本实验方案描述了两种物种——Zea mays 和 Festuca rubra 根部丛枝菌根定殖模式与策略的评估方法。采用 MycoPatt 方法可计算相关参数，将菌根结构转化为数字数据，并绘制其在根部的实际位置分布图。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
丛枝菌根真菌是植物根部的共生体，其作用是促进寄主植物的生长发育，并维持生态系统的营养平衡。菌根定殖过程受多种因素影响，如土壤生态、真菌与寄主的遗传多样性以及农艺管理措施。这些因素的协同作用促使形成复杂的菌丝网络，并在根细胞内进一步发育形成泡囊和丛枝结构。本研究旨在分析菌根结构定位方法（MycoPatt）在Festuca rubra和Zea mays根系中定位真菌结构的效率。另一项目标是通过每种植物的菌根分布图谱，探究真菌的定殖策略。通过获取并整合多幅显微图像，可对玉米和红羊茅植物中的菌根定殖情况进行评估，从而提供所形成结构实际位置的信息。观察到的菌根定殖模式揭示了不同植物在与土壤共生真菌建立连接方面的效率差异，这种差异由所施加的处理措施和生长阶段引起。通过MycoPatt方法获得的详细菌根图谱，有助于早期检测植物从土壤中获取共生效益的效率。
引言
丛枝菌根（AM）真菌是一类土传内生真菌，长期以来一直是研究人员关注的重点。由于其广泛存在于大多数植物根系中，并参与养分循环，因此在所有存在草本植物的生态系统稳定性中发挥着至关重要的作用1,2。通过其根外菌丝，AM真菌充当植物根系的真菌性延伸，尤其在难以到达的区域发挥功能3。其主要活动发生在寄主植物根部，在此处AM真菌形成庞大的菌丝网络以及称为丛枝的特定胞内结构。由于缺乏寄主特异性，该共生真菌能够同时定殖多种植物物种。这一特性使AM真菌在生态系统中承担资源分配与养分调控的角色；此外，该真菌还能支持植物存活并促进植物生长表现4,5,6,7。AM真菌对寄主根系的反应体现在根内菌丝的延伸程度与分布位置，以及胞内形成的丛枝的存在状态与形态特征。胞内丛枝作为两种共生体之间的物质交换位点，是快速转运过程发生的区域。AM真菌所产生的结构具有物种依赖性，除丛枝外，在根部还可形成泡囊、孢子以及辅助细胞。
在评估植物根部的丛枝菌根（AM）共生体时存在诸多挑战
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 生物材料的选择、根系取样与保存
- 使用铁铲分别采集每个变异株及其重复样本的完整根系（图1A）。用手轻轻去除根系上的大块土壤团聚体。将整个根系清洗干净，并在带有1 cm × 1 cm网格的称量台上进行测量（图1B）。将每株植物的根系分别剪下，放入塑料袋中。
- 将每株植物的所有洁净根系收集到一个塑料袋中，并将同一变异株的所有样本放入一个较大的袋子中。在每个袋子上标注发育阶段/变异株名称及采样日期。将根系样品储存于冰箱或冷冻箱中，温度保持在−4 °C至−20 °C之间，直至后续处理。
2. 显微镜观察用根系的处理、透明化与染色
注意：进行本实验步骤时，需佩戴手套、口罩，并在微生物/化学通风橱中操作。
- 确保根系在室温下缓慢解冻。在所有处理步骤中，使用小玻璃瓶（30–50 mL）以减少所需试剂的用量。
- 执行以下四步慢速透明化与染色流程15。所有步骤均在室温下进行。该方法可同时处理大量样品，且无需使用水浴加热煮沸。
- 根系透明化：将一株植物的所有根系放入一个玻璃瓶中。用自来水配....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在染色步骤后正确使用轻柔压片法处理根系，可清晰显示玉米（Zea mays）（图8A-C）和红羊茅（Festuca rubra）（图9A-E）的菌根结构细节，菌根结构与根细胞之间对比明显，并因蓝色染色可确认中柱的存在。若透明和染色步骤未能成功，根样品难以压碎，且菌根结构不清晰（图10A-E）。此时，应重复整个透明-染色流程。
利用菌根定殖格局方法及 MycoPatt 工具，能够对定殖机制进行全面探索。该方法可对每个物种的定殖格局与策略进行深入的微观尺度分析。图11 和
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
菌根定殖研究对于农业领域新策略的开发至关重要。多种栽培植物与丛枝菌根形成共生关系的潜力，使其成为农业生态系统可持续发展及维持系统健康的重要组成部分16,17,18,19,20。因此，有必要更深入地理解定殖机制及真菌的生存策略，以获取植物如何与土壤中的营养网络建立联系、其产量及生存潜力的关键数据。因此，在智慧农业背景下，本世纪必须开展对定殖情况的深入评估，相关研究需真实反映真菌在植物根部的分布状态。
菌根根系模式分析方法能够对根系进行如此深入的扫描，但该方法同时具有局限性与优势11。其局限性包括：首次分析植物时需要评估大量样本、需要进行图像处理，以及需手动标注根系中的菌根结构；但这些局限均可通过该方法带来的多种长期.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本文所用数据来自两个博士研究，研究主题领域为 "农艺投入驱动的玉米菌根模式"，由 Victoria Pop-Moldovan 操作完成， "山地草原优势物种的菌根状况及定殖发育"由Larisa Corcoz在Roxana Vidican教授指导下完成。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5% 苹果醋 | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| 蓝色墨水 | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| 盖玻片 | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| 镊子，PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| 47 mL 玻璃瓶 | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| 覆膜袋 | Peach | PP525-08 | 名片 (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| II 级 ABS 生物安全柜 | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| 显微镜载玻片 | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel 和 PowerPoint；电子表格与演示文稿 |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| 丁腈手套 | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika 相机 | OPTIKA | CP-8; P8 Pro 相机，8.3 MP CMOS，USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika 显微镜 | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| FFP3 防护口罩 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| 手术刀 | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| 9% 白葡萄酒醋 | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | O?ET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
参考文献
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).
- Jeffries, P., Barea, J. M. 4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. The Myco....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
