til en fotofølsom degron (lille blåt domæne), der sikrer tæt undertrykkelse i mørket. PC120 og en overfølsom VP16-EL222 mutant kontrolekspression af GAL4 (eller QF2) med lys, som stærkt aktiverer PGAL1 (eller en QUAS-holdig promotor) i lyset. GAL-afledte kredsløb kan bruge konstruerede former for PGAL1, såsom PGAL1-M eller PGAL1-S, som har øget aktivitet, samt vildtypepromotorer kontrolleret af GAL-regulon (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). Figuren er ændret fra Zhao et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: To- og trefasede fermentementer gennem tiden. (A) Tofasede fermentementer, der drives med inverterede kredsløb, består af en lysdrevet vækstfase og en mørk produktionsfase. I vækstfasen akkumuleres biomasse, da produktionsvejen forbliver undertrykt. Efter at have nået den ønskede OD600, skiftes cellerne til mørket for metabolisk justering, inden de resuspendes i friske medier til produktionsfasen. (B) I en trefaset proces defineres vækst-, inkubations- og produktionsfaserne af unikke lysskemaer, som kan bestå af en mørk vækstperiode, pulserende inkubation og fuldt belyst produktionsfase. Figur oprettet med Biorender. Klik her for at se en større version af denne figur.

Optogenetiske kredsløb er også udviklet til dynamisk styring af kemisk og proteinproduktion i E. coli. OptoLAC-kredsløb styrer den bakterielle LacI-repressor ved hjælp af det lysresponsive pDawn-kredsløb, som er baseret på YF1/FixJ-tokomponentsystemet6 (figur 3). I lighed med OptoINVRT5 er OptoLAC-kredsløb designet til at undertrykke genekspression i lyset og inducere det i mørket. Ekspressionsniveauer ved hjælp af OptoLAC-kredsløb kan matche eller overstige dem, der opnås med standard isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induktion, hvilket opretholder styrken af kemisk induktion, samtidig med at den giver forbedret tunbarhed og reversibilitet6. Derfor muliggør OptoLAC-kredsløb effektiv optogenetisk kontrol til metabolisk teknik i E. coli.

Figure 3
Figur 3: OptoLAC-kredsløb til dynamisk styring af E. coli. OptoLAC-kredsløbene tilpasser pDawn-systemet og lac operon for at opnå aktivering i mørket og undertrykkelse i lyset. I mørket fosforylerer YF1 FixJ, som derefter aktiverer PFixK2-promotoren for at udtrykke cI-repressoren. CI-repressoren forhindrer ekspression af lacI-repressoren fra PR-promotoren, hvilket tillader transkription af genet af interesse fra en lacO-holdige promotor. Omvendt reducerer blåt lys YF1-netkinaseaktiviteten, vender FixJ-fosforylering og dermed cI-ekspression, hvilket aflaster ekspression af lacI og forhindrer ekspression fra den lacO-holdige promotor. Figuren er modificeret fra Lalwani et al.6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vi beskriver her de grundlæggende protokoller for lyskontrollerede fermenteringen af S. cerevisiae og E. coli til kemisk eller proteinproduktion. For både gær og bakterier fokuserer vi først på fermentementer med en lysdrevet vækstfase og en mørkeinduceret produktionsfase muliggjort af OptoINVRT- og OptoLAC-kredsløb. Derefter beskriver vi en protokol for en trefaset (vækst, induktion, produktion) lysstyret gæring aktiveret af OptoAMP-kredsløb. Desuden beskriver vi, hvordan man opskalerer optogenetisk kontrollerede fermentementer fra mikroplader til laboratorieskala bioreaktorer. Med denne protokol sigter vi mod at levere en komplet og let reproducerbar vejledning til udførelse af lyskontrollerede fermenteringener til kemisk eller proteinproduktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lysstyret kemisk produktion ved hjælp af S. cerevisiae OptoINVRT7-kredsløbet

  1. Stamme konstruktion
    1. Opnå en stamme med his3 auxotrofi, da denne markør er nødvendig for de fleste eksisterende OptoINVRT plasmider5. Hvis du søger optogenetisk regulering af et gen, der er hjemmehørende i S. cerevisiae, skal du konstruere en stamme, hvor enhver endogen kopi af genet slettes.
    2. Lineariser plasmidet, der indeholder OptoINVRT7-kredsløbet, såsom EZ-L4395, og integrer det i his3-locus af den auxotrofiske stamme ved hjælp af standard lithium-acetattransformationsmetoder15. Hvis du bruger EZ-L439-plasmidet, som indeholder komponenterne til at undertrykke PGAL1 i lyset og aktivere det i mørket, skal du linearisere på PmeI-begrænsningsstedet.
    3. Efter transformationen centrifugeres cellerne ved 150 x g i 1 min og resuspenderes forsigtigt i 200 μL frisk histidin-dropout syntetisk komplet medium (SC-His) medium.
    4. Plade hele cellevolumenet på SC-His agarplader og inkuber ved 30 °C i 2-3 dage, indtil kolonier vises.
    5. Forbered kompetente celler fra denne stamme ved hjælp af standard lithiumacetattransformationsprotokoller, og transformer dem med et plasmid, der indeholder det eller de gener, der skal kontrolleres optogenetisk nedstrøms for enten PGAL1-M eller PGAL1-S-promotoren5.
      BEMÆRK: Brug af et plasmid, der integreres på δ-sites (YARCdelta5) og vælger med Zeocin, giver mulighed for stabil multikopiintegration7,16,17,18.
    6. Efter transformation centrifugeres kulturen ved 150 x g i 1 min og suspenderes forsigtigt i 200 μL frisk SC-dropout-medium.
      BEMÆRK: PGAL1-M-promotoren er en syntetisk version af PGAL1-promotoren med Mig1p-undertrykkelsesstederne slettet, mens PGAL1-S er en konstrueret version af PGAL1-M, som har ekstra Gal4p-aktivatorbindingssteder. Den almindelige PGAL1-promotor kan bruges til at styre udtrykket; udtryksstyrken vil dog være lavere end fra disse konstruerede promotorer.
    7. Plade hele cellevolumenet på en gærekstrakt peptone dextrose (YPD) agarplade, hvis den integreres i δ steder, eller en SC-dropout plade, hvis den transformeres med et plasmid indeholdende en markeringsmarkør. Inkuber ved 30 °C i 16 timer under konstant blåt lys for at holde det optogenetisk kontrollerede gen undertrykt.
      BEMÆRK: For nogle stammer kan kolonier vokse hurtigere, når de inkuberes i blå lysimpulser (f.eks. 1 s on/79 s off, 5 s on/75 s off, 10 s on/70 s off osv.) i stedet for i konstant belysning, som skal bestemmes eksperimentelt for hver stamme, hvis det er nødvendigt.
    8. Brug en hvilken som helst 465 nm lyskilde, og placer et LED-panel ~ 40 cm over pladen, så lysintensiteten er ~ 80-110 μmol / m2 / s. Mål intensiteten ved hjælp af en kvantemåler (se Tabel over materialer).
    9. Hvis der integreres i δ steder, skal du oprette en kopi af pladen på YPD-plader, der indeholder en række Zeocin-koncentrationer mellem 400 μg / ml og 1.200 μg / ml for at vælge en række integrationskopinumre5,7,12,16,17,18. Inkuber replikapladerne ved 30 °C under konstant eller pulserende blåt lys i 2-3 dage, indtil kolonierne vises.
  2. Foreløbig screening for de bedste kolonier
    1. Vælg otte kolonier fra hver plade og brug dem til at inokulere 1 ml SC-His medium suppleret med 2% glucose i individuelle brønde i en 24-brønds plade. Voks i 24-brønds plader under cellerne natten over (16-20 timer) ved 30 ° C med 200 o / min (19 mm orbital diameter), der ryster under konstant blåt lysbelysning.
    2. Næste morgen fortyndes hver kultur i 1 ml af et frisk SC-His medium med 2% glucose til OD600 værdier fra 0,01-0,3 og vokser i 24-brønds plader under konstant eller pulserende lys ved 30 ° C med 200 o / min rystelser, indtil de når celletætheder mellem 2 og 9 OD600 værdier (figur 4A). Den tid, der er nødvendig for denne vækstfase, afhænger af belastningen.
    3. Inkuber pladerne i mørke i 4 timer ved 30 °C med 200 o/min rystelser ved at slukke for lyspanelet og pakke pladerne ind i aluminiumsfolie.
      BEMÆRK: Dette trin gør det muligt for cellerne metabolisk at overgå til produktionsfasen før resuspension i produktionsmediet.
    4. For at starte produktionsfasen centrifugeres kulturerne i 24-brøndspladen ved 234 x g i 5 minutter og resuspenderes celler i 1 ml frisk SC-dropout-medium med 2% glucose. Forsegl pladerne for at forhindre fordampning af det ønskede produkt ved hjælp af sterilt mikropladeforseglingstape.
    5. Gær de forseglede plader i mørke i 48 timer ved 30 °C med omrystning ved 200 o/min. Sørg for, at pladerne er pakket ind i aluminiumsfolie for at forhindre udsættelse for lys.
      BEMÆRK: Indpakning af pladerne i folie begrænser ikke ilt- eller gastilgængeligheden i gæringer; Det sterile tætningstape begrænser dog gasoverførslen. Små huller kan stikkes i båndet for at indføre ilt, hvis det er nødvendigt.
  3. Høst og analyse
    1. For at høste gæringerne centrifugeres pladerne i 5 minutter ved 234 x g og overføres 800 μL af supernatanten til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Afhængigt af det af interessekemikaliet analyseres ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC), gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) eller en anden analysemetode ved hjælp af prøveforberedelsesteknikken, der er bedst egnet til det anvendte instrument.

2. Lysstyret proteinproduktion ved hjælp af E. coli OptoLAC-systemet

  1. Stamme konstruktion
    1. Samtransformer elektrokompetent BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 med et plasmid indeholdende OptoLAC1B- eller OptoLAC2B-kredsløbet6 og et plasmid, der udtrykker det rekombinante protein af interesse fra PT7-promotoren19.
    2. Efter transformation genvindes cellerne i 1 time i 1 ml superoptimal bouillon med katabolitundertrykkelse (SOC; 2% trypton, 0,5% gærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose) ved 37 °C med rotation eller omrystning.
      BEMÆRK: Plasmidet, der indeholder proteinet af interesse, skal være kompatibelt med OptoLAC-plasmidet (dvs. forskellig resistensmarkør og replikationens oprindelse) og må ikke indeholde en kopi af lacI.
    3. Centrifuger cellerne ved 4845 x g i 3 minutter og koncentrer pelleten i 200 μL lysogen bouillon (LB) medier. Plade hele koncentrerede celler på en LB agar plade med passende antibiotika og vokse ved 37 ° C natten over under konstant blåt lys for at holde proteinekspression undertrykt.
  2. Indledende screening for at bekræfte udtryk
    1. Tag tre enkeltkolonier og brug dem til at inokulere 1 ml LB-medier med passende antibiotika i individuelle brønde på en 24-brønds plade. Voks natten over (16-20 timer) ved 37 °C med 200 o/min rystelser under konstant blå lysbelysning (figur 4A).
    2. Den næste dag skal du bruge 1,5 μL kultur til at måle OD600 i et spektrofotometer med en mikrovolummåling. Fortynd kulturer i 1 ml frisk LB i 24-brøndsplader til OD600-værdier fra 0,01-0,1.
    3. Dyrk kulturerne ved 37 °C med 200 o/min, der ryster under blåt lys i 2-3 timer. Fra den anden time skal du tage OD600-målinger hvert 15. minut for at sikre, at kulturerne ikke vokser over OD600-området på 0,1-1,5.
    4. Når kulturerne er ved den ønskede OD600, skal du slukke for lyspanelet og pakke pladen ind i aluminiumsfolie for at starte produktionsfasen. Opbevar pladen i mørke i 8 timer (37 °C), 20 timer (30 °C) eller 48 timer (18 °C) med 200 o/min. rystelser.
    5. Mål og registrer den endelige OD600-værdi for hver kultur.
  3. Høst og analyse
    1. Overfør 800 μL af hver kultur til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuge i 5 minutter ved 17.000 x g.
    2. Resuspend cellepillen i 200 μL resuspensionbuffer (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM).
      BEMÆRK: Koncentrationen af NaCl kan justeres baseret på det rekombinante protein, der analyseres.
    3. Tilsæt 50 μL 6x natriumdodecylsulfat (SDS) prøvebuffer (Tris 375 mM, pH 6,8, SDS 9%, glycerol 50%, bromphenolblå 0,03%, DTT 9%). Inkuber ved 100 °C i 10 minutter med omrystning ved 700 o/min i en termomixer.
    4. Indlæs ~ 3-20 μL af kulturen i en 12% SDS-PAGE gel. Ved hjælp af den endelige OD600-måling som vejledning indlæses omtrent den samme mængde protein for hver prøve (svarende til 10 μL af prøven svarende til en endelig OD600-værdi på 1). Brug en strømforsyning til at køre elektroforese ved 100 V, indtil gelen er helt opløst.
    5. Plet gelen med Coomassie strålende blå G-250-opløsning ved opvarmning i 30-40 s i en mikrobølgeovn og derefter inkubere på en platformrotator i mindst 15 minutter.
    6. Skyl med deioniseret vand to gange og afhold på en platform rotator i mindst 30 minutter (eller natten over), tilsæt to rengøringsservietter bundet i en knude for at hjælpe med at absorbere pletten. Kog gelen i tilstrækkelig mængde vand i mikrobølgeovnen i 15 minutter for at fremskynde affarvningsprocessen.

3. Trefaset gæring ved hjælp af S. cerevisiae OptoAMP-systemet

  1. Stamme konstruktion
    1. Få en stamme med en his3 auxotrofisk markør, da denne markør er nødvendig for at kunne anvende de eksisterende OptoAMP-plasmider5. Hvis du søger optogenetisk regulering af et gen, der er hjemmehørende i S. cerevisiae, skal du konstruere en stamme, hvor den endogene kopi af dette gen slettes.
    2. Lineariser et plasmid, der indeholder OptoAMP4-kredsløbet, såsom EZ-L58012, og integrer det i his3-locus for den auxotrofiske stamme ved hjælp af standard lithium-acetattransformationsmetoder15. Hvis du bruger EZ-L580, skal du linearisere plasmidet på PmeI-begrænsningsstedet.
    3. Efter transformationen centrifugeres cellerne ved 150 x g i 1 min og resuspenderes forsigtigt i 200 μL frisk SC-His medium.
    4. Plade hele cellevolumenet på selektive medier (SC-His-agar) og inkuber ved 30 °C i 2-3 dage, indtil kolonier vises.
    5. Forbered kompetente celler fra denne stamme og transformer dem med et plasmid, der indeholder det eller de gener, der skal kontrolleres optogenetisk nedstrøms for PGAL1-S-promotoren12.
      BEMÆRK: Brug af et plasmid, der integreres på δ-steder og vælger med Zeocin, giver mulighed for stabil multikopiintegration og -udvælgelse.
    6. Efter omdannelse centrifugeres kulturen ved 150 x g i 1 min og suspenderes forsigtigt i 200 μL frisk SC-dropout-medium.
      BEMÆRK: PGAL1-S-promotoren er en syntetisk version af PGAL1-promotoren, hvor Mig1p-undertrykkelsesstederne slettes, og der tilføjes ekstra Gal4p-aktivatorbindingssteder. Den almindelige PGAL1-promotor kan bruges; udtryksstyrken vil dog være lavere end denne konstruerede promotor.
    7. Plade hele cellevolumenet på en YPD- eller SC-dropout-agarplade og inkuber ved 30 °C i 16 timer i mørke (pakket ind i aluminiumsfolie). Inkubation i mørket holder det optogenetisk kontrollerede gen undertrykt, hvilket gør det muligt for cellerne at rette deres metaboliske ressourcer mod cellevækst snarere end kemisk produktion.
    8. Hvis der integreres i δ-steder, replikaplade på YPD-plader, der indeholder en række Zeocin-koncentrationer, der skal vælges til en række integrationskopinumre. Inkuber pladerne ved 30 °C i mørke (pakket ind i aluminiumsfolie) i 2-3 dage, indtil kolonier vises.
  2. Foreløbig screening for de bedste kolonier
    1. Vælg otte kolonier fra hver plade og brug dem til at inokulere 1 ml SC-His medium med 2% glucose i individuelle brønde i en 24-brønds plade. Cellerne vokser natten over (16-20 timer) i mørke ved 30 °C med 200 o/min rystelser.
    2. Næste morgen fortyndes hver kultur i 1 ml frisk SC-His medium med 2% glukose til 0,1 OD600 og vokser i mørke ved 30 ° C med 200 o / min rystelse, indtil de når en OD600 på 3. Pak pladerne ind i aluminiumsfolie for at forhindre udsættelse for lys. Den tid, der er nødvendig for denne vækstfase, afhænger af belastningen.
    3. For at starte induktionsfasen skal pladerne inkuberes under pulserende lys (f.eks. 5 s til/95 s slukket) i 12 timer ved 30 °C med 200 o/min rystelser. Brug en hvilken som helst 465 nm lyskilde, og placer et LED-panel over pladen, så lysintensiteten er ~ 80-110 pmol / m2 / s for optimale resultater (figur 4A).
      BEMÆRK: Den optimale lyspulsvarighed for denne inkubation vil variere afhængigt af det kemikalie, der produceres. Det anbefales at screene en række lysplaner fra 0,1% (f.eks. 1 s på 999 s slukket) til 100% (fuldt lys).
    4. For at starte produktionsfasen centrifugeres kulturerne ved 234 x g i 5 minutter og resusuderes i frisk SC-His medium med 2% glucose. Forsegl pladerne for at forhindre fordampning af det ønskede produkt ved hjælp af sterilt mikropladeforseglingstape.
    5. De forseglede plader gæres i lys i 48 timer ved 30 °C med omrystning ved 200 o/min. Optimer lysplanen i løbet af dette trin, da nogle kemikalier drager fordel af en pulserende produktionsfase snarere end fuldt lys.
  3. Høst og analyse
    1. Gæringerne høstes ved at centrifugere pladerne i 5 minutter ved 234 x g og overføre 800 μL af supernatanten til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Afhængigt af det kemikalie, der er af interesse, analyseres ved hjælp af HPLC, GC-MS eller en anden analysemetode ved hjælp af den prøveforberedelsesteknik, der er bedst egnet til det anvendte instrument.

4. Kemisk (mevalonat) produktion fra E. coli i en lysstyret bioreaktor

  1. Indledende podning og bioreaktoropsætning
    1. Inokuler en koloni af en E. coli-stamme konstrueret med lysstyret kemisk produktion til 5 ml M9 minimale salte (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl) suppleret med 0,2% w/v casaminosyrer, 5% w/v glucose og spormetalblanding20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L CoCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L CuCl2, 0,003 g/L H3BO3, 0,0025 g/L Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L Fe (III)citrat, 0,0045 g/L thiamin, 1,3 g/L MgSO4) i et 50 ml konisk rør.
    2. Dyrk kulturen natten over ved 30 °C med 200 o/min, der ryster under blåt lysbelysning.
    3. Opsæt bioreaktorbeholderens hovedplade, og sørg for, at følgende porte er installeret: indsæt til termisk sonde; sonde til opløst ilt (DO) gassparger - tilslut til luftkilden gennem et 0,2 μm filter; pumpehjul; gaskondensator - tilslut til et 0,2 μm filter; køleledning (x2); fødelinjer (x2) - en til medietilsætning, en til pH-kontrol; prøveudtagningslinje - sørg for, at den når bunden af beholderen; tom port; pH-sonde - kalibrer sonden med standarder for pH = 4 og pH = 7 inden installationen, enten autoklave med resten af beholderen eller steriliser med 95% ethanol og indsæt aseptisk inden opsætning.
    4. Fyld beholderen med 1 liter filtreret vand, og fastgør hovedpladen og stram, og sørg for, at O-ringen sidder tæt og forsegler.
    5. Dæk eventuelle åbninger ind i reaktoren med aluminiumsfolie.
    6. Forbered tre strimler slanger: en til fjernelse af vandet, en til indsættelse af foderet og en til pH-kontrol. Dæk enderne med aluminiumsfolie og pakk alle slangerne ind i aluminiumsfolie.
      BEMÆRK: NH4OH, der bruges til pH-justering, flyder ikke glat i silikonerør, hvilket kan føre til unøjagtige strømningshastigheder og overbasificering af kulturen. For at undgå dette problem skal du bruge biokompatibel pumperør (BPT) til NH4OH-tilførslen.
    7. Autoklave bioreaktoren og slangen ved hjælp af en 30 minutters væskecyklus.
    8. Fjern materialerne fra autoklaven. Når det er køligt nok til at håndtere, skal du tilslutte pumpehjulet, pH- og DO-sonderne, luftkilden, kondensatorens indløb og udløb samt køleindløb og -udløb til kontrolstationen.
    9. Indsæt den termiske sonde og dæk beholderen med en varmekappe. Fastgør jakken mod toppen af beholderen for at undgå at blokere kulturen fra lyseksponering.
    10. Tilslut et af de sterile rør til prøvetagningsledningen, og fastgør det gennem prøvetagningspumpen. Placer den anden ende, så den strømmer ind i en tom beholder, der kan rumme mindst 1 L. Tøm vandet inde i beholderen.
    11. Tilslut et andet sterilt rør til en af fødeledningerne og fastgør det gennem en af fødepumperne. Tilslut den anden ende af røret til en flaske M9-medier. Før medierne ind i reaktoren.
    12. Tilslut et andet sterilt rør til en af fødeledningerne og fastgør det gennem en af fødepumperne. Tilslut den anden ende af røret til flasken, der indeholder 28% -30% NH4OH.
      FORSIGTIG: NH4OH er ætsende. Arbejd i en stinkhætte, mens du overfører til en fødeflaske, og sørg for, at fødeflasken er anbragt i sekundær indeslutning.
    13. Placer tre lyspaneler i en trekantet formation ~ 20 cm væk fra reaktoren, og kontroller, at lysintensiteterne på beholderens overflade når ~ 80-110 μmol / m2 / s fra hver side (figur 4B).
    14. Den næste dag skal du tænde bioreaktorsystemet og køleren. Sæt reaktortemperaturens setpunkt til 37 °C, pH-sætpunktet til 7,0 og omrøringen til 200 o/min. Varmejakken skal tændes.
    15. Kalibrer DO-sonden ved først at vente, indtil temperatur- og DO-målingerne bliver konstante (dette vil være 100% setpunktet). Frakobl derefter sonden fra systemet (dette vil være 0% sætpunktet). Gentag, indtil DO-målingen stabiliseres ved 100 %, når sonden er tilsluttet, og indstil derefter DO-setpunktet til 20 %.
  2. Lysstyret kemisk produktion
    1. Inokuler bioreaktoren til en indledende OD600 på 0,001-0,1. Tænd for lyspanelerne for at starte væksten.
    2. Efter 3 timer skal du begynde at tage prøver fra prøveudtagningslinjen for at tage OD600-målinger for at undgå at overgro den optimale celletæthed af induktion (ρs). Når de optimale ρs er nået (den optimale værdi for mevalonatproduktion er 0,17), skal du slukke for lyspanelerne, dække reaktoren i aluminiumsfolie og pakke opsætningen ind i sort klud for at starte den mørke produktionsfase.
    3. Tilsæt 50 μL skumdæmpende, 8 timer efter skift til mørke. Skru den tomme port af, og pipetter antiskummet direkte ind i reaktoren.
    4. Brug prøveudtagningsporten til periodisk at udtage prøver til HPLC- eller GC-analyse.
  3. Demontering og analyse
    1. Når eksperimentet er afsluttet, skal du slukke for systemet. Skru forsigtigt DO- og pH-sonderne af, og vask dem med sæbe og vand. Skru hovedpladen af og vask den med sæbe og vand med en børste.
    2. Overfør kulturen til en tom beholder og tilsæt blegemiddel til en endelig koncentration på 10% v/v. Anbring i en stinkhætte og bortskaf efter 30 minutter.
    3. Vask reaktorbeholderen med sæbe og vand med en børste.
    4. Forbered prøverne til analyse baseret på det produkt, der er af interesse. Til mevalonatproduktion blandes 560 μL kultur med 140 μL 0,5 M HCl og hvirvel ved høj hastighed i 1 min. Dette omdanner mevalonat til (±)-mevalonolacton.
      FORSIGTIG: HCI er en sundhedsfare. Håndter med korrekte personlige værnemidler, og sørg for, at prøverørene er korrekt afgrænset inden hvirvel.
    5. Centrifuge ved 17.000 x g i 45 minutter ved 4 °C. Overfør 250 μL af supernatanten til et HPLC-hætteglas.
    6. For mevalonat analyseres prøver ved hjælp af en organisk ionbytterkolonne for organiske syrer. Kvantificer produktionen ved hjælp af en brydningsindeksdetektor (RID), der sammenligner spidsbelastningsområder med en standard for (±)-mevalonolacton.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optogenetisk regulering af mikrobiel metabolisme er blevet implementeret med succes for at producere en række produkter, herunder biobrændstoffer, bulkkemikalier, proteiner og naturlige produkter5,6,7,12,13. De fleste af disse processer er designet til, at cellevækst kan forekomme i lyset (når lav celletæthed udgør minimale udfordringer med lysindtrængning), og til produktion, der skal induceres af mørke, når cellerne er vokset. Forskellige kemikalier, der er fremstillet af gær ved hjælp af denne tilgang, herunder mælkesyre, en værdifuld polymerprækursor og fødevaretilsætningsstof samt isobutanol, et næste generations biobrændstof. For begge kemikalier stammer en fælles udfordring fra S. cerevisiaes stærke drivkraft til at metabolisere glukose mod ethanolproduktion snarere end det produkt, der er af interesse, og manglende evne til at slette ethanolfermenteringsvejen uden at forårsage en alvorlig vækstdefekt7. En kombination af lysaktiverede OptoEXP og lyspressede OptoINVRT-kredsløb er blevet anvendt til selektivt at aktivere genet for pyruvatdecarboxylase (PDC1), der kræves til ethanolfermentering, med lys og inducere vejen for det ønskede produkt i mørket5 (figur 5A,B). Ved hjælp af denne strategi med en optimeret celletæthed af induktion (ρs) kan der opnås høje titre af begge ønskede kemikalier (figur 5C,D), hvilket fremhæver værdien af tovejskontrol, der tilbydes af optogenetik.

Mens de fleste gærbaserede optogenetiske processer har centreret sig om en lysdrevet vækstfase og mørkeinduceret produktionsfase, har den nylige udvikling af ekstra følsomme og stærke OptoAMP-kredsløb også åbnet muligheder for lysdrevne gæringer12. Disse lysdrevne fermenteringener ligner de tidligere beskrevne processer; lysskemaerne vendes dog om, så produktionen sker i lyset. Desuden giver disse kredsløb mulighed for implementering af trefasede processer, hvilket tilføjer mere fleksibilitet og kontrol til produktionen sammenlignet med standard tofasetilgangen. I betragtning af følsomheden og styrken af disse kredsløb optimeres disse trefasede processer typisk ved at screene forskellige lysplaner i hver fase. Optimale lysimpulser afhænger af belastningen og produktet af interesse. Sådanne kredsløb er med succes blevet anvendt til fremstilling af naringenin, et naturprodukt med terapeutiske anvendelser, ud over mælkesyre og isobutanol12 (figur 6). Den øgede produktion af alle tre kemikalier viser værdien af optogenetisk regulering på tværs af en række vejkompleksiteter samt det nye potentiale, der tilbydes af trefasede fermenteringer.

Ud over disse demonstrationer i gær er optogenetik også blevet anvendt til at forbedre produktionen af proteiner og kemikalier i den bakterielle arbejdshest E. coli. Fermentementer med denne vært har fulgt en lysdrevet vækst- og mørkeinduceret produktionsramme ved hjælp af OptoLAC-pakken af kredsløb6. Når den anvendes til fremstilling af et gult fluorescerende protein (YFP) eller transkriptionsfaktor FdeR, er lysstyret produktion sammenlignelig med eller bedre end de niveauer, der opnås med standard IPTG-induktion, men med lettere indstilling til mellemliggende produktionsniveauer (figur 7A). Derudover er OptoLAC-kredsløb blevet anvendt til fremstilling af mevalonat, en vigtig terpenoidprækursor, både på mikroplade- og bioreaktorniveau (figur 7B,C). Disse udvalgte resultater giver et generelt overblik over styrken, alsidigheden og tunbarheden af optogenetisk regulering til mikrobiel kemisk og proteinproduktion.

Figure 4
Figur 4: Eksperimentel opsætning til belysning af plader og bioreaktorer. (A) 24-brønds plader kan belyses under rystelser ved at placere et blåt LED-lyspanel ca. 40 cm over rysteren. Lysintensiteten skal måles med en kvantemeter for at sikre, at den er mellem ~80-110 μmol/m2/s. (B) For at belyse en bioreaktor skal du placere tre lyspaneler i en trekantet formation omkring bioreaktoren. Som med pladerne med 24 brønde skal lysintensiteten måles og justeres for at nå ~ 80-110 pmol / m2 / s fra alle sider. Figur oprettet med Biorender. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Lysfortrykt produktion af kemikalier fra S. cerevisiae. For at forbedre produktionen af mælkesyre (A) eller isobutanol (B) er en kombination af lys- og mørkinducerbare kredsløb blevet anvendt til selektivt at aktivere specifikke veje. I begge scenarier induceres den essentielle ethanolproduktionsvej i lyset ved at styre PDC1-ekspression med OptoEXP, mens produktionsvejene aktiveres i mørke ved hjælp af et OptoINVRT-kredsløb. (C) Produktionen af mælkesyre blev testet ved en række ρs-værdier med to kredsløb fra OptoINVRT-pakken. OptoINVRT7-versionen klarede sig bedst med en optimal ρs-værdi på 7,0. (D) OptoINVRT7-versionen maksimerede også isobutanolproduktionen sammenlignet med det andet kredsløb med en optimal ρs på 8,75. **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistikker udledes ved hjælp af en tosidet t-test. Data vises som gennemsnitsværdier, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelserne for fire replikater. Figuren er blevet modificeret fra Zhao et al.5. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Lysaktiveret produktion af kemikalier i trefasede fermentementer af S. cerevisiae. Fermentementer ved hjælp af OptoAMP-kredsløbene kan fungere med tre dynamiske faser: vækst (i), induktion (ii) og produktion (iii), hver defineret af forskellige lette driftscyklusser. (A) Biosyntese af mælkesyre induceres i blåt lys ved optogenetisk kontrol af LDH-ekspression . (B) Mælkesyreproduktionen kan optimeres ved hjælp af en pulserende (1 s on/79 s off) lysplan i vækstfasen og fuld belysning i induktions- og produktionsfaserne. (C) Fremstilling af isobutanol induceres ved optogenetisk kontrollerende ILV2-ekspression . (D) Isobutanolproduktionen optimeres ved hjælp af en pulserende vækstfase (1 s on/79 s off), fuldt belyst induktionsfase og pulserende (2 s on/118 s off) produktionsfase. E) Kontrol af den mere komplekse biosyntetiske vej for naringenin, induceret ved optogenetisk kontrollerende ekspression af TAL- og PAL-generne . (F) Naringeninbiosyntese optimeres bedst ved hjælp af en pulserende vækst (1 s on/79 s off), fuldt belyst induktion og mørk produktionsfase. *p < 0,05, **p < 0,01, n.s. = ingen betydning. Statistikker udledes ved hjælp af en tosidet t-test. Data vises som middelværdier, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelserne for fire uafhængige replikater. Figuren er blevet modificeret fra Zhao et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Optogenetisk produktion af rekombinante proteiner og kemikalier i E. coli. OptoLAC-systemet er blevet brugt til at producere både proteiner og kemikalier ved titre, der er sammenlignelige med eller højere end dem, der nås ved hjælp af kemisk induktion med IPTG. (A) Optogenetisk ekspression af FdeR er både stærk og justerbar ved hjælp af en række lette driftscyklusser, som løst og kvantificeret med western blot. B) En stamme, der er konstrueret til mevalonatproduktion, overstiger titre opnået ved IPTG-induktion på 24-brøndsskalaen ved den optimale ρs-værdi . C) Optogenetisk produktion af mevalonat i en 2 L bioreaktor viser skalerbarheden af produktionen ud over mikroplader. *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistikker udledes ved hjælp af en tosidet t-test. Alle data vises som middelværdier, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelserne for biologisk uafhængige prøver. Data for (A) og (C) repræsenterer tre replikater, mens for (B) antallet af replikater fra venstre mod højre = 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4, 4. Figuren er modificeret fra Lalwani et al.6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dynamisk kontrol har længe været anvendt til at forbedre udbyttet for metabolisk teknik og rekombinant proteinproduktion4. Forskydninger i enzymatisk ekspression implementeres typisk ved hjælp af kemiske induktorer såsom IPTG21, galactose22 og tetracyclin23, men er også blevet medieret ved hjælp af procesbetingelser som temperatur og pH. Optogenetisk kontrol af genekspression eliminerer behovet for ændringer i fermenteringsparametre eller mediesammensætning, hvilket gør det til et let anvendeligt alternativ til traditionelle induktionsstrategier. Den lethed, hvormed lys kan tændes eller slukkes, giver også nye muligheder som hurtig og reversibel tuning af gendosering. Desuden, mens disse protokoller fokuserer på blåt lys-responsive systemer, giver eksistensen af optogenetiske værktøjer, der inverterer eksisterende lysresponser24 eller reagerer på andre bølgelængder af lys25,26,27,28,29, spændende potentiale til ortogonalt at kontrollere flere veje for et hidtil uset kontrolniveau. Sådanne fordele gør lys til en alsidig ny løsning til fleksibel kontrol over mikrobielle fermentementer.

Ud over screening for de bedste kolonier, som diskuteret i protokollerne, bør andre parametre såsom celletætheden, hvor kulturer skiftes fra vækst til produktion (ρs), produktions- og inkubationsperiodernes længder og lette driftscyklusser også optimeres. De bedste værdier af disse parametre er produkt- og belastningsafhængige og bør derfor optimeres til enhver ny applikation. For eksempel kan veje, der involverer giftige slutprodukter, drage fordel af højere ρs-værdier, hvilket giver mulighed for tilstrækkelig akkumulering af celler, før de inducerer produktion6,7, mens et svagere, men mindre utæt kredsløb kan favorisere lavere værdier af ρs for at maksimere den samlede ekspressionstid. Ligeledes kan nogle veje og rekombinante proteiner drage fordel af mellemliggende ekspressionsniveauer, hvilket kan opnås med unikke lysopgaver. I tilfælde af fermenteringen, der bruger OptoAMP-kredsløb, kan antallet af tidsmæssige faser desuden optimeres. Mens den demonstrerede protokol beskriver en trefaset proces, kan fermentementer ved hjælp af disse kredsløb styres med et større antal faser defineret af unikke lette tidsplaner og varigheder. Således bør en række af disse parametre testes for at optimere ydeevnen.

Undgå kilder til lysforurening udgør en vigtig overvejelse under forsøgsopstillingen. For processer, der kræver en forsinkelse af lysstimulering indtil senere stadier (f.eks. Mørke til lyse gæringer), kan det være tilrådeligt at arbejde i et mørkt rum for at undgå for tidlig aktivering af optogenetiske systemer. I disse tilfælde kan en inert lyskilde anvendes til synlighed under forsøgsopsætningen (for eksempel en langt rød lyskilde på ~ 700 nm, når man arbejder med blåt lysaktiverede systemer). En fordel ved processer, der starter med lysinduceret vækst (lys til mørk) er, at indledende eksperimentelle manipulationer kan udføres under omgivende lys med rigelig synlighed.

Den lethed, hvormed et stort antal lette tidsplaner kan anvendes på fermenteringen, giver mulighed for at udvikle metoder med højere gennemstrømning til at afbalancere biosyntetiske veje og belyse de optimale forhold, der maksimerer fermenteringsproduktiviteten. I stedet for at afbalancere metaboliske veje ved at teste et stort antal kombinatorisk samlede konstruktioner, der har hvert enzym udtrykt af promotorer med forskellige styrker, kunne veje afbalanceres ved at variere genekspressionsniveauer ved hjælp af forskellige lette driftscyklusser fra et meget mindre antal konstruktioner. Dette undgår behovet for mere besværlige eksperimentelle opsætninger, såsom resuspension i forskellige induktionsmedier eller serielle fortyndinger til kemiske induktorer. Optogenetiske eksperimenter kan potentielt endda automatiseres for at øge gennemstrømningen ved at bruge in silico-controllere til at levere specifikt tidsindstillede eller lokaliserede lysimpulser til forskellige prøvepuljer30. Forsøg med høj kapacitet under forskellige lysforhold skal dog være tilstrækkeligt adskilt til at undgå krydskontaminering af lys, hvilket kan udgøre rumlige begrænsninger. Derudover forhindrer kravet om lysstimulering brugen af de fleste pladelæsere og mikrobioreaktorer til kontinuerlige målinger. Selvom de endnu ikke er bredt tilgængelige kommercielt, er der for nylig udviklet flere apparater og algoritmer til højkapacitet og kontinuerlige optogenetiske eksperimenter, som hjælper med at løse disse rumlige begrænsninger31,32,33,34. På trods af disse begrænsninger tilbyder optogenetik således et stort potentiale for at øge eksperimentel gennemstrømning og samtidig give forbedret kontrollerbarhed.

Protokollerne og videoen, der præsenteres her, vil forhåbentlig sænke barriererne for andre forskere til at vedtage optogenetiske kontroller af cellulær metabolisme og mikrobielle fermenteringer. Optogenetik er en støtteteknologi til grundforskning og bioteknologiske anvendelser, der kan drage fordel af finjusteret kontrol af genekspression, såsom genetik, molekylær- og cellebiologi, metabolisme, systembiologi og cybergenetik35,36,37,38. Derudover er optogenetisk regulering af genekspression blevet påvist i andre mikroorganismer såsom Bacillus subtilis og Pseudomonas aeruginosa, hvilket tyder på, at fordelene ved lyskontrol kan udvides til undersøgelse og anvendelse af forskellige arter39,40,41. Disse muligheder fremhæver optogenetikkens fremtidige potentiale til metabolisk teknik, proteinproduktion og andre bioteknologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ansøgt om flere patenter på de optogenetiske kredsløb og metoder, der er beskrevet i denne artikel.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts og Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
  3. Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. Engineering metabolism through dynamic control. Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).
  4. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).
  5. Zhao, E. M., et al. Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering. ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).
  6. Lalwani, M. A., et al. Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production. Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).
  7. Zhao, E. M., et al. Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production. Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).
  8. Baumschlager, A., Khammash, M. Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria. Advanced Biology. 5 (5), 2000256 (2021).
  9. Dvorak, P., et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway. Microbial Cell Factories. 14, 201 (2015).
  10. Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications. Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).
  11. Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. Dynamic control of metabolism. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).
  12. Zhao, E. M., et al. Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control. ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).
  13. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression. ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).
  14. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  16. Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus. FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).
  17. Nordén, K., et al. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris. BMC Biotechnology. 11, 47 (2011).
  18. Zhao, E. M., et al. Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles. Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).
  19. Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  20. Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids. Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).
  21. Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).
  22. Steen, E. J., et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).
  23. Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).
  24. Jayaraman, P., et al. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994 (2016).
  25. Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. Engineering RGB color vision into Escherichia coli. Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).
  26. Ding, Q., et al. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production. Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).
  27. Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).
  28. Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).
  29. Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. Multichromatic control of gene expression in escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).
  30. Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894 (2017).
  31. Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  32. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, (2016).
  33. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  34. Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biology. 18 (7), (2020).
  35. Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics. Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).
  36. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).
  37. Melendez, J., et al. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  38. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  39. Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  40. Xia, A., et al. Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).
  41. Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).

Tags

Bioengineering udgave 181
Lysstyrede fermentementer til mikrobiel kemisk og proteinproduktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A.,… More

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter