Summary
Ett protokoll som beskriver bildandet av humana blastoider som effektivt, i rätt tid och sekventiellt genererar blastocystliknande celler.
Abstract
En modell av den mänskliga blastocysten bildad av stamceller (blastoid) skulle stödja vetenskapliga och medicinska framsteg. Dess prediktiva kraft kommer emellertid att bero på dess förmåga att effektivt, i rätt tid och troget rekapitulera sekvenserna för blastocystutveckling (morfogenes, specifikation, mönstring) och att bilda celler som återspeglar blastocyststadiet. Här visar vi att naiva mänskliga pluripotenta stamceller odlade under PXGL-förhållanden och sedan tredubbla hämmade för Hippo, transformerande tillväxtfaktor- β och extracellulära signalreglerade kinasvägar effektivt genomgår morfogenes för att bilda blastoider (>70%). Matchning med utvecklingstidpunkt (~ 4 dagar) rullar blastoider blastocystsekvensen av specifikationen genom att producera analoger av trofoblasten och epiblasten, följt av bildandet av analoger av den primitiva endodermen och de polära trofoblasterna. Detta resulterar i bildandet av celler som transkriptionellt liknar blastocysten (>96%) och en minoritet av postimplantationsanaloger. Blastoider mönstrar effektivt genom att bilda den embryonala-abemboroniska axeln som kännetecknas av mognaden av polarområdet (NR2F2+), som förvärvar den specifika potentialen att rikta till hormonellt stimulerade endometrieceller, som i livmodern. En sådan human blastoid är en skalbar, mångsidig och etisk modell för att studera mänsklig utveckling och implantation in vitro.
Introduction
Brist på experimentella modeller har begränsat förståelsen för tidig mänsklig embryogenes. Aktuell kunskap om människospecifika aspekter av embryonal utveckling härrör från överskott av in vitro fertilisering (IVF) embryon donerade för forskning. Den begränsade tillgängligheten, svårigheterna med experimentella manipulationer och embryonas varierande kvalitet hindrar dock vetenskapliga undersökningar. Tvärtom skulle en trogen in vitro-modell av mänskliga embryon möjliggöra komplexa experimentella manipulationer och därmed ge en etisk möjlighet att komplettera forskningen på mänskliga embryon 1,2,3,4. En tidigare utvecklad modell av musblastocyster kombinerade musembryonala stamceller och trofoblaststamceller5. I detta detaljerade protokoll beskrivs en metod för att generera en modell av den mänskliga blastocysten från naiva pluripotenta stamceller som är trogen elementära blastocystkriterier6.
Fyra kriterier för humana blastoider. Här, i ett försök att upprätta en standardiserad definition av humana blastoider, föreslår vi fyra minimala kriterier. Även om de inte är uttömmande kan dessa kriterier tjäna som grund för att utvärdera de parametrar som möjliggör bildandet av humana blastoider (figur 1A). (1) Blastoider bör bildas effektivt när det gäller morfologi och generering av analogerna i de tre släktlinjerna, nämligen epiblast (Epi), trophectoderm (TE) och primitiv endoderm (PrE). Ineffektivitet kommer sannolikt att peka på ett otillräckligt initialt celltillstånd eller / och odlingstillstånd (t.ex. blastoidmedium). (2) Blastoider bör generera analoger av de tre släktlinjerna enligt utvecklingssekvensen (Epi/TE först, PrE/polarTE sist)7,8 och timing (induktion ~ 3 dagar; embryonala dagar 5-7)7,9. (3) Blastoider bör bilda analoger av blastocyststadiet, men inte av postimplantationsstadier (t.ex. epiblast efter implantation, trofoblast eller amnionceller). (4) Slutligen bör blastoider kunna rekapitulera funktionella egenskaper hos implantation och utveckling av blastocyster. Med hjälp av detta protokoll bildas humana blastoider effektivt med hjälp av flera cellinjer (>70%), kan generera blastocystcellanalogerna sekventiellt och inom 4 dagar, och analogerna liknar transkriptionellt blastocyststadiet (>96% baserat på flera analyser)6,10,11. Slutligen genererar blastoider robust den embryonala-abemboroniska axeln, vilket gör att de kan interagera med hormonellt stimulerade endometrieceller genom polarområdet och robust expandera linjerna vid utökad odling (tidsekvivalent: embryonal dag 13).
Betydelsen av det ursprungliga celltillståndet. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) kan stabiliseras i olika tillstånd som försöker fånga exakta utvecklingsstadier. Dessa tillstånd upprätthålls av odlingsförhållanden som, även om de fortfarande är suboptimala, begränsar celler i ett preimplantations- (~ embryonala dagar 5-7) eller postimplantationsliknande (~ embryonala dagar 8-14) epiblaststadium12. Transkriptomisk analys visade att hPSCs odlade i PD0325901, XAV939, Gö6983 och leukemihämmande faktor (LIF; kallade PXGL-naiva hPSCs)13,14 liknar blastocystepikblasten jämfört med hPSCs odlade i fibroblasttillväxtfaktor (FGF) 2 och aktivin15 (benämnda grundade hPSCs12) och humana utvidgade pluripotenta stamceller (hEPSC)16 (se analys i referens17, 18,19). Följaktligen matchar transkriptomet för grundade hPSCs bäst med en postimplantation / pre-gastrulation cynomolgus apa epiblast20. Ytterligare molekylära kriterier, som transposonuttryck, DNA-metylering och X-kromosomtillstånd, bekräftade att variationer av det naiva tillståndet mer liknar blastocystepiblasten jämfört med det grundade tillståndet17,21. Slutligen har linjer av naiva hPSCs framgångsrikt härletts direkt från blastocyster med användning av PXGL-odlingsförhållanden22.
Mänskliga tidiga blastocystceller är ännu inte engagerade. Murin härstamningsspecifikation sker från morulastadiet som föregår blastocyststadiet23. Tvärtom har dissociations- och reaggregeringsexperiment visat att de humana trophectodermcellerna i tidiga blastocyster ännu inte är engagerade24. Följaktligen har analys av cellerna i humana blastocyster genom encells RNA-sekvensering (scRNAseq) visat att den första härstamningsspecifikationen (trofoblast/epiblast) inträffar efter bildandet av blastocysthålan7. Denna uppskjutna mänskliga specifikation korrelerar med observationer om att hPSCs är potenta för att bilda trofoblaster 25,26,27 när mus-PSC: er till stor del är engagerade i epiblastlinjen. Dessa kombinerade observationer ledde till möjligheten att naiva hPSCs återspeglar ett blastocyststadium och behåller potentialen att bilda de tre blastocystlinjerna. På senare tid har styrkan hos hPSC för att specificera extraembryoniska analoger föreslagits för att flytta från trophectoderm till amnion under progression från naivt till grundat tillstånd27. Således liknar naiva hPSC: er mer preimplantationssteget 17,18,21 och har en förbättrad förmåga att bilda trofoblaster jämfört med grundade hPSCs27, hEPSC 16 eller mellanliggande omprogrammerade tillstånd28, som är benägna att bilda postimplantationsanaloger10 (Figur 1B ). Det initiala celltillståndet är således avgörande för att bilda lämpliga extraembryoniska analoger. Även om en grundlig sida vid sida-analys av konverterade trophectoderm-analoger återstår att göra, verkar ett PXGL-naivt tillstånd som återspeglar den tidiga blastocysten viktigt för att bilda hifi-blastoider.
Manar till specifikation och morfogenes genom att signalera väghämning. Hämningen av Hippo-signalvägen är en bevarad mekanism som driver trofoblastspecifikation hos möss, kor och människor 9,29,30. Sedan 2013 är det också känt att hämningen av NODAL (A83-01) och det extracellulära signalreglerade kinaset (ERK; PD0325901 eller motsvarande) och aktiveringen av signalvägarna för benmorfogenetiskt protein (BMP) utlöser grundade hPSCs för att aktivera transkriptionsnätverket associerat med trofoblastlinjen 25,31,32,33,34. Dessutom bekräftade nyligen flera rapporter också att hämningen av både NODAL- och ERK-vägen och aktiveringen av BMP underlättar trofoblastdifferentieringen från naiva hPSCs 25,31,32,33,34. Slutligen, om trofoblastspecifikationen utlöses från ett naivt tillstånd, rekapitulerar celler aspekter av utvecklingsprogressionen hos trophectoderm26. Självförnyande linjer som återspeglar blastocysttrophectoderm har dock inte stabiliserats in vitro. Efter trofoblastspecifikation kan induktion av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och Wnt-signalvägar tillsammans med HDAC-hämning underlätta trofoblastutvecklingsprogression34,35 och stabilisera celler i linjer av humana trofoblaststamceller (hTSC) som återspeglar cytotrofoblasterefter implantation 18,35. Sådana linjer kan härledas både från blastocyster och placentavävnader35.
Den andra extraembryoniska härstamningen, kallad PrE, specificeras efter trofoblaster och härstammar från epiblasten 7,9. I motsats till murin PrE36 tros den mänskliga motsvarigheten vara oberoende av FGF som signalerar 37,38. Linjer som återspeglar den extraembryoniska endodermen (kallad nEnd) etablerades från naiva hPSCs genom induktion av signalvägar med hjälp av aktivin A, Wnt och LIF39. Inkonsekvent med embryohämningsexperiment har ERK-hämning visat sig förhindra bildandet av sådana nEND-celler in vitro39. Hittills har sådana linjer inte härletts direkt från blastocyster.
På senare tid har modeller av det tidiga embryot bildats genom att kombinera variationer av de medier som tidigare utvecklats för hTSC35 och nEND-celler39 och därmed använda aktivatorer av den transformerande tillväxtfaktorn β (TGF-β), EGF och Wnt-signalvägar28,40. Dessa embryomodeller bildas vid låg effektivitet (10% -20%) och bildar celler som liknar post- snarare än preimplantationsstadium10, inklusive analoger av postimplantationsepiblasten, trofoblasten, amnion, gastrula, mesodermala vävnader (~ embryonal dag 14) och cytotrofoblaster10. Tvärtom styr en trippel hämning av Hippo-, ERK- och TGF-β vägar effektivt bildandet av blastoider innefattande blastocystliknande celler41. Tillsammans med det ursprungliga celltillståndet föreslår vi att hämning av trippelvägar (Hippo, ERK, TGF-β) är den andra väsentliga parametern för att bilda hifi-blastoider (Figur 1B).
Utvärdera celltillståndet och det reflekterade stadiet med hjälp av scRNAseq. Tillstånden hos celler som utgör blastoider kan utvärderas genom scRNAseq-analys. Deras transkriptionella likhet med specifika embryonala stadier kan mätas med hjälp av enbart blastoidceller och genom jämförelse med grundade hPSCs eller hTSC som återspeglar postimplantationsstadier 20,35. Att utföra klusteranalyser med olika definitionsnivåer avslöjar hur delpopulationer gradvis smälter samman när definitionen minskar, vilket avslöjar klusters likheter. Även om optimaliteten i antalet kluster kan mätas42, informerar högupplöst klustring också om den eventuella närvaron av små onormala delpopulationer, till exempel återspeglar postimplantationsstegen10. Generna som uttrycks differentiellt mellan kluster kan ge information om deras analoger i utvecklingsprocessen genom att bedöma uttrycksnivåerna för referensgenuppsättningar som definierar scenspecifika härstamningar. Detta gör det möjligt att mäta anrikningen av blastoida delpopulationer antingen genom oövervakade avståndskartor (t.ex. med hjälp av toppberikade gener) eller genom genuppsättningsanrikningsanalys (GSEA)43. Med hjälp av detta blastoidprotokoll bildas endast tre huvudkluster som transkriptionellt återspeglar de tre blastocystlinjerna. Ett kluster innehåller både de initiala naiva hPSC: erna och epiblastanalogen hos blastoiderna. Analys av celler vid olika tidpunkter visade den sekventiella karaktären hos specifikationen av linjer (trofoblaster börjar specificera inom 24 timmar och primitiva endodermceller inom 60 timmar). En högupplöst klustring fångade en subpopulation av celler (3,2%) som uttrycker gener som är specifika för embryon i gastrulationsstadiet (möjligen mesoderm eller amnion). Observera att de initiala naiva hPSC: erna också utgjorde 5% av postimplantationsliknande celler, som tidigarebeskrivits 44. I en andra analys kan blastoidceller slås samman i silico med referensceller isolerade från concepti i olika steg 45,46,47 för att dra slutsatsen om stadiumekvivalens. Här användes celler isolerade från preimplantationskoncepti45,46, in vitro odlade blastocyster45 och embryon i gastrulationsstadiet47 som referenspunkter. Med hjälp av detta protokoll kvantifierades det att de felaktiga blastoidcellerna som avslöjades av högupplöst klustring verkligen kluster med postimplantation mesoderm och amnion. I framtida steg bör transkriptomjämförelse kompletteras med analys av transposonuttryck, DNA-metylering och av X-kromosomstatus som också ger landmärken i utvecklingsstadier21.
Utvärdering av axelbildning och andra funktioner hos humana blastoider. En mogen blastocyst kännetecknas av bildandet av de embryonala-abembryoniska axelmönstrade trofoblasterna för implantation. Med hjälp av detta blastoidprotokoll bildas en axel robust exemplifierad av en mognad av de proximala trofoblasterna (t.ex. NR2F2 + / CDX2-) som förvärvar förmågan att fästa vid endometriella organoidceller endast när de är hormonellt stimulerade48,49. Jämförelse med trofosfärer som inte bildar epiblasten visar att dessa inre celler inducerar anliggande trofoblaster att mogna för att förmedla den initiala fästningen till endometrium. När de odlas i ett utökat odlingsmedium utformat för cynomolgus monkey blastocysts50, expanderar alla tre släktlinjerna från blastoid konsekvent i ytterligare sex dagar (tid motsvarande dag 13) även om deras organisation inte återspeglar det utvecklingsstadiet.
Implikationen av högeffektiva och högkvalitativa mänskliga blastoider. Bevarandet av utvecklingsprinciper som upptäcktes i modellorganismer är i sig svårt att testa i det mänskliga konceptet på grund av den begränsade tillgången och de tekniska svårigheterna att genetiskt och fysiskt manipulera det. En högeffektiv och högkvalitativ blastoidmodell skulle möjliggöra genetiska skärmar och läkemedelsskärmar med hög genomströmning, som ligger till grund för vetenskapliga och biomedicinska upptäckter. Dessutom skulle införlivandet av komplexa genetiska modifieringar för att ändra och registrera biologiska processer komplettera sådana studier. Sammantaget föreslår vi att trippelhämningen (Hippo, TGF-β, ERK) av naiva PXGL hPSCs är ledande för effektiv bildning av högkvalitativa humana blastoider som uppfyller de fyra minimala kriterierna. Den skalbara och mångsidiga karaktären hos detta protokoll gör det lämpligt att generera riktade hypoteser som sedan kan valideras med hjälp av humana blastocyster. Som sådan kommer mänskliga blastoider inte att ersätta användningen av human conceptus för in vitro-forskning utan kan fungera som ett kraftfullt sätt att tratta forskning genom tidigare otillgängliga experimentella metoder i hjärtat av den vetenskapliga och biomedicinska upptäcktsprocessen. Protokollet visar hur man bildar mänskliga blastoider och även hur man analyserar cellerna som finns i blastoiden.
Protocol
Riktlinjerna för stamcellsforskning och klinisk översättning från International Society for Stem Cell Research (ISSCR) rekommenderar att forskning på humana blastoider endast är tillåten efter granskning och godkännande genom en specialiserad vetenskaplig och etisk granskningsprocess 3,4. Alla experimentella förfaranden genomfördes genom att följa riktlinjerna från den mänskliga forskningsetiska kommittén vid Institutet för molekylär bioteknik vid den österrikiska vetenskapsakademin (IMBA) under godkännande Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. Överensstämmelse med dessa riktlinjer är nödvändig för publicering av forskningsresultat i vetenskapliga tidskrifter.
1. Odling av mänskliga naiva embryonala stamceller i PXGL-tillstånd
OBS: Naiva hPSCs kan erhållas från relevanta laboratorier. Linjer som användes här erhölls från laboratorierna i Yasuhiro Takashima (för närvarande vid CiRA, Kyoto, Japan) och Austin Smith (för närvarande vid Living Systems Institute, Exeter, Storbritannien). Alternativt kan naiva hPSC:er återställas internt från linjer med grundade hPSC:er som beskrivits tidigare13,14. Naiva hPSCs verkar stabila för flera passager (> 15) men kulturens kvalitet kan variera över tiden. Om kvaliteten på naiv hPSC minskar, tina en ny injektionsflaska med celler eller generera de novo naiva hPSCs från grundade PSC. För alla mediesammansättningar, se tilläggstabell 1.
- Beredning av skikt av bestrålad musembryonmatare (MEF)
- Dagen före passering av naiva hPSCs, förbered en 6-brunns cellodlingsplatta med bestrålade MEF-lager genom att följa stegen som beskrivs nedan.
- Täck en 6-brunns cellodlingsplatta med 1 ml 0,1% gelatin i PBS per brunn. Inkubera plattan vid 37 °C i 30 minuter. Ta bort gelatinlösningen.
- Förbered MEF-medium vid 37 °C.
- Tina MEFs i ett vattenbad vid 37 °C tills endast en liten isklump finns kvar. Lös upp injektionsflaskans volym med 1 ml berett MEF-medium med hjälp av en P1000-pipett.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör. Snurra ner suspensionen vid 200 x g i 4 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera MEF-pelleten genom att tillsätta färskt MEF-medium (tillräckligt för 1,5 ml per brunn).
- Räkna cellerna med hjälp av cellräkningsglas och tillsätt 300 000 celler per brunn och överför plattan till en normoxiinkubator vid 37 °C.
OM MEF:er lossnar med tiden kan nya PDF-filer läggas till i PXGL-mediet under rutinmässiga mediebyten.
- Passaging av mänskliga naiva pluripotenta stamceller
- Innan du passerar hPSCs, kontrollera deras morfologi under mikroskopet. Kolonier har vanligtvis en kupolformad morfologi med ljusa, definierade gränser. Om de enskilda kolonierna visar en plattare morfologi eller om differentierade kolonier börjar dyka upp, följ instruktionerna i steg 1.2.8.
- Aspirera mediet och tvätta cellerna med PBS en gång. Tillsätt 500 μL cellavskiljningslösning per brunn på en 6-brunnsplatta.
- Inkubera cellerna i 5 minuter vid 37 °C. Använd en P1000-pipett och pipettera cellerna flera gånger för att dissociera kolonierna i enstaka celler.
- Samla cellerna och överför dem till ett 15 ml rör som innehåller tvättbuffert (1 ml per brunn på en 6-brunnsplatta). Snurra ner cellerna vid 200 x g i 4 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i färskt PXGL-medium (tillräckligt för 1,5 ml per brunn). Tänk på ett delningsförhållande på 1: 3-1: 6 för rutinmässigt passering.
OBS: Efter varje 3-4 passager eller om kvaliteten på cellodlingen minskar baserat på cellmorfologin (t.ex. framväxten av platta kolonier i befolkningen), tillsätt 10 μM Y-27632 och tillväxtfaktor källarmembranextrakt (5 μL / brunn) till mediet under de första 24 timmarna efter passering. - Innan du plattan fräser om hPSC: erna, förbered plattorna med färska MEF genom att aspirera MEF-mediet och tvätta cellerna en gång med PBS. Använd sedan en P1000-pipett för att överföra 1,5 ml hPSCs cellsuspension per brunn på en 6-brunnsplatta som innehåller MEFs.
OBS: Se till att pipettering leder till en homogen sådd av cellerna över brunnsområdet. Detta kommer att säkerställa tillväxten av kolonier med homogena storlekar och relativ synkronisering av cellerna. - Odla hPSCs under hypoxiska förhållanden vid 37 °C i en fuktad miljö. Efter 24 timmar ska hPSC fästas. Ett stort antal icke-vidhäftande (eller flytande) celler återspeglar ett problem med livskraft eller fastsättning vid passering.
- Byt medium med 1,5 ml PXGL-medium per brunn dagligen. Passage hPSCs var 3-4 dagar eller använd dem för blastoidbildningsexperiment.
OBS: Efter upptining av hPSC, passera dem i minst tre passager innan du startar ett blastoidexperiment.
2. Bildandet av blastoider
- Bildandet av naiva PSC-aggregat
- Förbered och förvärm PXGL-media, N2B27 basalmedia, tvättbuffert, PBS och aggregeringsmedia innan du påbörjar experimentet. Undanta MEF från hPSCs suspension för att bilda blastoider genom att följa stegen som beskrivs nedan.
- För MEF-uteslutning, förbered en gelatinbelagd platta genom att tillsätta 1 ml 0,1% gelatin i brunnen på en 6-brunnsplatta och inkubera vid 37 ° C i 30-90 min.
- För att skörda cellerna, aspirera mediet och tvätta cellerna med 1 ml PBS.
- Tillsätt 500 μl cellavskiljningslösning (per brunn på en 6-brunnsplatta) och inkubera vid 37 °C i 5 minuter.
- Kontrollera cellerna under mikroskopet för att följa dissociationen av kolonier i enstaka celler (några flercelliga klumpar kan dissocieras senare genom mild pipettering).
- Späd cellavskiljningslösningen med 1 ml tvättbuffert. Samla cellerna från plattan genom att försiktigt pipettera 5 till 10 gånger. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör. Snurra ner cellerna vid 200 x g i 4 min.
- Aspirera supernatanten, återsuspendera cellerna i 1,5 ml PXGL-medium (per brunn på en 6-brunnsplatta) och frö cellerna på de gelatinbelagda plattorna för MEF-uteslutning och inkubera vid 37 °C i 60-90 min.
- När de naiva cellerna har ympats för MEF-uteslutning, ta bort PBS från mikrobrunnar och balansera brunnarna med 200 μL basalt N2B27-medium (per 1 mikrobrunnschip) och inkubera i 60 minuter vid 37 °C.
- Samla supernatanten som innehåller de obundna naiva cellerna, överför den till ett 15 ml rör och snurra ner cellerna vid 200 x g i 4 minuter.
- Aspirera media och resuspendera cellerna i 1 ml N2B27 basalmedia. Räkna cellerna med hjälp av cellräkningsbilder. Snurra ner cellerna vid 200 x g i 4 min.
- Aspirera mediet och tillsätt en lämplig mängd av 10 μM Y-27632 som finns i N2B27-media för att erhålla en celldensitet på 30 000 celler per 50 μL.
OBS: Optimalt initialt såddcellnummer kan variera mellan de olika cellinjerna. Till exempel, för att fröa 50-60 celler / mikrobrunn, 30 000 celler (inklusive överskott med tanke på att vissa celler faller utanför mikrobrunnen) sås i 1 brunn med 96 brunnsplattor som innehåller 430 mikrobrunnar. Ett olämpligt startcellnummer kan resultera i att den lilla aggregatbildningen utan hålighet eller bildning av kaviteterad struktur når mer än 250 μm. - Aspirera mediet från jämviktsmikrobrunnsmatriser och tillsätt 25 μl N2B27-media med 10 μM Y-27632. Tillsätt 50 μl cellsuspension och inkubera vid 37 °C i 15 minuter (tills cellerna faller ner i mikrobrunnens botten). Tillsätt sedan 125 μl N2B27-medium kompletterat med 10 μM Y-27632.
- Blastoid utveckling
- Inom 24 timmar kan aggregat av naiva hPSCs observeras (dag 0) på microwell-chipet. För att initiera blastoidbildning, förbered PALLY-medium och följ stegen nedan.
- Förvärm PALLY-medium vid 37 °C i 30 min.
OBS: 1-oleoyllysofosfatidinsyra (LPA) och 10 μM Y-27632 måste tillsättas strax före användning. Den optimala koncentrationen av LPA varierar mellan 0,5-5 μM. Detta måste titreras för enskilda hPSC-linjer som används för blastoider. - Aspirera aggregeringsmediet. Tillsätt 200 μl förvärmt PALLY-medium till mikrobrunnarna. Placera cellodlingsplattan tillbaka i en hypoxisk inkubator vid 37 °C. Upprepa medieändringen dag 1.
- På dag 2, ta bort PALLY-medium och tillsätt 200 μL N2B27-medium kompletterat med LPA och 10 μM Y-27632.
OBS: Dag 2 fortsätter majoriteten av aggregaten att växa. Vissa aggregat bildar emellertid små håligheter. Kontinuerligt odla blastoider i PALLY fram till dag 4 eller i in vitro-odlingsmedium (IVC1) från dag 2 och framåt. Men efter denna medieförändring ökar bildandet av PrE i mogna blastoider. - Upprepa mediebyte dag 3. Fullständig blastoidbildning sker vid dag 4.
OBS: Blastoider anses ha utvecklats fullt ut när de har genomgått fullständig morfogenes baserat på morfometrik av dag 7 humana blastocyster (t.ex. ett diameterområde från 150 -250 μm; ett inre kluster omgivet av ett epitel av trophectoderm-liknande celler) och har bildat polära trophectoderm-liknande celler (NR2F2 +/ CDX2-) och PrE-liknande celler (GATA4 +). Detta kan bedömas med hjälp av immunofluorescensfärgning eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
3. Bildning av blastoider i 96-brunnar ultralåga fästmikroplattor
- Förbered naiv hPSCs cellsuspension för blastoidbildning genom att följa stegen som beskrivs ovan från 2.1.1 - 2.1.11.
- Aspirera mediet och tillsätt en lämplig mängd N2B27-media innehållande 10 μM Y-27632 för att erhålla celldensiteten hos 70 celler per 100 μL av mediet.
OBS: Optimalt initialt såddcellnummer kan variera mellan olika cellinjer. Till exempel kan 70 celler/brunn vara det optimala celltalet för de flesta cellinjer. - Centrifugera plattan vid 200 x g i 2 min vid rumstemperatur för att gruppera celler i botten av brunnarna.
- Inkubera plattan i en inkubator vid 37 °C under hypoxiska odlingsförhållanden. Inom 24 timmar kan aggregat av naiva hPSCs observeras (dag 0) på brunnarna.
- Förbered 2x PALLY-medium. Tillsätt 100 μL förvärmt 2x PALLY-medium till brunnarna.
- Placera cellodlingsplattan tillbaka i en hypoxisk inkubator vid 37 °C. Efter 24 timmar, aspirera hälften av mediet (100 μL) och ersätt det med 100 μL förvarnat PALLY-medium. Upprepa steget till dag 4. Se till att inte aspirera aggregaten.
OBS: Dag 2 fortsätter majoriteten av aggregaten att växa. Vissa aggregat har emellertid små vätskefyllda håligheter. På dag 4 genomgår majoriteten av de kaviterade strukturerna fullständig morfogenes för att bilda blastocystliknande strukturer.
4. Bildandet av trofosfärer
- För trofosfärbildning, följ blastoidbildningsprotokollet från steg 2.1.1 (MEF-uteslutning) till steg 2.1.12 (sista steget i såddprotokollet).
- När aggregat av naiva hPSCs har bildats efter 24 h, byt ut aggregeringsmediet med PALY (utan LIF) kompletterat med 3 μM SC-144 för bildandet av trofosfärer som representerar tidig trophectoderm och PALLY kompletterat med 2 μM XMU-MP-1 för bildandet av trofosfärer som representerar mogen trophectoderm.
- Uppdatera mediet dagligen. Fullständig trofosfärbildning sker vid dag 4.
5. Analys av blastoidcellernas tillstånd och dess reflekterade stadium med användning av scRNAseq
- För att plocka upp blastoider och utföra dissociation, värm upp skakinkubatorn till 37 ° C och ställ in den på 100 rpm.
- Samla blastoider från den ursprungliga 96-brunnsplattan och överför dem till flera brunnar på en U-botten 96-brunnsplatta med hjälp av en munpipet utrustad med en glaskapillär.
OBS: Blastoider (> 70%) bör väljas baserat på de morfometriska kriterierna (storlek = 150-250 μm med ett unikt inre kluster) för att undvika kontaminering med icke-blastoida strukturer (< 30%). - Tvätta en gång med 200 μL PBS med en P200 genom att titta under ett stereomikroskop. Överför till en brunn som innehåller 50 μl kollagenas och inkubera i 30 minuter i skakinkubatorn.
- Överför blastoiderna till en brunn med 100 μL 10x trypsin-EDTA och blanda väl. Inkubera i 20 min i skakinkubatorn.
- Dissociera blastoiderna i en enda cell med hjälp av P200-pipett. Överför cellerna till ett 15 ml rör med FACS-buffert (1% FBS i PBS).
- För att fånga specifika förhållanden mellan analogerna i de tre linjerna, färga TE- och PrE-analogerna med TROP2- respektive PDGFRa-antikroppar.
OBS: Antalet PrE-celler i humana blastocyster är mindre jämfört med musblastocyster, vilket kan återspegla utvecklingsfel hos blastocyster som bildas genom in vitro-fertilisering (IVF) eller en artskillnad. I blastoider är PrE-analogerna mindre rikliga än TE- och EPI-analogerna och representerar 7,4% av cellerna vid räkning av GATA4+ -celler genom immunofluorescensavbildning. Dissociationsprocessen kan också inducera fördomar i proportionerna av de olika celltyperna som PrE-analoger för att representera 1% -2% av cellerna vid blastoiddissociation, PDGFRa-märkning och FACS-analys. - FACS-sorterar celler från alla tre härstamningsanalogerna till 384-plattor innehållande en lysbuffert för smart-seq2-analys. Uteslut döda celler märkta med DAPI-färgning (utförs enligt tillverkarens instruktioner).
- För att utvärdera celltillstånden (celltyp och utvecklingsstadium), jämför transkriptomiska data från blastoid med lämpliga kontroller.
6. Utökad kultur för att bedöma blastoid utvecklingsprogression
- Odla mänskliga blastoider på källarmembranmatrisbelagda plattor (glasbotten).
- Täck plattan med källarmembranmatris.
- Inspektera blastoiderna visuellt för att bedöma och registrera morfologi.
OBS: Endast blastoider som visar den klassiska ihåliga kula blastocystmorfologin med kompakt ICM har potential att växa och utvecklas ytterligare. - Tillsätt 100 μL CMRL medium-1 per en brunn på 96-brunnsplattan och placera plattan i inkubatorn minst 2 timmar innan blastoider överförs för jämvikt.
- Med hjälp av ett stereomikroskop, identifiera visuellt blastoiderna med god morfologi, överför de valda blastoiderna i en brunn med 96-brunnsplatta innehållande 100 μl CMRL medium-1 för att avlägsna spåren av blastoidmedia.
- Överför blastoiderna till brunnen som innehåller förekvivalent CMRL-media-1. Placera plattan i inkubatorn och inkubera vid 37 °C över natten.
OBS: Upp till 5 blastoider kan odlas i en brunn med 96 brunnsplattor. Att ha för många blastoider i en enda brunn kan leda till bildandet av aggregat av flera blastoider. - Nästa dag, inspektera blastoiderna visuellt under ett mikroskop. Om blastoiderna är fästa, tillsätt 100 μL förjämvikt cmrl-media-1 kompletterat med 5% källarmembranmatris. Placera plattan i inkubatorn och inkubera vid 37 °C över natten.
- Nästa dag, övervaka blastoiderna under ett mikroskop. Ta bort hälften av mediet (100 μL) och ersätt det med 100 μL förekvivalent CMRL-media-2 kompletterat med 5% källarmembranmatris.
- De följande dagarna, byt ut hälften av mediet (100 μL) med förekvivalent CMRL-media-3 kompletterat med 5% källarmembranmatris. Placera plattan i inkubatorn och inkubera vid 37 °C över natten. Upprepa varje dag i upp till 4-6 dagars in vitro-kultur .
OBS: Vi har odlat blastoider i upp till 6 dagar under förlängda odlingsförhållanden som motsvarar tidsekvivalenten för dag 13 för in vitro-odlade mänskliga embryon.
7. Immunfärgande blastoider
- Aspirera mediet. Tvätta proverna 3x med PBS i 5 min.
- Tillsätt 200 μl kall 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS och fixa prover i 30 minuter vid rumstemperatur. Ta bort PFA-lösningen och tvätta proverna 3x med PBS i 10 minuter.
OBS: Om blastoider odlades på mikrowellchips, överför blastoiderna från chipet till 96-brunnars U-bottenplattor för följande steg. - Permeabilisera och blockera blastoiderna i 100 μL blockerande lösning per brunn (PBS innehållande 0,3% Triton-X 100 och 10% normalt åsneserum) i 60 min.
OBS: Beroende på antikropparnas värdart, anpassa serum därefter. - Ta bort blockeringslösningen. Tillsätt 100 μl primära antikroppar utspädda i färsk blockerande lösning och inkubera prover över natten vid 4 °C.
OBS: Koncentrationerna av primära antikroppar måste bestämmas utifrån tillverkarens instruktioner. - Tvätta prover 3x med 0,1% Triton-X 100 i PBS (tvättlösning) i 10 min. Tillsätt 100 μl sekundära antikroppar i blockerande lösning tillsammans med 20 μg/ml Hoechst kärnfläck och inkubera prover i 1 timme vid rumstemperatur. Skydda prover från ljus.
OBS: Koncentrationerna av sekundära antikroppar måste bestämmas utifrån tillverkarens instruktioner. - Tvätta proverna 3x med tvättlösning i 10 min. För avbildning, överför proverna till glasbotten μ i PBS.
OBS: Monteringsmediet bör väljas utifrån det mål som används för avbildning. Till exempel är 80% glycerol i PBS möjligt att använda för montering av proverna medan du använder oljemål.
Representative Results
Vanligtvis är naiva hPSCs odlade i PXGL (figur 2A) aggregerade och kaviterade strukturer som uppstår mellan 48 och 72 timmar efter PALLY-induktion och når en diameter på 150-250 μm inom 96 h (figur 2B). Med hjälp av optimala (1) såddcellnummer, (2) varaktighet av förodlingsaggregering med N2B27 (0 till 24 h), (3) koncentration av enskilda kemiska komponenter (särskilt LPA) och (4) varaktighet av PALLY-behandling når induktionseffektiviteten 70% -80% enligt definitionen baserat på morfometriska parametrar (total storlek på 150-250 μm, enkel regelbunden hålighet, ett inre cellkluster; Figur 2C,D) och närvaron av de tre släktlinjerna. Ett suboptimalt initialt celltillstånd och / eller induktionsförhållanden kommer att resultera i mindre effektiv eller ingen blastoidbildning. För att säkerställa maximal effektivitet och för att endast bilda preimplantationsanaloger är det avgörande att använda en högkvalitativ kultur av naiva PXGL hPSCs. Detta kan bedömas genom att mäta med FACS andelen celler som är positiva för ytmarkörerna SUSD2 (naivt tillstånd) och CD24 (grundat tillstånd). Ytterligare ytmarkörer som är specifika för de extraembryoniska linjerna utanför målet (t.ex. amnion, extraembryonisk mesoderm) skulle också vara användbara men, så vitt vi vet, är för närvarande inte tillgängliga. Om den erhållna bildningseffektiviteten är lägre än de rapporterade resultaten är det viktigt att noggrant kontrollera alla komponenter i blastoidmediet, särskilt LPA som rekonstitueras i PBS och som, som en GPCR-ligand, kan vara mer instabil jämfört med syntetiska molekyler som rekonstitueras i DMSO. I de flesta fall, även om utbytet inte är maximalt, består kavitéstrukturerna fortfarande av de tre blastocystlinjerna. Framväxten av tre blastocystlinjer och bildandet av embryonal-abembryonisk axel kan bekräftas genom immunofluorescensfärgning av markörer (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Figur 2E,G). Trofosfärer, som endast består av TE, hjälper till att ytterligare dissekera rollen som intercellulär kommunikation. Trofosfärer kan bildas vid 50%-60% effektivitet inom 96 h efter induktion (figur 2H,I). Blastoidbildning kan utföras inte bara i hemmagjorda mikrobrunnsmatriser utan även i kommersiellt tillgängliga ultralåga brunnsplattor med optimering av induktionsförhållanden (se protokoll och figur 2J). Blastoider har också kapacitet att vidareutvecklas i ytterligare 6 dagar, vilket är tidsekvivalent med dag 13 embryo, med in vitro-differentieringsprotokoll (figur 2K).
För att ytterligare karakterisera celltillståndet hos blastoidceller måste encells RNA-sekvenseringsteknik användas. UMAP används vanligtvis för att visualisera en fördelning av celltillstånd och oövervakad klustringsanalys utförs på den för att utvärdera närheten till enskilda celltillstånd. Olika parametrar i encellsdataanalysen kan påverka hur celler visas i UAP: erna, vilket leder till kluster med olika rumsliga och relativa positioner och former (figur 3A). I denna analys visar cellerna dock markant reproducerbart distinkta klustringsprofiler oavsett vilka parametrar som används för att utföra klustringen och visualiseringen av data, vilket gör det möjligt att med hög säkerhet särskilja de tre blastocystlinjerna. Vi använde celler från embryon som skördats i olika utvecklingsstadier som referens. Sammanslagningen av dessa dataset visar att majoriteten av trophectoderm-analogen från blastoid grupperad med preimplantationstrophectoderm men inte med trofoblaster efter implantation (figur 3B). Dessa resultat bekräftades också av ett oberoende konsortium10.
När Carnegie steg 7 (CS7) gastrulating embryon introduceras i referenskartan, en liten population av blastoidceller (3%) grupperade med mesoderm- och amnionlinjerna hos dessa embryon (figur 3C). När amnionliknande celler introduceras i referenskartan grupperas en liten population av blastoidceller (< 2%) med sådana amnionliknande celler.
Sammantaget betraktas endast strukturerna som består av ett enda regelbundet hålrum, ett enda inre cellkluster, en total storlek som sträcker sig från 150-250 μm, bestående av transkriptomiska analoger av de tre blastocystlinjerna, och som till stor del saknar andra släktlinjer (t.ex. amnion, mesoderm, extraembryonisk mesoderm) som humana blastoider.
Figur 1: Fyra funktioner och två metoder för att generera hifi-blastoider.
Figur 2: Blastoid- och trofosfärer härledda från aggregat av naiv hPSC. (A) Faskontrastbilder som visar naiva hPSCs odlade i PXGL-medium samodlade med bestrålad MEF. Skalstreck: 50 μm. (B) Faskontrastbilder som visar den morfologiska förändringen av naiva hPSCs-aggregat odlade på en icke-vidhäftande hydrogelmikrowell-array med 500 nM LPA (PALLY-medium). Skalstång: 200 μm. (C) Mänskliga blastoider bildade på en mikrowell-array efter 96 h. Skalstaplar: 400 μm. (D) Kvantifiering av procentandelen mikrobrunnar som innehåller en human blastoid inducerad av PALLY-odlingstillstånd med optimerad LPA-koncentration från olika naiva hPSC-linjer (n = 3 mikrobrunnsmatriser). E) Immunofluorescensfärgning av humana blastoider med epiblastmarkörer (EPI) (gul) NANOG och OCT4. TE-markörerna (cyan) CDX2 och GATA3; och den primitiva endodermmarkören (magenta) SOX17 och GATA4. Skalstreck: 100 μm. (H-I) Kvantifiering av cellantalet (vänster) och procentandelen celler (höger) som tillhör varje härstamning i blastoid (96 h) baserat på immunofluorescensfärgning av OCT4, GATA3 och GATA4. (G) Immunofluorescensfärgning av humana blastoider för CDX2 (cyan) och NR2F2 (magenta). (F) Faskontrastbilder av tidiga och sena trofosfärer på mikrobrunnsarray inducerade genom tillsats av 3 μM SC144 (H) respektive 2 μM XMU-MP-1 (I). (J) Faskontrastbilder som visar den morfologiska förändringen av naiva hPSCs-aggregat odlade i ultralåg bindning 96-brunnsplatta med 500 nM LPA (PALLY-medium). (K) Faskontrastbild (vänster) och immunofluorescensfärgning (höger) för OCT4 (gul), GATA3 (cyan) och GATA4 (magenta) i blastoid som odlas i postimplantatoriskt odlingstillstånd i 6 dagar. Skalstång: 100 μm. Denna siffra är anpassad från 6,10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Karakterisering av sammansättningen av blastoider genom encellssekvensering. (A) Oövervakad klustringsanalys med olika parametrar på UMAP av transkriptomet för enskilda celler härledda från de olika tidpunkterna för blastoid (24 h, 60 h, 96 h), naiva hPSCs, grundade hPSCs och hTSC (representerar cytotrofoblasten efter implantation). (B) UMAP av transkriptomet för celler härledda från blastoid (96 h), naiva hPSCs och grundade hPSCs integrerade med publicerade datamängder från mänskliga embryon av preimplantation, periimplantation (in vitro odlade blastocyster) och gastrulation (Carnegie steg 7, dvs mellan E16-19) steg. Enskilda celler färgas baserat på deras ursprung i mänskliga embryon (vänster), blastoid-härledda celler eller stamceller (mitten) och resultatet av oövervakad klusteranalys (höger). (C) PUMAPs av transkriptomet av celler härledda från blastoider, naiva hPSCs, grundade hPSCs och integrerade med publicerade dataset från gastrulation (Carnegie steg 7, dvs mellan E16-19) stadium embryo. Enskilda celler färgas baserat på deras ursprung i mänskliga embryon (vänster), blastoid-härledda celler eller stamceller (mitten) och resultatet av oövervakad klusteranalys (höger). Denna siffra är anpassad från6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande tabell 1: All mediesammansättning som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
I den aktuella studien visar vi steg för steg hur man etablerar humana blastoider med hög effektivitet med hjälp av ett enkelt och robust protokoll. Vid aggregering av naiva PXGL hPSCs och deras trippelhämning bildas blastoider effektivt (> 70%) och genererar sekventiellt de 3 blastocystanalogerna inom 4 dagar. Begränsningar i blastoidernas effektivitet och kvalitet (t.ex. närvaro av celler utanför målet) kan uppstå om det ursprungliga tillståndet är suboptimalt. Observera att vi har mätt att PXGL hPSCs innehåller cirka 5% av cellerna som återspeglar postimplantationsstegen. Dessa celler kan begränsa bildandet av högkvalitativa blastoider. Utöver det initiala naiva PXGL-tillståndet som återspeglar blastocystepiblasten är en annan avgörande faktor mediet som används för blastoidbildning. För att snabbt bilda blastocystliknande celler och förhindra bildandet av off-target, postimplantationsliknande celler, föreslår vi att trippelvägshämning (Hippo, ERK, TGF-β) är avgörande. Medan olika cellinjer ger olika utbyten av blastoid vid ERK / TGF-β hämning (vanligtvis cirka 10% -20%), resulterar exponering för LPA i bildandet av lika högt blastoidutbyte över alla cellinjer, samtidigt som man använder strikta morfometriska och härstamningsspecifikationskriterier. LPA verkar möjligen på hämningen av Hippo-vägen, som spelar en avgörande roll i den första härstamningssegregeringen mellan epiblast- och trophectoderm-linjer i mus och människa 8,51. Den signifikanta förbättringen av blastoideffektiviteten av LPA tyder på att hippovägsmedierade inre-yttre cellspecifikationsmekanismer som spelas i blastocysten koopteras under blastoidbildning. En nuvarande begränsning ligger i det faktum att vi, på grund av en suboptimalitet hos de protokoll som används för att odla human blastocyst eller blastoider vid tidsekvivalent dag 7-13 (efter blastocyst / blastoidbildning), inte kan bedöma i vilken utsträckning vi korrekt kan modellera utvecklingen efter implantation.
Analys av det transkriptomiska tillståndet hos blastoidcellerna kan enkelt uppnås med hjälp av scRNAseq, adekvata referenskartor och bioinformatiska metoder. Tidigare visade den transkriptomiska analysen att hPSCs odlade i PXGL liknar blastocystepiblasten mer jämfört med det grundade tillståndet. Begränsningar i analysen av data kan uppstå om referenskartan endast består av blastocyststegsceller. Referenskartan bör omfatta celler som härrör från embryon efter implantation för att bedöma förekomsten av potentiella celler utanför målet. I framtiden, för att jämföra blastoidceller, skulle en referenskarta som inkluderar alla vävnader i pre- och postimplantation human conceptus vara extremt värdefull. Dessutom skulle multi-omics encellsreferenskartor, till exempel inklusive transkriptom, kromatintillgänglighet och DNA-metylering, ytterligare hjälpa till. Slutligen skulle standardiserade bioinformatiska metoder för att kvantitativt bedöma likheterna mellan celler från embryomodeller och referenskoncepti, och för att positivt identifiera celler utanför målet ytterligare hjälpa till att opartiskt analysera och jämföra resultat.
Sammantaget har blastoider som bildas genom trippelhämning av Hippo-, TGF-β- och ERK-vägar de fyra egenskaperna hos 1) mycket effektiv morfogenes, 2) korrekt sekvens av härstamningsspecifikation, 3) hög renhet hos blastocystliknande celler på transkriptomnivå, 4) kapacitet att modellera periimplantationsutveckling. Dessa egenskaper hos blastoider kommer att underlätta att bygga hypoteser om blastocystutveckling och implantation, men de rekapitulerar inte tidigare stadier av embryonal utveckling. I motsats till den begränsade tillgängligheten och mångsidigheten hos human blastocyst är blastoider mottagliga för genetiska och läkemedelsskärmar för funktionella undersökningar av blastocystutveckling och implantation. I framtiden kan sådan grundläggande kunskap bidra till att förbättra IVF-medieformuleringen, utveckla preventivmedel efter befruktning och bättre hantera tidig graviditet.
Disclosures
Institutet för molekylär bioteknik, Österrikiska vetenskapsakademin har lämnat in en patentansökan EP21151455.9 som beskriver protokollen för human blastoidbildning och blastoid-endometriuminteraktionsanalys. HK, AJ, HHK och NR är uppfinnarna av detta patent. Alla andra författare förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta projekt har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 (ERC-Co grant agreement No.101002317 'BLASTOID: a discovery platform for early human embryogenesis'). H.H.K. stöds av Austrian Science Fund (FWF), Lise Meitner Programme M3131-B. Vi tackar Yasuhiro Takashima för att dela H9- och H9-GFP-cellinjerna, och Austin Smith, Peter Andrews och Ge Guo för att dela HNES1, Shef6, niPSC 16.2b och cR-NCRM2 cellinjer. Vi tackar Hossein Baharvand för att han delade med sig av endometrieorganoiderna. Vi tackar Joshua M. Brickman för att ha delat RNA isolerat från PrE-differentierade celler och nEND-celler. Vi tackar Shankar Srinivas för att ha delat encells RNA-sekvenseringsdata för peri-gastrulationsembryomet. Vi tackar Aleksand Bykov och Luisa Cochella för teknisk hjälp för SMARTSeq2 biblioteksförberedelser. Vi tackar NGS, Biooptic och Stamcellsanläggningen på IMBA för kritisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | in house | ||
| DMEM/F12 | in house | ||
| 100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
| 50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| 100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
| MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| 1 M Hepes | in house | ||
| 50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
| XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
| Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
| Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
| A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
| 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
| Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
| CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
| Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
| Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
| TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
| PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
| SC-144 | Axon | 2324 | |
| XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
| Matrigel | basement membrane matrix | ||
| Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
| DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |
References
- Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
- Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
- Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
- Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
- Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
- Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
- Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
- Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
- Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
- Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
- Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
- Guo, G., et al.
- Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), Cambridge, England. 158501 (2018).
- Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
- Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
- Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
- Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
- Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
- Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
- De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
- Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
- Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
- Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
- Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
- Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
- Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), Cambridge, England. 871-882 (2012).
- Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Developmental Biology. 361 (2), 358-363 (2012).
- Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), Cambridge, England. (2019).
- Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
- Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
- Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), Cambridge, England. 1775-1786 (2017).
- Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), New York, N.Y. (2019).
- Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).
