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Biology

Transformation naturelle, expression des protéines et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacune

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

La lacune de Phormidium est une cyanobactérie filamenteuse qui a été isolée à partir de bassins rocheux marins. Cet article décrit l’isolement des filaments à partir de sources naturelles, l’extraction de l’ADN, le séquençage du génome, la transformation naturelle, l’expression du sfGFP, la cryoconservation et les méthodes de motilité.

Abstract

Les cyanobactéries font l’objet de recherches fondamentales et de projets biotechnologiques dans lesquels l’énergie solaire est utilisée pour la production de biomasse. La lacune de Phormidium est une cyanobactérie filamenteuse nouvellement isolée. Cet article décrit comment de nouvelles cyanobactéries filamenteuses peuvent être isolées à partir de bassins rocheux marins. Il décrit également comment l’ADN peut être extrait des filaments et comment les génomes peuvent être séquencés. Bien que la transformation soit établie pour de nombreuses espèces unicellulaires, elle est moins fréquemment rapportée pour les cyanobactéries filamenteuses. Une méthode simplifiée pour la transformation naturelle de P. lacuna est décrite ici. P. lacuna est le seul membre de l’ordre des Oscillatoriales pour lequel une transformation naturelle est établie. Cet article montre également comment la transformation naturelle est utilisée pour exprimer la protéine fluorescente verte superdosseuse (sfGFP). Un promoteur cpcB endogène a induit une expression environ 5 fois plus forte que les promoteurs cpc560, A2813 ou psbA2 de Synechocystis sp. PCC6803. En outre, une méthode de cryoconservation de P. lacuna et de Synechocystis sp.CPP 6803 a été établie, et des méthodes d’évaluation de la motilité dans un milieu liquide et sur des surfaces en gélose et en plastique sont décrites.

Introduction

Les cyanobactéries sont des organismes procaryotes qui utilisent la photosynthèse comme source d’énergie 1,2. La recherche se concentre de plus en plus sur les espèces cyanobactériennes. Plusieurs cyanobactéries peuvent être transformées avec de l’ADN3. Les gènes peuvent être assommés ou surexprimés chez ces espèces. Cependant, la transformation est limitée à quelques espèces 4,5,6,7,8,9,10,11, et il peut être difficile d’établir une transformation dans les souches des collections de culture ou de la nature 8. Des souches de l’espèce filamenteuse Phormidium lacuna (Figure 1) ont été isolées dans des bassins rocheux marins, dans lesquels les conditions environnementales, telles que les concentrations de sel ou la température, fluctuent au fil du temps. Ces cyanobactéries filamenteuses peuvent être utilisées comme organismes modèles pour l’ordreoscillatoriales 12 auquel elles appartiennent.

Au cours d’essais testant le transfert de gènes par électroporation 13,14, il a été constaté que P. lacuna peut être transformé par transformation naturelle15. Dans ce processus, l’ADN est absorbé naturellement par certaines cellules. Par rapport à d’autres méthodes de transformation16,17, la transformation naturelle a l’avantage de ne pas nécessiter d’outils supplémentaires qui pourraient compliquer la procédure. Par exemple, l’électroporation nécessite des cuvettes appropriées, des fils intacts et la sélection de la tension appropriée. P. lacuna est actuellement le seul membre d’Oscillatoriales sensible à la transformation naturelle. Étant donné que le protocole d’origine est basé sur des protocoles d’électroporation, il comprenait toujours plusieurs étapes de lavage qui pourraient être inutiles. Différentes approches ont été testées pour simplifier le protocole, ce qui a conduit au protocole de transformation présenté ici.

La séquence du génome est essentielle pour d’autres études moléculaires basées sur l’élimination ou la surexpression des gènes. Bien que les séquences du génome puissent être obtenues avec des machines de séquençage de nouvelle génération en peu de temps, l’extraction de l’ADN peut être difficile et dépend de l’espèce. Avec P. lacuna, plusieurs protocoles ont été testés. Une méthode modifiée à base de bromure de cétyle triméthylammonium (CTAB) a ensuite été établie, ce qui a permis d’obtenir une pureté acceptable des rendements en ADN et en ADN de chaque cycle de purification pour la poursuite des travaux en laboratoire. Le génome de cinq souches pourrait être séquencé avec ce protocole. L’étape de transformation logique suivante consistait à établir l’expression des protéines dans P. lacuna.

Le sfGFP utilisé comme protéine marqueur dans ce protocole peut être détecté avec n’importe quel microscope à fluorescence. Tous les promoteurs testés ont pu être utilisés pour l’expression de P. lacuna sfGFP. Le nombre croissant de souches résultant de la transformation a entraîné la nécessité d’une méthode de stockage des cultures. De telles méthodes sont établies pour Escherichia coli et de nombreuses autres bactéries18. Dans les protocoles standard, les cultures de glycérol sont préparées, transférées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C. Cette méthode ne nécessite que quelques étapes et est très fiable pour les espèces pour lesquelles elle est établie. Le protocole standard n’était pas réalisable pour P. lacuna parce que les cellules vivantes ne pouvaient pas être récupérées dans tous les cas. Cependant, lorsque le glycérol a été retiré après la décongélation, les cellules de tous les essais ont survécu. Des méthodes simples sont présentées pour l’analyse de la motilité de P. lacuna, qui peuvent être combinées avec la mutagénèse knockout pour étudier le pili de type IV ou le rôle des photorécepteurs. Ces tests sont différents de ceux des cyanobactéries unicellulaires 19,20,21 et peuvent également être utiles pour d’autres oscillatoriums.

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Protocol

1. Isolement de l’environnement naturel

REMARQUE: Les algues vertes, les diatomées, les cyanobactéries filamenteuses et d’autres microalgues peuvent être isolées. Le protocole peut être utilisé pour toutes les espèces de microalgues provenant de bassins rocheux poussant dans des conditions de laboratoire. Les cyanobactéries filamenteuses qui appartiennent aux oscillatoriales peuvent être facilement reconnues par leur mouvement et leur forme filamenteuse. L’espèce peut être identifiée dans un état semi-pur par séquençage du génome ou séquençage de l’ARNr 16S.

  1. Transférer des échantillons d’eau de mer liquide provenant de bassins rocheux marins (c.-à-d. cavités de la côte rocheuse) dans des flacons de 50 ml. Pour chaque flacon, notez l’emplacement exact ou les coordonnées de la source naturelle. Si possible, filtrez le contenu à travers des filets de 50 μm pour réduire les quantités de zooplancton. Conservez les échantillons à 4 °C jusqu’à ce qu’ils puissent être sous-cultivés.
  2. Transférer des cultures de 1 mL dans des boîtes de Petri de 10 cm contenant 3% de bacto-agar en milieu f/222,23 (voir le Tableau des matériaux). Préparez jusqu’à 20 assiettes. Cultiver sous une lumière blanche de 50 μmol m-2 s-1.
    REMARQUE: Des intensités lumineuses plus élevées peuvent être utilisées pour la culture. Une intensité allant jusqu’à 400 μmol m-2 s-1 peut être utilisée pour P. lacuna, bien que d’autres espèces puissent être plus sensibles à la lumière.
  3. Après une semaine, transférez les cellules souhaitées sur des plaques de gélose fraîches à l’aide de pinces stériles. Isolez les cellules sous un microscope binoculaire dans des conditions stériles. Conservez l’ancienne plaque d’agar à 4 °C jusqu’à ce que les cellules apparaissent et se développent sur la nouvelle plaque d’agar.
  4. Répétez cette étape de transfert chaque semaine pour éliminer la contamination. Utilisez l’œil nu pour détecter une contamination lourde et un microscope avec un grossissement de 400x pour des contrôles supplémentaires de contamination.
  5. Si un échantillon semble exempt de contamination, tester la contamination bactérienne ou fongique sur les plaques de gélose. Transférer une fraction de la culture avec une boucle d’inoculation sur une plaque de gélose LB24 (10 cm de diamètre), maintenir la plaque à température ambiante et vérifier la croissance des contaminants pendant 1 à 3 jours.
  6. Si une espèce cyanobactérienne filamenteuse stérile est obtenue, utilisez-la pour d’autres travaux de culture. Cultiver P. lacuna dans un liquide ou sur des plaques de bacto-agar. Utilisez des flacons de 250 mL avec 50 mL de milieu f/2 ou f/2+ pour la culture liquide.

2. Extraction de l’ADN

NOTE: Cette méthode est adoptée à partir de 25 26

  1. Préparer deux flacons avec 50 mL de f/2 de milieu. Inoculez chacun avec ~ 1 mL de filaments de P. lacuna provenant d’autres cultures en croissance. Conserver les cultures pendant 7 jours ou plus sous agitation (rotation horizontale) à 50 tr/min sous lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) à 25 °C.
  2. Traiter la culture avec des ultrasons (voir le tableau des matériaux) pendant 2 min avec toute l’énergie. Mesurer la DO à 750 nm; vérifiez qu’il est ~0,5. Continuez à cultiver les cultures si le DO est trop bas.
  3. Recueillir les filaments par 5 000 × g, 20 min de centrifugation. Retirez le surnageant. Transférer les filaments avec le liquide résiduel dans la chambre d’un Français Press27. Réglez la pression de la presse Français à 20 000 psi et extrayez les cellules.
    REMARQUE: La presse Français va lyser toutes les cellules et libérer l’ADN; de fortes forces de cisaillement produiront des fragments d’ADN de 1 500 bp.
  4. Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 10 000 × g et retirer le surnageant.
  5. Ajouter 400 μL de tampon de lyse (4 M d’urée, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) et 50 μL de protéinase K (10 mg/mL) à la pastille. Chauffer l’échantillon à 55 °C pendant 60 min en agitant à 550 tr/min.
  6. Ajouter 1 mL de tampon d’extraction d’ADN (3 % CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1 % Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) et incuber pendant 60 min à 55 °C et 550 tr/min. Transférer les solutions dans des tubes de centrifugation et ajouter deux volumes de chloroforme/isoamylalcool (24/1).
  7. Après agitation, centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 9 000 × g. Transférer la phase aqueuse supérieure dans des flacons de réaction et ajouter 1 mL d’éthanol glacé et 50 μL d’acétate de sodium 3 M.
  8. Vortex l’échantillon et placez-le à -20 °C pendant 1 h ou plus.
  9. Centrifuger pendant 5 min à 10 000 × g (4 °C) et jeter le surnageant. Lavez la pastille avec de l’éthanol à 70 %.
  10. Centrifuger à nouveau l’échantillon. Retirez le surnageant et séchez la pastille pendant la nuit. Dissoudre l’ADN dans de l’eau sans nucléase. Mesurer le spectre de l’ADN pour vérifier si la DO 260 nm/OD 280 nm est comprise entre 1,6 et 1,9.
  11. Analyser la taille de l’ADN sur un gel d’électrophorèse d’agarose28.
  12. Séquencez l’ADN génomique par séquençage de nouvelle génération pendant 300 cycles, avec un réglage d’extrémité appariée et une longueur de lecture de 150 bases (voir les tables des matériaux).
  13. Effectuez l’assemblage avec le programme informatique approprié; voir l’exemple donné dans la Table des matières.
  14. Soumettez le brouillon du génome au serveur RAST pour annotation.
    REMARQUE: Téléchargez des séquences d’ADN pour obtenir une annotation complète en quelques minutes.

3. Transformation naturelle et expression des GFP

REMARQUE: La transformation est basée sur un vecteur plasmidique propagé chez E. coli; pGEM-T ou pUC19 peuvent être utilisés comme vecteurs dorsaux. Des techniques de clonage sont établies dans de nombreux laboratoires; voir aussi les protocoles standard28 et les articles sur les vecteurs de transformation pour P. lacuna15,29. Des exemples de vecteurs pour l’expression sfGFP sont décrits dans la section des résultats représentatifs. Les détails de quatre vecteurs non encore publiés sont fournis dans le fichier supplémentaire 1.

  1. Effectuez toutes les étapes en utilisant un matériau stérile dans des conditions de laboratoire stériles (banc propre, verrerie stérile).
  2. Inoculer 2 x 50 mL de milieu liquide f/2 dans deux flacons de 250 mL avec 2 x 1 mL de filaments P. lacuna provenant d’une culture en cours d’exécution. Cultiver à la lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) sous agitation (rotation horizontale, 50 tr/min) pendant environ 5 jours à 25 °C.
  3. Préparez environ 200 μg d’ADN vecteur de transformation à l’aide d’un kit de préparation midi (voir le tableau des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
  4. Homogénéiser 100 mL de suspension de cellules P. lacuna (voir le tableau des matériaux) à 10 000 tr/min pendant 3 min. Mesurer la DO à 750 nm (valeur souhaitée = 0,35).
  5. Centrifuger la suspension de la cellule pendant 15 min à 6 000 × g. Retirez le surnageant et suspendez la pastille dans 800 μL (volume total, y compris le liquide résiduel et les filaments) du liquide restant et du milieu f/2+ supplémentaire.
  6. Prendre huit plaques de bacto-agar f/2+ (10 cm de diamètre) contenant 120 μg/mL de kanamycine. Pipette 10 μg d’ADN au milieu de chaque plaque de gélose. Pipeter immédiatement 100 μL de suspension cellulaire au milieu de chaque plaque de gélose (au-dessus de l’ADN).
  7. Gardez la plaque de gélose sans couvercle sur le banc propre pour permettre à l’excès de liquide de s’évaporer. Fermez la plaque et cultivez-la à la lumière blanche à 25 °C pendant 2 jours.
  8. Répartir les filaments de chaque plaque de gélose avec une boucle d’inoculation sur plusieurs plaques de bacto-agar f/2+ fraîches contenant 120 μg/mL de kanamycine. Cultivez les plaques à la lumière blanche à 25 °C et vérifiez régulièrement les cultures au microscope.
  9. Identifiez les filaments vivants et transformés après 7 à 28 jours au microscope. Recherchez des filaments verts sains (Figure 2) qui sont différents des autres filaments. Si ces filaments verts peuvent être identifiés, passez à l’étape suivante; sinon, conservez l’assiette pendant encore 7 jours.
  10. Utilisez des pinces pour transférer ces filaments vivants identifiés dans 50 mL de milieu liquide f/2+ avec 250 μg/mL de kanamycine. Cultiver à la lumière blanche à 25 °C sur un agitateur (rotation horizontale, 50 tr/min). Observez la croissance jusqu’à quatre semaines.
  11. Transférer les filaments dans un milieu agar contenant 250 μg/mL de kanamycine et attendre que les filaments se développent. Après plusieurs jours, transférer des filaments simples sur une plaque de gélose fraîche avec une concentration plus élevée de kanamycine, par exemple 500 μg / mL. Conservez la plaque d’origine.
  12. S’assurer que les filaments se propagent à une concentration élevée de kanamycine en culture liquide ou sur une gélose. Augmentez à nouveau la concentration de kanamycine pour accélérer la ségrégation.
    REMARQUE : P . lacuna transformé se développe jusqu’à 10 000 μg/mL de kanamycine. D’autres espèces pourraient ne pas tolérer de telles concentrations élevées.
  13. Si des cellules résistantes sont cultivées et réparties largement sur une plaque, testez l’intégration de l’insert dans le génome de P. lacuna en effectuant une PCR avec des amorces externes et internes.
    1. Utilisez des amorces conçues pour le clonage de l’insertion en tant qu’amorces internes.
    2. Pour la conception des amorces externes, sélectionnez des séquences qui sont 5' et 3' du site d’insertion proposé sur le génome de P. lacuna mais en dehors de l’insertion.
    3. Pour les réactions pcR, utilisez des amorces internes et des amorces externes. Utilisez la ou les souches résistantes et le type sauvage.
      REMARQUE: Les amorces internes indiquent que l’insert est présent; les amorces extérieures montrent que l’insert est inséré au bon emplacement.
  14. Pour chaque réaction de PCR, placez ~10 mg de filaments directement dans les tubes de PCR et effectuez la PCR selon les protocoles standard24. Si aucun produit n’est obtenu, faire varier la température de recuit et laver les filaments à l’eau.
    REMARQUE: De nombreuses polymérases différentes peuvent être utilisées dans la PCR. Les polymérases standard, telles que la Taq polymérase, ont un taux d’erreur plus élevé que les polymérases de vérification des erreurs, qui sont plus chères. Cette PCR analytique ne nécessite aucune polymérase de vérification des erreurs. Cependant, la polymérase de vérification des erreurs doit être testée si aucun produit PCR n’est obtenu avec une polymérase standard.
  15. Analyser les produits PCR de la ligne résistante sur l’électrophorèse de l’agarose24.
    1. Comparez les positions des bandes avec le marqueur et comparez le type sauvage et le transformant. Avec les amorces intérieures et extérieures, recherchez une bande plus grande pour le transformant que le type sauvage (en raison de l’insertion de la cassette de résistance) ou deux bandes pour le transformant: une avec la taille de la bande de type sauvage et une plus grande. Comme ce dernier cas indique une ségrégation incomplète, continuer la culture avec des concentrations élevées de kanamycine.
      REMARQUE: Pour plus de détails sur la PCR et l’électrophorèse, voir15,24 ou d’autres documents standard.
  16. Pour l’expression GFP : observez des filaments simples avec un microscope à fluorescence (voir la Table des matériaux) à un grossissement de l’objectif fixé à 40x ou 63x. Capturez une image de transmission en champ clair et une image de fluorescence. Utilisez les paramètres suivants pour GFP : passe-bande de 470 nm pour l’excitation, bande passante de 525 nm pour l’émission et séparateur de faisceau de 495 nm, temps d’exposition initial de 500 ms.
  17. Ajustez le temps d’exposition pour des signaux de fluorescence clairs, en évitant les intensités saturantes. Essayez d’utiliser le même paramètre pour tous les échantillons.
  18. Comme les filaments de type sauvage afficheront également la fluorescence, capturez des images avec les mêmes paramètres que ci-dessus pour cette fluorescence d’arrière-plan.
    REMARQUE: La déformation exprimant GFP doit avoir un signal plus élevé; sinon, il n’exprime pas la GFP.
  19. En fonction des temps d’exposition et de l’intensité en pixels des images de fluorescence, calculez et comparez la teneur en GFP des différents filaments.

4. Cryoconservation

NOTE: P. lacuna et la cyanobactérie unicellulaire Synechocystis sp. PCC 6803 sont utilisés. La méthode actuelle fonctionne mieux pour P. lacuna.

  1. Cultiver P. lacuna ou Synechocystissp PCC 6803 pendant au moins 10 jours dans 10 mL de milieu f/2+ ou BG-11, respectivement, sous lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) à 25 °C sous agitation (rotations horizontales, 50 tr/min).
  2. Homogénéiser la culture de P. lacuna (voir le Tableau des matériaux) à 10 000 tr/min pendant 3 min ou avec un appareil à ultrasons (voir le Tableau des matériaux) pendant 2 min à pleine énergie. Déterminez OD 750 nm de l’une ou l’autre culture pour vérifier si la valeur est comprise entre 1 et 7.
  3. Prélever les cellules par centrifugation à 6 000 × g pendant 15 min. Retirez le surnageant.
  4. Suspendre la pastille cellulaire dans 800 μL de milieu f/2+ ou BG-11 (volume final) et transférer dans un milieu cryovial de 2 mL. Ajouter 800 μL d’une solution de glycérol à 50 % à la suspension cellulaire. Fermer le flacon et mélanger en inversant à plusieurs reprises.
  5. Transférer le cryoviral dans l’azote liquide et le stocker dans une cryobox dans un congélateur à -80 °C. Notez la position de la boîte dans le congélateur et les coordonnées de l’échantillon dans la boîte.
  6. Pour la récupération des cellules, retirez le cryovial et décongelez le contenu à température ambiante. Transférer le contenu dans un tube de réaction de 2 mL.
  7. Lavez l’échantillon deux fois. Pour le1er lavage, centrifuger à 6 000 × g pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettez la pastille dans 2 mL de milieu f/2+ ou BG-11. Pour le 2e lavage, la récenteurière à 6 000 × g pendant 5 min, retirer le surnageant et suspendre la pastille dans 2 mL de milieu f/2+ ou BG-11.
  8. Pour vérifier l’intégrité de ces cellules prêtes à être cultivées, transférer la pastille dans 9 mL de milieu et les cultiver à la lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) sous agitation (55 tr/min). Comparez l’OD 750 nm de la culture le premier jour et après 1 semaine.

5. Motilité de la lacune de Phormidium

REMARQUE: Trois essais différents seront décrits. La même culture est utilisée dans tous les cas.

  1. Cultiver P. lacuna dans un milieu f/2 sous agitation horizontale (50 tr/min) en lumière blanche (50 μmol m-2 s-1) pendant environ 5 jours jusqu’à ce que la DO estimée à 750 nm soit de 0,35. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Homogénéiser les filaments (voir le Tableau des Matériaux) à 10 000 tr/min pendant 3 min ou avec des ultrasons (voir le Tableau des Matériaux) pendant 1 min à puissance maximale et cycle de 1. Mesure OD 750 nm. Si elle est supérieure à 0,35, diluer la fraction avec un milieu f/2. Utilisez cette solution dans les tests de motilité des étapes 5.3, 5.4 et 5.5.
  3. Dosage pour le mouvement en milieu liquide
    1. Pour l’observation directe de la motilité, transférer 8 mL de milieu contenant P. lacuna (à partir de l’étape 5.2) dans une boîte de Petri de 6 cm. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que l’échantillon atteigne la température ambiante. Couvrir la boîte de Petri avec du papier d’aluminium en cellophane.
    2. Placez une lame de microscope sur la table x-y d’un microscope standard avec une caméra. Allumez la lumière du microscope. Idéalement, utilisez toujours les mêmes réglages électriques et optiques pour l’éclairage. Déplacez un objectif 4x ou 10x dans le chemin de la lumière.
    3. Placez la boîte de Petri sur le dessus de la diapositive. Ajustez les filaments simples ou les faisceaux de filaments par x, y et z mouvements de la table.
      REMARQUE: En raison de la disposition tridimensionnelle, seule une partie de la section pertinente peut être mise au point. La feuille de cellophane permet d’ajuster la mise au point sans restriction.
    4. Observez les mouvements de filaments simples ou de faisceaux. Assurez-vous que l’objectif ne touche pas le liquide. Enregistrez les mouvements des filaments avec une caméra de microscope standard (voir Vidéo supplémentaire S1).
  4. Essai de mouvement sur la surface
    1. Pour l’observation de la motilité du filament sur les surfaces de gélose, préparez des boîtes de Petri de 6 cm avec f/2 bacto-agar. Assurez-vous que la gélose est suffisamment haute pour que l’objectif se rapproche de la surface de la gélose. Alternativement, préparez une couche d’agar d’environ 3 mm d’épaisseur et enregistrez les filaments à travers la gélose (gardez la plaque à l’envers ou utilisez un microscope inversé).
    2. Pipette 0,5 mL d’une solution contenant P. lacuna (à partir de l’étape 5.2) sur la surface bacto-agar d’une boîte de Petri de 6 cm. Laissez le liquide pénétrer dans la surface. Fermez la boîte de Petri et observez le mouvement des filaments sur la surface à l’aide d’un objectif 4x ou 10x.
    3. Assurez-vous que les mêmes réglages électriques et optiques du microscope sont utilisés tout au long de l’enregistrement et dans les enregistrements ultérieurs.
    4. Capturez des enregistrements en accéléré à l’aide d’une caméra oculaire et d’un système de mini-ordinateur. Assurez-vous que l’intervalle de temps entre les images suivantes est de 5 s-1 min. Programmez le script Linux du mini-ordinateur pour contrôler l’enregistrement en accéléré. Voir Fichier supplémentaire 2 pour un exemple de script et Vidéo supplémentaire S2 à titre d’exemple.
  5. Dosage pour phototaxis
    1. Pour les expériences de phototaxie, préparez des supports de diodes électroluminescentes (LED) (ici, avec une imprimante 3D) dans lesquels les LED de 5 mm sélectionnées sont montées pour irradier une zone de 20 mm2 du bas vers le haut (Figure 3). Si nécessaire, utilisez de nombreux supports led en parallèle, en connectant chaque LED électriquement via une résistance et un potentiomètre à une alimentation réglable. Mesurez et ajustez les intensités des LED, en fonction de l’expérience. Assurez-vous que l’ensemble du décor se trouve dans une pièce sombre ou un récipient sombre fermé.
    2. Placer 8 mL du milieu contenant P. lacuna (à partir de l’étape 5.2) dans une boîte de Petri de 6 cm. Ajustez l’intensité lumineuse de la LED. Fermez la boîte de Petri avec le couvercle et placez-la sur un support LED afin que la LED soit au centre de la boîte de Petri.
    3. Après la durée souhaitée (généralement 2 jours), capturez une image de la boîte de Petri avec un appareil photo de smartphone visant directement la position du traitement par la lumière. Utilisez un panneau LED blanc pour l’irradiation de l’échantillon. Utilisez les réglages manuels de l’appareil photo; éviter les reflets de lumière; ajustez toujours pour obtenir la même distance entre l’objectif de l’appareil photo et l’échantillon. Assurez-vous que les paramètres d’exposition donnent une image adaptée aux analyses ultérieures à l’aide d’ImageJ.
    4. Quantifiez le diamètre du cercle central des filaments à l’aide du logiciel ImageJ.
      1. Ouvrez ImageJ, cliquez sur Fichier | Ouvrez, sélectionnez le fichier souhaité, puis cliquez sur Entrée.
      2. Sélectionnez le bouton Droit (avec une ligne droite). Appuyez sur le bouton gauche de la souris pour tracer une ligne d’une extrémité de la boîte de Pétri à l’extrémité opposée. Assurez-vous que la ligne passe par le centre du cercle de filaments.
      3. Appuyez sur Ctrl-K sur le clavier ou cliquez sur Analyser | Profil de tracé dans le menu ImageJ. Recherchez une fenêtre x-y avec des intensités de pixels tracées par rapport à la distance - un profil 1D de la boîte de Petri. Assurez-vous que l’intensité de pixel la plus faible est légèrement supérieure à 0 et la valeur la plus élevée inférieure à 255.
      4. Estimez une valeur moyenne pour l’intensité des pixels à l’extérieur du cercle et une autre valeur moyenne pour l’intensité des pixels dans le cercle. À la position y- entre ces valeurs, estimez les valeurs x des deux côtés du cercle en pointant avec la souris sur ces positions. Notez les deux valeurs et calculez la différence.
      5. Obtenez la valeur x la plus élevée en pointant la souris sur l’axe des y à droite. Notez que cette valeur e représente le diamètre de la boîte de Pétri. Si ce diamètre est de 5 cm, calculez le diamètre du cercle central du filament comme d/e × 5 cm.

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Representative Results

Selon les méthodes susmentionnées, 5 souches différentes de P. lacuna ont été isolées dans des bassins rocheux et séquencées (figure 1 et tableau 1). Toutes les cultures étaient stériles après environ 1 an de sous-culture, à l’exception de P. lacuna HE10JO. Cette souche est toujours contaminée par Marivirga atlantica, une bactérie marine. Au cours des excursions ultérieures à Helgoland, d’autres cyanobactéries filamenteuses ont été isolées dans des bassins rocheux, qui sont différents de P. lacuna et doivent être caractérisés.

Plusieurs méthodes d’extraction et de purification de l’ADN ont été testées pour détecter la lacune de P. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec une méthode CTAB optimisée comme décrit ci-dessus. Les rendements en ADN étaient de 310 ± 50 μg/mL, l’OD 260 nm/OD 280 nm était de 1,7 ± 0,03 et l’OD 260 nm/OD 230 nm était de 0,78 ± 0,04 (n = 17). Le séquençage du génome a montré que l’ADN de toutes les souches était légèrement différent, comme prévu (tableau 1). Les séquences de protéines de base ont montré une différence maximale de 0,04 % (tableau 2). Bien que tous les génomes provisoires aient été incomplets, on peut supposer que >98% du génome de HE10JO30 a été séquencé. Cette estimation est basée sur le nombre de cadres de lecture ouverts incomplets. Les séquences protéiques partielles ont pu être facilement identifiées après l’annotation RAST de HE10DO et HE10JO. Dans HE10JO, 60 protéines sur environ 4 500 avaient une séquence N ou C-terminale manquante. Les séquences du génome se trouvent dans le supplément (dossier supplémentaire 3, fichier supplémentaire 4, fichier supplémentaire 5, fichier supplémentaire 6 et fichier supplémentaire 7).

Fait intéressant, des souches de la même espèce ont été isolées de deux îles, Helgoland et Giglio. La distance linéaire entre les deux îles est de 1 400 km. Il doit y avoir un lien entre les deux endroits, par exemple par des navires en mer ou, plus probablement, par des oiseaux migrateurs. De nombreuses espèces d’oiseaux peuvent être trouvées sur les deux îles, et beaucoup d’entre eux sont des oiseaux migrateurs. La diversité au sein des souches de P. lacuna d’une île était plus grande qu’entre les souches Helgoland et Giglio les plus proches (tableau 2). Cela indique un échange intense entre les deux endroits.

La transformation naturelle a été testée avec HE10DO comme souche principale et avec HE10JO. Le protocole actuel est plus simple que le protocole décrit précédemment12 en raison du nombre réduit d’étapes de lavage et du nombre réduit d’étapes de transfert après transformation. Cette nouvelle méthode est continuellement utilisée en laboratoire; ~15 transformations réussies ont été réalisées.

La cassette de résistance KanR était généralement intégrée dans le site homologue défini par les régions adjacentes, comme le montre la PCR à l’aide d’amorces internes et externes. Comme la plupart des cyanobactéries, P. lacuna est polyploïde. Il peut avoir plus de 100 chromosomes par cellule12. Un test PCR avec des amorces externes ~ 1 semaine après la transformation a généralement 2 bandes sur le gel d’électrophorèse, une avec la taille de la bande de type sauvage et une bande de migration plus lente qui indique l’insertion de la cassette de résistance (Figure 4). La double bande indique que seule une sous-fraction des chromosomes contient l’insertion. Après 4 semaines de sélection sur la kanamycine, la ségrégation est généralement complète et une seule grande bande PCR apparaît sur les gels. Cependant, dans le cas de la transformation avec pMH1 (voir ci-dessous), la ségrégation était complète après plus de 3 mois.

Les vecteurs pAK1, pAK2, pAK3 et pMH1 ont été construits pour des tests sur l’expression de sfGFP. Dans pAK1, pAK2 et pAK3, le gène sfGFP est sous le contrôle des promoteurs cpc560, A2813 et psbA2, respectivement. Ces promoteurs proviennent de Synechocystis sp. PCC 6803 ou Synechococcus sp. PCC 700231. Pour la construction de ces vecteurs, les séquences de promoteur et de terminateur sfGFP ont été prises à partir de vecteurs utilisés pour la transformation de Synechococcus sp. PCC 700231. Les séquences pertinentes ont été intégrées dans le site homologue chwA (sc_7_37) de pFN1 (ou pFN_7_37_KanR15). Le vecteur d’expression pMH1 a été construit par synthèse d’ADN en utilisant des séquences de lacunes de P. comme modèles (fichier supplémentaire 6). Les séquences cpcB-cpcA (phycocyanine ß et phycocyanine α) de P. lacuna sont disposées en série. Une région intergénique de 100 bp sépare les deux régions codantes. La séquence synthétique contenait cette séquence endogène cpcB-cpcA et le promoteur cpcB. La cassette sfGFP et KanR est placée à seulement 3' du codon d’arrêt cpcB (5' de cpcA). Toute la séquence synthétique avec promoteur cpcB, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' à 3') est clonée en pUC19. Une carte est illustrée à la figure 5. Plus de détails sur le clonage de pAK1, pAK2 et pAK3 et la séquence complète de pMH1 sont donnés dans le fichier supplémentaire 1.

Les 4 transformants (avec pAK1, pAK2, pAK3 et pMH1) ont exprimé la GFP ; tous les niveaux de fluorescence étaient supérieurs à la fluorescence de fond des filaments de type sauvage (figure 6). Les transformants pMH1 avec ségrégation incomplète ont révélé un signal GFP très variable entre les filaments. Le signal de fluorescence était réparti uniformément lorsque la ségrégation était terminée (figure 6E). Les signaux au microscope des transformants pAK1, pAK2 et pAK3 étaient similaires mais environ 5 fois plus faibles que ceux du pMH1 (Figure 6E).

La méthode de cryoconservation établie est basée sur une méthode qui a été établie pour E. coli. Lorsque 2 étapes de lavage ont été effectuées pour l’élimination du glycérol après décongélation, 15 des 15 échantillons de lacune de P. ont survécu (tableau 3). Ce protocole pourrait également être utilisé pour Synechocystis PCC 6803, mais seulement avec 2 étapes de lavage et non avec 1 (Tableau 3).

Une autre caractéristique des filaments Oscillatoriales est leur motilité : les filaments de P. lacuna se déplacent continuellement sur les surfaces (Figure 7) et dans un milieu liquide (Figure 8). Les deux types de mouvement peuvent être étudiés facilement dans des boîtes de Pétri sans ou avec un milieu de gélose. L’enregistrement en accéléré est nécessaire car le mouvement sur la gélose est lent. Les filaments se déplacent vers le cône de lumière si un faisceau lumineux vient d’en bas (Figure 3). Les effets de l’intensité lumineuse, de la longueur d’onde et du temps peuvent être facilement étudiés avec une configuration simple. Les photorécepteurs de cet effet ne sont pas encore clairs. Les candidats possibles peuvent être adressés avec des mutants knockout. Le mécanisme sous-jacent à la façon dont les filaments trouvent la lumière n’est pas clair non plus. Pour cette question, un système infrarouge est nécessaire pour enregistrer les filaments pendant leur mouvement de l’obscurité à la lumière.

Figure 1
Figure 1 : Souches de Phormidium lacunaires recueillies à Helgoland et Giglio. Les filaments sont multipliés pendant 11 jours sur une gélose f/2 dans des boîtes de Petri de 6 cm. A) la souche GI08AO; B) souche GI08IO; C) souche GI09CO; D) souche HE10DO; E) souche HE10JO; F) souche HE15M2G1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Filaments de lacune de phormidium 5 semaines après la transformation. Le vecteur d’expression sfGFP pMH1 a été utilisé ; la sélection s’est produite sur un milieu f/2+ avec 120 μg/mL de kanamycine. Les filaments verdâtres sont résistants et vivants; d’autres filaments sont morts. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Expérience de phototaxie. Gauche : Support LED avec 4 LED rouges, connecté à une alimentation réglable. Sur le dessus de chaque LED, il y a une boîte de Petri de 6 cm avec 8 mL d’une culture de lacune de Phormidium. A droite : Boîte de Petri avec P. lacuna après 2 jours sur la LED rouge (15 μmol m-2 s-1). Abréviation : LED = diode électroluminescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Intégration et ségrégation de l’insert après transformation de la lacune de Phormidium avec pAK1. PCR avec apprêts extérieurs. Les tailles attendues du produit sans et avec insert sont respectivement de 2371 et 5016 bp. Voie de gauche: marqueur, voies 1, 2, 3, 4: produits PCR de filaments 7 jours, 11 jours, 14 jours et 17 jours après l’isolement d’un filament résistant (4 semaines après la transformation), respectivement. Voie 5 : Produit PCR de type sauvage (à partir d’un gel différent). Dans l’échantillon de 7 jours, l’insert est présent dans une petite fraction des chromosomes. Cette fraction augmente jusqu’à 17 jours, où aucune bande de type sauvage n’est visible, c’est-à-dire que la ségrégation est complète. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Vecteur d’expression de sfGFP sous le contrôle d’un promoteur cpcB endogène. Orange : Séquence homologue de la lacune de Phormidium, violet/bleu : épine dorsale vectorielle pUC-19, vert : insert avec sfGFP et KanR. Abréviations: sfGFP = protéine fluorescente verte superfolder; KanR = résistance à la kanamycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Expression de la SFGFP dans la lacune de Phormidum. Images de fluorescence de P. lacuna filaments de type sauvage (A) et après transformation avec pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) et pMH1 (E). Dans pMH1, le gène sfGFP est placé 3' du gène phycocyanine ß et donc entraîné par le promoteur endogène cpcß ; dans les autres cas, sfGFP est piloté par les promoteurs cpc560, A2813 ou psbA2s de Synechocystis PCC 6803, respectivement. Les paramètres de fluorescence sont spécifiques pour GFP; toutes les images ont été enregistrées avec le même temps d’intégration et les mêmes paramètres optiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Image fusionnée de la lacune de Phormidium sur la surface de la gélose à un grossissement de 4x. La première image est présentée en rouge, la seconde (prise 1 min plus tard) en vert. Notez également les traces sur la gélose. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Image fusionnée de la lacune de Phormidium dans un milieu liquide. L’intervalle de temps entre les deux images était de 10 s. La première image est imprimée en rouge; la seconde est imprimée en vert. La comparaison des deux couleurs montre le mouvement dans les 10 s. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

filtrer HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Contigs 104 174 218 102 154
total pb 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tableau 1 : Souches de lacunes au phormidium .

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

Tableau 2. Différences d’acides aminés entre les souches dans des séquences de 20 protéines de base avec 10 876 acides aminés.

Densité cellulaire OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Lave 1 2 1 2 1 2 1 2
Synéchocystis PCC 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Lacune au phormidium HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tableau 3 : Essais de cryoconservation avec Synechocystis PCC 6803 et Phormidium lacuna HE10DO cyanobactéries. Le premier chiffre indique le nombre de cultures qui ont survécu après la congélation ou la décongélation; le deuxième chiffre indique le nombre total d’essais.

Vidéo supplémentaire S1: Mouvement des filaments de lacune de Phormidium en solution liquide, sans time-lapse. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire S2: Mouvement des filaments de lacune de Phormidium sur la surface de la gélose, avec time-lapse. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Fichier supplémentaire 1 : Clonage de vecteurs pour la transformation de la lacune de Phormidium. Liste des vecteurs de transformation; liste des amorces pour le clonage; séquence de pMH1 au format gb. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Scripts shell (sh) pour le mini-ordinateur Raspberry Pi. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Séquence d’ADN de HE152G1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4: Séquence d’ADN de GI08AO. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5 : Séquence d’ADN de GI09CO. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Séquence d’ADN de HE10DO. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 7 : Séquence d’ADN de HE10JO. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Bien que de nombreuses souches de cyanobactéries soient disponibles dans les collections de culture 32,33,34,35,36, il existe toujours une demande de nouvelles cyanobactéries de la nature car ces espèces sont adaptées à des propriétés spécifiques. P. lacuna a été prélevé dans des bassins rocheux et est adapté aux variations des concentrations de sel et de température30. Des souches de cette espèce ont été trouvées lors d’excursions en 2008, 2009 et 2010. Avec la procédure décrite ici, 5 souches de P. lacuna ont été isolées et 4 de ces souches étaient stériles. La souche P. lacuna HE10JO est contaminée de façon permanente par la bactérie Marivirga atlantica, une bactérie marine identifiée par séquençage de l’ARNr et du génome. Cette bactérie n’a pas pu être séparée de la cyanobactérie malgré l’application de la séparation mécanique, la croissance à différentes températures, les traitements avec des antibiotiques ou les traitements chimiques. Malgré la contamination, P. lacuna HE10JO peut être cultivé de la même manière que les autres souches. Lors d’excursions ultérieures, d’autres membres d’Oscillatoriales ont été trouvés, qui ne sont pas encore analysés en détail. P. lacuna n’a pas été retrouvé. On ne sait pas pourquoi P. lacuna a été isolé au cours des années suivantes et à deux endroits différents, mais n’a pas été retrouvé plus tard. Son abondance dépend certainement de conditions imprévisibles. La température, les concentrations de sel et les nutriments inorganiques ou organiques sont très variables dans les bassins rocheux. Par conséquent, la composition des espèces pourrait fluctuer au fil du temps de manière imprévisible.

La transformation naturelle est établie pour différentes cyanobactéries, principalement des espèces unicellulaires. La lacune filamenteuse de P. est la seule espèce de l’ordre des Oscillatoriales pour laquelle une transformation naturelle a été établie. La transformation a presque toujours été couronnée de succès avec le protocole actuel. En général, le nombre de filaments résistants après un essai de transformation varie considérablement et parfois la transformation échoue, ce qui entraîne une perte de temps précieux. Il est donc conseillé d’effectuer plusieurs projets de transformation en parallèle. Le temps de ségrégation complète, généralement 4 semaines après l’isolement de la souche résistante, peut également varier. Parce qu’il n’y a aucune garantie de ségrégation complète après la croissance sur la kanamycine, il est crucial d’effectuer les tests PCR en utilisant des amorces externes et internes.

Chaque vecteur doit contenir 2 séquences homologues de 500 à 1 000 pb, par exemple amplifiées de l’hôte par PCR et interrompues par une cassette à résistance (par exemple, la cassette de kanamycine KanR utilisée ici)37,38. Pour l’expression, un promoteur, une séquence de codage (par exemple, pour sfGFP39), un terminateur et une cassette de résistance doivent être clonés entre les séquences homologues. Les stratégies de clonage sont spécifiques à l’espèce et dépendent de l’objectif de l’expérience.

Cette méthode de transformation pourrait être possible avec d’autres souches d’Oscillatoriales ou d’autres cyanobactéries : la transformation naturelle est basée sur les pili de type IV, qui sont présents dans presque tous les autres génomes cyanobactériens 3,15,40. Par conséquent, la méthode actuelle pourrait stimuler de nouveaux essais avec d’autres espèces. Parce que les pili de type IV sont également pertinents pour la motilité, il est important de vérifier les conditions dans lesquelles les cyanobactéries sont mobiles.

L’insertion de gènes est basée sur la recombinaison homologue et entraîne une perturbation des sites homologues. Par conséquent, la transformation est souvent utilisée pour l’élimination des gènes. L’expression du gène inséré sera induite si un promoteur actif et une séquence codante sont intégrés dans le site homologue. Chez P. lacuna, l’activité du promoteur dépendait de l’espèce. Les promoteurs cpc560, A2813 et psbA2 de Synechocystis PCC sp 6803 ou Synechococcus sp. PCC 7002 31 et le promoteur cpcB de P. lacuna pourraient conduire l’expression de sfGFP . Parmi ces constructions, le promoteur endogène cpcB a induit l’expression la plus forte, bien que le gène sfGFP soit situé à 3' du gène phycocyanine ß. Cela indique une utilisation plus générale des promoteurs endogènes dans l’expression des cyanobactéries.

La combinaison de l’élimination des gènes et des études sur le mouvement permettra de mettre en lumière les mécanismes moléculaires de la motilité et de la phototaxie. Les sources de lumière LED peuvent fournir de la lumière pour des expériences de phototaxis. Presque toutes les longueurs d’onde sont disponibles, et l’intensité lumineuse peut être modulée par une alimentation réglable et des potentiomètres. Les supports LED peuvent être construits par des imprimantes 3D pour réaliser facilement des combinaisons de différentes LED.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Le travail a été soutenu par l’Institut de technologie de Karlsruher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

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References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

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Biologie numéro 180
Transformation naturelle, expression des protéines et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse <em>Phormidium lacune</em>
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Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

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