Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire

Summary

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technique d’imagerie puissante, non destructive et sans étiquette. Une application émergente est l’histologie Raman stimulée, où l’imagerie SRS bicolore aux transitions Raman protéique et lipidique est utilisée pour générer des images de pseudo-hématoxyline et d’éosine. Ici, nous démontrons un protocole pour l’imagerie SRS bicolore en temps réel pour le diagnostic tissulaire.

Abstract

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est devenue une puissante technique d’imagerie optique pour le diagnostic des tissus. Au cours des dernières années, il a été démontré que le SRS bicolore était capable de fournir des images équivalentes à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) qui permettent un diagnostic rapide et fiable du cancer du cerveau. Cette capacité a permis des applications passionnantes de diagnostic peropératoire du cancer. L’imagerie SRS bicolore des tissus peut être effectuée avec une source laser picoseconde ou femtoseconde. Les lasers femtosecondes ont l’avantage de permettre des modes d’imagerie flexibles, y compris l’imagerie hyperspectrale rapide et l’imagerie SRS bicolore en temps réel. Une approche de focalisation spectrale avec des impulsions laser gazouillées est généralement utilisée avec les lasers femtosecondes pour atteindre une résolution spectrale élevée.

L’acquisition SRS bicolore peut être réalisée avec modulation orthogonale et détection de verrouillage. La complexité du gazouillis, de la modulation et de la caractérisation des impulsions est un goulot d’étranglement pour l’adoption généralisée de cette méthode. Cet article fournit un protocole détaillé pour démontrer la mise en œuvre et l’optimisation du SRS à focalisation spectrale et de l’imagerie bicolore en temps réel du tissu cérébral de souris en mode épi. Ce protocole peut être utilisé pour un large éventail d’applications d’imagerie SRS qui tirent parti de la capacité d’imagerie spectroscopique et à haute vitesse de SRS.

Introduction

Les diagnostics tissulaires traditionnels reposent sur des protocoles de coloration suivis d’un examen au microscope optique. Une méthode de coloration courante utilisée par les pathologistes est la coloration H & E: l’hématoxyline colore les noyaux cellulaires d’un bleu violacé, et l’éosine tache la matrice extracellulaire et le cytoplasme en rose. Cette simple coloration reste la référence en pathologie pour de nombreuses tâches de diagnostic tissulaire, en particulier le diagnostic du cancer. Cependant, l’histopathologie H & E, en particulier la technique de sectionnement congelé utilisée dans un cadre peropératoire, a encore des limites. La procédure de coloration est un processus laborieux impliquant l’incorporation, le sectionnement, la fixation et la coloration des tissus¹. Le délai d’exécution typique est de 20 minutes ou plus. Effectuer des H & E pendant le sectionnement congelé peut parfois devenir plus difficile lorsque plusieurs sections sont traitées à la fois en raison de la nécessité d’évaluer les caractéristiques cellulaires ou les modèles de croissance en 3D pour l’évaluation des marges. De plus, les techniques histologiques peropératoires nécessitent des techniciens et des cliniciens qualifiés. La limitation du nombre de pathologistes certifiés par le conseil d’administration dans de nombreux hôpitaux est une contrainte pour la consultation peropératoire dans de nombreux cas. Ces limitations peuvent être atténuées avec les intérêts de développement rapide dans la pathologie numérique et le diagnostic basé sur l’intelligence artificielle². Cependant, les résultats de coloration H&E sont variables, en fonction de l’expérience du technicien, ce qui présente des défis supplémentaires pour le diagnostic informatisé².

Ces défis peuvent potentiellement être relevés avec des techniques d’imagerie optique sans étiquette. L’une de ces techniques est la microscopie SRS. SRS utilise des lasers pulsés synchronisés – pompe et Stokes – pour exciter les vibrations moléculaires avec un rendement élevé³. Des rapports récents ont démontré que l’imagerie SRS des protéines et des lipides peut générer des images équivalentes H & E (également connues sous le nom d’histologie Raman stimulée ou SRH) avec des tissus frais intacts, ce qui contourne la nécessité de tout traitement tissulaire, raccourcit considérablement le temps nécessaire au diagnostic et a été adapté en peropératoire⁴. De plus, l’imagerie SRS peut fournir des images 3D, ce qui offre des informations supplémentaires pour le diagnostic lorsque les images 2D sont insuffisantes⁵. La SSR est impartiale et génère des images numériques qui sont facilement disponibles pour le diagnostic informatisé. Il apparaît rapidement comme une solution possible pour le diagnostic peropératoire du cancer et l’analyse de la marge tumorale, en particulier dans le cancer du cerveau ^6,7,8. Plus récemment, l’imagerie SRS des changements chimiques des tissus a également été suggérée pour fournir des informations diagnostiques utiles qui peuvent aider davantage les cliniciens à stratifier différents types de cancer ou^{stades 9}.

Malgré son énorme potentiel dans les applications de diagnostic tissulaire, l’imagerie SRS est principalement limitée aux laboratoires universitaires spécialisés en optique en raison de la complexité associée à la plate-forme d’imagerie, qui comprend des lasers ultrarapides, le microscope à balayage laser et une électronique de détection sophistiquée. Ce protocole fournit un flux de travail détaillé pour démontrer l’utilisation d’une source laser femtoseconde commune pour l’imagerie SRS bicolore en temps réel et la génération d’images pseudo-H & E à partir de tissus cérébraux de souris. Le protocole couvrira les procédures suivantes :

Optimisation de l’alignement et du gazouillis
La plupart des schémas d’imagerie SRS utilisent des lasers picosecondes ou femtosecondes comme source d’excitation. Avec les lasers femtosecondes, la bande passante du laser est beaucoup plus grande que la largeur de ligne Raman. Pour surmonter cette limitation, une approche de focalisation spectrale est utilisée pour gazouiller les lasers femtosecondes à une échelle de temps picoseconde afin d’obtenir une résolution spectrale étroite^{de 10}. La résolution spectrale optimale n’est obtenue que lorsque le gazouillis temporel (également connu sous le nom de dispersion de retard de groupe ou simplement dispersion) est correctement adapté à la pompe et aux lasers Stokes. La procédure d’alignement et les étapes nécessaires pour optimiser la dispersion des faisceaux laser à l’aide de tiges de verre hautement dispersives sont démontrées ici.

Étalonnage de fréquence
Un avantage de la focalisation spectrale SRS est que l’excitation Raman peut être rapidement réglée en modifiant le délai entre la pompe et les lasers Stokes. Un tel réglage permet une imagerie rapide et une acquisition spectrale fiable par rapport au réglage des longueurs d’onde laser. Cependant, la relation linéaire entre la fréquence d’excitation et le délai nécessite un étalonnage externe. Des solvants organiques avec des pics Raman connus sont utilisés pour calibrer la fréquence Raman pour la focalisation spectrale SRS.

Imagerie bicolore en temps réel
Il est important d’augmenter la vitesse d’imagerie dans les applications de diagnostic tissulaire afin de raccourcir le temps nécessaire à l’analyse des échantillons de tissus volumineux. L’imagerie SRS bicolore simultanée des lipides et des protéines évite d’avoir à régler le laser ou le délai, ce qui augmente la vitesse d’imagerie de plus de deux fois. Ceci est réalisé en utilisant une nouvelle technique de modulation orthogonale et une démodulation à double canal avec un amplificateur de verrouillage¹¹. Cet article décrit le protocole de modulation orthogonale et d’acquisition d’images à double canal.

Imagerie SRS en mode épi
La majorité des images SRS montrées à ce jour sont effectuées en mode de transmission. L’imagerie en mode épi détecte les photons rétrodiffusés du tissu¹². Pour les applications de pathologie, les échantillons chirurgicaux peuvent être assez grands. Pour l’imagerie en mode de transmission, le sectionnement des tissus est souvent nécessaire, ce qui nécessite trop de temps. En revanche, l’imagerie en mode épi peut fonctionner avec des échantillons chirurgicaux intacts. Étant donné que le même objectif est utilisé pour collecter la lumière rétrodiffusée, il n’est pas non plus nécessaire d’aligner un condensateur à grande ouverture numérique requis pour l’imagerie de transmission. Le mode épi est également la seule option lorsque la section des tissus est difficile, comme avec les os. Auparavant, nous avons démontré que pour les tissus cérébraux, l’imagerie en mode épi offre une qualité d’imagerie supérieure pour l’épaisseur des tissus > 2 mm¹³. Ce protocole utilise un séparateur de faisceau polarisant (PBS) pour collecter les photons diffusés dépolarisés par les tissus. Il est possible de collecter plus de photons avec un détecteur annulaire au détriment de la complexité de l’assemblage personnalisé du détecteur¹². L’approche PBS est plus simple à mettre en œuvre (similaire à la fluorescence), la photodiode standard étant déjà utilisée pour la détection du mode de transmission.

Génération d’images Pseudo-H&E
Une fois les images SRS bicolores collectées, elles peuvent être recolorées pour simuler la coloration H&E. Cet article démontre la procédure de conversion des images SRS lipidiques et protéiques en images SRS pseudo-H&E pour des applications de pathologie. Le protocole expérimental détaille les étapes critiques nécessaires pour générer des images SRS de haute qualité. La procédure présentée ici n’est pas seulement applicable au diagnostic tissulaire, mais peut également être adaptée à de nombreuses autres applications d’imagerie SRS hyperspectrale telles que l’imagerie médicamenteuse et l’imagerie métabolique^14,15.

Configuration système générale requise
Le système laser pour ce protocole doit être capable de produire 2 faisceaux laser femtosecondes synchronisés. Les systèmes sont idéalement dotés d’un oscillateur paramétrique optique (OPO) pour le réglage de la longueur d’onde de l’un des faisceaux laser. La configuration de ce protocole utilise un système laser commercial Insight DS+ qui produit deux lasers (un faisceau fixe à 1 040 nm et un faisceau accordable basé sur OPO, allant de 680 à 1 300 nm) avec un taux de répétition de 80 MHz. Les microscopes à balayage laser, qu’ils proviennent de grands fabricants de microscopes ou fabriqués à la maison, peuvent être utilisés pour l’imagerie SRS. Le microscope utilisé est un microscope à balayage laser vertical construit sur un cadre de microscope vertical commercial. Une paire de miroirs galvo de 5 mm est utilisée pour scanner le faisceau laser. Pour les utilisateurs qui choisissent d’adopter un microscope à balayage laser maison, reportez-vous à un protocole publié précédemment pour la construction d’un microscope à balayage laser¹⁶.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été menées avec des cerveaux de souris fixes et sectionnés de 200 μm, conformément au protocole (# 4395-01) approuvé par l’Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Washington. Les souris de type sauvage (souche C57BL/6J) sont euthanasiées au CO₂. Ensuite, une craniotomie est effectuée pour extraire leur cerveau pour la fixation dans 4% de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate. Les cerveaux sont incorporés dans un mélange d’agarose à 3% et de gélatine à 0,3% et sectionnés en tranches de 200 μm d’épaisseur par un vibratome.

1. Alignement initial

REMARQUE: Assurez-vous que la taille du faisceau et la divergence des deux bras sont adaptées pour une sensibilité et une résolution optimales. Collotez la pompe et les faisceaux Stokes et ajustez leurs tailles avant qu’ils n’entrent dans le microscope à balayage laser. Pour ce faire, utilisez une paire de lentilles achromatiques pour chaque faisceau avant de les combiner sur le miroir dichroïque. Portez toujours des lunettes laser appropriées pour l’alignement du faisceau.

1. Collimation de faisceau
   1. Installez une paire de lentilles achromatiques pour le faisceau de la pompe. Comme point de départ, utilisez un objectif de 100 mm et un objectif de 200 mm pour agrandir la taille du faisceau laser de 2 fois. Assurez-vous que la distance des deux objectifs est d’environ 300 mm. Alignez le faisceau de la pompe à travers le centre des deux lentilles.
   2. Placez un miroir après la deuxième lentille pour envoyer le faisceau vers un mur (>1 m). Faites attention lorsque vous envoyez le faisceau sur de longues distances. Tracez le faisceau du miroir au mur avec une carte IR et vérifiez si le faisceau change de taille. Collotez le faisceau si le faisceau change de taille en fonction de la distance.
      1. Si le faisceau converge (diminution de la taille avec la propagation), rapprochez les deux lentilles.
      2. Si le faisceau diverge (augmentant la taille avec la propagation), éloignez les deux lentilles. Ajustez la distance jusqu’à ce que le faisceau soit collimé.
   3. Répétez les étapes 1.1.1 et 1.1.2 pour que le faisceau de Stokes puisse le coller.
2. Réglage de la taille du faisceau
   1. Si un profileur de faisceau est disponible, mesurez la taille du faisceau collimé pour chaque faisceau. Vous pouvez également estimer la taille du faisceau à l’aide de la carte IR et d’une règle pour obtenir un diamètre de faisceau de 4 à 5 mm.
   2. Si la taille du faisceau est trop petite ou trop grande, modifiez la paire d’objectifs utilisée à l’étape 1.1. Ajustez la paire d’objectifs jusqu’à ce que les deux faisceaux aient un diamètre de 4 à 5 mm.
      REMARQUE: Le grossissement du faisceau est le rapport entre la distance focale du deuxième objectif et le premier objectif (f₂/ f₁).
3. Chevauchement spatial
   REMARQUE: L’imagerie SRS nécessite que les deux faisceaux laser soient combinés dans l’espace et le temps pour exciter les vibrations moléculaires. Un schéma de l’imagerie SRS à focalisation spectrale est illustré à la figure 1.
   1. Combinez les deux faisceaux laser en installant un miroir dichroïque avec plusieurs rétroviseurs de direction pour le réglage. Optimisez le chevauchement spatial de la pompe et de Stokes en surveillant les faisceaux après le miroir dichroïque à deux positions différentes éloignées l’une de l’autre (~1 m). Ajustez de manière itérative le rétroviseur avant le miroir dichroïque et le miroir dichroïque pour aligner le faisceau de Stokes avec le faisceau de la pompe.
      REMARQUE: Si les deux poutres se chevauchent spatialement aux deux positions, elles se chevauchent suffisamment.
   2. Assurez-vous que les faisceaux combinés sont envoyés au centre des miroirs de balayage du microscope à balayage laser en ajustant une paire de miroirs de direction lorsque les miroirs de balayage sont en position stationnée. Assurez-vous que les deux faisceaux traversent le centre de l’objectif du microscope et le condenseur.
   3. Après le condenseur, utilisez une autre paire d’objectifs avec des distances focales de 100 mm et 30 mm, respectivement, pour relayer le faisceau transmis sur la photodiode. Assurez-vous que les deux faisceaux sont contenus dans la photodiode et installez deux filtres passe-bas pour bloquer le faisceau Stokes modulé.

2. Détection du signal SRS

1. Modulation électrooptique (EOM)
   REMARQUE: La MOE de 20 MHz est utilisée pour moduler l’amplitude de Stokes. Comme nous l’avons vu plus loin, la MOE est dérivée du train d’impulsions laser de 80 MHz, qui est nécessaire pour la modulation orthogonale. D’autres fréquences de modulation peuvent être utilisées si seul un SRS monocolore ou hyperspectral est effectué. Dans ce cas, la synchronisation de la fréquence de modulation à la fréquence laser n’est pas nécessaire. Un générateur de fréquence avec un amplificateur de puissance RF peut être utilisé pour piloter la moe. Par conséquent, les étapes 2.1.1 à 2.1.4 peuvent être ignorées.
   1. Placez un échantillonneur de faisceau dans la trajectoire du faisceau de Stokes pour capter 10% du faisceau et l’envoyer à une photodiode rapide pour détecter le train d’impulsions de 80 MHz.
      REMARQUE: Le signal de photodiode est envoyé à un diviseur de fréquence pour générer une sortie TTL de 20 MHz. Cette sortie est ensuite envoyée dans un tampon de sortie pour répliquer la sortie en quatre sorties identiques de 20 MHz. L’une des sorties est utilisée pour déclencher l’oscilloscope.
   2. Prenez l’une des sorties du tampon de sortie et filtrez-la avec un filtre passe-bande pour obtenir une onde sinusoïdale de 20 MHz. Utilisez un atténuateur RF pour ajuster la tension de crête à crête de sortie à ~500 mV.
   3. Envoyez la sortie résultante à un déphaseur, ce qui permet un réglage fin de la phase RF avec une source de tension. Envoyez cette sortie à un amplificateur de puissance RF et connectez la sortie de l’amplificateur à la moe électronique.
   4. Débloquez le faisceau de Stokes et optimisez la profondeur de modulation de l’EOM1 en plaçant une photodiode dans le trajet du faisceau. Ajustez la tension de la MOE et la plaque quart d’onde jusqu’à ce que la profondeur de modulation (rapport vallée/crête) apparaisse satisfaisante.
      REMARQUE: À une modulation de 20 MHz (1/4 du taux de répétition laser), deux impulsions sont attendues toutes les 50 ns.
2. Chevauchement temporel
   REMARQUE: Le chevauchement temporel de la pompe et de Stokes est obtenu en retardant l’un des deux trains d’impulsions laser avec un catadioptre monté sur un étage de retard (la figure 1 montre le Stokes en retard). Le chevauchement grossier est surveillé avec l’oscilloscope et le chevauchement fin est surveillé par le signal SRS. Un chevauchement temporel fin peut également être obtenu avec un autocorrélateur si disponible.
   1. Placez une photodiode après le miroir dichroïque pour détecter le faisceau laser. Bloquez d’abord le faisceau de Stokes. Zoomez sur l’un des pics d’impulsion de la pompe sur l’oscilloscope. Placez un curseur vertical pour marquer la position temporelle de ce pic avec l’oscilloscope.
   2. Bloquez le faisceau de la pompe et débloquez le faisceau de Stokes. Traduisez l’étage de retard pour faire correspondre temporellement la position de crête sur l’oscilloscope à la position marquée à l’étape précédente. Voir la figure 2 pour un affichage du chevauchement temporel de deux faisceaux.
      1. (FACULTATIF) Si la translation de l’étage de retard est insuffisante pour faire correspondre temporellement les deux faisceaux, déplacez l’étage de retard au milieu de sa plage de mouvement.
      2. Calculez la distance de retard requise pour faire correspondre les deux faisceaux en prenant la différence temporelle entre les deux faisceaux et en multipliant la différence par la vitesse de la lumière pour trouver la distance nécessaire pour faire correspondre les deux faisceaux temporellement.
      3. Allongez la trajectoire de faisceau du faisceau le plus rapide ou raccourcissez le trajet du faisceau le plus lent pour correspondre à peu près au délai temporel en conséquence.
   3. Préparez un échantillon de lame de microscope avec du DMSO et du ruban adhésif double face comme espaceur pour maintenir l’échantillon entre la lame et un couvercle.
   4. Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté du couvercle face à l’objectif du microscope. Changez le microscope en éclairage en champ lumineux et observez l’échantillon de l’oculaire. Trouvez le foyer de l’échantillon en trouvant d’abord le foyer à la fois sur la couche supérieure et inférieure de bulles d’air à l’interface verre-ruban, puis déplacez le focus pour qu’il se trouve entre les deux couches de ruban.
      REMARQUE: Assurez-vous que les faisceaux laser sont bloqués avant de regarder dans l’oculaire.
   5. Réglez la sortie du faisceau accordable sur 798 nm. En fonction du débit optique du condenseur, ajustez la puissance optique à environ 40 mW chacune pour la pompe et les faisceaux de Stokes au foyer de l’objectif.
   6. Ouvrez ScanImage dans MATLAB (ou un autre logiciel de numérisation qui contrôle le microscope) et cliquez sur le bouton INTITULÉ FOCUS pour lancer la numérisation.
      REMARQUE: Les faisceaux laser seront scannés par raster à travers l’échantillon pour générer une image. La sortie du signal basse fréquence de la photodiode (<100 kHz) est directement envoyée dans le canal 1 de la carte d’acquisition de données (appelé canal CC). La sortie haute fréquence (>100 kHz) de la photodiode est envoyée dans l’amplificateur de verrouillage et la sortie X du signal de l’amplificateur de verrouillage est envoyée dans le canal 2 de la carte d’acquisition de données (appelé canal CA).
   7. Réglez le rétroviseur avant le scanner galvo pour centrer le signal CC sur l’écran du canal 1. Déplacez l’étage de retard motorisé et observez de près la sortie de verrouillage affichée sur l’écran du canal 2 (c’est-à-dire le canal CA).
      REMARQUE: Lorsque la pompe et Stokes coïncident dans le temps, un signal apparaîtra sur le canal CA. Il est utile d’ajuster l’échelle de couleurs du canal CA pour afficher le petit changement d’intensité.
   8. Maximisez l’intensité du signal CA en ajustant finement le délai. Ajustez le miroir dichroïque pour centrer le signal SRS sur le canal CA (tout en gardant le canal CC centré). Ajustez la phase de l’amplificateur de verrouillage pour maximiser le signal. Voir la figure 3 pour un signal satisfaisant.

3. Optimisation de la résolution spectrale

REMARQUE: La pompe et les faisceaux de Stokes atteignant l’échantillon doivent avoir la même quantité de dispersion de retard de groupe (GDD) pour maximiser la résolution spectrale. La dispersion dépend fortement de la configuration expérimentale. La configuration expérimentale décrite ici utilise des impulsions femtosecondes à 1 040 nm et 800 nm comme Stokes et pompe, respectivement. Les tiges de verre silex denses (H-ZF52A) sont utilisées comme milieu d’étirement par impulsions.

1. Insérez 48 cm d’une tige de verre hautement dispersive (H-ZF52A ou verre à silex dense équivalent) dans le trajet du faisceau de 800 nm. Estimez le GDD à l’aide de Eq (1) :
   (1)
   REMARQUE: GVD de divers matériaux de verre à différentes longueurs d’onde peut être trouvé à partir de la ressource de la base de données d’indice de réfraction. Par exemple, H-ZF52A a un GVD de 220,40 fs²/mm à 800 nm. Le GDD total est de 105792 fs².
2. Calculez combien de cm de tige de verre dispersif doit ajouter à la trajectoire du faisceau de 1 040 nm pour correspondre au GDD de la pompe. Insérez la longueur appropriée des tiges de verre dispersives dans la trajectoire du faisceau de 1 040 nm pour correspondre à peu près au GDD du faisceau de 800 nm. Notez que l’ajout de tiges de verre modifiera le chevauchement temporel des deux poutres et qu’un ajustement du délai peut être nécessaire.
3. Étalonnage de la résolution spectrale
   1. Créez un échantillon de lame de microscope avec du DMSO. Placez la lame sur le microscope et vérifiez la puissance des faisceaux sortant du condensateur du microscope. Ajustez la puissance en conséquence pour avoir ~ 40 mW chacun au foyer de l’échantillon.
   2. Ouvrez ScanImage à partir de MATLAB. Trouvez le signal SRS maximal en balayant à travers l’étage de retard, ce qui correspond au pic Raman de 2 913 ^cm-1 du DMSO. Estimer la position de l’étage en fonction de la position de l’étage précédent avec la longueur de chemin optique accrue due à l’insertion de tiges. Réaligner le chevauchement spatial du faisceau en raison de la petite déviation du faisceau lorsque des tiges de verre sont ajoutées.
   3. Enregistrez un scan SRS hyperspectral en prenant séquentiellement une série d’images SRS tout en déplaçant la scène motorisée.
      REMARQUE: La plage de balayage de retard couvre deux pics Raman, correspondant aux pics Raman de 2 ^{913 cm-1} et 2 994 ^cm-1 de DMSO, respectivement. Ces deux transitions sont observées lors de l’utilisation d’une pompe de 800 nm et d’un laser Stokes de 1 040 nm.
   4. Tracez les spectres SRS de la solution DMSO à l’aide d’ImageJ ou de MATLAB. Ajuster le grand pic DMSO 2 913 ^cm-1 à une fonction gaussienne ou lorentzienne dans MATLAB pour calculer la pleine largeur à la moitié maximale (FWHM) du pic.
      REMARQUE : Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 4. Si un seul pic large est présent, cela signifie soit que la résolution spectrale est trop faible pour distinguer les deux pics et que plus de tiges de verre sont nécessaires, soit que la plage scannée était trop petite pour détecter le deuxième pic. En règle générale, une résolution spectrale acceptable DMSO est d’environ 20-25 ^cm-1 lorsque des tiges de verre d’une longueur de >60 cm sont utilisées. Une résolution plus faible est souvent utilisée pour l’imagerie tissulaire afin d’échanger des signaux plus élevés avec des impulsions plus courtes¹⁷.
4. (FACULTATIF) Utilisez un autocorrélateur ou un FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) pour déterminer la durée d’impulsion de chaque bras afin de calculer exactement la quantité de GDD et la longueur des tiges nécessaires pour correspondre au GDD entre la pompe et le Stokes.
5. Répétez les étapes 3.3.2-3.3.4 pour différentes longueurs de tiges sur le faisceau de Stokes pour trouver la résolution spectrale optimale, ce qui signifie que la meilleure correspondance GDD a été trouvée expérimentalement. Utilisez plusieurs ensembles de tiges de verre de longueur différente pour obtenir une résolution spectrale optimale.

4. Caractérisation du signal au bruit (SNR)

1. Assurez-vous que l’étape 4.2 est effectuée après un alignement spatial et temporel complet.
2. Acquérir une image SRS correspondant au pic Raman de 2 913 ^cm-1 du DMSO. Ouvrez l’image dans ImageJ et sélectionnez une petite zone au centre du cadre. Utilisez la fonction de mesure pour calculer la moyenne et l’écart-type des valeurs dans la zone sélectionnée.
3. Divisez la valeur moyenne de la zone sélectionnée par l’écart-type pour trouver la valeur SNR, comme dans Eq (2).
   (2)
   REMARQUE: Un bon SNR pour le système (avec une constante de temps de verrouillage de 4 μs) utilisant du DMSO à 40 mw / 40 mw au foyer pour les deux bras est >800. Des concentrations plus faibles de DMSO ou une puissance inférieure peuvent être utilisées pour une estimation plus précise du SNR si la carte d’acquisition de données a une profondeur de bits limitée.
4. Si le SNR est trop faible, réalignez les impulsions laser pour optimiser le chevauchement spatial, le chevauchement temporel, la correspondance taille/collimation du faisceau et/ou la correspondance de dispersion. Pour un objectif avec un collier de correction d’aberration, optimisez le signal en ajustant le collier de correction.

5. Étalonnage de l’axe de fréquence

REMARQUE: Cette étape est effectuée pour relier la position de l’étape de retard à la transition Raman numérisée. Une sélection minutieuse des solvants est nécessaire pour générer une « règle Raman » appropriée. Le DMSO est un solvant efficace pour les liaisons CH car il a deux pics Raman aigus à 2 913 ^cm-1 et 2 994 ^cm-1.

1. Enregistrez un balayage hyperspectral avec la plage d’étages de retard couvrant les pics Raman de 2 ^{913 cm-1} et 2 994 ^cm-1 du DMSO. Enregistrez les positions de scène correspondant au jeu de données hyperspectral.
   REMARQUE: Le pic maximal global du spectre correspond au décalage Raman DMSO 2 913 ^cm-1 et le deuxième pic maximal correspond au décalage Raman DMSO 2 994 ^cm-1 .
2. Effectuer une régression linéaire pour les positions des étages et les décalages Raman à 2 913 ^cm-1 et 2 994 ^cm-1. À l’aide de l’équation de régression linéaire reliant la position de l’étage au décalage Raman, convertissez les positions de retard en fréquences Raman correspondantes.

6. Modulation orthogonale et imagerie bicolore

REMARQUE: L’étape de modulation orthogonale n’est nécessaire que lorsque l’imagerie bicolore en temps réel est nécessaire. Un schéma de ce schéma est illustré à la figure 5. La modulation orthogonale utilise une paire d’EOM entraînés à un quart de la fréquence laser (20 MHz pour le laser 80 MHz) avec un déphasage de 90° entre les deux. Cette étape de modulation orthogonale peut être ignorée pour l’imagerie SRS monochrome ou l’imagerie SRS hyperspectrale.

1. Modulation EOM1
   1. Installez un PBS (PBS2), une plaque quart d’onde (QWP2) et une deuxième MOE (EOM2) dans le chemin de faisceau de Stokes après la première MOE. Débranchez l’entrée du signal dans EOM2. Branchez l’entrée du signal sur EOM1 et allumez-la.
   2. Moduler le faisceau de Stokes (fixé à 1 040 nm) à 20 MHz (f₀/4) en envoyant le faisceau à travers la première MOE. Ajustez l’inclinaison et la position de l’EOM1 pour vous assurer que le faisceau frappe droit et centré à travers le cristal EOM.
   3. Surveillez la profondeur de modulation en observant les deux polarisations sortant de PBS1 avec deux photodiodes et en affichant la modulation sur un oscilloscope.
   4. Ajustez la tension QWP1, EOM1 et la phase de l’entrée 20 MHz (à l’aide d’un déphaseur) pour optimiser la profondeur de modulation du faisceau transmis à près de 100%. Voir la figure 2B pour une illustration de la bonne profondeur de modulation.
2. Modulation EOM2
   1. Débranchez EOM1 et branchez EOM2.
   2. Envoyer la sortie haute tension du deuxième amplificateur à 20 MHz à EOM2. Ajustez l’inclinaison et la position de l’EOM2 pour vous assurer que le faisceau frappe droit et centré à travers le cristal EOM.
   3. Encore une fois, surveillez la profondeur de modulation en regardant les deux polarisations sortant de PBS2 avec un oscilloscope. Ajustez la tension QWP2, EOM2 et le déphaseur selon vos besoins pour obtenir une modulation proche de 100 % pour les deux polarisations.
   4. Assurez-vous que la modulation du train d’impulsions a un déphasage de 90° par rapport à la première modulation.
      REMARQUE: Si les deux trains d’impulsions de la pompe ne sont pas orthogonaux à 90 °, la diaphonie entre les deux canaux sera un problème.
   5. Testez l’orthogonalité de la modulation en allumant et en branchant à la fois EOM1 et EOM2. Surveillez les deux polarisations divisées par PBS2 avec un oscilloscope. Réoptimisez EOM1 et EOM2 individuellement si le train d’impulsions après le deuxième PBS ne ressemble pas à la figure 2C.
   6. Installez un cristal de quartz biréfringent (BRC) de 20 mm et un HWP en aval de l’EOM2. Branchez les deux EOM à la fois et surveillez le train d’impulsions de manière à ce qu’il ressemble à la Figure 2D.
      REMARQUE: Pour le gazouillis utilisé dans cette expérience, un BRC de 20 mm induit un délai qui correspond à un décalage Raman de 80 ^cm-1 . Une longueur de BRC différente peut être nécessaire si un gazouillis différent est utilisé.
3. Étalonnage
   1. Calibrez le système à l’aide de DMSO en détectant les signaux de la sortie des canaux X et Y de l’amplificateur de verrouillage (envoyés aux canaux 2 et 3 de la carte d’acquisition de données).
   2. Vérifiez si les signaux générés par le pic de 2 913 ^cm-1 de la polarisation plus rapide et ceux de la polarisation plus lente sont déphasés à près de 90° sur l’amplificateur de verrouillage. Si ce n’est pas le cas, ajustez l’alignement de la MOE jusqu’à ce que les deux signaux soient déphasés à près de 90°.
   3. Une fois l’étalonnage terminé, trouvez la position de retard qui sonde la transition protéique à 2 930 ^cm-1 pour l’un des faisceaux orthogonaux. Assurez-vous que l’autre polarisation sonde la transition lipidique de 2 850 ^cm-1.

7. Imagerie SRS en mode épi

REMARQUE: Dans le schéma d’imagerie en mode de transmission, l’objectif concentre le laser dans l’échantillon, puis une lentille de condensateur dirige le faisceau transmis vers une photodiode pour la détection de verrouillage. Dans le schéma d’imagerie en mode épi, la lumière rétrodiffusée et dépolarisée par l’échantillon est recueillie par l’objectif de focalisation et isolée à l’aide d’un séparateur de faisceau polarisant. Les photons isolés et rétrodiffusés sont envoyés à une photodiode à travers une paire de lentilles relais pour la détection de verrouillage. La figure 6 illustre le schéma d’imagerie en mode épi.

1. Installez un HWP avant que le faisceau n’entre dans le microscope pour modifier la polarisation du faisceau entrant dans le microscope. Placez un PBS au-dessus de l’objectif pour permettre au faisceau rétroréfléchissant dépolarisé d’atteindre le détecteur.
2. Utilisez une paire de lentilles composée d’une lentille achromate de 75 mm et d’une lentille asphérique de 30 mm pour relayer les photons rétrodiffusés de l’ouverture arrière de l’objectif au photodétecteur. Montez le détecteur pour recueillir la lumière rétrodiffusée dirigée par le PBS. Installez un filtre pour empêcher le faisceau modulé d’entrer dans le détecteur.
3. Placer l’échantillon de tissu sous l’objectif. Comme le condenseur n’est pas nécessaire pour l’imagerie en mode épi, retirez-le si plus d’espace est nécessaire.
4. Imagerie
   1. Bloquez le faisceau avec un obturateur; faire briller une source de lumière blanche sur l’échantillon de côté; et utiliser le champ lumineux pour trouver une concentration objective.
   2. Débloquez les deux faisceaux et utilisez les positions de retard préétalonnées pour acquérir des images SRS lipidiques et protéiques à partir de tissus à partir des deux sorties de l’amplificateur de verrouillage.
   3. Ajustez le gain de verrouillage et le facteur de bac de pixels pour acquérir des images de bonne qualité.

8. Coloration aux fausses couleurs

1. Ouvrez la pile d’images avec ImageJ.
2. Retirez les deux images qui correspondent aux espèces lipidique (2 850 ^cm-1) et protéique (2 930 ^cm-1) en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image et en cliquant sur Dupliquer.
3. Renommez l’image lipidique en lipides et l’image protéique en protéines.
4. Aller à processus | La calculatrice d’images et les protéines effectuées soustraient les lipides.
5. Combinez les images en accédant à Image | | de couleur Fusionner les canaux, en mettant les lipides au vert et les protéines au bleu. Ouvrez l’outil Couches d’image (Image | | de couleur Canaux) et ajustez la luminosité et le contraste (Image | Ajuster | Luminosité/Contraste).
6. Ajustez la luminosité et le contraste de chaque couche à l’aide de l’outil Couches . Pour le canal lipidique, ajustez le contraste jusqu’à ce que les caractéristiques cellulaires apparaissent sombres. Pour le canal protéique, ajustez le contraste jusqu’à ce que les caractéristiques cellulaires apparaissent bleues. Convertissez l’image verte/bleue du canal fusionné en image RVB en accédant à Image | Type | Couleur RVB. Exporter cette image par fichier | Enregistrer sous | Tiff.
   REMARQUE: Pour les fausses colorations H & E, la palette de couleurs montre un cytoplasme rose, tandis que les noyaux sont bleu-violet foncé.
7. Téléchargez le script HE.m MATLAB à partir de la fausse ressource de script de coloration H&E dans la table des matériaux.
8. Exécutez le script HE.m dans MATLAB. Sélectionnez l’image RVB exportée de l’étape précédente pour générer une image colorée artificiellement H&E.
9. (FACULTATIF) Normalisez l’intensité de l’image pour l’imagerie à grand champ de vision, car l’image apparaît plus sombre à la périphérie qu’au centre.
   1. Pour effectuer la normalisation de champ des images, faites la moyenne du plus grand nombre d’images possible. Ensuite, supprimez les fonctions d’intensité avec ImageJ (Process | Filtres | Flou gaussien | Rayon = 50).
   2. Mesurez l’intensité maximale de l’image floue (Ctrl+M). Divisez l’image floue par l’intensité maximale (Process | | mathématiques Diviser). Divisez l’image SRS brute par l’image floue (Process | | de l’image Calculatrice).

Representative Results

Optimisation de la résolution spectrale :
La dispersion à travers un matériau est affectée par le milieu dispersif (longueur et matériau) et la longueur d’onde. La modification de la longueur de la tige de dispersion affecte la résolution spectrale et la taille du signal. Il s’agit d’une relation donnant-donnant qui peut être pesée différemment selon l’application. Les tiges étirent l’impulsion du faisceau d’être large en fréquence et étroite dans le temps à être étroite en fréquence et large dans le temps. La figure 7 montre l’effet de la variation des longueurs de tige sur la résolution spectrale. La figure 7A montre une très mauvaise résolution spectrale; cette configuration n’a pas de tiges de gazouillis en verre, et les deux pics Raman de DMSO ne sont pas résolus du tout. Dans la figure 7B, C, une augmentation du nombre de tiges de gazouillis en verre commence à résoudre les deux pics. Enfin, la figure 7D montre comment le gazouillis apparié résout les deux pics et peut être utilisé pour calibrer les positions des étages en fonction de la fréquence.

Étalonnage avec DMSO :
Le DMSO a deux pics Raman nets à 2 913 et 2 994 ^cm-1 qui sont pratiques pour l’étalonnage dans la région C-H. Une fois qu’un spectre DMSO est obtenu à partir d’un balayage SRS hyperspectral, une simple régression linéaire convertit la position de l’étage en décalage Raman. Si la résolution spectrale est faible (comme le montre la figure 7A) et que les deux pics ne sont pas séparables, l’étalonnage avec régression linéaire est impossible. Dans ce cas, une meilleure correspondance de dispersion est nécessaire en ajoutant ou en retirant des tiges de verre. Les difficultés les plus courantes pour trouver un signal DMSO pour l’étalonnage sont dues à des erreurs de chevauchement temporel ou de chevauchement spatial des deux faisceaux. Avant de tenter l’étalonnage DMSO, répétez les étapes d’alignement spatial et temporel pour optimiser le signal SRS.

DMSO bicolore :
Dans le SRS bicolore, deux trains d’impulsions de pompe sont générés avec une polarisation orthogonale avec un délai fixe (dû à un cristal biréfringent). L’évaluation de la profondeur de modulation et du déphasage à 90° se fait avec une photodiode suivie d’un signal DMSO SRS. La figure 8 montre une profondeur de modulation et une séparation temporelle acceptables. Bien que la résolution spectrale du DMSO dans la figure 8 ne soit pas idéale, elle est souvent sacrifiée dans les expériences d’imagerie tissulaire pour obtenir un signal plus élevé avec des impulsions plus courtes. La figure 9 montre de mauvais déphasages qui donnent lieu à des pics inversés ou négatifs.

SRS bicolore du tissu cérébral de la souris en mode épi:
Mode épi (détection des photons rétrodiffusés) SRS est utilisé pour l’imagerie des tissus épais (>1 mm). La figure 10A,B illustre l’imagerie SRS bicolore en temps réel à 2 850 ^cm-1 et 2 930 ^cm-1 de tissu cérébral de souris ex vivo. Les images brutes des canaux lipidiques et protéiques (Figure 10A, B) ont été codées par couleur pour produire une seule image représentant les contributions lipidiques et protéiques (Figure 10C). Une fausse coloration H&E a été effectuée (Figure 10D) sur la Figure 10C pour imiter la coloration H&E. Une mauvaise qualité d’image peut être le résultat d’une grande profondeur d’imagerie ou d’un mauvais étalonnage (axe de fréquence ou profondeur de modulation). La profondeur d’imagerie typique dans le tissu cérébral est de 100-200 μm¹³.

Figure 1 : Schéma de la configuration de l’imagerie SRS monochrome. Construction d’un microscope SRS à focalisation spectrale en mode transmission. X et Y représentent les sorties orthogonales. Abréviations : SRS = diffusion Raman stimulée ; DL = ligne de retard basée sur un rétroréflecteur; Div = diviseur; FB = tampon de ventilation; AT = atténuateur; PS = déphaseur; PA = amplificateur de puissance; DCM = miroir dichroïque; GM = miroirs galvo; EOM = modulateur électrooptique; POM = miroir de pick-off; PBS = séparateur de faisceau polarisant, BRC = cristal biréfringent; QWP = plaque quart d’onde; HWP: plaque demi-onde; = photodiode; GR = tige de verre; BB = Bloc de faisceau; SPF = filtre passe-court; CL = lentille collimatrice; BS = lentille de changement de taille de faisceau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Chevauchement temporel représentatif. (A) Les faisceaux de pompe et de Stokes sont visibles comme se chevauchant temporellement sur l’oscilloscope. Les curseurs d’oscilloscope sont utilisés pour marquer les positions temporelles de la pompe et des faisceaux de Stokes. Ce chevauchement est satisfaisant comme point de départ pour ajuster davantage le chevauchement temporel avec une étape de retard. (B) Profondeur de modulation représentative satisfaisante d’une MOE à 20 MHz. (C) Modulation d’impulsion satisfaisante pendant que deux MOE sont utilisées. (D) Modulation satisfaisante du train d’impulsions après installation de cristal de quartz biréfringent et de plaque demi-onde sur le bras Stokes doublement modulé. Abréviation : EOM = modulateur électrooptique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Signaux SRS et de pompe représentatifs. (A) Signal de pompe mal aligné détecté dans le canal CC. (B) Signal SRS mal aligné détecté par photodiode. (C) Signal de pompe centré satisfaisant dans le canal CC. (D) Signal SRS satisfaisant centré sur le canal CA. Abréviation : SRS = diffusion Raman stimulée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Caractérisation de la résolution spectrale. Une fonction gaussienne était adaptée au pic de DMSO Raman de 2 ^{913 cm-1}. Le calcul FWHM a donné une résolution de 15 ^cm-1 pour le système. Abréviations : DMSO = diméthylsulfoxyde; FWHM = pleine largeur à la moitié maximum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Schéma de la configuration de l’imagerie SRS bicolore. Construction d’un microscope SRS bicolore en mode transmission. X et Y représentent les sorties orthogonales. Abréviations : DL = ligne de retard basée sur un rétroréflecteur; Div = diviseur; FB = tampon de ventilation; AT = atténuateur; PS = déphaseur; PA = amplificateur de puissance; DCM = miroir dichroïque; GM = miroirs galvo; EOM = modulateur électrooptique; PBS = séparateur de faisceau polarisant; BRC = cristal biréfringent; QWP = plaque quart d’onde; HWP = plaque demi-onde; = photodiode; GR = tige de verre; BB = Bloc de faisceau, SPF = filtre passe-court; CL = lentille collimatrice; POM = miroir de pick-off; BS = lentille de changement de taille de faisceau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Schéma de configuration du mode Epi de l’imagerie SRS bicolore. Construction d’un microscope SRS bicolore en mode épi. X et Y représentent les sorties orthogonales. Abréviations : DL = ligne de retard basée sur un rétroréflecteur; Div = diviseur; FB = tampon de ventilation; AT = atténuateur; PS = déphaseur; PA = amplificateur de puissance; DCM = miroir dichroïque; GM = miroirs galvo; EOM = modulateur électrooptique; PBS = séparateur de faisceau polarisant; BRC = cristal biréfringent; QWP = plaque quart d’onde; HWP = plaque demi-onde; = photodiode; GR = tige de verre; BB = Bloc de faisceau, BPF = filtre passe-bande; CL = lentille collimatrice; POM = miroir de pick-off; BS = lentille de changement de taille de faisceau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Optimisation de la résolution spectrale avec 25 % de DMSO. (A) Aucune tige de gazouillis en verre n’a été utilisée pour obtenir le spectre DMSO. Les deux pics ne sont pas résolus. (B) Des tiges de gazouillis en verre ont été utilisées, 20 cm sur le bras de la pompe et 24 cm sur le bras Stokes. Deux pics commencent à être résolus à un point satisfaisant. (C) Des tiges de gazouillis ont été utilisées, une pompe de 40 cm de long et des Stokes de 24 cm de long, pour obtenir un spectre de DMSO mieux résolu. (D) Des tiges de gazouillis ont été utilisées, une pompe de 64 cm de long et des Stokes de 60 cm de long, pour obtenir une résolution spectrale plus élevée. Abréviation : DMSO = diméthylsulfoxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : SRS bicolore, polarisation variable et délai. Deux trains d’impulsions retardés de polarisation orthogonale (s&p) sont utilisés pour imager les spectres DMSO afin de montrer le délai (et la différence de fréquence Raman) entre les excitations SRS. Abréviations : DMSO = diméthylsulfoxyde; SRS = diffusion Raman stimulée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Spectre SRS résultant d’un mauvais déphasage SRS bicolore. Un pic négatif de 2 994 ^cm-1 près de la position d’étage 48 est révélateur d’une faible différence de phase. Abréviation : SRS = diffusion Raman stimulée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Génération de fausse colorationS bicolores H&E d’images SRS. (A) Image SRS de protéine brute provenant d’un tissu cérébral de souris à la transition de 2 930 ^cm-1. (B) Image SRS lipidique brute du tissu cérébral de souris à la transition de 2 850 ^cm-1. (C) Canaux fusionnés et codés par couleur de A et B avec contribution lipidique en vert et contribution protéique en bleu. (D) Une fausse recoloration H&E a été effectuée sur C pour imiter la coloration H&E pour des applications pathologiques. Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : SRS = diffusion Raman stimulée ; H&E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le schéma d’imagerie SRS bicolore présenté dans ce protocole repose sur la mise en œuvre correcte de l’imagerie SRS monochrome. Dans l’imagerie SRS monochrome, les étapes critiques sont l’alignement spatial, l’alignement temporel, la profondeur de modulation et le déphasage. La combinaison spatiale des deux faisceaux est réalisée par un miroir dichroïque. Plusieurs rétroviseurs de direction sont utilisés pour un réglage fin lors de l’envoi des faisceaux au miroir dichroïque. Une fois les faisceaux combinés avec le miroir dichroïque, l’alignement spatial peut être confirmé en choisissant la trajectoire combinée du faisceau avec un miroir à envoyer vers un mur à >1 m de distance tout en vérifiant le faisceau combiné pour voir s’il se chevauche avec une carte IR. Après l’alignement spatial au microscope, le chevauchement temporel est effectué en ajustant la longueur du chemin avec un étage de retard basé sur un rétroréflecteur, ce qui a l’avantage de préserver l’alignement spatial. Le bras de 1 040 nm est le faisceau retardé dans ce protocole. Le chevauchement temporel est impossible si l’étage de retard n’a pas la portée nécessaire pour que les deux faisceaux se chevauchent temporellement. Dans ce cas, il peut être nécessaire de déplacer l’ensemble de l’étape de retard vers un autre emplacement pour s’assurer que le chevauchement temporel est proche du milieu de la plage d’analyse de retard. Par exemple, si la différence temporelle entre les deux faisceaux est mesurée à 6 ns, alors 1,8 m de réglage est nécessaire. Le réglage requis indique la longueur d’allongement de la trajectoire de la poutre pour la poutre la plus rapide ou le raccourcissement de la trajectoire de la poutre pour la poutre la plus lente.

Outre l’alignement, la correspondance de la taille du faisceau et la modulation du faisceau Stokes sont également importantes pour maximiser le signal SRS. Idéalement, les deux faisceaux devraient être collimés au plan de l’objectif et correspondre à la taille de l’ouverture arrière de l’objectif. Il est utile de vérifier la collimation et la taille du faisceau si le plan objectif est exposé à l’utilisateur. Si le faisceau converge ou diverge, il est nécessaire d’ajuster la deuxième lentille de la paire de lentilles de collimation pour obtenir la collimation (étape de protocole 1.1). De même, si la taille du faisceau est trop petite à l’ouverture arrière de l’objectif, une paire d’objectifs à fort grossissement doit être utilisée (étape de protocole 1.2). SRS évolue linéairement avec la profondeur de modulation du faisceau de Stokes. Il est important de s’assurer que la hauteur d’impulsion dans la vallée est <10% de la hauteur d’impulsion au sommet de l’oscilloscope. Une mauvaise modulation du faisceau de Stokes se traduit directement par un mauvais SNR.

Lors de l’utilisation de lasers femtosecondes pour l’imagerie SRS, la focalisation spectrale est nécessaire pour convertir le délai entre la pompe et Stokes en décalage de fréquence Raman. Le facteur de conversion dépend de la quantité de gazouillis appliquée. Il est essentiel de faire correspondre le GDD de la pompe et de Stokes pour obtenir une résolution spectrale optimale. Le GDD peut être estimé en fonction de la longueur du matériau de dispersion utilisé et de son GVD. Par exemple, la tige de verre silex dense SF11 a un GVD de 123,270 fs²/mm à 1 040 nm et 187,486 fs²/mm à 800 nm. Pour 240 mm de SF11 dans la trajectoire du faisceau de 800 nm, GDD est de 240 mm × 187,486 fs²/mm = 45 000 fs². Pour 240 mm de SF11 dans la trajectoire du faisceau de 1 040 nm, le GDD est de 240 mm × 123,270 fs²/mm = 30 000 fs². Cet exemple de calcul signifie que des tiges de verre supplémentaires doivent être ajoutées au bras de 1 040 nm ou que des tiges de verre doivent être retirées du bras de 800 nm pour correspondre à GDD. Pour obtenir une résolution spectrale plus élevée, un GDD plus grand est nécessaire, ce qui signifie des tiges plus longues. Cependant, dans le calcul du GDD, les contributions de la MOE et l’objectif ont été négligés. L’appariement réel de GDD est déterminé expérimentalement en trouvant la meilleure résolution spectrale pour les longueurs de tige données sur la pompe ou le Stokes. Les calculs constituent une bonne étape de départ. L’optimisation expérimentale par addition itérative et retrait de tiges de verre est toujours nécessaire pour optimiser la résolution spectrale.

Il est important de réaliser qu’un gazouillis important fournit une résolution spectrale plus élevée, mais au détriment de l’intensité du signal. Des gazouillis plus petits et des impulsions plus courtes sont bénéfiques pour l’imagerie tissulaire dans la région C-H, car les pics Raman protéiques et lipidiques sont larges. Une résolution spectrale plus faible peut être échangée contre un signal SRS plus élevé (ou une vitesse d’imagerie plus rapide) sans sacrifier le contraste tissulaire^{bicolore 17}. Dans d’autres applications où une résolution spectrale élevée est nécessaire, en particulier dans la région des empreintes digitales, il est nécessaire d’appliquer un gazouillis plus important à l’aide de longues tiges de verre. Alternativement, il pourrait être plus facile d’utiliser des civières à grille pour obtenir des impulsions plus longues (pour une durée d’impulsion supérieure à 3 ps). Cependant, l’une des principales limites du laser commercial utilisé est sa bande passante spectrale. La couverture spectrale du SRS à focalisation spectrale dépend de la bande passante des lasers d’excitation. Le système laser utilisé a une couverture spectrale généralement d’environ 200-250 ^cm-1. C’est à peine suffisant pour couvrir la région C-H. Une plus grande couverture spectrale est généralement nécessaire pour résoudre les espèces chimiques pour l’imagerie dans la région des empreintes digitales. Ce problème peut être résolu avec un module complémentaire de laser à fibre qui élargit la bande passante du laser Stokes de 6 nm à 60 nm¹⁸. Une autre limitation importante de la technique d’imagerie SRS bicolore est que seules deux transitions sont surveillées. Cette approche ne conviendrait pas aux échantillons complexes avec de nombreux pics Raman qui se chevauchent ou plusieurs espèces.

La méthode d’imagerie SRS bicolore en temps réel permet une imagerie tissulaire à grande vitesse en éliminant le besoin de réglage laser ou de retard. Cependant, il est difficile à mettre en place en raison des défis liés à l’obtention d’une profondeur de modulation presque parfaite pour les deux EOM. Il est préférable d’optimiser EOM1 et EOM2 indépendamment. Si EOM1 est activé, EOM2 doit être débranché et vice versa. Une fois que les deux modulations sont optimisées à la quasi-perfection (profondeur de modulation de >95 %), les deux EOM sont connectés pour permettre la modulation orthogonale. La durée du délai entre les deux trains d’impulsions orthogonales dépend de la longueur du BRC et du gazouillis. Cette méthode de modulation n’est pas immédiatement réalisable pour les applications cliniques car une électronique complexe est nécessaire pour fournir deux trains d’impulsions RF avec un déphasage accordable pour piloter les deux MOE. L’alignement de la MOE doit également être presque parfait pour assurer une transmission élevée, une bonne modulation et une orthogonalité entre les deux canaux. Cette technique est généralement applicable à d’autres applications qui nécessitent une imagerie rapide et simultanée de deux pics Raman en raison de changements de mouvement ou d’échantillon. Les exemples incluent les mesures de la température de l’eau ou le suivi d’objets en mouvement tels que des gouttelettes lipidiques ou des organites ^11,19.

Un laser à fibre robuste est nécessaire pour les futures applications cliniques⁴. L’approche décrite par le protocole pourrait également être étendue pour améliorer la vitesse d’acquisition jusqu’au débit vidéo, ce qui est important pour scanner de gros échantillons de tissus dans un délai raisonnable. Si le temps d’imagerie ou les artefacts de mouvement ne sont pas une préoccupation, les images SRS protéiques et lipidiques peuvent être acquises séquentiellement en déplaçant l’étape de retard motorisée image par image. Une autre méthode d’imagerie SRS bicolore en temps réel est un schéma biphasé qui recycle le faisceau de Stokes pour fournir les mêmes deux canaux orthogonaux²⁰. Cependant, la mise en œuvre du schéma biphasé nécessite un alignement supplémentaire impliquant trois poutres. Il nécessite également l’appariement de la taille du faisceau et de la divergence de trois faisceaux laser. Une avenue potentielle pour améliorer les deux techniques afin de surmonter la limite simultanée de deux couleurs est l’incorporation d’un laser à fibre rapidement accordable pour sonder des régions spectrales spécifiques²¹. Le traitement des images est le même que celui décrit dans le protocole pour générer des images H&E simulées.

Enfin, ce protocole démontre l’imagerie SRS en mode épi. Il génère généralement des images de qualité inférieure par rapport à l’imagerie en mode de transmission pour les sections de tissus minces en raison de la puissance inférieure de la pompe atteignant le détecteur¹³. Pour l’imagerie des tissus épais (>1-2 mm) ou les échantillons qui sont très diffusants (p. ex., le tissu osseux), l’imagerie en mode épi peut être plus performante que l’imagerie en mode transmission. Lors de l’imagerie de tissus frais tels que le tissu cérébral, la profondeur d’imagerie SRS est généralement limitée à 200-300 μm. Pour les tissus fixes, la diffusion est plus forte et la profondeur d’imagerie est de 100 à 200 μm. Une imagerie plus approfondie peut être obtenue avec une puissance plus élevée, une correction d’aberration ou un effacement optique^22,23. Néanmoins, l’imagerie en mode épi est une approche préférable pour le diagnostic tissulaire car elle ne nécessite aucune section tissulaire et l’alignement est plus simple sans le condensateur NA élevé. Les futures applications de diagnostic tissulaire bénéficieront d’une imagerie rapide et de grande surface sur des échantillons chirurgicaux intacts, suivie d’un diagnostic basé sur l’apprentissage automatique et l’apprentissage profond. Le protocole présenté ici convient également aux applications in vivo, telles que l’imagerie cérébrale ou l’imagerie cutanée, où l’imagerie en mode épi est la seule option, et l’imagerie à grande vitesse est importante pour éviter les artefacts de mouvement.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.