Summary
Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Beyindeki yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) iltihaplanma veya yaralanmaya birincil yanıt verenlerdir. Mikroglia dinlenme durumuna ve aktif duruma ayrılabilir ve beynin mikro ortamına yanıt olarak durumu hızla değiştirebilir. Mikroglia farklı patolojik koşullar altında aktive olacak ve farklı fenotipler sergileyecektir. Ek olarak, aktif mikroglianın birçok farklı alt grubu ve farklı alt gruplar arasında büyük heterojenlik vardır. Heterojenlik esas olarak mikroglia'nın moleküler özgüllüğüne bağlıdır. Çalışmalar, mikroglia'nın aktive olacağını ve inflamatuar demiyelinizasyonun patolojik sürecinde önemli bir rol oynayacağını ortaya koymuştur. Multipl skleroz ve nöromiyelit optika spektrum bozukluğu gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın özelliklerini daha iyi anlamak için perilezyonel primer mikroglial sıralama protokolü öneriyoruz. Bu protokol, yüksek oranda saflaştırılmış primer mikroglia elde etmek ve mikroglia'nın moleküler özelliklerini korumak için kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı (MACS) enflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglia'nın potansiyel etkilerini araştırmak için kullanır.
Introduction
Mikroglia, embriyonik beyne çok erken ulaşan ve CNS 1,2'nin gelişimine katılan yumurta sarısı kesesi progenitörlerinden kaynaklanır. Örneğin, sinaptik budama3 ve aksonal büyümeyi düzenleyen4'te rol oynarlar. Nöronal sağkalımı destekleyen ve nöronal lokalizasyona yardımcı olan faktörleri salgılarlar5. Aynı zamanda, normal beyin gelişimini sağlamak için anormal hücrelerin ve apoptotik hücrelerin çıkarılmasında rol oynarlar6. Ek olarak, beynin bağışıklık yetkin hücreleri olarak, mikroglia ölü hücreleri, işlevsiz sinapsları ve hücresel kalıntıları temizlemek için beyin parankimini sürekli olarak izler7. Mikroglial aktivasyonun, inflamatuar demiyelinizan hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve beyin tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Multipl sklerozda (MS) aktive mikroglia, oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) farklılaşmasına ve miyelin kalıntılarını yutarak miyelinin rejenerasyonuna katkıda bulunur8.
Alzheimer hastalığında (AD), amiloid beta (Aβ) birikimi, mikroglia9'un fagositik ve enflamatuar fonksiyonlarını etkileyen mikroglia'yı aktive eder. Glioma ile ilişkili mikroglia (GAM) adı verilen glioma dokusundaki aktif mikroglia, gliomun ilerlemesini düzenleyebilir ve sonuçta hastaların prognozunu etkileyebilir10. Aktivasyon mikroglial transkriptomu derinden değiştirir, morfolojik değişikliklere, immün reseptörlerin ekspresyonuna, fagositik aktivitenin artmasına ve sitokin sekresyonunun artmasına neden olur11. Nörodejeneratif hastalıklarda hastalıkla ilişkili mikroglia (DAM), aktif yanıt mikroglia (ARM) ve mikroglial nörodejeneratif fenotip (MGnD)8 gibi farklı aktif mikroglia alt kümeleri vardır.
Benzer şekilde, mikroglia'nın çoklu dinamik fonksiyonel alt kümeleri de enflamatuar demiyelinizan hastalıklarda beyinde bir arada bulunur12. Mikroglia'nın farklı alt kümeleri arasındaki heterojenitenin anlaşılması, inflamatuar demiyelinizan hastalıkların patogenezini araştırmak ve potansiyel tedavi stratejilerini bulmak için gereklidir. Mikroglia'nın heterojenliği esas olarak moleküler özgüllüğe bağlıdır8. Heterojenliğin incelenmesi için mikroglia'nın moleküler değişikliklerini doğru bir şekilde tanımlamak esastır. Tek hücreli RNA dizileme (RNA-seq) teknolojisindeki ilerlemeler, patolojik koşullarda aktive mikroglianın moleküler özelliklerinin tanımlanmasını sağlamıştır13. Bu nedenle, hücre popülasyonlarını izole etme yeteneği, bu hedef hücrelerin belirli koşullar altında daha fazla araştırılması için kritik öneme sahiptir.
Mikroglia'nın özelliklerini ve işlevlerini anlamak için yapılan çalışmalar genellikle in vitro çalışmalardır, çünkü kültür şişelerine bağlanan ve plastik yüzeyde diğer karışık glial hücrelerle birlikte büyüyen fare yavrusu beyinlerinden (1-3 günlük) çok sayıda birincil mikroglianın hazırlanabileceği ve kültürlenebileceği bulunmuştur. Daha sonra, saf mikroglia, karışık glial hücrelerin farklı yapışkanlığına dayanarak izole edilebilir14,15. Bununla birlikte, bu yöntem sadece mikroglia'yı perinatal beyinden izole edebilir ve birkaç hafta sürer. Hücre kültüründeki potansiyel değişkenler, moleküler ekspresyon16 gibi mikroglial özellikleri etkileyebilir. Dahası, bu yöntemlerle izole edilen mikroglia, yalnızca CNS hastalıklarının koşullarını simüle ederek in vitro deneylere katılabilir ve in vivo hastalık durumlarında mikroglia'nın özelliklerini ve işlevlerini temsil edemez. Bu nedenle, mikroglia'yı yetişkin fare beyninden izole etmek için yöntemler geliştirmek gerekir.
Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik ayırma, kendi farklı sınırlamalarına sahip olmalarına rağmen, yaygın olarak kullanılan iki yöntemdir16,17,18,19. İlgili avantaj ve dezavantajları tartışma bölümünde karşılaştırılacaktır. MACS teknolojisinin olgunlaşması, hücreleri hızla saflaştırma imkanı sunar. Huang ve ark. beyinlerdeki demiyelinizan lezyonları etiketlemek için uygun bir yöntem geliştirmişlerdir20. Bu iki teknik yaklaşımı birleştirerek, yetişkin fare beyinlerinde demiyelinizan lezyonlar etrafındaki mikrogliayı izole etmek ve mikroglia'nın moleküler özelliklerini korumak için adım adım bir açıklama sağlayan hızlı ve verimli bir sütunlu CD11b manyetik ayırma protokolü öneriyoruz. Fokal demiyelinizan lezyonlara, protokol 21'e başlamadan 3 gün önce korpus kallozuma 2 μL lizositin çözeltisinin (%0.9 NaCl'de %1 LPC) stereotaktik enjeksiyonu neden oldu. Bu protokol, in vitro deneylerde bir sonraki adımı gerçekleştirmek için temel oluşturur. Dahası, bu protokol zamandan tasarruf sağlar ve çeşitli deneylerde yaygın kullanım için uygun olmaya devam eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Tongji Tıp Koleji, Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Çin Hayvan Bakım Komitesi Enstitüsü tarafından onaylanmıştır.
1. Malzemeler
- Protokole başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
- Fosfat tamponlu saline (PBS) fetal sığır serumu (FBS,% 2) ekleyerek yükleme tamponunu hazırlayın.
- PBS'ye nötr kırmızı (NR) boya (son %1) ekleyin.
- Ticari olarak temin edilebilen Yetişkin Beyin Ayrışma Kitini kullanarak aşağıdaki çözümleri hazırlayın ( bkz.
- Enzim karışımı 1'i hazırlamak için, 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 1,9 mL Tampon Z ve 50 μL Enzim P pipetin.
- Enzim karışımı 2'yi hazırlamak için, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 20 μL Tampon Y ve 10 μL Enzim A pipetin.
- Enkaz kaldırma çözeltisini hazırlayın.
2. Farelerin perfüzyonu ve diseksiyonu
- İntraperitoneal olarak (i.p.) anesteziden önce fareye PBS'de 500 μL% 1 NR boya enjekte edin.
NOT: Demiyelinizan fare modellerinde intraperitoneal NR enjeksiyonu lezyonların ayırt edilmesine yardımcı olur (Şekil 1). - Pentobarbital (50 mg/kg, yani 50 mg) ile fareyi uyuşturun ve ağrı yanıtlarını inceleyerek farenin başarılı bir şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
- Farenin göğüs boşluğunu açın ve kalbi açığa çıkarın.
- Sağ atriyumun küçük bir köşesini dikkatlice kesin ve fareyi sol ventrikülden 20-30 mL soğuk PBS ile intrakardiyal olarak perfüze edin.
- Farenin kafasını anestezi altında kesin.
- Farenin kafatasını açın ve beyni kafatasından dikkatlice kurtarın.
- Beyni fare beyin dilimi kalıbına aktarın ve beyni 0,1 cm'lik dilimler halinde kesin.
- Beyin dilimlerini çıkarın ve bir Petri kabında (60/15 mm) soğuk PBS'ye yerleştirin. Korpus kallozumun etrafındaki NR boyası ile etiketlenmiş lezyonları mikrocerrahi forseps kullanarak stereomikroskop altında mikrodiseke eder.
NOT: Parçalanmış dokunun, sonraki transferi kolaylaştırmak için mümkün olduğunca eksiksiz olduğundan emin olun; toplam diseksiyon ilerlemesi 2 saat içinde tamamlanmalıdır. - Disseke edilen dokuyu uygun miktarda soğuk yükleme tamponu içeren 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.
NOT: 2-3 fareden korpus kallozum dokusunu tek bir tüp içinde tek bir örnek olarak bir araya getirin.
3. Doku ayrışması
- Tüpün dibinde numune toplamak için disseke edilmiş dokuyu 300 ×g'de 30 s boyunca (bu hıza ulaştıktan sonra) santrifüj edin.
- Bir inkübatörde enzim karışımı 1 ve enzim karışımı 2 ila 37 ° C'yi önceden ısıtın.
- Bir numuneye 1.950 μL önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde sindirin.
- 30 μL önceden ısıtılmış enzim karışımı 2 ekleyin ve yavaşça karıştırın.
- 37 ° C'de bir inkübatörde 15 dakika boyunca sindirin ve her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
- Sindirimden sonra tüpe 4 mL soğuk PBS ekleyin ve hafifçe çalkalayın.
- 50 mL santrifüj tüplerine 70 μm filtre yerleştirin ve filtreleri 500 μL soğuk PBS ile önceden ıslatın. Sindirilmiş doku örneklerini filtrelerden geçirerek ayrışmış dokuyu filtreleyin ve 50 mL santrifüj tüpündeki filtrelenmiş süspansiyonu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Doku miktarı çok küçükse bu adımı atlayın. - Filtrelenmiş doku örneklerini 300 × g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı yavaşça ve tamamen aspire edin.
NOT: Enzimatik sindirim hariç tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.
4. Enkaz kaldırma
- Hücre peletini 1.550 μL soğuk PBS ile nazikçe yeniden askıya alın.
- Enkaz giderimi için 450 μL soğuk çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.
- Yukarıdaki karışımı 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 2 x 1 mL soğuk PBS ile çok yavaş ve nazik bir şekilde kaplayın.
NOT: Santrifüj tüpünü 45° eğin ve pipetle birlikte tüp duvarı boyunca PBS'yi yavaşça ekleyin. - Tüpü yavaşça ve nazikçe bir santrifüje aktarın ve 10 dakika boyunca 4 ° C ve 3.000 × g'da döndürün.
- Santrifüjlemeden sonra üç katman arayın. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak iki üst katmanı tamamen aspire edin (Şekil 2).
- Tüpü 5 mL'ye kadar soğuk yükleme tamponuyla doldurun ve tüpü yavaşça üç kez ters çevirin.
- 10 dakika boyunca 4 °C'de ve 1.000 × g'de santrifüj. Süpernatantı tamamen aspire edin ve hücre peletini bozmaktan kaçının.
5. Mikroglial hücrelerin manyetik olarak ayrılması
- Hücre peletini 90 μL yükleme tamponu ile yeniden askıya alın ve 10 μL CD11b (Microglia) boncukları ekleyin.
- İyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 1 mL yükleme tamponu ekleyin ve inkübasyondan sonra hücreleri yıkamak için sıvıyı 1.000 μL'lik bir pipetle yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri 4 ° C ve 300 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için süpernatantı tamamen aspire edin.
- Hücreleri 500 μL yükleme tamponunda yeniden askıya alın.
- Manyetik alanda pozitif seçim için MS sütununu ayırıcısıyla birlikte yerleştirin.
- Hücreleri korumak ve üreticinin protokolüne göre manyetik sıralamanın verimliliğini sağlamak için sütunu 500 μL yükleme tamponu ile durulayın.
- Hücre süspansiyonunu MS sütununa uygulayın ve etiketsiz hücreler içeren akışı atın.
- Kolon duvarına yapışan hücreleri yıkamak ve akışı atmak için sütuna üç kez 500 μL yükleme tamponu ekleyin.
NOT: Yalnızca kolon haznesi tamamen boşaldığında yıkamak için yeni yükleme tamponu ekleyin. - Kolonu yıkadıktan sonra kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Sütuna 1 mL yükleme tamponu ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütunun altına itin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri tamamen toplamak için bu adımı üç kez yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CD11b boncukları kullanılarak izole edilen mikroglia yüksek saflığa sahiptir
Demiyelinasyon fare modellerinde lezyonların etrafındaki mikroglial hücreler yukarıda belirtilen protokol kullanılarak izole edildi ve akım sitometrisi ile test edildi. Hücreler, üreticinin talimatlarına göre akış sitometrisinde mikrogliayı belirlemek için CD11b-floresein izotiyosiyanat (FITC) ve CD45-allofikosiyanin (APC) ile floresan olarak etiketlenir. CD11b ve CD45 antikorlarının izole mikroglia 19,22'nin saflığını kontrol etmek için yeterli olduğunu gösteren çok sayıda literatür vardır. Floresan telafisi, boyanmamış ve tek boyalı kontrol numuneleri kullanılarak akış sitometresinde tamamlandı. Hücreler ileri saçılma yüksekliği (FSC-H) ve yan saçılma yüksekliği (SSC-H) ile kapatıldı; tek hücreler ileri saçılma alanı (FSC-A) ve FSC-H ile çevriliydi. Manyetik ayırmadan önce ve sonra mikroglia oranları (CD11b + CD45Ara olarak tanımlanan) akış sitometrisi ile test edildi. Geri döngü tekniği, mikroglia için kapıyı belirleyerek akış sitometri analizinin geçit stratejisini ayarlamak için kullanıldı. Her fare beyninin manyetik olarak ayrılmasından önce yaklaşık 3 × 104 hücre ve 6 × 103 mikroglia ile karşılaştırıldığında (Şekil 3A), MACS genellikle fare beyni başına yaklaşık 2.5 × 10 3 hücre ve 2 × 103 mikroglia verir (Şekil 3B), tüm tek hücrelerin yaklaşık% 85'idir. Bununla birlikte, miyeloid hücrelerin yaklaşık% 3'ü (CD11b + CD45yüksekliği olarak tanımlanmıştır) MACS ile ayrılmış hücrelerde mevcuttu ve bu protokolde CD11b popülasyonundan çıkarılması zordu. İzole edilmiş mikroglianın saflığı, iki manyetik sütun kullanılarak% 95'e çıkarılabilir (Ek Şekil S1). MACS ayıklama, beyin karışımı örneğindeki mikroglianın yaklaşık% 33'ünü yakalayabilir.
CD11b boncukları kullanılarak izole edilen mikroglia, yüksek hücre canlılığına sahiptir
Florokrom 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) genellikle akış sitometrisinde hücre canlılığını göstermek için kullanılır. 7-AAD+ hücreleri ölü hücreleri temsil eder19. MACS ile ayrılmış mikroglianın yaşayabilirliği, 7-AAD ile hücre boyama ile yaklaşık% 95 idi (Şekil 4).
MACS tarafından sıralanmış demiyelinizan lezyonların etrafındaki mikroglianın morfolojik analizi
Morfolojik analiz, mikroglia'nın MACS tarafından aktive edilmediğini gösterdi. Mikroglia, MACS'den sonra tipik bir uzunlamasına bipolar hücre gövdesi sergiler ve bu da FACS19'dan sonra mikroglial morfolojiye benzer. LPC'ye bağlı demiyelinizasyon modelinde demiyelinizan lezyonların etrafındaki mikroglia aktive edilecektir21. İyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba-1) ile boyanan mikroglia, bu protokolde aktif mikroglianın tipik amebik morfolojisini göstermiştir. P2ry12, mikroglial dinlenme durumunun tipik bir molekülüdür. Ayrışmış lezyonların derecesinin genişlemesi nedeniyle MACS'den önce dallanmış ve P2ry12+ mikroglianın küçük bir kısmı vardır. Bununla birlikte, MACS'den sonra P2ry12+ mikroglia'nın varlığı, MACS'nin mikroglia'yı aktive etmeyeceğini de göstermektedir (Ek Şekil S2).
Şekil 1: Nötral kırmızı boya ile etiketlenmiş fokal demiyelinizan lezyonların görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Santrifüjleme ile oluşan üç katmanın görüntüleri. Enkaz kaldırma işleminde üst iki katmanın (katman 1 + katman 2) kaldırılması gerekir (bkz. protokol adım 4.5). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MACS öncesi ve sonrası yetişkin farelerin demiyelinizasyon lezyonlarından izole edilen mikroglia'nın akış sitometri analizi. (A) MACS öncesi akış sitometri analizinde kullanılan geçiş stratejisinin şematik gösterimi: Hücreleri seçmek için FSC-H ve SSC-H, tek hücreleri seçmek için FSC-A ve FSC-H ve miyeloid hücreleri (yukarı) ve mikrogliayı (aşağı) seçmek için CD11b-FITC ve CD45-APC. (B) MACS sonrası akış sitometrisi analiz örneğinde kullanılan geçit stratejisinin şematik gösterimi. Mikroglia oranı MACS'den sonra önemli ölçüde artmıştır: hücreleri seçmek için FSC-H ve SSC-H, tek hücreleri seçmek için FSC-A ve FSC-H ve miyeloid hücreleri (yukarı) ve mikrogliayı (aşağı) seçmek için CD11b-FITC ve CD45-APC. Kısaltmalar: SSC-H = yan saçılma yüksekliği; FSC-H = ileri saçılma yüksekliği; FSC-A = ileri dağılım alanı; CD45-APC = allofikoksiyanin etiketli CD45; CD11b-FITC = floresein izotiyosiyanat etiketli CD11b; MACS = manyetik aktive hücre sıralama. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MACS'den sonra canlı/ölü tek hücreler için FACS geçit stratejisi. 7-AAD ve SSC-H, MACS'den sonra canlı hücreleri seçmek için. Kısaltmalar: SSC-H = yan saçılma yüksekliği; 7-AAD = 7-aminoaktinomisin D; MACS = manyetik aktive hücre sıralama; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Yetişkin demiyelinizasyon farelerinden izole edilen mikroglianın akış sitometri analizi. (A) MACS öncesi akış sitometrisi analiz örneğinde kullanılan geçit stratejisinin şematik gösterimi. (B) İki manyetik sütun kullanılarak MACS sonrası akış sitometrisi analiz örneğinde kullanılan geçit stratejisinin şematik gösterimi. (C) İki manyetik kolon kullanılarak MACS sonrası akış sitometrisinde CD11b-FITC ve CD45-APC'nin tek parametreli histogramı. Kısaltmalar: SSC-H = yan saçılma yüksekliği; FSC-H = ileri saçılma yüksekliği; FSC-A = ileri dağılım alanı; CD45-APC = allofikoksiyanin etiketli CD45; CD11b-FITC = floresein izotiyosiyanat etiketli CD11b; MACS = manyetik aktive hücre sıralama; CD45Int = ara CD45 ifadesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: MACS öncesi ve sonrası mikroglia'nın Iba-1 ve P2ry12 ile immünofloresan boyaması. (A) MACS'den önceki mikroglia görüntüleri. (B) MACS sonrası izole mikroglia görüntüleri. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: MACS = manyetik aktif hücre sıralama; Iba-1 = iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol, demiyelinizan lezyonların etrafındaki mikrogliayı izole etmek için bir yöntem önermektedir, bu da inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın fonksiyonel özelliklerini incelemeye yardımcı olabilir. CD11b boncukları kullanılarak yakalanan mikroglia, yüksek saflık ve canlılık gösterir. Protokoldeki kritik adımlar, odakların hassas lokalizasyonunu ve optimal mikroglial saflaştırmayı içerir. Protokol adım 2.1'de, lezyonların doğru bir şekilde görüntülenebilmesini sağlamak için fareyi feda etmeden önce NR solüsyonunu 2 saat enjekte etmek gerekir20. Protokol adım 2.8'de, beyin dokusu bölümlerinin diseksiyon için bir buz kutusuna yerleştirilmesine ve bu adımın mümkün olan en kısa sürede tamamlanmasına özen gösterilerek hücre canlılığının arttırılması sağlanmıştır. Adım 2.9'da, hem enzim sindirimi hem de döküntülerin giderilmesi için uygun dokuyu tek bir örnek olarak seçmek gerekir. Adım 3.7, enkaz kaldırmanın etkisi tatmin edici olmadığında atlanamaz. Adım 4.3'te, PBS ilavesi, farklı katmanlar oluşturmak için nazik olmalı ve mümkün olduğunca fazla enkazın giderilmesini sağlamalıdır. Enzimatik sindirim hariç protokoldeki tüm adımlar, hücre canlılığını sağlamak ve mikroglianın transkripsiyonel yanıtını azaltmak için buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. Protokoldeki her adım hafiftir ve yüksek canlılığı korur, bu nedenle ölü hücre temizleme çözeltisi 22,23'ü kullanmak gereksizdir.
Protokoldeki fare beyni için enzimatik ayrışma yönteminin, tek hücreli RNA-seq23 için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Protokoldeki enzimler hafif olmasına rağmen, Marsh ve ark. 37 ° C'de çeşitli enzimatik hidroliz protokollerinin mikroglia24'ün transkriptomunu önemli ölçüde değiştirebileceğini bulmuşlardır. Karşılaştırma için deneyde sağlıklı bir kontrol belirlemek, farklı şekilde ifade edilen demiyelinizasyon genlerini tanımlamaya yardımcı olabilir, böylece protokoldeki anormal transkripsiyonel yanıtı ortadan kaldırır. Bu arada, enzimatik sindirimden sonra bu anormal transkripsiyonel durumu önlemek için, protokol farklı adımlarda aktinomisin D, triptolid ve anizomisin gibi çeşitli transkripsiyon ve translasyon inhibitörleri eklenerek optimize edilebilir. Bu inhibitörlerin kullanımı, bir kontrol ayarı olmadan mikroglia'nın in vivo gerçek gen ekspresyonunu ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, bu inhibitörlerin protokole eklenmesi, deneyde gerekli olan hayvan veya numune sayısını azaltabilir ve aşağı akış analizi için daha ekonomiktir. Bununla birlikte, bazı mikroglia genlerinin bu inhibitörler tarafından modüle edileceği ve bu inhibitörlerin gelecekteki çalışmalar için kullanımını sınırlayabileceği belirtilmelidir24. Doku ayrışması için enzim karışımı 1 ve enzim karışımı 2'nin eklenmesinden sonra özel ayrışma cihazının kullanılması, protokol adım 323'teki transkripsiyonel yanıtları da sınırlayabilir.
Bu protokolün bazı sınırlamaları vardır. Mikroglia'nın saflığı protokolde sadece yaklaşık% 85'tir, bu da diğer literatürlere benzer şekilde tüm tek hücrelerin% 90'ından fazlasını oluşturamamaktadır19,22. LS sütununun MS sütunu ile değiştirilmesi, filtrelerin olmaması ve mikroboncukların kalitesi potansiyel nedenler olabilir. İzole edilmiş mikroglianın saflığı gereksinimleri karşılayamazsa, manyetik inkübasyon süresini uzatmak veya sıralanmış hücreleri ikinci bir manyetik kolondan geçirmek saflığı artıracaktır (Ek Şekil S1). Hücre sayısı düşükse, daha fazla fareden doku toplanmalı ve dikkatsiz aspirasyon nedeniyle hücre kaybından kaçınılmalıdır. Hücre canlılığı düşükse, yükleme arabelleğindeki PBS'yi RPMI 1640 ortamıyla değiştirmek, hücre canlılığını önemli ölçüde artırabilir. Protokolde kullanılan tüm çözümlerin taze olmasını ve protokolün en kısa sürede tamamlanmasını sağlamak hücre canlılığı açısından da faydalıdır. Kullanıcıların bu protokol kullanılarak elde edilen mikroglia saflığını ve sayısını dengelemesi önemlidir.
Protokol, mikroglia'nın CD11b boncuklarıyla bağlanmasını ve mikroglia'yı saflaştırmak için manyetik bir alanda zenginleştirilmesini kullanır. Bu nedenle, saflaştırılmış mikroglia, bu protokolde kaçınılmaz olan miyeloid hücrelerin kontaminasyonunu içerir. Hücreleri sıralamak için altın standart olan FACS'ın aksine, MACS tarafından izole edilen mikroglia'nın saflığı, yaygın kullanımını sınırlayan derin dizileme gibi bazı ayrıntılı uygulamalar için yeterince yüksek değildir. Ek olarak, mikrogliayı sıralamak için FACS, miyeloid hücrelerin kontaminasyonunu ortadan kaldırabilir. Bununla birlikte, MACS daha yumuşak bir yöntemdir, glial hücrelerin özellikle astrositlerin daha orijinal morfolojik özelliklerini korur, mikroglia'yı izole etmek için daha az zaman alır ve FACS'tan daha yüksek bir hücre verimine sahiptir, bu da kurban edilecek farelerin sayısını azaltabileceğini ve zamana duyarlı deneyler için daha uygun olabileceğini düşündürmektedir19,25 . Bu arada, MACS daha uygun maliyetli ve yaygın olarak kullanılabilir ve deneyciler için daha düşük teknik gereksinimlere sahiptir. MACS'nin mikroglia'yı izole etmek için en güvenilir ve tutarlı yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Morfolojik analiz, mikroglia'nın MACS tarafından aktive edilmeyeceğini gösterdi ve RNA-seq, bu yöntemle izole edilen mikroglia'nın dinlenme durumunu koruduğunu gösterdi19,26.
Genel olarak, protokol demiyelinizan hastalıklarda mikroglia araştırması için önemlidir ve bu protokol tarafından izole edilen mikroglia, kantitatif RT-PCR ve RNA-seq gibi çeşitli aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir. Protokol, demiyelinizan lezyonları bulmak için nötral kırmızı boya kullanır, bu da lezyon yerlerinin doğruluğunu sağlar ve örnekleme sırasında normal doku ile herhangi bir karışıklığı azaltır. Lezyonların doğru lokalizasyonu, hastalıkların etkilerine odaklanmaya ve demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın benzersiz moleküler fenotipini ve fonksiyonel özelliklerini incelemeye yardımcı olabilir. Bu, demiyelinizan hastalıklarda mikroglia mekanizmasını incelemek için bir temel sağlayacaktır. Manyetik CD11b boncukları kullanarak mikrogliayı izole etmenin bu yöntemi, mikroglia'yı yüksek hücre canlılığı ve verimi ile kısa sürede saflaştırabilir, deneysel koşullar için minimum gereksinimler vardır, bu da mikroglia'yı farklı koşullarda incelemek için yaygın kullanıma izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip çıkarların olmadığını ilan etmişlerdir.
Acknowledgments
Çalışma, Tongji Hastanesi (HUST) Mükemmel Genç Bilim İnsanı Vakfı (Hibe No. 2020YQ06) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
