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Neuroscience

Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63514
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Summary

Presentamos un protocolo para caracterizar electrofisiológicamente los fotopigmentos biestables: (i) explotar los desplazamientos de carga dentro de las moléculas de fotopigmento después de la absorción de fotones y su enorme cantidad en los fotorreceptores, y (ii) explotar las diferencias de espectros de absorción de los estados de fotopigmento de rodopsina y metarhodopsina. Estos protocolos son útiles para detectar mutaciones que afectan a los sistemas de fotopigmento biestables.

Abstract

El fotopigmento acoplado a la proteína G de Drosophila rodopsina (R) está compuesto por una proteína (opsina) y un cromóforo. El proceso de activación de la rodopsina se inicia mediante la isomerización inductora de absorción de fotones del cromóforo, promoviendo cambios conformacionales de la opsina y dando como resultado un segundo estado de fotopigmento oscuro-estable (metarhodopsina, M). La investigación de este fotopigmento biestable utilizando mutagénesis aleatoria requiere métodos simples y robustos para detectar moscas mutantes. Por lo tanto, se han diseñado varios métodos para medir las reducciones en los niveles de fotopigmento funcional. Uno de estos métodos explota los desplazamientos de carga dentro del fotopigmento después de la absorción de fotones y las enormes cantidades de moléculas de fotopigmento expresadas en los fotorreceptores. Esta señal eléctrica, llamada potencial del receptor temprano (o corriente temprana del receptor), se mide mediante una variedad de métodos electrofisiológicos (por ejemplo, electrorretinograma y registros de células enteras) y es linealmente proporcional a los niveles de fotopigmento funcional. Las ventajas de este método son la alta relación señal-ruido, la medición lineal directa de los niveles de fotopigmento y la independencia de los mecanismos de fototransducción aguas abajo de la activación de rodopsina o metarhodopsina. Un método electrofisiológico adicional llamado postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota la biestabilidad del fotopigmento de Drosophila y las diferencias espectrales de absorción de los estados de pigmento R y M de la mosca. El PDA es inducido por la luz azul intensa, convirtiendo cantidades saturadas de rodopsina en metarhodopsina, lo que resulta en la falla de la terminación de la respuesta a la luz durante un tiempo prolongado en la oscuridad, pero puede ser terminado por la conversión de metarhodopsina a rodopsina utilizando luz naranja intensa. Dado que el PDA es una señal robusta que requiere una conversión masiva de fotopigmentos, incluso pequeños defectos en la biogénesis del fotopigmento conducen a un PDA anormal fácilmente detectado. De hecho, los mutantes PDA defectuosos condujeron a la identificación de nuevas proteínas de señalización importantes para la fototransducción.

Introduction

La rodopsina activada por la luz (R), que es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR), está compuesta por una proteína transmembrana 7 (opsina) y un cromóforo. En Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), la absorción de fotones induce la isomerización del cromóforo 11-cis-3-OH-retinal a all-trans-3-OH-retinal1, promoviendo el cambio conformacional de la rodopsina a metarhodopsina (M, Figura 1A). A diferencia de la rodopsina de vertebrados, la fracción predominante del cromóforo de invertebrados no se disocia de la opsina, lo que resulta en el estado de pigmento fisiológicamente activo oscuro-estable M. A su vez, la absorción adicional de fotones por el cromóforo all-trans-3-OH-retinal induce la isomerización del cromóforo 2,3, generando el estado pigmentario R con el cromóforo 11-cis-3-OH-retinal. El estado R es un fotopigmento oscuro, estable y fisiológicamente no activo. Además de la ruta de regeneración de fotones extremadamente rápida del cromóforo4, al igual que los fotopigmentos de vertebrados, existe una ruta lenta enzimática alternativa para la regeneración de cromóforos en los invertebrados, en la que algunas de las etapas se realizan en las células de la retina que rodean las células fotorreceptoras 5,6.

Drosophila conlleva grandes ventajas como organismo modelo para el estudio de fotorreceptores de invertebrados. En particular, la accesibilidad de la preparación y la capacidad de aplicar la genética molecular han hecho de Drosophila un poderoso sistema modelo7. Por lo tanto, se han establecido varios métodos experimentales in vivo y ex vivo para estudiar la fototransducción en general y los niveles de fotopigmento, en particular. El método in vivo más simple explota la respuesta de voltaje extracelularmente registrada relativamente grande a la luz del ojo de Drosophila. En consecuencia, la estimulación de la luz evoca una respuesta de voltaje eléctrico en todo el ojo que se puede medir utilizando el registro de electrorretinograma extracelular (ERG), que es ~ 3 órdenes de magnitud mayor que la respuesta ERG a la luz de los ojos de los vertebrados 8,9. La respuesta ERG de Drosophila es robusta y fácil de obtener, lo que la convierte en un método conveniente para identificar anomalías en la respuesta a la luz debido a mutaciones. La respuesta del ERG a la luz surge principalmente de los fotorreceptores, las células pigmentarias (glía) y las neuronas secundarias de la lámina (ver Figura 1B). Los componentes principales del ERG son (i) la respuesta de voltaje extracelular de los fotorreceptores, (ii) los transitorios "on" y "off" al principio y al final del estímulo de luz que surgen de las neuronas de la lámina (Figura 2A, recuadro, ON, OFF), (iii) la respuesta lenta de las células gliales (Figura 2A, recuadro, flechas), y (iv) la respuesta breve y transitoria, resultante del desplazamiento de la carga durante la activación del fotopigmento que precede al transitorioON 10 (Figura 2C [recuadro], D, E). Esta breve respuesta se compone de dos fases (M1 y M2, Figura 2C [recuadro]) y solo puede ser inducida por una estimulación de luz extremadamente fuerte, que activa simultáneamente millones de moléculas de fotopigmento. No se observa bajo estimulación azul (Figura 2D, traza azul) ni en mutantes con niveles de fotopigmento muy reducidos (Figura 2E, traza roja), pero su amplitud se mejora ligeramente en un mutante que abole la actividad plc (Figura 2E, traza naranja). La fase M1 es un ERP típico de la mosca que surge de la activación de M en los fotorreceptores. La fase M1, que tiene una polaridad positiva (intracelularmente), libera un neurotransmisor de forma normal en una sinapsis inversora de signos y activa las neuronas de la lámina, que responden a la despolarización del fotorreceptor generando la fase M2 amplificada sinápticamente. Así, tanto las fases M1 como M2 reflejan la activación M10,11.

La despolarización del fotorreceptor genera el transitorio "on" corneal-positivo, que surge de la sinapsis inversora de signos entre el axón fotorreceptor y las neuronas monopolares de la lámina10,11 (Figura 1B). El lento ascenso y decaimiento del ERG surgen de la despolarización de las células pigmentarias (Figura 2A, recuadro, flechas) debido principalmente al eflujo K+ de las células fotorreceptoras12 a través de los canales de potencial receptor transitorio (TRP) y TRP-like (TRPL) 13,14,15. Estos componentes cinéticos lentos enmascaran y distorsionan en gran medida la forma de onda de la respuesta del fotorreceptor en comparación con los registros intracelulares o de células enteras de la respuesta del fotorreceptor a la luz 9,10. Además, a iluminaciones muy fuertes, se puede observar una respuesta transitoria adicional, que precede y se fusiona parcialmente con el transitorio "encendido" (Figura 2C [recuadro],D,E). Esta señal se origina directamente a partir de la activación masiva del fotopigmento10.

Se han desarrollado varios protocolos de régimen de luz que utilizan filtros de densidad neutra (ND) y de color, así como fuertes destellos de iluminación, para investigar el ojo en general y la cascada de fototransducción en particular. Estos protocolos también se han utilizado para investigar las propiedades del fotopigmento.

El protocolo de intensidad-respuesta mide la amplitud máxima de la respuesta de voltaje ERG de todo el ojo al aumento de las intensidades de luz (Figura 2A, B). Este protocolo ayuda a detectar cambios en la sensibilidad de las células fotorreceptoras a la luz9.

El protocolo postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota las diferencias en los espectros de absorción de rodopsina y metarhodopsina que permite, en Drosophila, una conversión fotopigmentada masiva de R a su estado intermedio M fisiológicamente activo y oscuro-estable2. En la respuesta de voltaje ERG, se da un pulso relativamente corto de luz saturada, y se registra la respuesta de voltaje resultante. Bajo esta condición, la señal de despolarización alcanza un techo (potencial de inversión) porque la activación de una fracción de un porcentaje de la enorme cantidad de moléculas de rodopsina (~ 1 x 108) es suficiente para alcanzar el techo. La presencia de los componentes de fototransducción en gran abundancia asegura que este techo se alcanzará incluso en mutantes con una reducción significativa en la concentración o un mal funcionamiento sutil de los componentes de fototransducción. Esta situación impide el aislamiento de estos mutantes. Pak et al. introdujeron el PDA screening7 buscando una prueba confiable y reveladora para aislar mutantes visuales. En Drosophila, la respuesta PDA se produce mediante la eliminación genética del pigmento rojo de cribado, que permite la conversión de fotopigmentos, y la aplicación de luz azul, que es absorbida preferentemente por la rodopsina (Figura 3A) y, por lo tanto, da como resultado una gran conversión neta de la R al estado de fotopigmento M. La terminación de la fototransducción se interrumpe a nivel del fotopigmento por una gran conversión neta de R a M, lo que, a su vez, da como resultado una excitación sostenida mucho después de que se apaga la luz (Figura 2C, Figura 4A [arriba]). Durante el período de PDA, los fotorreceptores son menos sensibles a las luces de prueba posteriores y están parcialmente insensibilizados (inactivados). El PDA detecta incluso defectos menores en la biogénesis de rodopsina y prueba la capacidad máxima de la célula fotorreceptora para mantener la excitación durante un período prolongado. Dado que depende estrictamente de la presencia de altas concentraciones de rodopsina, califica fácilmente para la reposición deficiente de los componentes de fototransducción. Sorprendentemente, la pantalla PDA ha producido muchos mutantes visuales nuevos y muy importantes (revisados en Pak et al.7). Por lo tanto, los mutantes PDA aislados por Pak et al.7 siguen siendo extremadamente útiles para analizar el sistema visual de Drosophila .

El PDA es inducido en Drosophila por la saturación de luz azul, lo que resulta en una despolarización continua mucho después del desplazamiento de la luz (Figura 4A [arriba]). Después de saturar la luz azul inductora de PDA, los fotorreceptores periféricos (R1-6) permanecen continuamente activos en la oscuridad a su capacidad máxima, alcanzando la saturación. Las luces azules saturadas adicionales durante el PDA no producen ninguna respuesta adicional en las células R1-6 durante muchos segundos, sino que inducen una respuesta en las células R7-8 que se superpone a la PDA. Las respuestas superpuestas se explican por los diferentes espectros de absorción de los fotopigmentos expresados en estas células (R7-8)16. El PDA puede ser suprimido por la fotoconversión de M de vuelta a R con luz naranja saturada (Figura 4A [arriba]). La capacidad del PDA para llevar a las células fotorreceptoras a su capacidad activa máxima, una situación que no se puede lograr con luz blanca intensa, explica por qué ha sido una herramienta importante para detectar mutantes visuales de Drosophila. Esto se debe a que permite la detección de incluso defectos menores en proteínas implicadas en la biogénesis de niveles normales de fotopigmento17,18. Se han aislado dos grupos de mutantes defectuosos de PDA: ni mutantes de inactivación ni después de potenciales (nina) e inactivación, pero no mutantes postpotenciales (ina). El fenotipo del primero es la falta de un CAP y la inactivación asociada que surge de una gran reducción en los niveles de fotopigmento (Figura 4A [medio]). El fenotipo de este último muestra inactivación pero no despolarización oscura después de la luz azul debido a un mecanismo aún desconocido en el mutante con niveles normales de rodopsina pero carente de proteínas que interactúan con los canales TRP (Figura 4A [abajo]).

El PDA surge de la diferencia en la cantidad de fotopigmento en relación con la arrestina (ARR2), que une y termina la actividad M 19,20,21 (Figura 1A). En los fotorreceptores de Drosophila, la cantidad del fotopigmento es aproximadamente cinco veces mayor que la cantidad de ARR219. Así, los niveles de ARR2 son insuficientes para inactivar todas las moléculas M generadas por una gran fotoconversión neta de R a M, dejando un exceso de M constantemente activo en la oscuridad 17,19,20,22,23. Este mecanismo explica la eliminación de la respuesta del CAP por mutaciones o por privación de carotenoides24,25, provocando una reducción del nivel de fotopigmento, pero no afecta a los niveles de arrestina. Además, esta explicación también explica los fenotipos del alelo21 mutante nulo ARR2 (arr2 3), en el que se podría lograr PDA a intensidades de luz azul más tenues ~ 10 veces 19,20,21 (Figura 4B, C). El PDA no es una característica única de los fotorreceptores de mosca, y aparece en todas las especies probadas que tiene M estable oscuro con un espectro de absorción diferente al del estado R, lo que permite una fotoconversión suficiente del fotopigmento del estado R al estado M. Una especie investigada a fondo en la que se descubrió la fenomenología PDA es el fotorreceptor percebe (Balanus), en el que el espectro de absorción del estado R está en una longitud de onda más larga que el estado M2 (Figura 3B). En consecuencia, a diferencia de la situación en la mosca, en el percebe, la luz naranja-roja induce un PDA, mientras que la luz azul suprime el PDA2.

El protocolo de potencial del receptor temprano (ERP) explota el desplazamiento de carga que ocurre durante la activación de R o M. El pigmento visual es una parte integral de la membrana superficial del compartimento de señalización de las membranas de vertebrados e invertebrados3. En consecuencia, el proceso de activación en el que las moléculas de fotopigmento cambian de un estado intermedio a otro se acompaña de un desplazamiento de carga 4,26. Como las moléculas de fotopigmento se alinean eléctricamente en paralelo con la capacitanciade membrana 4, un cambio conformacional sincronizado rápido genera un cambio de polarización rápido de la membrana superficial, que, en las moscas, ocurre en el compartimiento de señalización compuesto por una pila de ~ 30,000-50,000 microvellosidades llamada rabdomere. Esta polarización luego se descarga pasivamente a través de la capacitancia de membrana del cuerpo celular hasta que la membrana celular está igualmente polarizada. El ERP es el registro extracelular del desplazamiento de carga. El ERP registrado intracelularmente manifiesta el ERP extracelular integrado por la constante de tiempo de la membrana celular 4,27,28. La corriente activada por el desplazamiento de la carga visual del pigmento también podría medirse en registros de pinzas de voltaje de celda entera29,30 (Figura 5A-D), con la gran ventaja (en registros de corriente de receptor temprano (ERC)) de minimizar el efecto de la capacitancia de membrana en la cinética de la señal.

La sección de protocolo describe cómo realizar mediciones de ERG a partir de Drosophila eye9 y mediciones de ERC mediante registros de células enteras de ommatidia aislada de Drosophila 31,32. También describimos protocolos específicos que se utilizan para investigar la fototransducción en general y los fotopigmentos en particular.

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Protocol

1. Medición de la relación de respuesta de intensidad, postpotencial de despolarización prolongada (PDA) y el potencial receptor temprano (ERP) utilizando el electrorretinograma

  1. Condiciones de cría adecuadas para la preparación de D. melanogaster
    1. Criar moscas D. melanogaster en botellas que contengan alimentos que contengan maíz amarillo estándar en una incubadora mantenida a una temperatura de 24 °C y en un ciclo oscuro/claro de 12 h
    2. Mantenga las botellas de mosca en la oscuridad al menos 24 horas antes del experimento.
  2. Configuración general
    1. Prepare pipetas de grabación tirando de capilares de vidrio llenos de fibra de 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) llenos de fibra (Figura 6L, O). La resistencia de las pipetas debe ser de 5-10 MΩ; se puede utilizar cualquier tirador adecuado.
    2. Cubra dos cables de plata con AgCl2, insertando alambre de plata de 0,25 mm en una solución KCl de 3 M conectada a una fuente de alimentación de 5 V hecha a medida.
    3. Inserte cada alambre de plata recubierto en los soportes de los electrodos (Figura 6N).
    4. Llene el capilar de vidrio con la solución filtrada de Ringer (ver Tabla 1) usando una jeringa de punta alargada (Figura 6M).
    5. Inserte el electrodo de alambre en el capilar de vidrio. Asegúrese de que la solución dentro del capilar esté en contacto con el alambre de plata.
    6. Inserte los soportes de electrodos (Figura 7P, N) en los dos micromanipuladores de electrodos (Figura 7G).
  3. Procedimiento de preparación de la mosca para grabaciones eléctricas
    NOTA: Para mantener la mosca en condiciones adaptadas a la oscuridad, use solo iluminación de luz roja tenue durante los siguientes pasos.
    1. Anestesiar las moscas en la botella con gas CO2 utilizando el sistema fly sleeper (Figura 6A, B) y verterlas en el recipiente de la traviesa.
    2. Elija una mosca y sosténgala cuidadosamente por su ala con una pinza afilada. Cubre el resto de las moscas con una placa de Petri.
    3. Coloque la mosca en el soporte de la mosca en la orientación adecuada, acostada de lado, con la espalda hacia la mano (Figura 6P).
    4. Encienda la fuente de alimentación del soldador. Establezca la corriente en ~2.25 A. Esta corriente debe calentar el filamento de platino-iridio de 0,25 mm a ~55-56 °C (consulte el archivo complementario).
    5. Coloque una gota de cera con una temperatura de fusión baja (~ 55-56 ° C) en el soldador (Figura 6F).
    6. Usando pinzas, levante la mosca de sus alas y fije sus alas al soporte de la mosca (Figura 6I) usando el soldador.
    7. Usando el soldador, conecte la espalda de la mosca a la superficie del soporte con cera (Figura 6P).
    8. Baje la punta del soldador sobre el punto de unión de las patas y derrita la cera para cubrir todas las patas juntas (Figura 6P).
    9. Coloque una pequeña gota de cera entre la cabeza y la espalda en el área del cuello (Figura 6P).
      NOTA: Tenga especial cuidado para evitar el sobrecalentamiento de la cabeza de la mosca. Asegúrese de que la mosca esté correctamente fijada y no pueda moverse durante el experimento; movimientos menores pueden crear artefactos en las grabaciones. Asegúrese de que las aberturas de la tráquea (entradas de respiración) en el tórax y el abdomen no estén cubiertas con cera.
    10. Coloque el soporte para moscas (Figura 7Q) en una jaula oscura de Faraday en un bloque magnético (Figura 7I) y asegúrese de que la mosca esté a ~ 5 mm del final de la guía de luz (Figura 7L).
    11. Coloque el electrodo de grabación (Figura 7P) sobre el ojo de la mosca y el electrodo de tierra (Figura 7N) sobre la parte superior de la espalda de la mosca utilizando los micromanipuladores.
    12. Inserte el electrodo de tierra en la parte posterior de la mosca utilizando los micromanipuladores.
    13. Inserte el electrodo de grabación en la periferia externa del ojo de la mosca, preferiblemente, utilizando los micromanipuladores.
      NOTA: Después de insertar el electrodo en el ojo, se observará un pequeño hoyuelo; tire del electrodo hacia arriba sin retirarlo del ojo hasta que el hoyuelo desaparezca. Los electrodos también se pueden sumergir en pequeñas gotas de gelatina de electrodo aplicadas en el torso y el ojo.
  4. Protocolo de intensidad-respuesta
    1. Coloque un filtro naranja (filtro de borde 590) delante de la lámpara de xenón de alta presión. Utilice un filtro de densidad neutra atenuante (ND) grande (seis órdenes de magnitud).
    2. Espere 60 s en la oscuridad y dé un pulso de luz de 5 s.
    3. Reemplace el filtro ND por un filtro ND menos atenuante en incrementos de un orden de magnitud.
    4. Espere 60 s en la oscuridad y dé un segundo pulso de luz de 5 s.
    5. Repita los pasos 1.4.1.-1.4.4, aumentando gradualmente la intensidad de la luz utilizando filtros ND menos atenuantes (el último pulso debe generarse sin ningún filtro ND). Asegúrese de utilizar la serie de filtros ND en la dirección adecuada, comenzando por una gran atenuación y alcanzando una atenuación baja.
  5. Protocolo PDA (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos)
    1. Dar un pulso de luz de 5 s de máxima intensidad usando un filtro naranja (filtro de borde 590, para convertir el fotopigmento máximo al estado R).
    2. Reemplace el filtro naranja por un filtro azul de banda ancha (BP450/40 nm) y dé tres pulsos de luz de 5 s a la máxima intensidad.
      NOTA: También es posible dar un pulso de luz azul de intensidad máxima continua y larga hasta que se alcance una respuesta de voltaje de estado estacionario.
    3. Espere 60 s en la oscuridad, reemplace el filtro azul con el filtro naranja anterior y dé dos pulsos de luz de 5 s con intervalos de 60 s.
  6. Protocolo ERP/M-potential para medir el espectro de fotoequilibrio de M (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos10,25)
    1. Dé un pulso de luz azul continuo (paso de banda (BP) 450/40 nm) hasta alcanzar una respuesta de voltaje de estado estacionario, que convierte la cantidad máxima de fotopigmento del estado R al estado M de las celdas R1-6.
    2. Dé un breve destello de luz intensa (<3 ms) de una longitud de onda entre 350-700 nm (el espectro de absorción conocido del fotopigmento de las células R1-6) utilizando filtros de paso de banda estrechos (~ 20 nm) y mida la amplitud máxima de la fase M1 de la respuesta potencial M (que refleja la absorción de metarhodopsina en esta longitud de onda específica en el fotoequilibrio10,25).
      NOTA: Para la activación síncrona de un gran grupo de moléculas de fotopigmento, se requiere un breve e intenso destello de luz para que el contenido de fotones se empaquete en una corta duración. El potencial M está compuesto por dos componentes: M1 (fase negativa corneal), que refleja el desplazamiento de carga de la metarhodopsina en el fotorreceptor, y M2 (fase11,33 positiva corneal), que refleja la respuesta M1 amplificada de los fotorreceptores en la lámina 9,10,11 . Cada uno de estos componentes puede ser identificado y medido. Sin embargo, es preferible medir el potencial M1 ya que es una manifestación lineal directa de los niveles M. Si se utiliza M2, asegúrese de que su amplitud esté en el rango lineal mediante el uso de privación leve de carotenoides24,25.
    3. Vuelva a dar un pulso de luz azul continuo (BP450/40 nm), seguido de un breve destello de luz intensa (<1 ms) de una longitud de onda diferente.
    4. Repita este protocolo hasta que se cubra todo el espectro de absorción de M en el equilibrio fotográfico.

2. Protocolo ERC para medir el espectro de acción de los estados R y M de las celdas R1-6 utilizando registros de pinzas de voltaje de celda entera

NOTA: Para obtener un protocolo detallado para el uso de grabaciones de pinzas de voltaje de celda entera, véase Katz et al.34. El potencial M utiliza el ERG para medir la activación del estado M solo porque la contribución del estado R es suprimida por la capacitancia de la membrana. Por el contrario, el ERC mide la activación de los estados R (ERC positivo) y M (ERC negativo) porque los registros de pinza de voltaje eliminan el efecto de la capacitancia de la membrana (ver introducción).

  1. Convierta el fotopigmento al estado deseado (R o M). Para la conversión de R a M, primero, adapte las moscas mediante un breve (<1 ms) flash azul adaptativo (BP450/40 nm). Para la conversión de M a R, proporcione un flash naranja adaptativo corto (filtro de borde OG590).
  2. Dé un breve destello de luz (<1 ms) de una longitud de onda entre 350-700 nm y mida la amplitud máxima negativa o positiva de la respuesta ERC, que refleja la absorción M / R en esta longitud de onda específica.
    NOTA: Para la activación síncrona de un gran grupo de moléculas de fotopigmento, se requiere un breve e intenso destello de luz para empacar el contenido de fotones en una corta duración. La conversión máxima de fotopigmento de R a M por flash azul puede alcanzar ~ 80% del total de moléculas de fotopigmento debido a la superposición en el espectro de absorción de R y M (Figura 3A). Por lo tanto, en longitudes de onda inferiores a ~ 550 nm, el ERC tiene dos componentes: una fase negativa que refleja la respuesta de la metarhodopsina y una fase positiva que refleja la respuesta de la rodopsina restante. El ERC depende linealmente de la intensidad de la luz (Figura 5D). En consecuencia, para derivar la sensibilidad espectral de los estados R y M, cada fase del ERC necesita ser normalizada en las diversas longitudes de onda para una energía igual29.
  3. Repita los pasos 2.1.-2.2. utilizando destellos de diferentes longitudes de onda.
  4. Trazar el ERC positivo y negativo normalizado en función de la longitud de onda.
    NOTA: El fuerte destello de luz induce una corriente masiva a través de los canales sensibles a la luz que conduce a un estrés metabólico en el fotorreceptor, que, a su vez, causa la apertura del canal independiente de la luz. El ERC se superpone a esta corriente constitutiva.

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Representative Results

La Figura 2 ejemplifica la robustez y facilidad de uso de la técnica ERG. Es robusto porque se registra en la mosca prácticamente intacta mediante una técnica simple de registros de voltaje extracelular que requieren una configuración electrofisiológica simple. La robustez se manifiesta mediante la obtención de registros de respuestas de luz con amplitudes relativamente grandes (en el rango de milivoltios) incluso cuando las mutaciones reducen o distorsionan fuertemente la respuesta de la luz. Por lo tanto, incluso un experimentador sin experiencia puede usar la configuración experimental altamente simple y aprender a obtener resultados significativos en unos pocos días. El objetivo principal de la técnica diseñada para medir los niveles de fotopigmento se logra mediante métodos extremadamente simplificados de la PDA (Figura 2C) y ERP (Figura 2C-E). La alternativa, a saber, la microespectrofotometría, requiere equipos ópticos costosos y una capacitación y habilidad considerables (Figura 3B). El ERC (Figura 5A-D), aunque técnicamente desafiante, es menos sensible a la preservación celular; se caracteriza por una alta relación señal-ruido y la eliminación de la capacitancia de la membrana.

Figure 1
Figura 1: El ciclo fotoquímico: la activación y desactivación del fotopigmento. (A) Iluminación azul saturada (flecha azul ondulada) fotoconvierte rodopsina (R) a metarhodopsina (M). La fosforilación múltiple de M por la rodopsina quinasa y la posterior unión de la arrestina 2 (ARR2) inactiva la M. La luz naranja (flecha roja ondulada) fotoconvierte M no fosforilada de nuevo a R. La M no fosforilada activa la proteína G heterotrimérica (Gqαβγ), provocando la disociación de Gqα de Gqβγ y el intercambio de GDP unido con GTP citoplasmático. Gqα-GTP luego activa la fosfolipasa C (PLC), que hidroliza PIP2 a diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3), activando así los canales TRP / TRPL de una manera aún poco clara. La quinasa dependiente de calmodulina Ca2+ (CaMKII) fosforila el complejo M pp-ARR2 y sufre endocitosis y degradación dependientes de clatrina. La iluminación con luz naranja (flecha roja ondulada) fotoconvierte el complejo M pp-ARR2 a R fosforilada (Rpp), liberando ARR2 al citosol. La R fosforilada (Rpp) sufre desfosforilación por la rodopsina fosfatasa (rdgC), produciendo R listo para otro ciclo del fotopigmento. (B) Perfil de profundidad del ERG de la mosca de ojos blancos a un estímulo blanco de 1 s (columna central) o un destello estroboscópico blanco (columna derecha). Los estímulos se indican mediante barras o puntos debajo de las huellas. Las trazas se organizan verticalmente en orden de profundidad, con la traza superior registrada ~ 10 μm por debajo de la córnea, con cada registro posterior 25 μm más profundo que el anterior. A la izquierda hay un dibujo lúcido de la cámara de una sección correspondiente a través de otro ojo, que indica retina, membrana basal (BM), corteza laminar, cartuchos laminares (seccionados oblicuamente) y corteza medular. Esta cifra ha sido modificada de Stephenson y Pak11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Registros de electrorretinograma (ERG) de respuestas de luz de tipo salvaje de ojos blancos (w1118) y Drosophila mutante que muestran la relación intensidad-respuesta, postpotencial despolarizante prolongado (PDA) y potencial de metarodipsina (potencial M). (A) Relación intensidad-respuesta de una mosca WT (w1118) obtenida por una serie de luces naranjas (filtro de borde OG590, la energía total emitida desde el borde de la guía de luz utilizando el filtro naranja fue de 4 mW) con intensidad de luz creciente indicada en escala -log. El recuadro muestra la respuesta indicada en una escala de tiempo más rápida. Recuadro: Los principales componentes del ERG son la respuesta de voltaje extracelular del fotorreceptor (potencial receptor), los transitorios "on" y "off" (respuesta ON, OFF) al principio y al final del estímulo de luz, y la respuesta lenta de las células glía (flechas). (B) La amplitud pico promedio de las respuestas ERG se traza en función de la intensidad relativa de la luz. (C) El ERP de una mosca WT (w1118) se obtuvo mediante la aplicación de luz azul saturante (BP450/4 nm, la energía total emitida desde el borde de la guía de luz utilizando el filtro azul fue de 1 mW) que inicialmente induce un PDA. El ERP (recuadro) se obtuvo mediante un siguiente flash verde intenso (~70 J, 2 ms de duración) (flecha, filtro de interferencia de banda ancha de 550 nm), que suprimió la PDA. Recuadro: los diversos componentes del ERP incluyen el potencial M1 negativo corneal y el potencial M2 positivo, como se indica. También se indica un residual en respuesta transitoria ("ON"). (D-E) La conversión de fotopigmento es necesaria para la inducción del potencial M: (D) El potencial M se obtuvo mediante un flash verde (filtro de interferencia de banda ancha de 550 nm) después de la adaptación azul, pero no por un destello azul (BP450/4 nm) después de la adaptación azul en WT (w1118) mosca. (E) El protocolo de D se repitió en WT (w1118, traza negra) y dos moscas mutantes (PLC mutante nulo, norpAP24, traza naranja, y mutante de rodopsina hipomórfica, ninaEP318, traza roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Espectros de absorción de fotopigmentos de moscas y percebes. (A) Espectros de absorción relativos de mosca rodopsina (R) y metarhodopsina (M) calculados a partir de mediciones fotométricas del espectro de diferencia y el espectro de fotoequilibrio. Esta figura ha sido modificada a partir de Selinger y Minke35. (B) Dos nomogramas de Dartnall con longitudes de onda máximas de 492 nm y 532 nm, con una relación de absorción máxima de 1,63:1, respectivamente. La diferencia entre estas curvas da el mejor ajuste al espectro de diferencia medido a partir de los ocelos del percebe Balanus eborneus, obtenido por mediciones de transmisión en el rango de 400-650 nm después de saturar la adaptación monocromática de azul (442 nm) y naranja (596 nm). Esta figura ha sido modificada de Minke y Kirschfeld36. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: El fenotipo PDA de los mutantes nina, ina y Arr2 . (A) El protocolo de inducción y supresión del CAP en Drosophila. El protocolo de inducción PDA se compone de una iluminación inicial utilizando pulso de luz naranja de máxima intensidad (filtro de borde 590, la energía total emitida desde el borde de la guía de luz utilizando el filtro naranja fue de 4 mW, barra naranja) seguido de la aplicación de tres pulsos de luz azul de máxima intensidad (los pulsos2º y3º son para verificación de alcanzar el PDA máximo, Filtro BP450/40 nm, la energía total emitida desde el borde de la guía de luz utilizando el filtro azul fue de 1 mW, tres barras azules). La supresión de PDA se obtuvo mediante la aplicación del pulso de luz naranja seguido de la aplicación de una luz naranja adicional (dos barras naranjas). El protocolo de inducción y supresión de PDA se repitió en el mutante de ojos blancos del gen estructural del fotopigmento R1-6, ninaEP318 7 (medio). El protocolo de inducción y supresión de PDA también se repitió en el mutante nulo de ojos blancos de la proteína quinasa C específica del ojo (PKC32) inaCP209 (abajo). (B) Una comparación entre la cantidad de luz azul requerida para la inducción de un PDA entre WT de ojos blancos (W1118) y mutante Arr2 nulo (Arr23). Un tren de pulsos de luz naranja alterna (saturando 590 filtros de borde) y azul (BP450/40 nm) de intensidades de luz crecientes (ND en escala relativa -log). A la luz azul de intensidad -log 1, se induce un PDA (arriba). El paradigma de la traza superior se repitió en el mutante Arr23 mostrando que el PDA fue inducido a la luz azul de ~ 10 veces la intensidad de luz más tenue (-log 2) (abajo). (C) Un tren de pulsos de luz azul tenue (-log 2) de intensidad constante no logró inducir un PDA en W1118 fly (izquierda), mientras que el mismo tren de luces azules tenues indujo un PDA por el pulso de luz1st en el mutante Arr23 (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Registros de células enteras con pinza de parche de las respuestas de luz de ommatidios aislados, registrados a partir de WT de ojos blancos (w1118), que muestran la generación de corriente receptora temprana (ERC) y su relación intensidad-respuesta. (A) Grabaciones de células enteras con pinza de parche de ommatidio aislado de la mosca WT (w1118) de respuesta ERC bifásica con latencia de submicrosegundos. El estímulo de luz se compone de un intenso (~ 220 J, 0,8 ms de duración) flash de luz azul (filtro de banda ancha con absorción máxima a 425 nm, flecha) estimulación aplicada después de una fuerte adaptación al amarillo-verde (filtro de banda ancha con absorción máxima a 546 nm de luz, traza negra). Al inicio de la luz, se observa un artefacto eléctrico negativo rápido. La fase negativa surge de la activación de M, y la fase positiva surge de la activación de R. La activación de la corriente inducida por la luz (LIC) se manifiesta por la fase negativa retardada que surge de la apertura de los canales sensibles a la luz. El mutante nulo ninaEI17 mostró una falta de respuesta ERC al mismo destello de luz aplicado al ommatidio aislado (traza roja). (B) Medición ERC de fotopigmentos Rh1 registrados desde la misma célula que (A). El rastro negro muestra una respuesta negativa monofásica (estado M) a la estimulación del destello naranja de la mosca WT (w1118) después de una fuerte adaptación a la luz azul. (C) Muestra de trazas bifásicas de ERC medidas a partir de una sola célula fotorreceptora de Drosophila transgénica (opn4;ninaEI17) que expresan ectópicamente ratones fotopigmento de melanopsina (opn4) en fotorreceptores de mosca R1-6 en respuesta al aumento de las intensidades de las luces de flash blancas (en una escala relativa -log I; ND indica filtros de densidad neutra). El inicio del flash se indica mediante la flecha. (D) El aumento de la intensidad de la luz se manifestó por un aumento lineal de la amplitud ERC de opn4;ninaEI17. Un gráfico de la amplitud pico promedio de la fase negativa de las respuestas ERC (escala logarítmica) en función de la intensidad relativa de la luz (I/Imax, también en escala logarítmica). La línea recta continua representa una curva de regresión lineal que mejor se ajusta a los puntos experimentales (R2 = 0,99, las barras de error son SEM, n = 5). Esta cifra ha sido modificada a partir de Yasin et al.29. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Herramientas y dispositivos necesarios para la fijación de moscas y la preparación de pipetas de registro. (A) Sistema de traviesas de mosca; (B) Pedal del sistema fly sleeper; (C) Fuente de luz fría; D) Microscopio estereoscópico; (E) Calentador de filamento de cera; f) Soldador; (G) Pedal del calentador de filamento de cera; (H) Pinzas rugosas; (I) Soporte de mosca magnética; (J) Cera de baja temperatura de fusión; K) Toallitas delicadas; (L) Tirador de pipeta vertical; (M) Jeringa con punta alargada; (N) Soportes de electrodos; (O) Capilares de vidrio de borosilicato; (P) Mosca fija. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Descripción general de la configuración del ERG. (A) Generador de impulsos; b) Ordenador; C) Convertidor A/D; (D) Amplificador; E) Microscopio estereoscópico; F) Micromanipulador (fino mecánico); (G) Sistema preamplificador de microelectrodos con etapa de cabeza; H) Mesa antivibración; (I) Bloque magnético de encendido / apagado; J) Micromanipulador (grueso mecánico); K) Jaula de Faraday; (L) Guía de luz de la fuente de luz de xenón; (M) Guía de luz del sistema de luz de flash; (N) Soporte de electrodo de tierra; (O) Detector de luz; (P) Soporte de electrodo de grabación; (Q) Soporte de mosca magnética; (R) Fuente de alimentación de lámpara de xenón; (S) Soporte de filtros de color y ND; T) Banco óptico; (U) Sistema de lámpara de flash; (V) Controlador del obturador; (W) Fuente de alimentación de la lámpara; (X) Sistema de luz de flash de xenón Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La solución de Ringer
Reactivo Concentración (mM)
NaCl 130
Kcl 2
MgCl2 5
CaCl2 2
HEPES 10
Titulación del pH a 7,15 usando NaOH y HCl

Tabla 1: Composición de la solución de Ringer.

Archivo suplementario 1: Diagrama de circuito del regulador de fusión de cera. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La principal ventaja de usar la preparación de fotorreceptores Drosophila es su accesibilidad, la facilidad y precisión de la estimulación de la luz y, lo más importante, la capacidad de aplicar el poder de la genética molecular7. Extensos estudios genéticos han establecido Drosophila como un sistema modelo extremadamente útil para la disección genética de procesos biológicos complejos7. La estructura relativamente simple del genoma de Drosophila (que consta de solo cuatro cromosomas, incluidos los cromosomas sexuales X e Y, dos elementos autosómicos más grandes, los cromosomas 2 y 3, y el cuarto cromosoma de punto pequeño), la facilidad de crecimiento y el rápido tiempo de generación (~ 2 semanas a 24 ° C) hacen que Drosophila sea adecuado para detectar un gran número de moscas individuales mutagenizadas. Además, el aislamiento y mantenimiento de cualquier mutación aislada se hace posible debido a la generación de cromosomas balanceadores, que contienen marcadores dominantes y múltiples inversiones, que impiden la recombinación con los cromosomas nativos. Las herramientas moleculares disponibles han permitido estudiar productos genéticos modificados in vitro en su entorno celular nativo37. Esta poderosa metodología ha producido una gran cantidad de moscas mutantes con defectos en nuevas proteínas que de otro modo habrían sido difíciles de predecir7.

La principal ventaja de utilizar el ERG para mediciones de niveles de fotopigmento y sensibilidad a la luz es su simplicidad y facilidad de aplicación y su gran relación señal-ruido. La desventaja de utilizar el ERG es su origen celular heterogénico, distorsionando la forma de onda de la respuesta de luz derivada de los fotorreceptores9. La principal ventaja de las grabaciones de celda entera con abrazadera de voltaje es la capacidad de derivar el cambio de conductancia midiendo la relación corriente-voltaje (I-V). La apertura y el cierre de los canales TRP y TRPL durante y después de la iluminación se reflejan en esta medición13. Además, se obtiene una alta relación señal-ruido debido a la baja resistencia de la pipeta de grabación (~ 10 MΩ) y la medición de corrientes, lo que permite mediciones confiables de protuberancias cuánticas (respuestas de un solo fotón), lo que es útil para calibrar la intensidad de luz efectiva38. Un inconveniente importante de las grabaciones de células enteras con pinza de parche es que, si bien las grabaciones ERG se pueden mantener durante horas incluso bajo intensidades de luz extremas, es difícil realizar grabaciones confiables de células enteras con abrazadera de parche durante más de 15-30 minutos, y se requiere estimulación con luz tenue para grabaciones prolongadas. Para obtener grabaciones de células enteras, se requiere contacto directo entre la pipeta de grabación y la membrana fotorreceptora. El contacto directo se logra mediante la eliminación de las células pigmentarias (gliales) que rodean la ommatidio34 (Figura 1B). La eliminación de células pigmentarias causa estrés metabólico porque la célula fotorreceptora no puede sintetizar los metabolitos necesarios para la producción de trifosfato de adenosina (ATP), interrumpiendo el suministro metabólico39. Dado que los canales TRP y TRPL son vulnerables a la anoxia y se abren fácilmente espontáneamente en la oscuridad debido al agotamiento del ATP, el uso de ommatidios aislados impone una gran dificultad40,12. Todo el procedimiento tiene que hacerse bajo una luz roja tenue porque la respuesta de la luz induce un gran consumo de ATP34.

La mayoría de las mutaciones en la cascada de fototransducción inducen una disminución de la sensibilidad a la luz. Esta reducción en la sensibilidad a la luz puede ser fácilmente detectada por una pantalla basada en la medición de la relación intensidad-respuesta. Los paradigmas de intensidad-respuesta se logran mediante estimulaciones de luz repetidas con intensidad creciente en una escala logarítmica. Se requiere aumentar (y no disminuir) las intensidades de luz naranja para evitar la adaptación a la luz. El ERG (M-potential) y el PDA son métodos muy simples para medir los niveles de fotopigmento. La alternativa, a saber, la microespectrofotometría36, requiere un equipo óptico costoso y una capacitación y habilidad considerables.

Para concluir, el ERG es una herramienta simple de aplicar pero relativamente inexacta. El registro de célulasenteras 31 es preciso para medir los niveles de fotopigmento mediante el uso del ERC, y es esencial para compensar la inexactitud y las limitaciones del ERG.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Fundación de Ciencias de Israel (ISF) y la Fundación Binacional de Ciencias de Estados Unidos e Israel (BSF). Agradecemos al Sr. Anatoly Shapochnikov por la construcción del calentador de filamento de cera.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

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References

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

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Neurociencia Número 184
Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores <em>de Drosophila</em>
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Gutorov, R., Katz, B., Minke, B.… More

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

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