Summary
胚盤胞様細胞を効率的、タイムリーに、かつ逐次的に生成するヒト芽球の形成を概説するプロトコル。
Abstract
幹細胞から形成されたヒト胚盤胞(blastoid)のモデルは、科学的および医学的進歩を支持するであろう。しかし、その予測力は、胚盤胞発生のシーケンス(形態形成、仕様、パターニング)を効率的、タイムリー、忠実に反復し、胚盤胞期を反映する細胞を形成する能力に依存する。ここでは、PXGL条件下で培養し、その後、カバ、形質転換成長因子-β、および細胞外シグナル調節キナーゼ経路に対して3倍に阻害されたナイーブヒト多能性幹細胞が、形態形成を効率的に受けてブラストイドを形成することを示す(>70%)。発生時期(〜4日間)と一致させて、胚盤は、栄養芽細胞およびエピブラストの類似体を産生することによって本明細書の胚盤胞配列を展開し、続いて原始内胚葉および極性栄養芽細胞の類似体を形成する。これは、胚盤胞(>96%)および少数の移植後類似体に転写的に類似した細胞の形成をもたらす。ブラストイドは、子宮のようにホルモン刺激された子宮内膜細胞に指向的に付着する特異的電位を獲得する極性領域(NR2F2+)の成熟によって特徴付けられる胚 - 外胚軸を形成することによって効率的にパターン 化する。このようなヒト芽球体は、 インビトロでヒトの発達および移植を研究するためのスケーラブルで汎用性が高く、倫理的なモデルである。
Introduction
実験モデルの欠如は、初期のヒト胚発生の理解を制限している。胚発生のヒト特異的な側面に関する現在の知識は、研究のために寄付された余剰の体外受精(IVF)胚に由来する。しかし、入手の限界、実験操作の困難さ、および胚の可変的な品質は、科学的調査を妨げている。それどころか、ヒト胚の忠実なin vitroモデルは、複雑な実験的操作を可能にし、したがってヒト胚1、2、3、4に関する研究を補完する倫理的機会を提供する。マウス胚性幹細胞と栄養芽細胞を組み合わせたマウス胚盤胞の以前に開発されたモデル5.この詳細なプロトコールでは、要素胚盤胞基準に忠実なナイーブ多能性幹細胞からヒト胚盤胞のモデルを生成する方法が6に記載されている。
ヒト芽球の4つの基準。ここでは、ヒト芽球の標準化された定義を確立しようと試みて、我々は4つの最小基準を提案する。網羅的ではありませんが、これらの基準は、ヒト芽球の形成を可能にするパラメータを評価するための基礎として役立つ可能性があります(図1A)。(1)芽球は、形態および3つの系統、すなわちエピブラスト(Epi)、トロフェクトダーム(TE)、および原始内胚葉(PrE)の類似体の生成の点で効率的に形成されるべきである。非効率性は、不十分な初期細胞状態または/および培養状態(例えば、ブラスト様培地)を指し示す可能性が高い。(2)芽球は、発生配列(Epi/TEが最初、PrE/polarTEが最後)7,8およびタイミング(誘導〜3日;胚発生日5〜7日)7,9に従って3系統の類似体を生成するべきである。(3)胚盤胞は胚盤胞期の類似体を形成するべきであるが、移植後段階(例えば、移植後エピブラスト、栄養芽細胞、または羊膜細胞)の類似体を形成するべきではない。(4)最後に、胚盤胞は、胚盤胞の移植および発達の機能的特徴を再現することができるべきである。このプロトコールを使用すると、ヒト芽球体は複数の細胞株(>70%)を使用して効率的に形成され、胚盤胞細胞類似体を順次および4日以内に生成することができ、類似体は胚盤胞期と転写的に類似している(いくつかの分析に基づいて>96%)6、10、11。最後に、ブラストイドは胚外胚軸を強固に生成し、極性領域を介してホルモン的に刺激された子宮内膜細胞と相互作用し、延長培養時に系統を堅牢に拡張することを可能にする(時間等価:胚13日目)。
初期セル状態の重要性。 ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、正確な発生段階を捕捉しようとするさまざまな状態で安定化させることができる。これらの状態は、依然として最適ではないが、移植前(〜胚発生日5〜7日目)または移植後様(〜胚発生日8〜14)エピブラスト段階12において細胞を拘束する培養条件によって持続される。トランスクリプトーム解析により、PD0325901、XAV939、Gö6983、および白血病阻害因子(LIF;PXGLナイーブhPSCsと呼ばれる)13,14で培養されたhPSCは、線維芽細胞増殖因子(FGF)2およびアクチビン15(プライミングhPSCs12と称される)およびヒト伸長多能性幹細胞(hEPSC )16で培養されたhPSCと比較して、胚盤胞エピブラストに類似していることが示された(参考文献17の分析を参照のこと、18,19)。したがって、プライミングされたhPSCsのトランスクリプトームは、移植後/胃形成前のカニクイザルエピブラスト20と最もよく一致する。トランスポゾン発現、DNAメチル化、およびX染色体状態のような追加の分子基準は、ナイーブ状態の変異がプライミング状態と比較して胚盤胞エピブラストにより近いことを確認した17,21。最後に、ナイーブhPSCの系統は、PXGL培養条件22を用いて胚盤胞から直接誘導されることに成功した。
ヒト初期胚盤胞細胞はまだコミットされていない。 マウス系統指定は、胚盤胞期23に先行する桑実期から生じる。それどころか、解離および再凝集実験は、初期の胚盤胞のヒト栄養胚葉細胞がまだコミットされていないことを示している24。したがって、単一細胞RNAシーケンシング(scRNAseq)によるヒト胚盤胞の細胞の解析により、最初の系統仕様(絨毛芽細胞/エピブラスト)が胚盤胞腔の形成後に起こることが示された7。この延期されたヒト仕様は、マウスPSCがエピブラスト系統に大きく関与している場合、hPSCが栄養芽細胞25、26、27を形成するのに強力であるという観察と相関する。これらの複合的な観察は、素朴なhPSCが胚盤胞期を反映し、3つの胚盤胞系統を形成する可能性を保持する可能性につながった。最近、胚外類似体を指定するためのhPSCの効力は、ナイーブ状態からプライミング状態への進行の間に栄養胚葉から羊膜に移行することが提案されている27。したがって、素朴なhPSCは、移植前段階17、18、21とより類似しており、プライミングされたhPSC27、hEPSC16、または中間再プログラム状態28と比較して、栄養芽細胞を形成する能力が増強されている(図1B).したがって、初期細胞状態は、適切な胚外類似体を形成するために重要である。変換されたトロフェクトダーム類似体の徹底的な並行分析はまだ行われていないが、初期の胚盤胞を反映するPXGLナイーブ状態は、忠実度の高い芽球を形成するために重要であると思われる。
シグナル伝達経路阻害による仕様および形態形成の促進。カバシグナル伝達経路の阻害は、マウス、ウシ、およびヒト9、29、30において栄養芽細胞仕様を駆動する保存されたメカニズムである。また、2013年以降、NODAL(A83-01)や細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK;PD0325901または同等)および骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路の活性化は、栄養芽細胞系統に関連する転写ネットワークを活性化するためにプライミングされたhPS細胞を誘発する25、31、32、33、34。さらに、最近いくつかの報告により、NODALおよびERK経路の両方の阻害およびBMPの活性化が、ナイーブhPSCs25、31、32、33、34からの栄養芽細胞分化を促進することも確認された。最後に、栄養芽細胞仕様がナイーブ状態から誘発される場合、細胞は栄養胚葉26の発生進行の側面を反復する。しかしながら、胚盤胞栄養胚葉を反映する自己更新線は、インビトロで安定化されていない。栄養芽細胞の仕様に従って、HDAC阻害とともに上皮成長因子(EGF)およびWntシグナル伝達経路の誘導は、絨毛芽細胞発生進行を促進し得34,35、および移植後の細胞栄養芽細胞を反映するヒト絨毛芽細胞幹細胞(hTSC)の系統に細胞を安定化させる可能性がある18,35。このような系統は、胚盤胞および胎盤組織35の両方から誘導することができる。
PrEと呼ばれる第2の胚外系統は、栄養芽細胞の後に特定され、エピブラスト7,9に由来する。マウスPrE36とは対照的に、ヒトの対応物はFGFシグナル伝達37、38から独立していると考えられている。胚外内胚葉を反映する系統(nEndと呼ばれる)は、アクチビンA、Wnt、およびLIF39を用いたシグナル伝達経路の誘導によって、ナイーブhPSCから確立された。胚阻害実験と矛盾する、ERK阻害は、インビトロ39においてこのようなnEND細胞の形成を防止することが示されている。今まで、そのような系統は胚盤胞から直接誘導されていなかった。
最近、初期胚のモデルは、hTSCs35およびnEND細胞39のために以前に開発された培地のバリエーションを組み合わせることによって形成されており、したがって、形質転換成長因子−β(TGF−β)、EGF、およびWntシグナル伝達経路28、40の活性化剤を使用する。これらの胚モデルは、低効率(10%〜20%)で形成し、着床後エピブラスト、栄養芽細胞、羊膜、胃、中胚葉組織(〜胚14日目)、および細胞栄養芽細胞10の類似体を含む、着床前段階ではなく移植後段階10に似た細胞を形成する。それどころか、カバ、ERK、およびTGF−β経路の三重阻害は、胚盤胞様細胞41を含む胚盤状の形成を効率的に導く。初期細胞状態とともに、我々は、トリプル経路阻害(カバ、ERK、TGF-β)が高忠実度ブラストイドを形成するための第2の必須パラメータであることを提案している(図1B)。
scRNAseqを用いて細胞状態および反射ステージを評価した。ブラストイドを構成する細胞の状態は、scRNAseq解析によって評価することができる。特定の胚期に対するそれらの転写類似性は、ブラスト様細胞のみを用いて、および着床後段階を反映するプライミングhPSCまたはhTSCとの比較によって測定することができる20,35。異なるレベルの定義を使用してクラスター分析を実行すると、定義が減少したときに亜集団がどのように徐々にマージされるかが明らかになり、クラスターの類似性が明らかになります。クラスタ数の最適性は42を測定することができるが、高解像度クラスタリングはまた、例えば移植後段階10を反映して、小さな異常な亜集団の最終的な存在について知らせる。クラスター間で発現差のある遺伝子は、段階特異的系統を定義する参照遺伝子セットの発現レベルを評価することによって、開発プロセスにおいてそれらの類似体に関する情報を提供することができる。これにより、教師なし距離マップ(例えば、トップエンリッチド遺伝子を使用)または遺伝子セットエンリッチメント解析(GSEA)43のいずれかによって、ブラストイド亜集団のエンリッチメントを測定することができる。このブラストイドプロトコルを使用して、3つの胚盤胞系統を転写的に反映する3つの主要なクラスターのみが形成される。1つのクラスターには、ブラストイドの初期ナイーブhPSCとエピブラスト類似体の両方が含まれる。異なる時点で細胞を分析すると、系統仕様の逐次的な性質が示された(栄養芽細胞は24時間以内に特定し始め、原始内胚葉細胞は60時間以内に特定し始める)。高解像度クラスタリングは、胃形成期の胚(おそらく中胚葉または羊膜)に特異的な遺伝子を発現する細胞の亜集団(3.2%)を捕捉した。注目すべきは、初期の素朴なhPSCは、前述のように移植後様細胞の5%も含んでいた44。第2の分析において、ブラストイド細胞は、ステージ等価性を推測するために、異なるステージ45、46、47で概念から単離された参照細胞とインシリコでマージされ得る。ここでは、着床前概念45、46、体外培養胚盤胞45、及び胃胞期胚47から単離した細胞を基準点とした。このプロトコールを用いて、高解像度クラスタリングによって明らかにされたミスマッチな芽球様細胞が実際に移植後中胚葉および羊膜とクラスターしていることを定量化した。将来のステップでは、トランスクリプトームのベンチマークは、トランスポゾン発現、DNAメチル化、および発達段階21のランドマークも提供するX染色体状態の分析によって補完されるべきである。
ヒト芽球の軸形成およびその他の機能性を評価する。成熟した胚盤胞は、移植のための胚芽細胞をパターニングする胚 - 外胚軸の形成によって特徴付けられる。このブラストイドプロトコルを使用して、近位絨毛芽細胞(例えば、NR2F2+/CDX2-)の成熟によって例示される軸が頑丈に形成され、子宮内膜オルガノイド細胞がホルモン刺激された場合にのみ子宮内膜オルガノイド細胞に付着する能力を獲得する48,49。エピブラストを形成しない対流圏との比較は、これらの内部細胞が、子宮内膜への初期付着を媒介するように成熟するように隣接する絨毛芽細胞を誘導することを示す。カニクイザル胚盤胞50用に設計された拡張培養培地で培養すると、胚盤からの3つの系統はすべて、その発生段階を反映していないが、さらに6日間(13日目の時間相当)にわたって一貫して拡大する。
高効率および高忠実度のヒト芽球の意味合い。 モデル生物で発見された発生原理の保存は、アクセスが制限されていることと、遺伝的および物理的に操作することの技術的困難さのために、人間の概念でテストすることは本質的に困難です。高効率で忠実度の高いブラストイドモデルは、科学的および生物医学的発見の基礎となるハイスループットの遺伝子および薬物スクリーニングを可能にする。さらに、生物学的プロセスを変化させ、記録するための複雑な遺伝子改変の組み込みは、そのような研究を補完するだろう。全体として、我々は、素朴なPXGL hPSCの三重阻害(カバ、TGF-β、ERK)が、4つの最小基準に準拠した忠実度の高いヒト芽球の効率的な形成のために導電性であることを提案します。このプロトコルのスケーラブルで汎用性の高い性質により、ヒト胚盤胞を使用して検証できる標的仮説を生成するのに適しています。このように、ヒト芽球は、in vitro研究のためのヒト概念の使用に取って代わるものではなく、科学的および生物医学的発見プロセスの中心にある以前はアクセスできなかった実験的アプローチを通じて研究を注ぎ込む強力な方法として機能する可能性がある。このプロトコルは、ヒト芽球を形成する方法と、胚盤内に含まれる細胞を分析する方法を示しています。
Protocol
国際幹細胞研究協会(ISSCR)の幹細胞研究および臨床翻訳ガイドラインは、ヒト芽球に関する研究は、専門的な科学的および倫理的レビュープロセスを通じてレビューおよび承認された後にのみ許可されることを推奨しています3,4。すべての実験手順は、オーストリア科学アカデミー(IMBA)の分子バイオテクノロジー研究所(IMBA)のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従って、Rivron_Stellungnahme_2020-04-22の承認の下で実施されました。研究成果を科学雑誌に掲載するためには、これらのガイドラインの遵守が必要です。
1. PXGL条件下でのヒトナイーブ胚性幹細胞の培養
注:素朴なhPSCは、関連する研究室から入手することができます。ここで使用したラインは、高島康弘(現京都府CiRA)とオースティン・スミス(現英国エクセターのリビングシステム研究所)の研究室から入手したものです。あるいは、素朴なhPSCは、前述のようにプライミングされたhPSCのラインから社内でリセットすることができる13,14。素朴なhPSCは、複数の継代(>15)で安定に見えますが、培養物の品質は時間の経過とともに変化する可能性があります。素朴なhPSCの品質が低下する場合は、新しい細胞のバイアルを解凍するか、プライミングされたPSCからde novo素朴なhPSCを生成します。すべての培地組成物については、補足表1を参照されたい。
- 照射マウス胚性フィーダー(MEFs)層の作製
- ナイーブhPSCsの継代の前日に、下記の手順に従ってMEF層を照射した6穴細胞培養プレートを作製した。
- 6ウェル細胞培養プレートを1ウェルあたりPBS中の0.1%ゼラチン1mLでコーティングする。プレートを37°Cで30分間インキュベートする。ゼラチン溶液を除去する。
- 37°CでMEF培地を調製した。
- MEFを37°Cの水浴中で、小さな氷塊だけが残るまで解凍する。P1000ピペットを用いてバイアルの容量を1mLの調製MEF培地で溶解する。
- 細胞懸濁液を15mLチューブに移す。サスペンションを200 x g で4分間スピンダウンします。上清を吸引し、新鮮なMEF培地(ウェルあたり1.5mLに十分)を加えてMEFペレットを再懸濁する。
- 細胞計数スライドを使用して細胞を計数し、1ウェルあたり300,000個の細胞を加え、プレートを37°Cの正常性インキュベーターに移す。
メモ: 時間の経過とともに MEF がデタッチすると、日常的なメディア変更中に新しい MEF を PXGL メディアに追加できます。
- ヒトナイーブ多能性幹細胞の継代
- hPSCを継代する前に、顕微鏡下でその形態を確認してください。コロニーは通常、明るく定義された境界線を持つドーム型の形態を有する。個々のコロニーがより平坦な形態を示す場合、または分化したコロニーが出現し始めた場合は、ステップ1.2.8の指示に従ってください。
- 培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄する。6ウェルプレートのウェルあたり500μLの細胞剥離溶液を加える。
- 細胞を37°Cで5分間インキュベートする。 P1000ピペットを使用し、細胞を数回ピペットしてコロニーを単一細胞に解離させる。
- 細胞を集め、洗浄バッファー(6ウェルプレートのウェルあたり1 mL)を含む15 mLチューブに移します。細胞を200 x g で4分間スピンダウンします。
- 上清を吸引し、ペレットを新鮮なPXGL培地(ウェルあたり1.5mLに十分)に再懸濁する。日常的に継代するために、1:3-1:6の分割比を検討してください。
注:3〜4継代ごとに、または細胞形態に基づいて細胞培養の品質が低下する場合(例えば、集団内の扁平なコロニーの出現)、継代後最初の24時間の間に10μM Y-27632および成長因子基底膜抽出物(5μL/ウェル)を培地に加える。 - hPSCを再めっきする前に、MEF培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄することによって、新鮮なMEFでプレートを準備する。次いで、P1000ピペットを使用して、MEFsを含む6ウェルプレートのウェル当たり1.5mLのhPSCs細胞懸濁液を移す。
注: ピペッティングによって、ウェル領域全体に細胞が均質に播種されることを確認します。これにより、均質なサイズと細胞の相対的な同期性を有するコロニーの成長が保証される。 - hPSCsを加湿環境下、37°Cで低酸素条件下で培養する。24時間後、hPSCを取り付ける必要があります。多数の非付着性(または浮遊性)細胞は、継代時の生存率または付着の問題を反映している。
- 1ウェルあたり1.5 mLのPXGL培地で毎日培地を交換してください。hPSCを3〜4日ごとに通過させるか、ブラストイド形成実験に使用する。
注:hPSCを解凍した後、ブラストイド実験を開始する前に、少なくとも3つの継代のためにそれらを継代してください。
2. 芽球の形成
- 素朴なPSC凝集体の形成
- 実験を開始する前に、PXGL培地、N2B27基礎培地、洗浄バッファー、PBS、および凝集培地を準備し、予備温めてください。以下に説明する手順に従って、ブラストイドを形成するためのhPSCs懸濁液からMEFを除外する。
- MEF排除のために、6ウェルプレートのウェルに0.1%ゼラチン1mLを添加し、37°Cで30〜90分間インキュベートすることにより、ゼラチンコーティングプレートを作製した。
- 細胞を回収するには、培地を吸引し、1mLのPBSで細胞を洗浄する。
- 500 μLの細胞剥離溶液(6ウェルプレートのウェルあたり)を加え、37°Cで5分間インキュベートした。
- 顕微鏡下で細胞をチェックして、コロニーの単一細胞への解離を追跡します(いくつかの多細胞凝集塊は、後で穏やかなピペッティングによって解離することができます)。
- 細胞剥離溶液を1mLの洗浄緩衝液で希釈する。プレートから細胞を5〜10回穏やかにピペッティングすることによって集める。細胞懸濁液を15mLチューブに移す。細胞を200 x g で4分間スピンダウンします。
- 上清を吸引し、細胞を1.5 mLのPXGL培地(6ウェルプレートのウェルあたり)に再懸濁し、MEF排除のためにゼラチンコーティングプレートに細胞を播種し、37°Cで60〜90分間インキュベートする。
- MEF排除のためにナイーブ細胞を播種したら、マイクロウェルからPBSを除去し、200μLの基礎N2B27培地(マイクロウェルチップ1個あたり)でウェルを平衡化し、37°Cで60分間インキュベートする。
- 未接続のナイーブ細胞を含む上清を収集し、それを15mLチューブに移し、細胞を200 x g で4分間スピンダウンする。
- 培地を吸引し、細胞を1mLのN2B27基礎培地に再懸濁する。セルカウントスライドを使用してセルをカウントします。細胞を200 x g で4分間スピンダウンします。
- 培地を吸引し、N2B27培地に含まれる10 μM Y-27632を適量加えると、50 μLあたり30,000細胞の細胞密度を得た。
注:最適な初期播種細胞数は、異なる細胞株間で変化し得る。例えば、50~60個の細胞/マイクロウェルを播種するには、30,000個の細胞(一部の細胞がマイクロウェルの外側にあることを考慮すると余剰を含む)を、430個のマイクロウェルを含む96ウェルプレートの1ウェルに播種する。不適切な開始細胞数は、空洞のない小さな凝集体形成または250μm以上に達するキャビテーション構造の形成をもたらし得る。 - 平衡化したマイクロウェルアレイから培地を吸引し、25 μLのN2B27培地を10 μM Y-27632とともに加える。50 μLの細胞懸濁液を加え、37°Cで15分間(細胞がマイクロウェルの底に落ちるまで)インキュベートする。次いで、10μM Y-27632を添加したN2B27培地を125 μL加える。
- ブラストイド発生
- 24時間以内に、ナイーブhPSCの凝集体がマイクロウェルチップ上に観察され得る(0日目)。ブラストイド形成を開始するには、PALY培地を調製し、以下に概説する手順に従ってください。
- PALY培地を37°Cで30分間予備加温する。
注:1-オレオイルリゾホスファチジン酸(LPA)および10μM Y-27632は、使用直前に添加する必要があります。LPAの最適濃度は0.5〜5μMの間で変化する。これは、ブラストイドに使用される個々のhPSCラインに対して滴定する必要があります。 - 凝集媒体を吸引する。200 μLの予備加温したPALY培地をマイクロウェルに加える。細胞培養プレートを37°Cの低酸素インキュベーターに戻した。 1日目にメディアの変更を繰り返します。
- 2日目に、PALY培地を除去し、LPAおよび10μM Y-27632を添加したN2B27培地を200μL加える。
注: 2 日目も、集計の大部分は増加し続けています。しかし、いくつかの凝集体は小さな空洞を形成する。4日目までPALYでブラストイドを連続的に培養するか、2日目以降から in vitro 培養液(IVC1)で培養する。しかし、この培地変化に続いて、成熟した芽球におけるPrEの形成が増強される。 - 3日目にメディアの変更を繰り返します。完全な芽球形成は4日目までに起こる。
注:胚盤状は、7日目のヒト胚盤胞の形態測定法(例えば、直径150-250μmの範囲;栄養胚葉様細胞の上皮に囲まれた1つの内部クラスター)に基づく完全な形態形成を受け、極性栄養胚葉様細胞(NR2F2+/CDX2-)およびPrE様細胞(GATA4+)を形成したときに完全に発達したと考えられる。これは、免疫蛍光染色または蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて評価することができる。
3. 96ウェル超低付着マイクロプレートにおけるブラストイドの形成
- 上記の2.1.1~2.1.11の手順に従って、ブラスト様形成用のナイーブhPSC細胞懸濁液を調製する。
- 培地を吸引し、10 μM Y-27632を含むN2B27培地を適量加えて、培地100 μLあたり70細胞の細胞密度を得た。
注:最適な初期播種細胞数は、異なる細胞株間で異なり得る。たとえば、70細胞/ウェルは、ほとんどの細胞株にとって最適な細胞数となり得る。 - プレートを室温で200 x g で2分間遠心分離し、ウェルの底に細胞をクラスター化します。
- プレートを低酸素培養条件下で37°Cのインキュベーター内でインキュベートする。24時間以内に、ナイーブhPSCの凝集体が井戸上に観察され得る(0日目)。
- 2倍のPALLY培地を用意する。予温した2x PALY培地100 μLをウェルに加える。
- 細胞培養プレートを37°Cの低酸素インキュベーターに戻す。 24時間後、培地の半分(100 μL)を吸引し、100 μLの予温したPALY培地と交換する。4日目までこの手順を繰り返します。アグリゲートを吸引しないようにしてください。
注: 2 日目も、集計の大部分は増加し続けています。しかし、いくつかの凝集体は、小さな液体充填空洞を有する。4日目に、キャビテーションされた構造の大部分は完全な形態形成を受け、胚盤胞様構造を形成する。
4. 対流圏の形成
- 対流圏形成のためには、ステップ2.1.1(MEF排除)からステップ2.1.12(播種プロトコルの最後のステップ)までのブラストイド形成プロトコルに従う。
- 24時間後にナイーブhPSCの凝集体が形成されたら、初期対流球を表す対流球圏の形成のために3μM SC-144を添加したPALY(LIFなし)と凝集培地を交換し、成熟した対流球を表す対流球圏の形成のために2μM XMU-MP-1を添加したPALYと交換する。
- メディアを毎日リフレッシュします。完全な対流圏形成は4日目までに起こる。
5. scRNAseqを用いた芽球様細胞の状態とその反射ステージの解析
- ブラストイドを拾い上げて解離を行うには、振とう培養器を37°Cに温め、100rpmに設定してください。
- 最初の96ウェルプレートからブラストイドを収集し、ガラスキャピラリーを備えたマウスピペットを使用して、U底96ウェルプレートの複数のウェルに移します。
注:非ブラストイド構造(>30%)による汚染を避けるために、形態測定基準(サイズ= 150-250μm、固有の内部クラスターを持つ)に基づいてブラストイド(<70%)を選択する必要があります。 - 実体顕微鏡下で観察することによりP200を用いて200μLのPBSで1回洗浄する。50 μLのコラゲナーゼを含むウェルに移し、振とうインキュベーター内で30分間インキュベートする。
- ブラストイドを100 μLの10倍トリプシン-EDTAを含むウェルに移し、よく混合する。振とうインキュベーター内で20分間インキュベートする。
- P200ピペットを用いてブラストイドを単一細胞に解離させる。FACS緩衝液(PBS中の1%FBS)を用いて細胞を15mLチューブに移す。
- 3つの系統の類似体の特異的比を捕捉するために、TEおよびPrE類似体をそれぞれTROP2およびPDGFRa抗体で染色する。
注:ヒト胚盤胞中のPrE細胞の数は、マウス胚盤胞と比較して少なく、これは 体外 受精(IVF)によって形成された胚盤胞の発生欠陥または種差を反映している可能性がある。芽球において、PrE類似体はTEおよびEPI類似体よりも豊富ではなく、免疫蛍光イメージングによるGATA4+細胞の計数時に細胞の7.4%を表す。また、解離プロセスは、ブラスト様解離時に細胞の1%〜2%を表すPrE類似体として異なる細胞型の割合に偏りを誘発する可能性があり、PDGFRaタグ付けおよび、FACS分析。 - FACSは、3つの系統類似体すべてから細胞を、smart-seq2分析用の溶解バッファーを含む384プレートに選別します。DAPI染色(製造元の指示に従って実施)によってマークされた死細胞を除外する。
- 細胞状態(細胞型および発生段階)を評価するには、ブラストイドからのトランスクリプトームデータを適切な対照と比較する。
6. 芽球発生の進行を評価するための培養の延長
- ヒト芽球を基底膜マトリックスコーティングプレート(ガラス底)上で培養する。
- プレートを基底膜マトリックスでコーティングします。
- ブラストイドを目視で検査して、形態を評価および記録します。
注:コンパクトなICMで古典的な中空ボール胚盤胞の形態を示す胚盤状のみが、さらに成長し、発達する可能性を秘めています。 - 96ウェルプレートの1ウェルあたり100μLのCMRL培地-1を加え、平衡化のためにブラストイドが移入される少なくとも2時間前にプレートをインキュベーターに入れます。
- 実体顕微鏡を用いて、良好な形態を有する胚盤状を目視で同定し、選択した胚盤状体を100μlのCMRL培地−1を含む96ウェルプレートのウェルに移し、胚盤状媒体の痕跡を除去した。
- ブラストイドを、予め平衡化したCMRL培地-1を含むウェルに移す。プレートをインキュベーターに入れ、37°Cで一晩インキュベートします。
注:最大5つのブラストイドを96ウェルプレートの1ウェルで培養することができます。1つのウェルにあまりにも多くのブラストイドを有すると、複数のブラストイドの凝集体が形成される可能性がある。 - 翌日、顕微鏡下でブラストイドを目視検査する。ブラストイドが付着している場合は、5%基底膜マトリックスを添加した100μLの予め平衡化したCMRL培地-1を加える。プレートをインキュベーターに入れ、37°Cで一晩インキュベートした。
- 翌日、顕微鏡下でブラストイドをモニターする。培地の半分(100 μL)を除去し、5%基底膜マトリックスを添加した100 μLの予め平衡化したCMRL培地-2と交換する。
- 翌日、培地の半分(100μL)を、5%基底膜マトリックスを添加した予め平衡化したCMRL培地-3と交換する。プレートをインキュベーターに入れ、37°Cで一晩インキュベートした。 体外 培養を最大4〜6日間毎日繰り返す。
注: インビトロ 培養ヒト胚の13日目に相当する時間に相当する延長培養条件で、ブラストイドを最大6日間培養した。
7. 芽球の免疫染色
- 媒体を吸引する。サンプル3xをPBSで5分間洗浄する。
- PBSに200μLの冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、室温で30分間サンプルを固定する。PFA溶液を除去し、サンプル3xをPBSで10分間洗浄する。
注: ブラストイドをマイクロウェルチップで培養した場合は、以下の手順でチップから 96 ウェル U ボトムプレートにブラストイドを移します。 - 1ウェルあたり100 μLのブロッキング溶液(0.3%Triton-X 100および10%ノーマルロバ血清を含むPBS)でブラストイドを透過処理し、60分間ブロックします。
注:抗体の宿主種に応じて、それに応じて血清を適応させる。 - ブロック ソリューションを削除します。新鮮なブロッキング溶液で希釈した一次抗体100 μLを加え、サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。
注:一次抗体の濃度は、製造元の指示に基づいて決定する必要があります。 - サンプル3xをPBS(洗浄溶液)中の0.1%Triton-X 100で10分間洗浄する。ブロッキング溶液に100 μLの二次抗体を20 μg/mLのヘキスト核染色剤とともに加え、サンプルを室温で1時間インキュベートします。サンプルを光から保護します。
注:二次抗体の濃度は、製造元の指示に基づいて決定する必要があります。 - サンプル3xを洗浄液で10分間洗浄する。イメージングのために、サンプルをPBSでスライドμガラス底に移します。
メモ:取り付け媒体は、イメージングに使用する目的に基づいて選択する必要があります。例えば、PBS中の80%グリセロールは、油目的を使用しながらサンプルをマウントするために使用することができる。
Representative Results
典型的には、PXGLで培養されたナイーブhPSC(図2A)は、PALY誘導後48〜72時間の間に出現し、96時間以内に150〜250μmの直径に達する凝集およびキャビテーション構造である(図2B)。最適な(1)播種細胞数、(2)N2B27による前培養凝集の持続時間(0〜24時間)、(3)個々の化学成分(特にLPA)の濃度、および(4)PALY処理の持続時間を使用して、誘導効率は形態測定パラメータ(150〜250μmの全体サイズ、単一の規則的な空洞、単一の内部細胞集塊;図2C、D)および3つの系統の存在。最適でない初期細胞状態および/または誘導条件は、効率が低下したり、ブラストイド形成がまったく行われなかったりします。最大の効率を確保し、移植前類似体のみを形成するためには、素朴なPXGL hPSCの高品質の培養物を使用することが重要です。これは、表面マーカーSUSD2(ナイーブ状態)およびCD24(プライミング状態)に対して陽性の細胞の割合をFACSによって測定することによって評価することができる。オフターゲットの胚外系統(例えば、羊膜、胚外中胚葉)に特異的な追加の表面マーカーも同様に有用であるであろうが、我々の知る限り、現在利用できない。得られた形成効率が報告された結果よりも低い場合、ブラスト状培地のすべての成分、特にPBSで再構成されたLPAおよびGPCRリガンドとして、DMSOで再構成された合成分子と比較してより不安定であり得ることを注意深くチェックすることが重要である。ほとんどの場合、収量が最大でなくても、キャビテーションされた構造は依然として3つの胚盤胞系統で構成されています。3つの胚盤胞系統の出現および胚外胚軸の形成は、マーカーの免疫蛍光染色によって確認することができる(EPI:NANOG、OCT4、TE:GATA3、Polar-TE NR2F2、壁ルTE:CDX2、PrE:GATA4;図2E,G)。TEのみで構成されるトロホスフェールは、細胞間通信の役割をさらに解剖するのに役立ちます。トロホスフェールは、誘導から96時間以内に50%〜60%の効率で形成することができます(図2H、I)。ブラストイド形成は、自家製マイクロウェルアレイだけでなく、誘導条件を最適化した市販の超低付着96ウェルプレートでも行うことができます(プロトコルおよび図2Jを参照)。芽球はまた、インビトロ分化プロトコールを用いて、13日目の胚の時間当量である追加の6日間、さらに発達する能力を有する(図2K)。
ブラスト様細胞の細胞状態をさらに特徴付けるためには、単一細胞RNAシーケンシング技術を使用しなければならない。UMAPは一般に、細胞状態の分布を視覚化するために適用され、教師なしクラスタリング分析は、個々の細胞状態の近接性を評価するために実行されます。単一セル データ分析のパラメーターが異なると、UMAP でのセルの表示方法に影響し、空間的および相対的な位置と形状が異なるクラスターになる可能性があります (図 3A)。しかし、この解析では、クラスタリングおよびデータの視覚化を実行するために使用されるパラメータに関係なく、細胞は顕著に再現性よく異なるクラスタリングプロファイルを表示するため、3つの胚盤胞系統を高い信頼性で区別することができる。我々は、異なる発生段階で採取された胚からの細胞を基準として用いた。これらのデータセットのマージは、芽球様からの栄養補助胚葉類似体の大部分が移植前の栄養芽細胞でクラスター化しているが、移植後の栄養芽細胞ではクラスター化していないことを示している(図3B)。これらの結果は、独立したコンソーシアム10によっても確認された。
カーネギーステージ7(CS7)の胃胚が参照マップに導入されると、芽球様細胞の小さな集団(3%)がこれらの胚の中胚葉および羊膜系統とクラスター化した(図3C)。羊膜様細胞が参照マップに導入されると、芽球様細胞の小さな集団(<2%)がそのような羊膜様細胞と集塊する。
全体として、単一の規則的な空洞、単一の内部細胞クラスター、150〜250μmの範囲の全体的なサイズ、3つの胚盤胞系統のトランスクリプトーム類似体を含み、他の系統(例えば、羊膜、中胚葉、胚外中胚葉)をほとんど欠く構造のみがヒト芽球様と見なされる。
図 1: 忠実度の高いブラストイドを生成するための 4 つの機能と 2 つのアプローチ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ナイーブhPSCの凝集体に由来する芽球体および対流圏。 (a)照射MEFと共培養したPXGL培地で培養したナイーブhPSCsを示す位相差画像。(B)500nM LPA(PALY培地)を有する非付着性ヒドロゲルマイクロウェルアレイ上で培養されたナイーブhPSCs凝集体の形態変化を示す位相コントラスト画像。スケールバー:200μm. (C)ヒト芽球を96時間後にマイクロウェルアレイ上に形成した。スケールバー:400μm(D)異なるナイーブhPSC株(n=3マイクロウェルアレイ)からの最適化されたLPA濃度を有するPALY培養条件によって誘導されたヒトブラストイドを含むマイクロウェルの割合の定量化。(e)エピブラスト(EPI)マーカー(黄色)NANOGおよびOCT4によるヒト芽球の免疫蛍光染色;TEマーカー(シアン)CDX2およびGATA3;原始内胚葉マーカー(マゼンタ)SOX17およびGATA4。スケールバー:100 μm(H-I)OCT4、GATA3、およびGATA4の免疫蛍光染色に基づくブラストイド(96時間)における各系統に属する細胞数(左)および細胞の割合(右)の定量。(g)CDX2(シアン)およびNR2F2(マゼンタ)に対するヒト芽球の免疫蛍光染色。(F)それぞれ3μM SC144(H)または2μM XMU-MP-1(I)の添加によって誘導されたマイクロウェルアレイ上の初期および後期の対流圏の位相差画像。(j)500nM LPA(PALY培地)を用いた超低付着96ウェルプレートで培養したナイーブhPSCs凝集体の形態変化を示す位相差画像。(k)6日間の着床後培養条件で増殖させた芽球体におけるOCT4(黄色)、GATA3(シアン)、およびGATA4(マゼンタ)の位相差画像(左)および免疫蛍光染色(右)。スケールバー:100μm。この数字は6,10から適応されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単一細胞シーケンシングによるブラストイドの組成の特性評価。 (A)芽球様(24時間、60時間、96時間)、ナイーブhPSC、プライミングhPSC、およびhTSC(移植後の細胞栄養芽細胞を表す)の異なる時点に由来する単一細胞のトランスクリプトームのUMAP上の異なるパラメータを用いた教師なしクラスタリング解析。(B)芽球様(96時間)、ナイーブhPSC、およびプライミングhPSCに由来する細胞のトランスクリプトームのUMAPは、移植前、移植前(インビトロ 培養胚盤胞)、および胃形成(カーネギーステージ7、すなわち、E16〜19の間)のヒト胚からの公開されたデータセットと統合される。個々の細胞は、ヒト胚(左)、芽球由来細胞または幹細胞(中央)、および教師なしクラスタリング解析の結果(右)におけるその起源に基づいて着色される。(c)UMAPsのブラストイドに由来する細胞のトランスクリプトームを、ナイーブhPSCs、プライミングされたhPSCs、および胃形成(Carnegieステージ7、すなわち、E16〜19の間)段階の胚から公開されたデータセットと統合した。個々の細胞は、ヒト胚(左)、芽球由来細胞または幹細胞(中央)、および教師なしクラスタリング解析の結果(右)におけるその起源に基づいて着色される。この図は6から適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:本試験で使用した全ての培地組成物。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
本研究では、シンプルで堅牢なプロトコルを使用して、高効率でヒト芽球体を確立する方法を段階的に示しています。ナイーブPXGL hPSCの凝集およびそれらの三重阻害により、ブラストイドは効率的に形成され(>70%)、4日以内に3つの胚盤胞類似体を順次生成する。ブラストイドの効率および品質における制限(例えば、オフターゲット細胞の存在)は、初期状態が最適でない場合に起こり得る。注目すべきは、PXGL hPSCsが移植後の段階を反映する細胞の約5%を含むことを測定した。これらの細胞は、高品質の芽球の形成を制限する可能性がある。胚盤胞エピブラストを反映する初期の素朴なPXGL状態を超えて、もう一つの重要な要因は、ブラストイド形成に使用される培地である。胚盤胞様細胞を速やかに形成し、オフターゲットの移植後様細胞の形成を防ぐためには、三重経路阻害(カバ、ERK、TGF-β)が不可欠であると提案しています。異なる細胞株は、ERK/TGF-β阻害(一般に約10%-20%)時に異なる胚盤の収量を与えるが、LPAへの曝露は、厳密な形態測定および系譜仕様基準を使用しながら、すべての細胞株にわたって等しく高いブラストイド収量の形成をもたらす。LPAはおそらく、マウスおよびヒトにおけるエピブラストと栄養胚葉系統との間の第1系統分離において重要な役割を果たすカバ経路の阻害に作用する8,51。LPAによる胚盤様効率の有意な改善は、胚盤胞において作用するカバ経路媒介性内外細胞仕様機構が胚盤形成中に取り込まれることを示唆している。現在の限界は、ヒト胚盤胞または胚盤状を7-13日目(胚盤胞/胚盤形成後)に培養するために使用されるプロトコルの最適性が低いため、移植後の発達を適切にモデル化できる程度を評価できないという事実にある。
芽球様細胞のトランスクリプトーム状態の解析は、scRNAseq、適切なリファレンスマップ、およびバイオインフォマティクス法を使用して簡単に達成できます。以前、トランスクリプトーム解析は、PXGLで培養されたhPSがプライミング状態と比較して胚盤胞エピブラストとより類似していることを示した。データの解析における制限は、参照マップが胚盤胞期細胞のみを含む場合に起こり得る。参照マップには、潜在的なオフターゲット細胞の存在を評価するために、着床後の胚に由来する細胞を含める必要があります。将来的には、胚盤状細胞をベンチマークするために、移植前および移植後のヒト概念のすべての組織を含む参照マップが非常に貴重であろう。さらに、例えばトランスクリプトーム、クロマチンアクセシビリティ、およびDNAメチル化を含むマルチオミクス単一細胞参照マップは、さらに役立つであろう。最後に、胚モデルと参照概念からの細胞間の類似性を定量的に評価し、オフターゲット細胞を積極的に同定するための標準化されたバイオインフォマティクス法は、結果を公平に分析および比較するのにさらに役立つであろう。
全体として、カバ、TGF-β、およびERK経路の三重阻害によって形成される胚盤状は、1)非常に効率的な形態形成、2)系統仕様の正しい配列、3)トランスクリプトームレベルでの胚盤胞様細胞の高純度、4)移植前後発達をモデル化する能力の4つの特徴を有する。胚盤胞のこれらの特徴は、胚盤胞の発生と移植に関する仮説の構築を容易にするが、胚発生の初期段階を再現するものではない。ヒト胚盤胞の限られたアクセス性と汎用性とは対照的に、胚盤胞は、胚盤胞の発生および移植の機能的調査のための遺伝的および薬物スクリーニングに適している。将来的には、このような基礎知識は、体外受精培地製剤の改善、受精後避妊薬の開発、妊娠初期の管理の改善に貢献する可能性があります。
Disclosures
オーストリア科学アカデミー分子バイオテクノロジー研究所は、ヒト芽球形成のプロトコルおよび芽球-子宮内膜相互作用アッセイを記載した特許出願EP21151455.9を提出しました。HK、AJ、HHK、およびNRは、この特許の発明者です。他のすべての著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラム(ERC-Co助成金契約No.101002317「BLASTOID:初期ヒト胚発生のための発見プラットフォーム」)の下で、欧州研究評議会(ERC)から資金提供を受けています。H.H.K.はオーストリア科学基金(FWF)、リーゼ・マイトナー・プログラムM3131-Bの支援を受けています。我々は、H9およびH9-GFP細胞株を共有してくれた高島康弘氏、HNES1、Shef6、niPSC 16.2bおよびcR-NCRM2細胞株を共有してくれたAustin Smith、Peter Andrews、Ge Guo氏に感謝する。子宮内膜オルガノイドを共有してくれたホセイン・バハールヴァンドに感謝します。PrE分化細胞とnEND細胞から単離されたRNAを共有してくれたジョシュア・M・ブリックマンに感謝します。我々は、胃周囲胚の単一細胞RNAシーケンシングデータを共有してくれたShankar Srinivasに感謝する。我々は、SMARTSeq2ライブラリの準備のための技術支援について、Aleksand BykovとLuisa Cochellaに感謝する。我々は、重要な支援に対してIMBAのNGS、Biooptic、およびStem Cell施設に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | in house | ||
| DMEM/F12 | in house | ||
| 100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
| 50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| 100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
| MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| 1 M Hepes | in house | ||
| 50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
| XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
| Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
| Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
| A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
| 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
| Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
| CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
| Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
| Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
| TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
| PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
| SC-144 | Axon | 2324 | |
| XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
| Matrigel | basement membrane matrix | ||
| Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
| DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |
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