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方法文章

菌根图谱作为探索红羊茅（Festuca rubra）和玉米（Zea mays）根部定殖模式与真菌策略的工具

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DOI：

10.3791/63599

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2022年8月26日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Faculty of Agriculture, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca

本文内容

摘要

本实验方案描述了两种物种——Zea mays 和 Festuca rubra 根部丛枝菌根定殖模式与策略的评估方法。采用 MycoPatt 方法可计算相关参数，将菌根结构转化为数字数据，并绘制其在根部的实际位置分布图。

摘要

丛枝菌根真菌是植物根部的共生体，其作用是促进寄主植物的生长发育，并维持生态系统的营养平衡。菌根定殖过程受多种因素影响，如土壤生态、真菌与寄主的遗传多样性以及农艺管理措施。这些因素的协同作用促使形成复杂的菌丝网络，并在根细胞内进一步发育形成泡囊和丛枝结构。本研究旨在分析菌根结构定位方法（MycoPatt）在Festuca rubra和Zea mays根系中定位真菌结构的效率。另一项目标是通过每种植物的菌根分布图谱，探究真菌的定殖策略。通过获取并整合多幅显微图像，可对玉米和红羊茅植物中的菌根定殖情况进行评估，从而提供所形成结构实际位置的信息。观察到的菌根定殖模式揭示了不同植物在与土壤共生真菌建立连接方面的效率差异，这种差异由所施加的处理措施和生长阶段引起。通过MycoPatt方法获得的详细菌根图谱，有助于早期检测植物从土壤中获取共生效益的效率。

引言

丛枝菌根（AM）真菌是一类土传内生真菌，长期以来一直是研究人员关注的重点。由于其广泛存在于大多数植物根系中，并参与养分循环，因此在所有存在草本植物的生态系统稳定性中发挥着至关重要的作用1,2。通过其根外菌丝，AM真菌充当植物根系的真菌性延伸，尤其在难以到达的区域发挥功能3。其主要活动发生在寄主植物根部，在此处AM真菌形成庞大的菌丝网络以及称为丛枝的特定胞内结构。由于缺乏寄主特异性，该共生真菌能够同时定殖多种植物物种。这一特性使AM真菌在生态系统中承担资源分配与养分调控的角色；此外，该真菌还能支持植物存活并促进植物生长表现4,5,6,7。AM真菌对寄主根系的反应体现在根内菌丝的延伸程度与分布位置，以及胞内形成的丛枝的存在状态与形态特征。胞内丛枝作为两种共生体之间的物质交换位点，是快速转运过程发生的区域。AM真菌所产生的结构具有物种依赖性，除丛枝外，在根部还可形成泡囊、孢子以及辅助细胞。

在评估植物根部的丛枝菌根（AM）共生体时存在诸多挑战8,9。第一个挑战是AM共生体在整个寄主植物生长周期中持续发育，导致菌丝和丛枝结构发生多种变化。丛枝生长的不同阶段直至其退化解体在根中均清晰可见，但衰老的AM结构有时会被寄主消化，因而仅部分可见10。第二个挑战来自染色方法与实验方案、根系形态的高度多样性、细胞尺寸以及根组织厚度的差异，这些因素使得建立统一的方法十分困难。最后一个挑战在于AM定殖程度的评估与评分。目前存在多种评估AM定殖程度的方法，其客观性各不相同，且大多数方法仍局限于显微镜技术。较简单的方法基于根皮层中是否存在菌根结构进行判断，而更复杂的方法则依赖于视觉评分和定殖等级的划分，并结合定殖频率与强度进行综合评估。过去几十年已积累了大量关于多种植物菌根状态的数据，但大多数方法仅提供定殖的观察值，未能明确指出每种结构在根皮层中的实际位置。为满足对AM定殖更精确评估的需求，研究人员开发了一种基于根部菌根定殖模式显微分析（MycoPatt）的方法，以数字化形式整合详细的菌根分布图谱11。该方法还可实现对定殖参数的客观计算，并准确确定每种结构在根中的具体位置。

菌根真菌结构的位置对于回答以下两个问题具有重要意义。第一个问题是关于植物某一特定生长阶段中菌根定殖情况的分析。在此背景下，观察丛枝/泡囊的丰度，记录它们在根部的分布位置，并提供清晰的定殖图像及相关参数，具有重要价值。第二个问题涉及真菌策略及其方向性的识别，甚至可用来预测其未来的发展趋势。MycoPatt 的一个应用是用于对植物进行每日、每2-3天、每周或在不同生长阶段的连续分析。在此背景下，泡囊/丛枝的位置信息对于深入理解丛枝菌根定殖的生物学机制至关重要。这些参数和观察结果对于补充数学参数具有重要意义。

本文旨在展示 MycoPatt 系统在不同发育阶段的玉米（Zea mays）根系以及在不同长期施肥条件下红羊茅（Festuca rubra）根系中，探索其原生丛枝菌根真菌定殖潜力与策略的能力。为实现该目标，分析了来自两个实验的两个大型数据库。玉米实验位于克卢日农业科学与兽医大学教学实验农场的科约克纳（北纬46°44′56″，东经23°50′0″），土壤类型为质地为壤土的暗域土12。红羊茅实验是2001年建立于阿普塞尼山脉盖塔里（北纬46°49'064"，东经22°81'418''）的一个更大实验场地的一部分，土壤类型为前淋溶土（红壤）13,14。玉米在五个不同的生长物候期12进行采样：B1 = 2-4叶期（作为菌根定殖起始的对照点）；B2 = 6叶期；B3 = 8-10叶期；B4 = 穗形成期；B5 = 生理成熟期。从2-4叶期（A0）开始施用有机处理，形成两个梯度因子（A1 = 对照，A2 = 处理）。红羊茅根系样本采自具有五种长期施肥处理的实验，采样时期为开花期13,14：V1 = 对照，不施肥；V2 = 10 t·ha-1 粪肥；V3 = 10 t·ha-1 粪肥 + N 50 kg·ha-1, P2O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1；V4 = N 100 kg·ha-1, P2O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1；V5 = 10 t·ha-1 粪肥 + N 100 kg·ha-1, P2O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1。每个发育阶段的每种施肥处理均采集五株植物。分析了染色方案及其在样品处理时间和染色质量方面的表现。分别针对每个物种分析了丛枝菌根菌丝发育与其在根内结构存在之间的关系，并进一步确定了最有利于定殖的根系。基于定殖图谱和丛枝菌根参数值，分析了每种根系系统的特异性定殖模式。

玉米是一种一年生植物，这意味着其根系持续生长，这也是在生长阶段应用MycoPatt的主要原因。红羊茅是一种多年生植物，采自长期施用不同肥料的草地。其根系的生长期较短，约为1年，而抽穗期被视为植物从营养生长转向生殖生长的代谢转折点。为了在这些植物代谢活跃的关键时期进行取样，选择了上述时间点。对于生长在天然草地中的该物种而言，在生长期进行采样十分困难。

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方案

1. 生物材料的选择、根系取样与保存

  1. 使用铁铲分别采集每个变异株及其重复样本的完整根系（图1A）。用手轻轻去除根系上的大块土壤团聚体。将整个根系清洗干净，并在带有1 cm × 1 cm网格的称量台上进行测量（图1B）。将每株植物的根系分别剪下，放入塑料袋中。
  2. 将每株植物的所有洁净根系收集到一个塑料袋中，并将同一变异株的所有样本放入一个较大的袋子中。在每个袋子上标注发育阶段/变异株名称及采样日期。将根系样品储存于冰箱或冷冻箱中，温度保持在−4 °C至−20 °C之间，直至后续处理。

2. 显微镜观察用根系的处理、透明化与染色

注意：进行本实验步骤时，需佩戴手套、口罩，并在微生物/化学通风橱中操作。

  1. 确保根系在室温下缓慢解冻。在所有处理步骤中，使用小玻璃瓶（30–50 mL）以减少所需试剂的用量。
  2. 执行以下四步慢速透明化与染色流程15。所有步骤均在室温下进行。该方法可同时处理大量样品，且无需使用水浴加热煮沸。
    1. 根系透明化：将一株植物的所有根系放入一个玻璃瓶中。用自来水配制10% NaOH溶液，并倒入每个瓶中，直至完全浸没根系。剧烈振荡瓶体1至2分钟，使透明化溶液在根系中均匀分散。24小时后重复此操作，并将根系在透明化溶液中至少放置48小时。
      注：透明化完全的根系呈淡黄色至白色，质地柔软（用镊子轻压即可压碎）。
    2. 根系漂洗：每次将一个瓶中的内容物通过筛网过滤，回收透明化溶液。用自来水反复漂洗根系，直至完全去除透明化溶液。
      注：若未彻底去除透明化溶液，将影响后续染色效果。
    3. 根系染色：将漂洗后的根系放入洁净的玻璃瓶中。用自来水配制5%:5%墨水-醋酸溶液（5 mL蓝色墨水 + 5 mL 9%乙酸 + 90 mL自来水）。将溶液倒入每个瓶中，直至完全浸没根系。剧烈振荡瓶体1至2分钟，使染色液在根系中均匀分散。24小时后重复此操作，并将根系在该溶液中放置48小时。
      注：染色后的根系呈深蓝色。
    4. 根系部分脱色：用自来水冲洗染色后的根系1–2分钟。剧烈振荡瓶体以去除多余的染色液。若染色过深而影响显微观察，可重复该步骤。
      注：染色后的根系可在室温下保存于自来水中长达1周，染色质量不会改变（图2）。如需更长时间保存，可将根系置于5%市售苹果醋溶液（含5%乙酸）中，保存时间可达2–3个月。

3. 显微镜观察用根的处理

  1. 根系分段：将每个样品的染色根系置于带刻度的切板上（图3A）。将根系切割成1 cm长的片段（图3B）。为每种变异类型选取15个片段。
  2. 轻柔压片法进行片段制备：将根系平铺在载玻片上。使用覆膜袋覆盖根系，并从边缘开始轻轻碾压（图3C，D）。使用柔软的塑料工具（例如镊子、手术刀手柄、笔或带橡皮擦的铅笔）缓慢地在载玻片上展开根系。小心移除覆膜袋，并用盖玻片覆盖样品（图3E）。
    注意：根系呈管状结构，因此需将其展平至二维平面。该操作意味着从根系中点处分开，从而展示其内径的两个部分。在轻柔压片过程中使用覆膜袋，可使呈圆柱形的根系沿中点分离为两部分——左侧和右侧各一。通过这种方式，可对整条根系进行深入分析，而定殖程度这一参数则反映的是体积定殖情况（详见MycoPatt原始研究11）。本质上，我们是将一个圆柱体从中间切开，随后通过数学方法重建其整体结构。
  3. 用移液器向载玻片的一角加入少量水，使水缓慢扩散至整个载玻片（图3F）。用纸巾吸除多余水分。

4. 根样品的显微分析

  1. 使用配备高分辨率相机的显微镜。
  2. 从根段的一端开始分析切片，拍摄每个显微视野。将拍摄的每幅图像用特定编码重命名，以便后续真实地重组根的各部分。对于粗根，使用10倍或40倍放大倍数；对于细根，使用40倍放大倍数。同一物种的所有根样本应使用相同的物镜和放大倍数。

5. 显微镜后图像组装

  1. 使用演示软件设计用于图像拼接的画板。画板宽度应比图像宽度宽 2-3 cm。按采集顺序将同一片段的所有图像依次添加，并重建根段的完整长度（图 4A）。
    1. 简而言之，每个 1 cm 的根段共采集 15 张图像，并在演示软件中自上而下按 1 至 15 的顺序垂直排列，以重建该根段。
  2. 将图像居中对齐。使用垂直对齐功能，确保每张图像紧接前一张图像。在所有图像上叠加一个 10 格 × 150 格的网格，覆盖整个根段。
    1. 此外，在每张单独图像上叠加一个 10 × 10 的网格，并在该网格的每个格子中，若可见丛枝菌根（AM）结构，则填入数字 1 至 6；若无 AM 结构，则留空。通过此方法，可最大程度保证观察过程中 AM 结构定位的准确性，避免出现误差。
  3. 添加一个宽度为 10 格、长度为 150 格（即 15 个 10 格 × 10 格的方块）的表格。将表格的宽度调整为与图像宽度一致，长度调整为覆盖所有图像（图 4B）。

6. 菌根定殖的评分

  1. 根据菌根结构模式方法11中所述，使用特定编号对每种结构类型进行评分：1代表菌丝；2代表丛枝；3代表泡囊；4代表孢子；5代表辅助细胞；6代表侵入点（图4C）。对先前应用的网格中每个细胞所观察到的每一种菌根结构进行评分（图4D）。

7. 原始数据分析与结果提取

  1. 将所有获得的分数输入 MycoPatt 电子表格中11. 使用复制/粘贴功能将所有评分从演示文稿转移到名为第一个工作表中 原始数据 (图5).
  2. 结果的初步分析：使用 MycoPatt 电子表格工具中名为 parameters 的第三个工作表，以三种形式分别将结果以百分比（%）形式可视化图6A- C）。使用A至K列分析定植的横向图像；使用M至W列分析定植的纵向图像；使用Y至AI列分析每个15个10×10方格（第2–17行）的横向（平均）定植情况以及最终的平均定植水平（第19–20行）。
    注意：横向平均定植率用于计算与水平和垂直分析均相关的实际定植参数。通过这种方式，可避免仅使用水平或垂直分析时可能出现的误差（详见原始研究）。11）。此外，这组参数是针对显微镜视野的整个表面进行计算的。
    1. 使用针对每个参数的定义和公式来分析结果11使用以下定殖参数：定殖频率（%）、定殖强度（%）、丛枝（%）、泡囊（%）、孢子（%）和辅助细胞（%）、侵入点（%）、非菌根区域百分比（%）、总体定殖程度（%），以及菌根/非菌根区域报告。
      注意：如果分析的样品中缺少丛枝、泡囊、孢子、辅助细胞和侵入点，MycoPatt 电子表格将把这些结构记为零（0）。
  3. 菌根图谱的制作与提取：在名为 MycoPatt 的工作表的第二张表中，将菌根结构编码转换为颜色后，可视化所获得的图像 图表 (图7A）。将图表工作表中生成的图像导出为图片（图7B）。使用图例中的颜色代码来分析菌根模式。
  4. 菌根图谱分析：识别菌根图谱中最重要的结构及其组合方式。描述在所分析根系中观察到的菌根定殖模式。根据根内观察到的结构发育、分枝模式以及丛枝/泡囊的发育情况，描述菌根定殖策略。

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结果

在染色步骤后正确使用轻柔压片法处理根系，可清晰显示玉米（Zea mays）（图8A-C）和红羊茅（Festuca rubra）（图9A-E）的菌根结构细节，菌根结构与根细胞之间对比明显，并因蓝色染色可确认中柱的存在。若透明和染色步骤未能成功，根样品难以压碎，且菌根结构不清晰（图10A-E）。此时，应重复整个透明-染色流程。

利用菌根定殖格局方法及 MycoPatt 工具，能够对定殖机制进行全面探索。该方法可对每个物种的定殖格局与策略进行深入的微观尺度分析。图11 和

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讨论

菌根定殖研究对于农业领域新策略的开发至关重要。多种栽培植物与丛枝菌根形成共生关系的潜力，使其成为农业生态系统可持续发展及维持系统健康的重要组成部分16,17,18,19,20。因此，有必要更深入地理解定殖机制及真菌的生存策略，以获取植物如何与土壤中的营养网络建立联系、其产量及生存潜力的关键数据。因此，在智慧农业背景下，本世纪必须开展对定殖情况的深入评估，相关研究需真实反映真菌在植物根部的分布状态。

菌根根系模式分析方法能够对根系进行如此深入的扫描，但该方法同时具有局限性与优势11。其局限性包括：首次分析植物时需要评估大量样本、需要进行图像处理，以及需手动标注根系中的菌根结构；但这些局限均可通过该方法带来的多种长期...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本文所用数据来自两个博士研究，研究主题领域为 "农艺投入驱动的玉米菌根模式"，由 Victoria Pop-Moldovan 操作完成， "山地草原优势物种的菌根状况及定殖发育"由Larisa Corcoz在Roxana Vidican教授指导下完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5% 苹果醋FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.O?ET DE MEREhttps://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
蓝色墨水Pelikan4001https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
盖玻片Menzel-GlaserD 263 Mhttps://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
镊子，PMPVitalab9.171 411http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK.
htm?UID=55005bf838d8000000000000
&OFS=33
47 mL 玻璃瓶Indigo CardsBORCAN 47 ML HEXAGONALhttps://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
覆膜袋PeachPP525-08名片 (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
II 级 ABS 生物安全柜Bioquell UK LtdMicroflow Class II ABS Cabinethttp://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
显微镜载玻片DeltalabD100001https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign=
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Optika 相机OPTIKACP-8; P8 Pro 相机，8.3 MP CMOS，USB 3.0https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika 显微镜OPTIKAB383pLhttps://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
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