Summary
Hier leveren we exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen aan de nier via staartaderinjectie van een niet-virale vector en polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen. Dit leidde tot significante overexpressie van doelmiRNA in de nier, wat resulteerde in geremde progressie van nierziekte in verschillende muismodellen.
Abstract
microRNA's (miRNA's), kleine niet-coderende RNA's (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA's (mRNA's) door hun vertaling bij verschillende nierziekten te destabiliseren en te remmen. Daarom is afwisseling van miRNA-expressie door exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen een potentieel nuttige behandelingsoptie voor het remmen van de ontwikkeling van veel nierziekten. Omdat serumRNAase echter onmiddellijk systematisch toegediende exogene miRNA-nabootsingen in vivo afbreekt, blijft de afgifte van miRNA aan de nier een uitdaging. Daarom zijn vectoren nodig die exogene miRNA-nabootsingen kunnen beschermen tegen afbraak door RNAase en ze aanzienlijk aan de nier kunnen afleveren. Veel studies hebben virale vectoren gebruikt om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren. Virale vectoren kunnen echter een interferonrespons en/of genetische instabiliteit veroorzaken. Daarom is de ontwikkeling van virale vectoren ook een hindernis voor het klinische gebruik van exogene miRNA-nabootsers of -remmers. Om deze zorgen met betrekking tot virale vectoren weg te nemen, ontwikkelden we een niet-virale vectormethode om miRNA-nabootsingen aan de nier af te leveren met behulp van staartaderinjectie van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP's), wat leidde tot significante overexpressie van doel-miRNA's in verschillende muismodellen van nierziekte.
Introduction
miRNA's, kleine niet-coderende RNA's (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA's (mRNA's) door ze te destabiliseren en hun vertaling bij verschillende nierziekten te remmen 1,2. Daarom is gentherapie met exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers een potentiële nieuwe optie om de ontwikkeling van veel nierziekten te remmen 3,4,5.
Ondanks de belofte van miRNA-nabootsers of -remmers voor gentherapie, blijft levering aan doelorganen een grote hindernis voor in vivo experimenten om hun klinische potentieel te ontwikkelen. Omdat kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers onderhevig zijn aan onmiddellijke afbraak door serum-RNase, wordt hun halfwaardetijd verkort bij systemische toediening in vivo6. Bovendien is de efficiëntie van miRNA-nabootsers of -remmers om het plasmamembraan en transfect cytoplasma te passeren over het algemeen veel lager zonder geschikte vectoren 7,8. Deze bewijslijnen suggereren dat de ontwikkeling van het miRNA-nabootsings- of remmersysteem voor de nier nodig is om het gebruik ervan in klinische omgevingen mogelijk te maken en ze een nieuwe behandelingsoptie te maken voor patiënten met verschillende nierziekten.
Virale vectoren zijn gebruikt als dragers om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren 9,10. Hoewel ze zijn ontwikkeld voor bioveiligheid en transfectie-werkzaamheid, kunnen virale vectoren nog steeds een interferonrespons en / of genetische instabiliteit veroorzaken11,12. Om deze zorgen weg te nemen, ontwikkelden we een miRNA-nabootsingssysteem voor de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP's), een niet-virale vector, in verschillende muismodellen van nierziekte13,14,15.
PEI-NP's zijn lineaire op polymeren gebaseerde NP's die oligonucleotiden, inclusief miRNA-nabootsers, effectief aan de nier kunnen afleveren en worden beschouwd als de voorkeur voor het bereiden van niet-virale vectoren vanwege hun veiligheid op lange termijn en biocompatibiliteit13,16,17.
Deze studie toont de effecten aan van systematische exogene miRNA-nabootsing toediening met PEI-NP's via staartaderinjectie in nierfibrosemodelmuizen geproduceerd door unilaterale ureterobstructie (UUO). Daarnaast demonstreren we de effecten van systematische exogene miRNA-nabootsing met PEI-NP's via staartaderinjectie in diabetische nierziektemodelmuizen (db / db-muizen: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) en acute nierbeschadigingsmodelmuizen geproduceerd door nierischemie-reperfusieletsel (IRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierexperimentele protocollen werden goedgekeurd door de dierethische commissie van de Jichi Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor gebruik en verzorging van proefdieren uit de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Hier toonden we miRNA-nabootsing van toediening aan de nier aan, wat resulteerde in overexpressie met behulp van UUO-muizen. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Jichi Medical University [Goedkeuring nrs. 19-12 voor nierfibrose, 17-024 voor acute nierinfectie (AKI) en 19-11 voor diabetische nefropathie].
1. Bereiding van PEI-NPs-miRNA-mimic complex
OPMERKING: Hier worden de bereiding van PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 en PEI-NPs-control-miRNA (als een negatieve controle) beschreven voor één muis.
- Bereid de volgende items voor:
- Bereid 10 μL lineaire PEI-NP's voor.
- Bereid 50 μL kunstmatig gesynthetiseerde miRNA's opgelost in nucleasevrij water in een concentratie van 100 μM (5 nmol miRNA opgelost in 50 μL nucleasevrij water).
- Bereid 50 μL kunstmatig gesynthetiseerde controle (niet-doel) miRNA's opgelost in nucleasevrij water in een concentratie van 100 μM (5 nmol miRNA opgelost in 50 μL nucleasevrij water).
- Bereid 5% en 10% glucose-oplossingen. Zorg voor de beschikbaarheid van 1,5 ml microcentrifugebuizen en een vortexmixer.
- Los 10 μL PEI-NP's op in 90 μL 5% glucoseoplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden.
- Meng 50 μL kunstmatig gesynthetiseerde miRNA's (5 nmol) opgelost in nucleasevrij water (100 μM-concentratie) met 50 μM 10% glucoseoplossing in microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden. Dit proces levert miRNA opgelost in 5% glucose-oplossing.
- Meng 100 μL PEI-NP's in 5% glucoseoplossing en 100 μL miRNA-mimiek (5 nmol) in 5% glucose-oplossing. Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden.
- Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) om een stabiel complex van PEI-NPs-miRNA-mimic te bereiden. Deze oplossing bevat PEI-NP's en miRNA-mimiek (5 nmol) in een verhouding van stikstof (N) in het polymeer tot fosfaat (P) in nucleïnezuren (N/P-verhouding) = 6 (figuur 1).
OPMERKING: PEI-NPs-control-miRNA-complex kan worden bereid met behulp van hetzelfde proces dat wordt beschreven in stappen 1.1-1.5 voor alle nierziektemuizenmodellen die in dit manuscript worden beschreven (UUO, diabetische nefropathie en AKI). Eén injectievolume PEI-NP-miRNAs-mimic is hetzelfde als 5 nmol miRNA's-mimic geconjugeerd met PEI-NP's bij N/P-verhouding = 6. De injectieduur en frequentie van elke PEI-NP-miRNAs-mimic hangt af van het ziektemodel waarin het wordt toegepast.
2. Bevestiging van significante afgifte van miRNA-nabootsing aan de nier bij UUO-muizen door PEI-NP via staartaderinjectie met behulp van fluorescerende microscopie
OPMERKING: Hier wordt de toedieningsmethode van kunstmatig gezuiverde miRNA-nabootsing aan de nier uitgewerkt, wat wijst op de vaststelling van therapeutische methoden voor verschillende nierziekten. Kortom, UUO-muizen kregen cyanine3-carbonzuur (Cy3) -gelabelde miRNA-mimiek toegediend, toegevoegd aan 100 μL PEI-NP's via de staartader. De levering aan de nieren werd bevestigd met fluorescentiemicroscopie. PEI-NPs-cyanine3 carbonzuur (Cy3)-gelabelde miRNA-mimiek (oligonucleotiden) voor één muis wordt beschreven. Deze methode kan miRNA-nabootsing aanzienlijk leveren aan de nier in verschillende muismodellen, zoals UUO-muizen, diabetische nierziektemuizen en AKI-muizen geproduceerd door IRI. Hier gebruikten we een UUO-muismodel voor de videodemonstratie. De inductiemethode van UUO is eerder elders beschreven13. Volg deze protocollen binnen zes dagen na de UUO-operatie.
- Bereid de volgende items voor:
- Bereid 2 μL PEI-NP's en 100 μL Cy3-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotiden [Cy3-gelabelde miRNA-mimic (1 nmol; 10 μM)].
- Bereid 5% en 10% glucose-oplossingen. Zorg voor de beschikbaarheid van 1,5 ml microcentrifugebuizen en een vortexmixer.
- Gebruik een plastic centrifugebuis van 50 ml met een klein gaatje in de dop om de staartaders van UUO-muizen te isoleren.
- Bereid voor fluorescentiemicroscopie optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding, een cryostaat, vloeibare stikstof, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), 1,0 ml spuiten met een naald van 27 G en silaangecoat glas.
OPMERKING: Fluoresceïne-gelabelde Lotus tetragonolobus lectine (een proximale tubulus marker) en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kunnen worden bereid voor optionele kleuring van proximale tubuli en celkernen.
- Los 2 μL PEI-NP's op in 98 μL 10% glucoseoplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden.
- Voeg 100 μL Cy3-gelabelde miRNA-mimiek toe aan 100 μL PEI-NP's in 10% glucoseoplossing (bereid in stap 2.2). Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden.
- Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij RT om een stabiel complex van PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimic te bereiden.
- Plaats de UUO-muis met het hoofd in een centrifugebuis van 50 ml zonder anesthesie en plaats vervolgens de staart door het voorbereide gat in de dop.
- Vul een spuit van 1,0 ml met een naald van 27 G met 200 μl PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic complex.
- Injecteer PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) via de staartader van de muis met behulp van de 1,0 ml spuit met 27 G naald.
OPMERKING: Veeg de staartader af met watten verzadigd met ethanol (70% -80%) om de staartader te verwijden en het injectiegebied te desinfecteren. - Een uur na 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic complexe injectie, verdooft u de muis met isofluraan (4% -5%) met behulp van een geschikt anestheticum voor kleine dieren. Bevestig de diepte van de anesthesie met een afwezigheid van teenknijpreflex. Handhaaf de anesthesie met isofluraan (3%) gedurende de hele operatie.
- Maak vervolgens een incisie in de huid, spieren en ribben met een chirurgische schaar en tang om het hart bloot te leggen. Na het maken van een incisie in het rechter atrium, injecteert u PBS in de linker ventrikel om bloed door het hele lichaam te trekken totdat de nierkleur verandert in lichtgeel (wat aangeeft dat het hele muizenlichaam is doordrenkt met PBS).
OPMERKING: Hartperfusie wordt uitgevoerd om het bloed efficiënt door het hele lichaam te verwijderen. - Stop isofluraan en verwijder de nieren van de muizen en was ze met PBS. Verwijder daarna niercapsules uit de nieren en was de nieren twee keer met PBS.
- Sluit de nierweefselmonsters in OCT-verbinding in en vries in vloeibare stikstof.
- Gebruik een cryostaat om secties (5 μm dik) te bereiden. Monteer de secties op silaan-gecoate glasplaten en bevestig ze met 4% paraformaldehyde.
OPMERKING: Nierweefsels kunnen optioneel worden gekleurd met fluoresceïne-gelabelde Lotus tetragonolobus lectine (2 mg / ml) bij RT gedurende 2 uur voor proximale tubuli, gevolgd door DAPI (30 nM in PBS) bij RT gedurende 15 minuten voor celkernen. - Was de dia's twee keer voorzichtig met PBS.
- Visualiseer de fluorescentiekleuring door fluorescentiemicroscopie bij 100x en 400x vergroting en geschikte beeldvormingssoftware.
3. Bevestiging van doel-miRNA-veranderingen na toediening van miRNA-mimiek aan de nier door PEI-NP via staartaderinjectie
- Voer kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) uit om de doelmiRNA-afwisselingen te bevestigen.
OPMERKING: Raadpleeg het eerder gepubliceerde artikel voor de details van qRT-PCR18,19,20. Het qRT-PCR-systeem dat wordt gebruikt om de hieronder vermelde representatieve resultaten te genereren, is door de fabrikant gewijzigd. qRT-PCR moet worden uitgevoerd in overeenstemming met het nieuwste protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hieronder beschreven doel-miRNA's voor nierfibrose, diabetische nefropathie en AKI werden geselecteerd op basis van de microarray, qRT-PCR en / of database-onderzoek voor gentherapietoepassingen. Voor nadere bijzonderheden wordt verwezen naar de vorige publicaties13,14,15.
Toediening en effecten van miRNA-146a-5p-mimic met behulp van PEI-NP's bij nierfibrosemuizen13
Fluorescerende microscopie-analyse toonde aan dat staartaderinjectie van PEI-NP's de miRNA-mimiek naar de tubulo-interstitiële ruimte kon brengen. Bij nierfibrosemuizen geproduceerd door UUO omvatte dit renale buiscellen, die geen regelmatige vorm in de nier hebben (figuur 2A-pijl), en de glomerulus (figuur 2A). qRT-PCR-analyse toonde aan dat injectie van PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic significante overexpressie van miRNA-146a-5p in de nier veroorzaakte (figuur 2B). Bovendien remde injectie de progressie van nierfibrose in de modelmuizen geproduceerd door UUO, zoals geschat met Sirius rode kleuring (rood duidt op fibrotische gebieden) in vivo. Injectie van PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic werd uitgevoerd 1 dag vóór, 1 dag na en 3 dagen na UUO-behandeling (geschat 6 dagen na UUO-behandeling) (figuur 2C). Injectie van PEI-NPs-controle miRNA vertoonde geen preventieve effecten op nierfibrose (figuur 2B,C). Toediening van PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic en PEI-NPs-miRNA-control-miRNA's veroorzaakte geen IFN-respons, zoals verhoogde expressie van 5-oligoadenylaatsynthase en signaaltransductie en activator van transcriptie 1 bij muizen (figuur 2D).
Toediening en effecten van miRNA-181b-5p-mimic met behulp van PEI-NP's in diabetische nierziekte model muizen14
Om het therapeutisch potentieel van miRNA-181b-5p voor diabetische nierziekte te beoordelen, injecteerden we miRNA-181b-5p-PIE-NP's of controle miRNA-PIE-NP's in 10 weken oude db / db-muizen wekelijks gedurende 10 weken. Fluorescerende microscopie-analyse toonde aan dat staartaderinjectie van PEI-NP's miRNA-mimiek kon leveren aan de glomerulus- en tubulo-interstitiële ruimte in nieren van diabetische niermodel (db / db) muizen in vivo (figuur 3A). Bovendien toonde de qRT-PCR-analyse aan dat injectie van PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic significante overexpressie van miRNA-181b-5p in de nier veroorzaakte (figuur 3B). Histologische analyse met periodieke zuur-Schiff-kleuring toonde aan dat injectie van PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic eenmaal per week van 10-20 weken oud de progressie van diabetische nierziekte bij db/db-muizen in vivo remde (figuur 3C). Daarentegen leverde injectie van PEI-NPs-control miRNA geen preventieve effecten op nierfibrose op (figuur 3B,C).
Toediening en effecten van PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in acute nierbeschadigingsmodelmuizen geproduceerd door IRI15
Fluorescerende microscopie-analyse toonde aan dat de staartaderinjectie van PEI-NP's miRNA-mimiek kon leveren aan de glomerulus- en tubulo-interstitiële ruimte van aki-modelmuizennieren in vivo (figuur 4A). qRT-PCR-analyse toonde aan dat de injectie van PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimic significante overexpressie van miRNA-5100 veroorzaakte in nieren van AKI-muizen geproduceerd door IRI (figuur 3B). Histologische analyse met hematoxyline-eosinekleuring toonde aan dat een enkele injectie van PEI-NPs-miRNA-5100 de tubulaire celapoptose (zwarte pijl) verminderde, wat de ontwikkeling van AKI in het AKI-muizenmodel geproduceerd door IRI voorkwam. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic werd 2 dagen voor de IRI-procedure via de staartader geïnjecteerd (figuur 4B). Injectie van PEI-NPs-controle miRNA-toonde geen preventieve effecten op nierfibrose (figuur 4B,C).
Figuur 1: Structuur van het PEI-NPs-miRNA-mimic complex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Levering en effecten van PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic bij nierfibrosemuizen . (A) Fluorescerende microscopieanalyse. Schaalbalk = 200 μm. (B) qRT-PCR-analyse van miRNA-146a-5p-expressieniveaus in elke groep (n = 6 per groep). (C) Histologische analyse met Sirius rode kleuring (rood geeft het fibrotische gebied aan, schaalbalk = 100 μm). Injectie van PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic 1 dag vóór, 1 dag na en 3 dagen na UUO-behandeling remde de ontwikkeling van nierfibrose bij muizen in vivo. (D) qRT-PCR-analyse van de nier om mogelijke IFN-responseffecten op PEI-NPs-miRNA-146a-5p bij UUO-muizen te onderzoeken (n = 6 per groep). Afkortingen: DAPI, 4,6-diamidino-2-fenylindool; FITC, fluoresceïne-isothiocyanaat; qRT-PCR, kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie; NS, niet significant; PEI-NP's, polyethylenimine nanodeeltjes; miRNA, microRNA; UUO, unilaterale ureterobstructie; OAS1, 5′-oligoadenylaatsynthase; STAT1, signaaltransductie en activator van transcriptie 1. Waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± standaardfout (foutbalken). *P < 0,05. Morishita et al. (International Journal of Nanomedicine, 2015, 10, 3475-3488. Oorspronkelijk gepubliceerd door en gebruikt met toestemming van Dove Medical Press Ltd). 13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Toediening en effecten van PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic in diabetische nierziekte model muizen14. (A) Fluorescerende microscopie analyse. Schaalbalk = 200 μm. (B) qRT-PCR-analyse om overexpressie-effecten van miRNA-181b-5p te evalueren na injectie van PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic (n = 3 per groep). (C) Fenotypische veranderingen werden waargenomen door lichtmicroscopie. Injectie van PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic eenmaal per week vanaf de leeftijd van 12-20 weken remde de progressie van diabetische nierziekte bij db/db-muizen in vivo. Schaalbalk = 50 μm. We gebruikten een variantieanalyse (ANOVA) voor het testen van meerdere vergelijkingsanalyses tussen groepen. Als we statistische significantie door de ANOVA ontdekten, voerden we de test van Turkije uit om de middelen van twee groepen te vergelijken als een post-hocanalyse. Afkortingen: PEI-NPs, polyethylenimine nanoparticles; qRT-PCR, kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie; miRNA, microRNA. *P < 0,05. Dit cijfer is aangepast van Ishii et al. 14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Toediening en effecten van PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in acute nierschade model muizen geproduceerd door IRI . (A) Fluorescerende microscopie analyse. Schaalbalk = 100 μm. (B) qRT-PCR-analyse om de overexpressie-effecten van miRNA-5100 na injectie van PEI-NPs-miRNA-5100-mimic te evalueren. (C) Histologische analyse van hematoxyline-eosine gekleurde nier. Schaalbalk = 100 μm. PEI-NP's die 2 dagen voor de IRI-procedure via de staartader worden geïnjecteerd, voorkomen AKI-progressie geïnduceerd door IRI. Afkortingen: PEI-NPs, polyethylenimine nanoparticles; qRT-PCR, kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie; miRNA, microRNA; AKI, acuut nierletsel; IRI, ischemie-reperfusie letsel. **P < 0,01,*P < 0,05. Dit cijfer is aangepast van Aomatsu et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, kunnen PEI-NP's miRNA-nabootsingen aan de nier leveren om overexpressie van doel-miRNA's te induceren, wat resulteert in behandelingseffecten in in vivo muismodellen van verschillende nierziekten, waaronder nierfibrose, diabetische nierziekte en AKI.
De methode om het complex van PEI-NP's en miRNA-mimiek te bereiden is heel eenvoudig. Het positief geladen oppervlak van PEI-NP's vangt de miRNA-nabootsing in wanneer ze net 13,14,15,16,17 zijn gemengd (figuur 1). Bovendien, als een lineaire polyethyleen-gebaseerde niet-virale vector, vermijden PEI-NP's problemen in verband met het gebruik van virale vectoren, zoals IFN-respons en oncogenese geïnduceerd door genetische instabiliteit11,15,16.
Injectie van PEI-NPs-mimic via staartader kan training vereisen, omdat de staartaders van muizen met nierziekte soms moeilijk te doorprikken zijn vanwege uitdroging, vooral bij AKI- en zwaarlijvige db / db-muizen. Bovendien kan herhaalde injectie van PEI-NPs-miRNA-mimic nodig zijn voor verschillende muizenmodellen. Injectie-intervallen moeten worden bepaald door voorafgaande ervaring met hoe overexpressie door PEI-NPs-miRNA-mimic optreedt in de context van elk nierziektemuismodel.
Virale vectoren worden vaak gebruikt voor transfectie van miRNA-mimiek in nieren en kunnen leiden tot significante transfectie van miRNA's 9,10. Virale vectoren hebben echter potentiële problemen zoals het veroorzaken van een interferonrespons en/of genetische instabiliteit11,12. Daarom zijn verschillende alternatieve toedieningsmethoden met behulp van niet-virale vectoren, zoals Gelatine-NP's 21,22, elektroporatie 23, hydrodynamische injectie 24,25 en transfectie met behulp van echografie 26, ontwikkeld. In dit manuscript introduceerden we PEI-NP's als een niet-virale vector voor de nier. Sommige niet-virale vectoren zijn zeer invasief (elektroporatie en hydrodynamische injectie) en kunnen daarom moeilijk toe te passen zijn voor klinisch gebruik. Een vergelijking van PEI-NP's met andere niet-virale vectoren, zoals op lipiden gebaseerde nanodeeltjes en gelatine-NP's, moet echter in verdere studies worden geëvalueerd.
Dit protocol heeft de volgende beperkingen. Ten eerste, hoewel PEI-NPs-miRNA's geschikt zijn voor muismodellen (althans als eerste fase), zijn grote hoeveelheden PEI-NPs-miRNA's vereist voor grote diermodellen (zoals ratten, konijnen, apen en honden) die worden gebruikt voor preklinisch onderzoek. Bovendien moet worden opgemerkt dat PEI-NP's geen miRNA-mimiek specifiek aan de nier leverden, omdat PEI-NP's, net als virale vectoren, geen gericht toedieningssysteem zijn. Daarom moet het fenotype van andere organen mogelijk worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Wij danken Edanz (https://jp.edanz.com/ac) voor het redigeren van kladversies van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L.
- Bushati, N., Cohen, S. M.
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
