Summary
本文演示了如何制备和施用转铁蛋白结合的非放射性同位素铁，用于小鼠妊娠中铁转运的研究。还描述了量化胎儿胎盘区室中同位素铁的方法。
Abstract
铁对怀孕期间的母体和胎儿健康至关重要，人类需要大约 1 克铁来维持健康的怀孕。胎儿铁赋完全依赖于铁在胎盘上的转移，这种转移的扰动会导致不良的妊娠结局。在小鼠中，传统上测量胎盘上的铁通量依赖于放射性铁同位素，这是一种高度敏感但繁琐的方法。稳定的铁同位素（57Fe和 58Fe）为人类妊娠研究提供了一种非放射性替代品。
在生理条件下，转铁蛋白结合的铁是胎盘吸收的主要铁形式。因此，制备 58Fe-转铁蛋白并在妊娠母体内静脉注射，以直接评估胎盘铁运输并绕过母体肠道铁吸收作为混杂变量。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量胎盘和小鼠胚胎组织中的同位素铁。这些方法也可以用于生理学或疾病的其他动物模型系统，以量化 体内 铁动力学。
Introduction
铁对各种代谢过程至关重要，包括生长发育、能量产生和氧气运输1.维持铁稳态是一个动态的协调过程。铁从十二指肠的食物中吸收，并在与铁转运蛋白转铁蛋白（Tf）结合的循环中在身体周围运输。它被每个细胞用于酶促过程，掺入新生红细胞的血红蛋白中，并通过巨噬细胞从衰老的红细胞中回收。铁过量时储存在肝脏中，并通过出血或细胞脱落从体内流失。循环中的铁量是铁的消费和供应之间平衡的结果，后者受到肝激素铁调素（HAMP）的严格调节，肝激素铁调素是铁稳态的中枢调节器1。铁调素的功能是通过阻塞或诱导泛素化和降解铁输出剂铁转运蛋白（FPN）来限制血液中铁的生物利用度2。功能性 FPN 的减少导致膳食铁吸收减少、肝脏中的铁隔离以及巨噬细胞的铁循环减少1.
铁调素受铁状态、炎症、红细胞生成驱动和妊娠的调节（综述于3）。鉴于铁稳态是高度动态的，了解和测量总铁库以及铁分布和周转非常重要。动物研究传统上依赖于放射性铁同位素，这是一种高度敏感但繁琐的方法来测量铁动力学。然而，在最近的研究中，包括这里介绍的研究4，非放射性，稳定的铁同位素（58Fe）用于测量怀孕期间的铁转运5，6，7，8，9。稳定同位素是研究营养代谢的宝贵工具（综述于10）。在人体研究中使用稳定的铁同位素表明，i）铁吸收在妊娠结束时增加5，6，ii）膳食铁向胎儿的转移取决于母体铁状态7，iii）母体摄入的血红素铁比非血红素铁更容易被胎儿吸收8，以及iv）铁转移到胎儿与母体铁调素水平8负相关，9.这些实验测量了血清中的铁同位素或其掺入红细胞;然而，单独测量红细胞中铁的测量可能会低估真正的铁吸收9。在目前的研究中，血红素和非血红素铁都在组织中测量。
在怀孕期间，需要铁来支持母体红细胞体积的扩张，并通过胎盘转移以支持胎儿的生长和发育11。胎儿铁禀赋完全依赖于铁通过胎盘的运输。在人类12和啮齿动物4，13怀孕期间，铁调素水平显着降低，增加了转移到胎儿的血浆铁的可用性。
胎盘铁转运的基本原理最初是在 1950-70 年代使用放射性示踪剂（59Fe 和 55Fe）表征的。这些研究确定铁通过胎盘的运输是单向的 14，15，并且二铁转铁蛋白是胎盘和胎儿铁的主要来源16，17。目前对胎盘铁转运的理解更为完整，尽管一些关键的铁转运蛋白和调节机制仍未知。小鼠模型对于理解铁调节和运输至关重要18，因为关键的转运蛋白和机制非常相似。人和小鼠胎盘都是血绒毛膜，即母体血液与胎儿绒毛膜直接接触19。但是，存在一些显着的结构差异。
合体滋养层是分离母体和胎儿循环并积极运输铁和其他营养物质的胎盘细胞层20。在人类中，合体滋养层是单层融合细胞。相反，小鼠胎盘由两个合体滋养层21组成，Syn-I和Syn-II。然而，Syn-I和Syn-II界面处的间隙连接允许营养物质在层22，23之间扩散。因此，这些层作为类似于人类合体滋养层的单个合胞层起作用。Rossant和Cross21回顾了人类和小鼠胎盘之间的其他异同。胎盘铁转运是由母体血液中的铁-Tf与位于合体滋养层24顶端侧的转铁蛋白受体（TfR1）结合触发的。这种相互作用通过网格蛋白介导的内吞作用诱导铁-Tf/TfR1内化25。然后，铁从酸性内体26中的Tf释放出来，通过未确定的铁还原酶还原为亚铁，并通过尚未确定的转运蛋白从内体输出到细胞质。铁如何在合体滋养层中陪伴也有待描述。铁最终由铁输出者FPN运输到胎儿侧，位于合体滋养层的基底或面向胎儿的表面上（在27中回顾）。
为了了解TfR1，FPN和铁调素的生理和病理调节如何影响胎盘铁转运，使用稳定的铁同位素定量从母体循环到体内胎盘和胚胎的铁转运4。本文介绍了制备和给予怀孕小鼠同位素铁转铁蛋白的方法，ICP-MS的组织处理以及组织中铁浓度的计算方法。体内使用稳定的铁同位素可以适用于研究铁在不同动物模型中的调节和分布，以研究生理和病理铁的调节。
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Protocol
所有动物方案和实验程序均由加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 58Fe-Tf的制备
注意：该协议使用 58Fe;但是，相同的协议可用于 57Fe。这两种同位素都可以作为标准铁化学品使用和处理，而无需额外的预防措施。
- 将 58Fe 溶解在 12 N HCl 中，50 μL HCl/mg 的 58Fe。
- 将HCl添加到供应商提供的玻璃小瓶中的金属中，然后松散地盖上盖子。要溶解铁，请将 58Fe / HCl溶液加热至60°C1小时。如果仍未溶解，请将溶液在室温下在通风橱中放置过夜以溶解。
注意：溶解的 58Fe / HCl溶液呈黄橙色。
铁3O4 + 8HCl（水溶液） → 铁（II）氯化物 2（水溶液） + 2铁（III）氯化物 3（水溶液） + 4H2 O
- 将HCl添加到供应商提供的玻璃小瓶中的金属中，然后松散地盖上盖子。要溶解铁，请将 58Fe / HCl溶液加热至60°C1小时。如果仍未溶解，请将溶液在室温下在通风橱中放置过夜以溶解。
- 氧化任何剩余的Fe（II）Cl2 以生成Fe（III）Cl3 溶液。
- 将 58Fe / HCl溶液加热至60°C，盖上盖子以促进氧化。
- 每 50 μL 58Fe/HCl 溶液中加入 1 μL 35% H 2 O2，以进一步促进氧化。
二氯化铁2（水溶液） + O 2 + 4HCl → 4铁（III）氯化物3（水溶液） + 2H2 O
- 制备氯化铁（58Fe（III）Cl3）溶液。
- 将氯化铁溶液留在60°C的罩中，盖上盖子以蒸发样品。
注意：蒸发可能需要一到几天的时间。 - 用超纯H 2 O复溶58 Fe（III）Cl 3至100 mM，并根据步骤1.1中使用的初始金属重量（58Fe（III）Cl3的分子量为162.2）计算所需的超纯H 2O量。
- 将氯化铁溶液留在60°C的罩中，盖上盖子以蒸发样品。
- 通过在 20 mM NaHCO3 存在下以 1：5 摩尔比将 58Fe（III）Cl3 与 NTA 孵育来制备 58Fe（III）-次氮基三乙酸酯 （NTA）。
- 在 1 N NaOH 中制备 500 mM NTA。
- 制备5x转铁蛋白上样缓冲液（0.5 M HEPES，pH 7.5;0.75 M NaCl）。
- 在超纯 H2O 中制备 1 M NaHCO3。
- 向 15 mL 锥形管中加入 150 μL 100 mM 58 Fe（III）Cl3 溶液（来自步骤 1.3.2）、150 μL 在 1 N NaOH 中制备的 500 mM NTA、480 μL 超纯 H2O、200 μL 5x转铁蛋白上样缓冲液和 20 μL 1 M NaHCO3 溶液。
- 将混合物在室温下孵育5分钟。
- 用58 Fe（III）-NTA加载apo-Tf以形成58Fe-Tf。
注意：此协议改编自McCarthy和Kosman28。- 将 500 mg apo-Tf 溶解在 4 mL 的 1x Tf 上样缓冲液中。
- 在步骤1.4.4中，向含有1 mL 58Fe（III）-NTA溶液的15 mL锥形管中，加入4 mL apo-Tf溶液。
注意：这是 3：1 的摩尔比， 58Fe-NTA 与 apo-Tf。每个Tf包含2个Fe结合位点;添加了过量 的58Fe-NTA，以确保Tf满载。 - 为了允许在apo-Tf上最大负载 58Fe-NTA，请检查溶液的pH值是否为7.5，并在必要时使用NaHCO3 或HCl调节pH值。
- 在室温下孵育2.5小时。
- 去除多余的未结合 58Fe（III）-NTA并释放NTA。
- 将 58Fe-Tf溶液转移到分子量截止柱（30 kDa截止）中，并在室温下以2，500 × g 离心15分钟。
- 用 10 mL 1x 转铁蛋白上样缓冲液洗涤色谱柱，并在室温下以 2，500 × g 离心 15 分钟。重复洗涤和离心，用10mL盐水进行盐水洗涤，并在室温下以2，500× g 离心15分钟。
- 计算 58Fe-Tf的浓度。
注意：由于在步骤1.5.2中添加了过量的 58Fe，假设所有转铁蛋白都是二铁。当使用500毫克apo-Tf时，在步骤1.5.4中产生~500毫克 58Fe-Tf。- 在步骤1.6.2中测量盐水洗涤后从离心中回收的体积。
- 将500 mg除以回收的体积，以确定 58Fe-Tf溶液的浓度（以mg / mL为单位）。
- 使用0.22μm注射器过滤器对 58Fe-Tf溶液进行灭菌;储存在4°C直至准备使用。
注意：制备后1至4周使用 58Fe-Tf溶液。
2. 设置定时小鼠怀孕
- 使用6至8周龄的雌性小鼠。在交配前将动物置于低铁饮食（4 ppm铁）或标准食物（185 ppm铁）2周，并在整个怀孕期间保持动物各自的饮食。
- 选项01：通过E7.5的体重增加确认怀孕。
- 设置多个养殖笼。对于每个笼子，将 2 只雌性与 1 只雄性混合过夜;动物分离的第二天被认为是胚胎日（E）0.5。在E7.5下称量女性以确定是否怀孕。再次与体重不增的雌配雄性。
注意：在WT C57BL / 6中，E1时体重增加7.5克是怀孕的良好指标。这种方法确保植入发生在特定的16小时时间范围内，允许在同一交配期间怀孕的所有动物进行同步治疗。
- 设置多个养殖笼。对于每个笼子，将 2 只雌性与 1 只雄性混合过夜;动物分离的第二天被认为是胚胎日（E）0.5。在E7.5下称量女性以确定是否怀孕。再次与体重不增的雌配雄性。
- 选项02：通过塞子检查确认怀孕。
- 将 2 只雌性与 1 只雄性结合起来，每天检查插头以确定是否发生了交配。
注意：这种方法可能会导致交错怀孕，并且塞子的存在并不能保证怀孕。
- 将 2 只雌性与 1 只雄性结合起来，每天检查插头以确定是否发生了交配。
3.静脉内给予E17.5怀孕小鼠 58Fe-Tf
- 准备步骤1.8中的 58Fe-Tf进行注射。
- 在盐水中以35mg / mL制备 58Fe-Tf溶液;每只小鼠注射100μL。
- 用 100 μL 的 58Fe-Tf 溶液填充胰岛素注射器。
注意：每剂含有3.5毫克人58Fe-Tf（5μg58 Fe）。
- 使用异氟醚麻醉怀孕的小鼠。
- 使用带腔室的异氟醚调节剂。
- 使用以下设置：5%异氟醚，2 L / mL的O 2，2分钟。
- 通过查找对脚趾捏没有反应来确认鼠标已麻醉。
- 将眼睛润滑剂涂在眼睛表面，然后将鼠标放在加热垫上。
- 缓慢而小心地将 58Fe-Tf溶液注入眶后窦。
- 让鼠标从麻醉中恢复;在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让动物无人看管。
- 注射后六小时，通过异氟醚过量对E17.5孕妇实施安乐死。
- 进行心脏穿刺以放血小鼠作为继发性安乐死的一种形式。
- 用针将脚向下固定以稳定。
- 收集胎盘和胚胎肝脏。
- 使用无菌镊子和解剖剪刀，小心地从怀孕的小鼠身上取出子宫。切断胎盘胎盘单位，该单位包括单个胎儿和羊膜中的胎盘，羊膜囊中被子宫的一部分包围。
- 小心切开子宫和羊膜囊，不要打扰胎儿和胎盘。
- 剥开羊膜囊，取出胎儿和胎盘。
- 剪断脐带。
- 用干净的工作擦拭布吸干胎儿和胎盘，以去除多余的羊水。
- 记录整个胎盘的重量。
- 用剃须刀片将每个胎盘切成两半，将每一半放入 2.0 mL 管中，并在液氮中快速冷冻。
注意：由于 58 Fe 不需要特殊的处理预防措施和处置，因此胎盘的一半可用于 58Fe 测量，另一半可用于任何其他分析，包括通过蛋白质印迹和 qPCR 定量转铁蛋白受体 （TFR1） 和铁转运蛋白 （FPN） 表达。 - 要收集胚胎肝脏，请牺牲胚胎：使用剃须刀片迅速斩首胚胎。
注意：在E17.5中，子宫中的所有胚胎都必须单独安乐死，即使它们未用于研究。 - 将胚胎固定下来以稳定，使腹部暴露在外。
- 使用解剖剪刀，在连接脐带的地方做一个小切口，将解剖剪刀的一端插入切口，并向冠状平面进行约1/4英寸的正中平面切割。然后，进行横向平面切割以暴露胎儿肝脏。
- 用镊子取出胎肝。
- 记录整个胚胎肝脏的重量。
- 将整个胚胎肝脏放入 2 mL 管中，并在液氮中快速冷冻。
注意：或者，如果需要额外的分析，只有一部分胚胎肝脏可用于 58Fe测量。与 1.5 mL 管相比，使用 2.0 mL 管可实现更好的组织匀浆。
- 将组织无限期地储存在-80°C。
4. 通过ICP-MS进行定量铁分析的工艺组织
- 处理胎盘和胎儿肝脏以定量 非血红素铁。
- 解冻胎盘半部分和整个胎肝，并称量胎盘半部分（记录胎肝重量参见步骤3.6.12）。
- 加入 400 μL 蛋白质沉淀溶液（0.53 N HCl，5.3% TCA）。
- 使用电动均质机均质组织。
- 将样品在100°C孵育1小时。
- 将样品在室温水中冷却2分钟。
- 打开盖子以释放压力，然后再次关闭管子。
- 在室温下以17，000× g 离心10分钟以沉淀组织碎片。
- 小心地将上清液转移到新的标记管中。
- 送去样品进行 ICP-MS 分析。
- 处理胎盘和胎儿肝脏以定量 血红素铁。
注意：在步骤1中提取非血红素铁后，沉淀中剩余的铁主要是血红素。- 记录步骤4.1.7中每个颗粒的重量。
- 将沉淀在 10 mL 浓缩的 70% HNO3 中，补充有 1 mL 30% H 2 O2
注意：咨询ICP-MS核心或中心，以优化特定研究的HNO3 体积;体积将部分取决于样品重量。 - 将样品加热至200°C15分钟。
- 将样品送去进行 ICP-MS 分析。
注意：如果不需要区分血红素和非血红素铁源，并且仅测量总铁，则可以在HNO3 中消化整个组织作为第一步。
5. 数据分析
注意：ICP-MS的数据以 56铁和 58铁浓度提供，单位为ng/mL或mg，ppb（表1）。 56Fe是自然界中最丰富的铁同位素，其测量反映了整个怀孕期间胎盘/胚胎中的铁积累，而 58Fe测量反映了注射后6小时内转移的铁。
- 从测量的 58 Fe 值中减去 58Fe（占总 Fe 的 0.28%）的天然丰度。
- 计算总非血红素 58Fe。
- 计算胚胎肝脏总非血红素铁（ng），首先将步骤5.1中计算的铁浓度（ng / mL）乘以步骤4.1.2中初始处理期间的体积（mL），以估计总 58Fe。
- 通过将步骤3.6.6中测量的胎盘的总重量除以步骤4.1.1中处理的胎盘重量来计算整个胎盘中的铁量。将该值乘以步骤5.2.1中计算的总非血红素铁（ng），得到胎盘的总非血红素 58Fe含量。
- 计算总血红素 58铁。
- 首先将步骤5.1中计算的铁浓度（ng / mg）乘以步骤4.2.1中测量的颗粒重量（mg），从而计算总血红素 58Fe。
- 然后，将步骤3.5.1中测量的胎盘总重量除以步骤4.2.1中测量的胎盘沉淀的重量。将该值乘以步骤5.3.1中计算的总血红素铁（ng），得到胎盘的总血红素 58Fe含量。
- 将计算出的非血红素和血红素 58Fe值相加，以确定每个组织的总铁含量。
图 1：协议中步骤的可视化摘要 。 （A）制备 58铁转铁蛋白。（B） 体内 给予 58铁转铁蛋白。（三）组织采集和贮存。（D）通过ICP-MS处理胎盘和胚胎肝脏以定量金属种类。缩写：Fe = 铁;NTA = 次氮基三乙酸;Tf = 转铁蛋白;PPS = 蛋白质沉淀溶液;Sup = 上清液;TCA = 三氯乙酸;ICP-MS = 电感耦合等离子体质谱。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
早期一项使用稳定铁同位素测量铁转运的研究表明，母体缺铁导致胎盘铁输出者FPN4的下调。FPN是唯一已知的哺乳动物铁出口者，在发育过程中缺乏FPN导致胚胎在E9.529之前死亡。为了确定观察到的FPN表达降低是否在功能上转化为胎盘铁转运减少，将 58Fe-Tf静脉注射到怀孕的母亲中，并在母体缺铁的情况下量化胎盘和胚胎中的铁。
为了了解胎盘铁转运如何受到母体铁状态的影响，在小鼠中模拟了缺铁4。雌性C57BL / 6小鼠在怀孕前和整个怀孕期间置于低铁饮食（4ppm铁）或标准食物（185ppm铁）2周。与标准饮食的动物相比，这种饮食方案导致母体肝脏非血红素铁、血清铁和血红蛋白在 E12.5、E15.5 和 E18.5 处降低4。在E18.5时，来自缺铁母亲的胚胎具有较低的肝铁，并且比来自铁充足母亲的胚胎低铁血症和贫血。在充铁组和缺铁组中各使用3只怀孕小鼠，并使用每只怀孕小鼠的2-3个胎盘进行分析。
为了定量胎盘铁转运，制备58Fe-转铁蛋白并在妊娠母体内静脉注射，并通过ICP-MS在胎盘和胎儿肝脏中测量58Fe，如协议中所述，如图1所示。在将非血红素铁样品送出进行ICP-MS分析之前，通过前面描述的费烯方法独立定量总非血红素铁水平30。通过费烯与ICP-MS方法测量的非血红素铁浓度在所有测量的组织中高度显着相关（R2 = 0.94，P < 0.0001，n = 36）。ICP-MS定量铁同位素的代表性结果如表1所示。如协议步骤5中所述计算总58Fe。数据以总铁而不是血红素或非血红素铁表示（图2A-D），因为目的是定量转移到胎盘的总铁和从胎盘转移到胚胎的总铁。
平均而言，施用的58Fe剂量的21%在胎盘，胚胎肝脏和胚胎血清中回收。56Fe测量提供了整个怀孕期间胎盘和胚胎肝脏中长期铁转移的见解。缺铁组和补铁组的总胎盘56Fe相似（图2A），而缺铁组的胚胎肝总铁减少（图2B）。这是基于观察到的缺铁组胎盘FPN的减少4，这将导致铁保留在胎盘中，而牺牲胚胎。总58铁提供了短期铁运输的快照。在这项研究中，与56Fe相似，缺铁组和充盈组的胎盘58 Fe相似（图2C），缺铁组的胚胎肝脏58Fe降低（图2D）。这些数据表明，在缺铁妊娠期间，胎盘FPN的下调导致铁转运到胚胎的减少，导致胎盘和胚胎中铁含量的累积差异。
重要的是要考虑施用的铁剂量，因为它可能导致铁调素浓度或铁转运蛋白表达的意外变化31。研究表明，母体缺铁导致胎盘FPN4降低。为了确定Fe-Tf注射是否影响这种调节，在注射后6小时通过蛋白质印迹测量胎盘FPN。5μg的铁剂量不足以通过母体缺铁改变胎盘FPN调节（图3）。
综上所述，该方法用于证明母体缺铁期间胎盘FPN的生理调节导致 体内胎盘铁转运减少。稳定的铁同位素为测量铁的运输和分布提供了一种灵敏且可量化的放射性替代方案，允许同时使用组织进行额外的分析。
图 2：缺铁或补铁妊娠中 56Fe 和 58Fe 通过胎盘运输。 胎盘（A）和胚胎肝脏（B）中总共56铁。胎盘（C）和胎儿肝脏（D）中总共58Fe。使用正态分布值的 2 尾学生 t 检验进行统计分析，否则使用曼-惠特尼 U 秩和检验（P 值后用星号表示）进行统计分析。动物的数量在盒子和晶须图的 x 轴中表示。箱形图的上半部分表示第 75 个百分位数，底部表示第 25个百分位数;框上方的胡须表示第 90 个百分位数，框下方的胡须表示第 10个百分位数。框内的实线表示中位数，虚线表示平均值。使用科学绘图和数据分析软件进行统计分析。这个数字是从4修改而来的。缩写：Fe = 铁。请点击此处查看此图的大图。
图 3：胎盘 TFR1 和 FPN 水平。 （A）用58Fe-Tf治疗母亲后6 h，通过蛋白质印迹评估缺铁和充盈胎盘中的TFR1和FPN表达。（B）蛋白质表达被定量并呈现为相对于β-肌动蛋白的蛋白质表达。使用正态分布值的 2 尾学生 t 检验进行统计分析。动物的数量在盒子和晶须图的 x 轴中表示。箱形图的上半部分表示第 75 个百分位数，底部表示第 25个百分位数;框上方的胡须表示第 90 个百分位数，框下方的胡须表示第 10个百分位数。框内的实线表示中位数，虚线表示平均值。使用科学绘图和数据分析软件进行统计分析。这个数字是从4修改而来的。缩写：TFR1 = 转铁蛋白受体;FPN = 铁转运蛋白。请点击此处查看此图的大图。
| 样本 | 56铁 | 58铁 | 总铁 | ||||
| 浓度 [纳克/毫升或毫克，ppb] | 浓度 [纳克/毫升或毫克，ppb] | 同位素总和 [纳克/毫升或毫克] | |||||
| 平均* | 斯特德夫 | 平均* | 斯特德夫 | ||||
| 非血红素铁 | 胎盘 | 缺铁 | 729.7 | 17.7 | 2.5 | 0.5 | 732.2 |
| 704.9 | 6.2 | 3.8 | 0.1 | 708.8 | |||
| 649.8 | 3.8 | 0.0 | 0.0 | 649.8 | |||
| 799.2 | 4.6 | 3.8 | 0.2 | 803.0 | |||
| 铁质丰富 | 1919.1 | 5.3 | 11.0 | 0.2 | 1930.1 | ||
| 1610.0 | 26.8 | 11.7 | 0.6 | 1621.7 | |||
| 1925.5 | 39.0 | 14.0 | 0.3 | 1939.5 | |||
| 2551.6 | 16.1 | 8.3 | 0.4 | 2559.9 | |||
| 血红 素 | 胎盘 | 缺铁 | 253.8 | 1.8 | 1.1 | 0.0 | 254.9 |
| 32.9 | 0.4 | 0.3 | 0.0 | 33.2 | |||
| 337.7 | 5.1 | 1.4 | 0.0 | 339.1 | |||
| 402.3 | 5.3 | 1.7 | 0.0 | 404.0 | |||
| 铁质丰富 | 123.5 | 1.3 | 0.6 | 0.0 | 124.0 | ||
| 75.7 | 1.3 | 0.4 | 0.0 | 76.1 | |||
| 441.9 | 3.0 | 1.9 | 0.0 | 443.8 | |||
| 250.4 | 1.1 | 1.1 | 0.0 | 251.5 | |||
| 非血红素铁 | 胚胎肝 | 缺铁 | 361.6 | 8.3 | 31.9 | 1.0 | 393.5 |
| 652.4 | 3.4 | 61.7 | 0.3 | 714.1 | |||
| 411.9 | 10.7 | 43.1 | 0.8 | 455.0 | |||
| 631.1 | 7.5 | 62.8 | 0.2 | 693.9 | |||
| 铁质丰富 | 7657.5 | 129.3 | 226.4 | 2.2 | 7883.8 | ||
| 3820.2 | 69.5 | 119.4 | 3.4 | 3939.6 | |||
| 5519.0 | 112.9 | 145.6 | 0.5 | 5664.6 | |||
| 4617.4 | 78.6 | 91.6 | 1.0 | 4709.0 | |||
| 血红 素 | 胚胎肝 | 缺铁 | 44.5 | 0.3 | 1.6 | 0.0 | 46.0 |
| 31.0 | 0.4 | 2.9 | 0.0 | 34.0 | |||
| 11.8 | 0.2 | 1.1 | 0.0 | 12.9 | |||
| 42.3 | 0.1 | 3.2 | 0.0 | 45.5 | |||
| 铁质丰富 | 54.3 | 1.4 | 2.1 | 0.0 | 56.4 | ||
| 31.9 | 0.8 | 1.3 | 0.1 | 33.2 | |||
| 59.4 | 0.6 | 2.2 | 0.0 | 61.6 | |||
| 66.7 | 0.6 | 2.1 | 0.0 | 68.8 | |||
表1：胎盘和胚胎肝脏中56 Fe和58 Fe的ICP-MS定量的代表性结果。缩写：ppb = 十亿分之一;标准差 = 标准差;ICP-MS = 电感耦合等离子体质谱。
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Discussion
铁对许多生物过程很重要，它在体内的运动和分布是高度动态和调节的。稳定铁同位素为评估铁稳态的动力学提供了放射性同位素的一致且方便的替代方案。该方案的一个关键步骤是跟踪所有组织重量和体积。铁是一种元素，因此不能合成或分解。因此，如果仔细记录所有重量和体积，则可以通过计算来计算系统内的所有铁。如前所述，该方法可用于区分血红素和非血红素铁源。然而，如果铁形式之间的这种区别不是必需的，并且只测量总铁，则可以通过仅使用浓缩的HNO3 处理组织来简化方案，如方案步骤4.2中所述。重要的是要注意，如果在分析前未灌注组织，尤其是胎盘等高血管组织，血液的存在可能导致高估组织血红素铁含量。
该研究选择了转铁蛋白结合的铁，因为它是胎盘吸收铁的主要来源16，17。小鼠 TFR1 的整体敲低导致E12.5之前的胚胎致死率，这表明转铁蛋白结合的铁对发育至关重要。其他铁种类，如铁蛋白和非转铁蛋白结合铁（NTBI），也可能在较小程度上对胎儿铁禀赋的贡献。然而，没有评估这些替代铁物种的贡献。将来，稳定同位素可用于确定不同铁源对发育和胚胎铁禀赋的贡献。
该研究的目的是确定母体铁状态变化对胎盘铁转运的影响。然而，缺铁期间铁调素降低会导致肠细胞 FPN 水平升高并增强铁向循环的转运1。因此，在缺铁的水坝中，如果口服 58Fe，饮食中的铁吸收会固有地增加，并且混淆了对结果的解释。因此，选择静脉内施用 58Fe-Tf，因为它绕过了肠道吸收水平的铁调节。根据富含铁的E18.5妊娠母猪的血清铁浓度选择 5μg58Fe/小鼠的剂量。在野生型C57BL / 6 E18.5妊娠母猪中，血清铁浓度范围为10至50μM4。预计怀孕的E18.5小鼠的总血容量约为2mL32。因此，富含铁的孕妇循环中的铁总量在1.1至5.6微克之间。因此， 5μg58Fe/小鼠相当于在富含铁的动物中观察到的生理浓度。
ICP-MS检测58 Fe的限制是来自58Ni的同量异位干扰。小鼠胎盘中的内源性Ni浓度为0.04±0.02μg/ g湿重33。平均E18.5小鼠胎盘重0.080克;因此，Ni的总量约为3.2ng。58Ni的天然丰度为68%;因此，小鼠胎盘中58Ni的量为~2.2ng，比检测到的58Fe水平低约10倍。在胚胎中，Ni浓度甚至更低，为0.01±0.01μg/g湿重33。E18.5小鼠胚胎平均重1g;因此，正常小鼠胚胎中Ni的总量约为10ng。假设在胚胎肝脏中发现了所有的胚胎Ni，这些水平仍然比58Fe浓度低10倍，比胚胎肝脏总铁含量低近1000倍。鉴于这些小鼠组织中Ni的丰度较低，本研究未考虑58Ni干扰。
另一个考虑因素是检测的检测限。本研究中的检测限为 250 pg/mL 58Fe。但是，如果在组织处理步骤（方案步骤4.1.2和图1D）或通过ICP-MS核心设施的修改减少组织的稀释度，则可以改变该限值以检测更低浓度的58Fe。当在整个胚胎中测量58 Fe时，由于58Fe浓度低于检测限，因此未检测到其水平。然而，在胚胎肝脏中检测到58Fe，这是主要的铁储存器官。施用更大剂量的58Fe可能允许在整个胚胎中检测到58Fe。然而，相对少量的58Fe用于避免胎盘的铁负荷，这可能会触发反馈机制并改变铁转运蛋白的表达。在该模型中，其利用野生型C57BL / 6小鼠，测量胚胎肝铁作为胎盘铁转运的反映，因为胚胎肝铁浓度与整个胚胎铁浓度成正比4。然而，在铁分布改变的小鼠模型中34，单独的胚胎肝铁可能无法准确代表胎盘铁的总运输。在这种情况下，可能需要测量掺入整个胚胎或红细胞隔室的铁。此外，实验时间点的变化也需要进一步优化和测量各个胎儿隔室中的铁。这种稳定同位素示踪方法用于量化小鼠怀孕期间的铁转运。该方法很容易适应研究非怀孕小鼠和其他动物模型中的铁转运。
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Disclosures
EN是Intrinsic LifeSciences和Silarus Pharma的科学联合创始人，也是Protagonist，Vifor，RallyBio，Ionis，Shield Therapeutics和Disc Medicine的顾问。VS 声明没有冲突。
Acknowledgments
作者承认在加州大学洛杉矶分校CNSI的UC纳米技术环境影响中心内使用ICP-MS设施，以协助优化 58Fe测量的协议。该研究得到了NIH国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）（K01DK127004，至VS）和NIH国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）（R01HD096863，至EN）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
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