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Biology

फेस्टुका रूब्रा और ज़िया मेस की जड़ों में औपनिवेशीकरण पैटर्न और फंगल रणनीतियों का पता लगाने के लिए एक उपकरण के रूप में माइकोराइजल मैप्स

Published: August 26, 2022 doi: 10.3791/63599
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Faculty of Agriculture, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca

Summary

यहां प्रोटोकॉल दो प्रजातियों के लिए जड़ों में आर्बसकुलर माइकोराइजल औपनिवेशीकरण पैटर्न और रणनीति के आकलन के तरीकों का वर्णन करता है: ज़िया मेस और फेस्टुका रूबरा। माइकोपैट विधि का उपयोग मापदंडों की गणना, माइकोराइजल संरचनाओं को डिजिटल डेटा में बदलने और जड़ों में उनकी वास्तविक स्थिति के मानचित्रण की अनुमति देता है।

Abstract

आर्बसकुलर माइकोराइजल कवक पौधों की जड़ों में सिम्बियोट्स हैं। उनकी भूमिका मेजबान विकास को बनाए रखने और पारिस्थितिक तंत्र में पोषण संतुलन बनाए रखने के लिए है। औपनिवेशीकरण प्रक्रिया कई कारकों पर निर्भर है जैसे मिट्टी की पारिस्थितिकी, कवक और मेजबान की आनुवंशिक विविधता, और कृषि संबंधी प्रथाएं। उनकी सिंक्रनाइज़ कार्रवाई एक जटिल हाइफल नेटवर्क के विकास की ओर ले जाती है और जड़ कोशिकाओं में पुटिकाओं और आर्बस्कुल्स के द्वितीयक विकास की ओर ले जाती है। इस शोध का उद्देश्य फेस्टुका रूबरा और ज़िया मेस की जड़ों में फंगल संरचनाओं की स्थिति के लिए माइकोराइजल पैटर्न (माइकोपैट) विधि की दक्षता का विश्लेषण करना था। एक अन्य उद्देश्य प्रत्येक प्रजाति के माइकोराइजल मानचित्रों द्वारा प्रकट फंगल औपनिवेशीकरण रणनीति का पता लगाना था। कई सूक्ष्म छवियों का अधिग्रहण और संयोजन विकसित संरचनाओं की यथार्थवादी स्थिति पर जानकारी प्रदान करने के लिए मकई और लाल फेस्क्यू पौधों दोनों में माइकोराइजल औपनिवेशीकरण मूल्यांकन की अनुमति देता है। देखे गए माइकोराइजल पैटर्न लागू उपचार और विकास चरण के कारण मिट्टी के सहजीवी कवक के साथ संबंध विकसित करने के संदर्भ में प्रत्येक पौधे की परिवर्तनीय दक्षता को उजागर करते हैं। माइकोपैट विधि के माध्यम से प्राप्त माइकोराइजल विस्तृत नक्शे मिट्टी से सहजीवी अधिग्रहण में पौधे की दक्षता का जल्दी पता लगाने के लिए उपयोगी हैं।

Introduction

आर्बुस्कुलर माइकोराइजा (एएम) कवक मिट्टी से उत्पन्न एंडोफाइट्स की एक श्रेणी है जो लगातार शोधकर्ताओं के लिए रुचि का क्षेत्र है। अधिकांश पौधों की जड़ों में उनकी उपस्थिति और पोषक तत्व चक्रों में उनकी भागीदारी उन्हें हर पारिस्थितिकी तंत्र की स्थिरता में महत्वपूर्ण घटक बनाती है जहां जड़ी-बूटियों के पौधे मौजूद होते हैं। उनके अतिरिक्त-रेडिकुलर माइसेलियम के माध्यम से, एएम पौधे की जड़ों के लिए एक फंगल विस्तार के रूप में कार्य करताहै, खासकर कठिन-से-पहुंच वाले क्षेत्रों में। मुख्य गतिविधि मेजबान पौधे की जड़ों में है, जहां एएम बड़े हाइफे नेटवर्क और विशिष्ट इंट्रासेल्युलर संरचनाओं को विकसित करता है जिन्हें आर्बसकुल्स कहा जाता है। मेजबान विशिष्टता की कमी सिम्बियोनेट को एक ही समय में कई प्रजातियों को उपनिवेशित करने की अनुमति देती है। यह क्षमता एएम को पारिस्थितिकी तंत्र में संसाधन आवंटन और पोषक तत्व विनियमन की भूमिका प्रदान करती है; कवक पौधे के अस्तित्व में भी सहायता प्रदान करता है और पौधे के प्रदर्शन 4,5,6,7 में सहायता करता है। मेजबान जड़ों के लिए एएम प्रजातियों की प्रतिक्रिया इंट्रा-रेडिकुलर माइसेलियम के विस्तार और स्थान में दिखाई देती है और आर्बस्कुल्स की उपस्थिति और आकार इंट्रासेल्युलर रूप से विकसित होता है। इंट्रासेल्युलर आर्बसक्यूल्स दो सिम्बियोन्ट्स के बीच एक इंटरचेंज बिंदु के रूप में कार्य करते हैं और तेजी से हस्तांतरण प्रक्रियाओं की विशेषता वाले क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं। एएम द्वारा उत्पादित संरचनाएं प्रजातियों पर निर्भर हैं, और, जड़ों में आर्बसक्यूल्स के अलावा, वे पुटिकाओं, बीजाणुओं और सहायक कोशिकाओं को भी विकसित करते हैं।

पौधे की जड़ों 8,9 में एएम सिम्बियोन्ट्स के आकलन में कई चुनौतियां हैं। पहला एक मेजबानों की पूरी वनस्पति अवधि के दौरान उनका निरंतर विकास है, जो हाइफल आर्बसुलर संरचना में कई बदलावों की ओर जाता है। आर्बसकुलर विकास के विभिन्न चरण, उनके पतन तक, जड़ों में स्पष्ट रूप से मौजूद होते हैं, लेकिन सेनेसेंट एएम संरचनाएं कभी-कभी पच जाती हैं, जो उन्हें केवल आंशिक रूप से दिखाई देती हैं। दूसरी चुनौती को धुंधला विधि और प्रोटोकॉल, जड़ प्रणालियों की बड़ी विविधता, उनकी कोशिकाओं के आयाम और मोटाई में अंतर द्वारा दर्शाया जाता है, जो एक एकीकृत विधि का प्रस्ताव करना कठिन बनाता है। अंतिम चुनौती एएम उपनिवेशीकरण के मूल्यांकन और स्कोरिंग द्वारा दर्शाया गया है। ऐसे कई तरीके हैं जो निष्पक्षता की विभिन्न डिग्री के साथ एएम स्कोर करते हैं, और उनमें से अधिकांश अभी भी माइक्रोस्कोपी तकनीकों तक ही सीमित हैं। सरल लोग रूट कॉर्टेक्स में संरचनाओं की उपस्थिति / अनुपस्थिति पर आधारित हैं, जबकि अधिक जटिल लोग दृश्य स्कोरिंग और उपनिवेशीकरण कक्षाओं के उपयोग पर आधारित हैं, उपनिवेशीकरण घटना की आवृत्ति और तीव्रता के एकीकरण के साथ। पिछले दशकों में कई प्रजातियों की माइकोराइजल स्थिति पर बहुत सारे डेटा का उत्पादन किया गया है, लेकिन अधिकांश विधियां रूट कॉर्टेक्स में प्रत्येक संरचना की वास्तविक स्थिति को इंगित किए बिना उपनिवेशीकरण के देखे गए मूल्य तक ही सीमित हैं। एएम उपनिवेशीकरण पर अधिक सटीक परिणामों की आवश्यकता के जवाब के रूप में, जड़ों में माइकोराइजल पैटर्न (माइकोपैट) के सूक्ष्म विश्लेषण पर आधारित एक विधि को डिजिटल रूप में, विस्तृत माइकोराइजल मानचित्र11 को इकट्ठा करने के लिए विकसित किया गया था। इसके अलावा, विधि औपनिवेशीकरण मापदंडों की उद्देश्य गणना और जड़ में प्रत्येक संरचना की वास्तविक स्थिति के निर्धारण की अनुमति देती है।

एएम फंगल संरचनाओं की स्थिति निम्नलिखित दो प्रश्नों के उत्तर देने में महत्वपूर्ण हो सकती है। पहला एक पौधे के वनस्पति चक्र से एक विशिष्ट क्षण में उपनिवेशीकरण के विश्लेषण से संबंधित है। पुटिका बहुतायत का निरीक्षण करना बहुत उपयोगी है, रिपोर्ट करें कि वे जड़ में कैसे स्थित हैं, और एक बहुत ही स्पष्ट उपनिवेश छवि और पैरामीटर प्रदान करते हैं। दूसरा एक फंगल रणनीति और इसके अभिविन्यास का पता लगाने और यहां तक कि इसके भविष्य के विकास के पूर्वानुमान से संबंधित है। माइकोपैट का एक अनुप्रयोग दैनिक, हर 2-3 दिनों, साप्ताहिक, या विभिन्न विकास चरणों के दौरान विश्लेषण किए गए पौधों के लिए हो सकता है। इस संदर्भ में, एएम उपनिवेशीकरण के जैविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए पुटिकाओं / आर्बसकुल्स का स्थान महत्वपूर्ण है। ये पैरामीटर और अवलोकन गणितीय मापदंडों के पूरक के लिए बहुत उपयोगी हैं।

इस लेख का उद्देश्य विभिन्न विकास चरणों के दौरान ज़िया मेस (मकई) की जड़ों में और विभिन्न दीर्घकालिक निषेचन स्थितियों के तहत फेस्टुका रूबरा (लाल फेस्क्यू) जड़ों में देशी एएम कवक उपनिवेशीकरण क्षमता और रणनीति का पता लगाने के लिए माइकोपैट प्रणाली की क्षमता का प्रदर्शन करना है। उद्देश्य को पूरा करने के लिए, दो प्रयोगों से दो बड़े डेटाबेस का विश्लेषण किया गया था। मकई प्रयोग कोजोकाना (46 °44'56"lat. N और 23°50'0" लंबे) में स्थापित किया गया था। ई), कृषि विज्ञान और पशु चिकित्सा चिकित्सा विश्वविद्यालय के प्रायोगिक उपदेशात्मक फार्म में क्लुज एक दोमट बनावट मिट्टी के साथ एक फेओज़ियोम पर12. लाल फेस्क्यू प्रयोग 2001 में घेसारी, अपुसेनी पर्वत (46 ° 49'064 " लैट एन और 22 ° 81'418" लंबे घेसरी में स्थापित एक बड़ी प्रयोगात्मक साइट का एक हिस्सा है। ई), एक प्रीलुवोसोल (टेरा रोसा) मिट्टी के प्रकार13,14 पर। मकई को पांच अलग-अलग विकास फेनोफेज12: बी 1 = 2-4 पत्तियों में एकत्र किया गया था (माइकोराइजल उपनिवेशीकरण की शुरुआत के लिए एक नियंत्रण बिंदु के रूप में); बी 2 = 6 पत्तियां; बी 3 = 8-10 पत्ते; बी 4 = कोब गठन; बी 5 = शारीरिक परिपक्वता। 2-4 पत्तियों के चरण (ए0) से शुरू होकर, एक कार्बनिक उपचार लागू किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप दो-स्नातक कारक (ए 1 = नियंत्रण और ए 2 = उपचारित) हुआ। लाल फेस्क्यू की जड़ों को पांच दीर्घकालिक निषेचन13,14: वी 1 = नियंत्रण, गैर-निषेचित के साथ एक प्रयोग से फूलों पर एकत्र किया गया था; V2 = 10 t.ha-1 खाद; V3 = 10 t.ha-1 खाद + N 50 kg.ha-1, P2O5 25 kg.ha-1, K2O 25 kg.ha-1; V4 = N 100 kg.ha-1, P2O5 50 kg.ha-1, K2O 50 kg.ha-1; V5 = 10 t.ha-1 खाद + N 100 kg.ha-1, P2O5 50 kg.ha-1, K2O 50 kg.ha-1. प्रत्येक निषेचन संस्करण से प्रत्येक विकास चरण में पांच पौधे एकत्र किए गए थे। नमूना प्रसंस्करण समय और धुंधला होने की गुणवत्ता के संदर्भ में धुंधला प्रोटोकॉल और उनके प्रदर्शन का विश्लेषण किया गया था। एएम हाइफे विकास और जड़ों में इसकी संरचनाओं की उपस्थिति के बीच संबंध का प्रत्येक प्रजाति के लिए अलग से विश्लेषण किया गया था और उपनिवेशीकरण के लिए सबसे अनुमेय जड़ों की पहचान के साथ जारी रखा गया था। प्रत्येक रूट सिस्टम के विशिष्ट औपनिवेशीकरण पैटर्न का विश्लेषण उपनिवेशन मानचित्रों और एएम मापदंडों के मूल्य के आधार पर किया गया था।

मकई एक वार्षिक पौधा है, जिसका अर्थ है जड़ों की निरंतर वृद्धि, और यह बढ़ते चरणों में माइकोपैट को लागू करने का मुख्य कारण था। लाल फेस्क्यू एक घास के मैदान से एक बारहमासी पौधा है जिसे विभिन्न उर्वरकों के साथ लंबे समय तक इलाज किया जाता है। इसकी जड़ों में 1 वर्ष का कम विकास होता है, और एंथेसिस को वनस्पति बिंदु माना जाता है जब पौधा अपने चयापचय को वनस्पति से उत्पादक में बदल देता है। इन तीव्र गतिविधि अवधियों के दौरान इन पौधों को पकड़ने के लिए, उपर्युक्त समय बिंदुओं को चुना गया था। प्राकृतिक घास के मैदानों में उगाए जाने पर वनस्पति अवधि के दौरान नमूना लेना इस प्रजाति के लिए मुश्किल होता है।

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Protocol

1. जैविक सामग्री, जड़ नमूनाकरण और भंडारण का चयन

  1. प्रत्येक संस्करण के लिए अलग-अलग फावड़ा (चित्रा 1 ए) के साथ पौधों की पूरी जड़ को इकट्ठा करें और प्रतिकृति बनाएं। धीरे से, हाथ से, जड़ों से बड़ी मिट्टी के समुच्चय को हटा दें। पूरे रूट सिस्टम को धोएं और इसे 1 सेमी x 1 सेमी कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) के साथ पैमाने पर मापें। प्रत्येक पौधे के लिए जड़ों को अलग से काटें, और उन्हें प्लास्टिक बैग में रखें।
  2. प्रत्येक पौधे से सभी साफ जड़ों को एक प्लास्टिक बैग में इकट्ठा करें, और एक बड़े बैग में एक संस्करण से सभी नमूने एकत्र करें। प्रत्येक बैग पर स्टेज/वेरिएंट का नाम और सैंपलिंग डेट लिखें। प्रसंस्करण तक -4 डिग्री सेल्सियस और -20 डिग्री सेल्सियस के बीच के तापमान पर जड़ों को फ्रिज या फ्रीजर में स्टोर करें।

2. माइक्रोस्कोपी के लिए रूट प्रोसेसिंग, क्लियरिंग और धुंधलापन

नोट: प्रोटोकॉल के इस चरण के लिए दस्ताने, एक मास्क और एक सूक्ष्मजीवविज्ञानी / रासायनिक हुड का उपयोग करें।

  1. सुनिश्चित करें कि रूट पिघलने की प्रक्रिया कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे की जाती है। प्रसंस्करण के सभी चरणों के लिए, आवश्यक एजेंटों की मात्रा को कम करने के लिए छोटे जार (30-50 एमएल) का उपयोग करें।
  2. धीमी समाशोधन और धुंधला प्रक्रिया 15 के निम्नलिखित चारचरणों का पालन करें। कमरे के तापमान पर सभी चरणों का पालन करें। यह विधि उबलने के लिए पानी के स्नान के उपयोग के बिना एक ही समय में बड़ी संख्या में नमूनों के प्रसंस्करण की अनुमति देती है।
    1. जड़ साफ़ करना: एक जार में एक पौधे से सभी जड़ों को रखें। नल के पानी के साथ 10% NaOH समाधान तैयार करें और इसे प्रत्येक जार में डालें जब तक कि यह जड़ों को पूरी तरह से कवर न कर ले। जड़ों में समाशोधन समाधान के समरूप फैलाव का उत्पादन करने के लिए जार को 1 मिनट या 2 मिनट के लिए जोर से हिलाएं। 24 घंटे के बाद इस प्रक्रिया को दोहराएं और कम से कम 48 घंटे के लिए समाशोधन समाधान में जड़ों को छोड़ दें।
      नोट: साफ जड़ों में एक हल्का पीला (सफेद तक) पहलू होता है, और स्थिरता नरम होती है (उन्हें चिमटी से दबाकर आसानी से कुचला जा सकता है)।
    2. रूट कुल्ला: छलनी के माध्यम से एक बार में एक जार की सामग्री को पास करें। समाशोधन समाधान को रीसायकल करें. नल के पानी में जड़ों को कई बार धोएं जब तक कि समाशोधन समाधान पूरी तरह से हटा न जाए।
      नोट: यदि समाशोधन समाधान पूरी तरह से हटाया नहीं गया है, तो यह धुंधला प्रक्रिया की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा।
    3. जड़ धुंधला: कुल्ला जड़ों को एक साफ जार में रखें। नल के पानी के साथ 5%:5% स्याही-सिरका समाधान तैयार करें (5 एमएल नीली स्याही + 5 एमएल 9% एसिटिक एसिड + 90 एमएल नल का पानी)। प्रत्येक जार में घोल डालें जब तक कि यह जड़ों को पूरी तरह से कवर न कर ले। जड़ों में धुंधला घोल का समरूप फैलाव उत्पन्न करने के लिए जार को 1 मिनट या 2 मिनट के लिए जोर से हिलाएं। 24 घंटे के बाद इस प्रक्रिया को दोहराएं और इस घोल में जड़ों को 48 घंटे के लिए छोड़ दें।
      नोट: दाग वाली जड़ों में एक तीव्र नीला रंग होता है।
    4. रूट आंशिक स्टेनिंग: दाग वाली जड़ों को नल के पानी में 1-2 मिनट के लिए धो लें। अतिरिक्त धुंधला घोल को हटाने के लिए जार को जोर से हिलाएं। प्रक्रिया को दोहराएं यदि धुंधला बहुत तीव्र है और स्पष्ट सूक्ष्म मूल्यांकन की अनुमति नहीं देता है।
      नोट: दागदार जड़ों को धुंधला गुणवत्ता में बदलाव किए बिना कमरे के तापमान पर 1 सप्ताह तक नल के पानी में रखा जा सकता है (चित्रा 2)। लंबी अवधि के लिए, जड़ों को 5% वाणिज्यिक सेब सिरका समाधान (5% एसिटिक एसिड) में 2-3 महीने तक बनाए रखा जा सकता है।

3. माइक्रोस्कोपी के लिए रूट प्रोसेसिंग

  1. रूट विभाजन: प्रत्येक नमूने से दाग वाली जड़ों को स्केल कटिंग बोर्ड (चित्रा 3 ए) पर रखें। जड़ों को 1 सेमी खंडों में काटें (चित्रा 3 बी)। प्रत्येक संस्करण के लिए 15 सेगमेंट चुनें।
  2. सेगमेंट तैयार करने के लिए कोमल क्रशिंग विधि: एक स्लाइड पर जड़ों को फैलाएं। जड़ों को ढंकने के लिए एक लैमिनेटिंग थैली का उपयोग करें और धीरे से उन्हें किनारे से शुरू करके कुचल दें (चित्रा 3 सी, डी)। धीरे-धीरे स्लाइड पर जड़ों को प्रदर्शित करने के लिए एक नरम प्लास्टिक उपकरण का उपयोग करें, जैसे, चिमटी, स्केलपेल हैंडल, पेन, या इरेज़र के साथ पेंसिल। लैमिनेटिंग थैली को ध्यान से हटा दें और नमूने को कवरस्लिप (चित्रा 3 ई) के साथ कवर करें।
    नोट: जड़ों में एक ट्यूबलर रूप होता है, इसलिए उन्हें द्वि-आयामी विमान में अलग करना आवश्यक है। यह क्रिया मध्य बिंदु पर जड़ों के पृथक्करण का अनुमान लगाती है, जिससे आंतरिक व्यास के दो भागों का प्रदर्शन होता है। कोमल क्रशिंग प्रक्रिया में लैमिनेटिंग पाउच का उपयोग जड़ों के प्रदर्शन की अनुमति देता है, जिसमें एक सिलेंडर रूप होता है, दो टुकड़ों में- एक बाईं ओर और एक दाईं ओर- उनके मध्य बिंदु की ओर। इस तरह, पूरे रूट का गहराई से विश्लेषण किया जाता है, और औपनिवेशीकरण की डिग्री वह पैरामीटर है जो वॉल्यूमेट्रिक औपनिवेशीकरण को दर्शाता है (माइकोपैट11 पर मूल काम में वर्णित)। मूल रूप से, हमने एक सिलेंडर को आधे में काट दिया, और उसके बाद, हम इसे गणितीय रूप से पुनर्निर्माण करते हैं।
  3. एक पिपेट के साथ स्लाइड के एक कोने में पानी जोड़ें और पानी को धीरे-धीरे स्लाइड पर फैलने दें (चित्रा 3 एफ)। अतिरिक्त पानी को पेपर तौलिया से निकालें।

4. जड़ के नमूनों का सूक्ष्म विश्लेषण

  1. एक अच्छे रिज़ॉल्यूशन कैमरे से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. एक छोर से शुरू होने वाली स्लाइड्स का विश्लेषण करें। प्रत्येक सूक्ष्म क्षेत्र को पकड़ें। कैप्चर की गई प्रत्येक छवि को एक कोड के साथ नाम दें जो रूट भागों के वास्तविक पोस्ट-संयोजन की अनुमति देगा। मोटी जड़ों के लिए, 10x या 40x आवर्धन का उपयोग करें, और पतली जड़ों के लिए, 40x आवर्धन का उपयोग करें। एक प्रजाति से जड़ों के पूरे सेट के लिए एक ही उद्देश्य और आवर्धन का उपयोग करें।

5. पोस्ट-माइक्रोस्कोपी छवि संयोजन

  1. छवि संयोजन के लिए ड्राइंग बोर्ड डिजाइन करने के लिए प्रस्तुति सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। छवि की चौड़ाई की तुलना में चौड़ाई 2-3 सेमी चौड़ा सेट करें। उनके कैप्चर के क्रम में एक खंड से सभी कैप्चर की गई छवियों को जोड़ें और रूट सेगमेंट की पूरी लंबाई का पुनर्निर्माण करें (चित्रा 4 ए)।
    1. संक्षेप में, प्रत्येक 1 सेमी खंड के लिए कुल 15 चित्र एकत्र करें और सेगमेंट के पुनर्निर्माण के लिए प्रस्तुति सॉफ्टवेयर में 1 से 15 से शुरू करके उन्हें लंबवत रूप से व्यवस्थित करें।
  2. छवियों को केंद्र में संरेखित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए ऊर्ध्वाधर संरेखण का उपयोग करें कि प्रत्येक छवि पिछले एक का अनुसरण कर रही है। सभी चित्रों पर, पूरे रूट सेगमेंट को कवर करने के लिए 10 कोशिकाओं x 150 कोशिकाओं का एक ग्रिड रखें।
    1. इसके अतिरिक्त, प्रत्येक व्यक्तिगत चित्र पर, एक 10 x 10 ग्रिड रखें, और इस ग्रिड के प्रत्येक सेल में, एक एएम संरचना दिखाई देने पर एक से छह तक एक संख्या डालें या यदि कोई एएम संरचना मौजूद नहीं है तो खाली छोड़ दें। इस तरह, प्रक्रिया की सटीकता अधिकतम है जिसमें एएम संरचनाओं के स्थान में कोई त्रुटि नहीं देखी जा रही है।
  3. चौड़ाई में 10 कोशिकाओं और लंबाई में 150 कोशिकाओं (10 कोशिकाओं के 15 वर्ग x 10 कोशिकाओं) के ग्रिड के लिए एक तालिका जोड़ें। तालिका चौड़ाई आयाम को छवियों की चौड़ाई में परिवर्तित करें. सभी छवियों को शामिल करने के लिए तालिका की लंबाई बदलें (चित्रा 4 बी)।

6. माइकोराइजल औपनिवेशीकरण का स्कोरिंग

  1. हाइफे के लिए माइकोराइजल पैटर्न विधि11: 1 में वर्णित प्रत्येक प्रकार की संरचना को स्कोर करने के लिए अद्वितीय संख्या का उपयोग करें; आर्बसकुल्स के लिए 2; पुटिकाओं के लिए 3; बीजाणुओं के लिए 4; सहायक कोशिकाओं के लिए 5; और प्रवेश बिंदुओं के लिए 6 (चित्रा 4 सी)। पहले से लागू ग्रिड (चित्रा 4 डी) के प्रत्येक सेल से प्रत्येक देखे गए माइकोराइजल संरचना को स्कोर करें।

7. कच्चे डेटा विश्लेषण और परिणाम निष्कर्षण

  1. MycoPatt स्प्रेडशीट11 में सभी प्राप्त स्कोर डालें। प्रस्तुति से सभी स्कोर को कच्चे डेटा (चित्रा 5) के रूप में नामित पहली शीट में स्थानांतरित करने के लिए कॉपी / पेस्ट फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  2. परिणामों का प्राथमिक विश्लेषण: तीन रूपों (चित्रा 6 ए-सी) में अलग-अलग प्रतिशत (%) के रूप में परिणामों की कल्पना करने के लिए माइकोपैट स्प्रेडशीट टूल में तीसरी शीट नामित मापदंडों का उपयोग करें। उपनिवेशीकरण की क्षैतिज छवि का विश्लेषण करने के लिए कॉलम ए से के का उपयोग करें; उपनिवेशीकरण की ऊर्ध्वाधर छवि का विश्लेषण करने के लिए कॉलम एम से डब्ल्यू; और कॉलम वाई से एआई 15 10 x 10 वर्गों (लाइनों 2-17) और अंतिम औसत उपनिवेशीकरण (लाइन 19-20) में से प्रत्येक के लिए ट्रांसवर्सल (औसत) उपनिवेशीकरण का विश्लेषण करने के लिए।
    नोट: ट्रांसवर्सल औसत उपनिवेशीकरण का उपयोग क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर विश्लेषण दोनों से संबंधित वास्तविक उपनिवेशीकरण मापदंडों की गणना के लिए किया जाता है। इस तरह, यदि केवल क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर विश्लेषण का उपयोग किया जाता है (मूल कार्य11 में विस्तार से वर्णित) की तुलना में कोई त्रुटि नहीं की जा सकती है। इसके अलावा, मापदंडों के इस सेट की गणना सूक्ष्म क्षेत्र की पूरी सतह के लिए की जाती है।
    1. परिणाम11 का विश्लेषण करने के लिए, प्रत्येक पैरामीटर के लिए विशिष्ट परिभाषाओं और सूत्रों का उपयोग करें। निम्नलिखित औपनिवेशीकरण मापदंडों का उपयोग करें: औपनिवेशीकरण की आवृत्ति (%), उपनिवेशीकरण की तीव्रता (%), आर्बसकुल्स (%) और पुटिकाओं (%), बीजाणुओं (%) और सहायक कोशिकाओं (%), प्रवेश बिंदु (%), गैर-माइकोराइजल क्षेत्रों का प्रतिशत (%), समग्र उपनिवेशीकरण डिग्री (%), और माइकोराइजल / गैर-माइकोराइजल क्षेत्रों की रिपोर्ट।
      नोट: यदि विश्लेषण किए गए नमूनों से आर्बसक्यूल्स, पुटिका, बीजाणु, सहायक कोशिकाएं और प्रवेश बिंदु गायब हैं, तो माइकोपैट स्प्रेडशीट उन्हें शून्य (0) के रूप में स्कोर करेगी।
  3. माइकोराइजल मानचित्रों का उत्पादन और निष्कर्षण: माइकोपैट नामित ग्राफ़ (चित्रा 7 ए) की दूसरी शीट में माइकोराइजल संरचना कोड के रूपांतरण से प्राप्त छवि की कल्पना करें। ग्राफ़ शीट में परिणामी छवि को छवि के रूप में निर्यात करें (चित्रा 7 बी)। माइकोराइजल पैटर्न के विश्लेषण के लिए किंवदंती में रंग कोड का उपयोग करें।
  4. माइकोराइजल मानचित्र विश्लेषण: माइकोराइजल मानचित्रों पर सबसे महत्वपूर्ण संरचनाओं और उनके संयोजन की पहचान करें। विश्लेषण की गई जड़ों में देखे गए माइकोराइजल औपनिवेशीकरण पैटर्न का वर्णन करें। जड़ में देखे गए संरचनात्मक विकास, शाखा पैटर्न और आर्बसक्यूल / पुटिका विकास के आधार पर माइकोराइजल औपनिवेशीकरण रणनीति का वर्णन करें।

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Representative Results

धुंधला प्रक्रियाओं के बाद जड़ों की कोमल क्रशिंग विधि का सही उपयोग माइकोराइजल संरचनाओं का अच्छा विवरण प्रदान करता है, दोनों ज़िया मेस (चित्रा 8 ए-सी) और फेस्टुका रूबरा (चित्रा 9 ए-ई), माइकोराइजल संरचनाओं और जड़ कोशिकाओं के बीच अच्छा अंतर, और नीले रंग के कारण स्टेल की पुष्टि। यदि समाशोधन और धुंधला प्रक्रियाएं सफल होने में विफल रहती हैं, तो जड़ के नमूने कुचलना मुश्किल होता है और स्पष्ट रूप से माइकोराइजल संरचनाओं को नहीं दिखाता है (चित्रा 10 ए-ई)। इस मामले में, पूरी समाशोधन-धुंधला प्रक्रिया दोहराएं।

माइकोराइजल पैटर्न विधि और माइकोपैट टूल के उपयोग ने उपनिवेशतंत्र की पूरी खोज की अनुमति दी। विधि उपनिवेश मापदंडों (तालिका 1 और तालिका 2) की एक अतिरिक्त दृश्य अभिव्यक्ति के साथ प्रत्येक प्रजाति (चित्रा 11 और चित्रा 12) के लिए उपनिवेश पैटर्न और रणनीतियों का एक गहरा, छोटे पैमाने पर अन्वेषण प्रदान करती है। ज़ीया मेस पर किए गए दो अध्ययन, पॉप-मोल्दोवन एट अल .12 द्वारा बड़े पैमाने पर वर्णित, और फेस्टुका रूबरा, कोरकोज़ एट अल द्वारा विस्तृत। 13,14, टिप्पणियों, माइकोराइजल मानचित्रों और उपनिवेश मापदंडों का एक बड़ा डेटाबेस प्रदान किया। दोनों डेटाबेस ने उपनिवेशीकरण की आवृत्ति (), उपनिवेशीकरण की तीव्रता (%), आर्बसक्यूल्स (%) और पुटिकाओं (%), गैर-माइकोराइजल क्षेत्रों का प्रतिशत (%), समग्र उपनिवेशीकरण डिग्री (%), और उपनिवेशीकरण मापदंडों के रूप में माइकोराइजल / गैर-माइकोराइजल क्षेत्रों की रिपोर्ट दर्ज की। ज़िया मेस के लिए, डेटाबेस में स्प्रेडशीट डेटाबेस में 5,850 लाइन प्रविष्टियां शामिल थीं, जिन्हें 390 उपनिवेश मानचित्रों में संकलित किया गया था। ज़िया मेस प्रयोग ने जड़ों में उपनिवेशित क्षेत्रों के बीच परिवर्तन और व्यवधान के विवरण के लिए एक पैरामीटर के रूप में माइकोराइजल / गैर-माइकोराइजल क्षेत्रों की रिपोर्ट का प्रस्ताव दिया। दृष्टिकोण औपनिवेशीकरण तंत्र और जड़ों के साथ इसके विकास के गहन विश्लेषण की अनुमति देता है। फेस्टुका रूबरा ने स्प्रेडशीट में 4,500 लाइन प्रविष्टियों का डेटाबेस प्रदान किया, जिसे 300 मानचित्रों में संकलित किया गया था। एक नया सूचकांक प्रस्तावित किया गया था, आर्बसक्यूल्स / पुटिकाओं की रिपोर्ट, जिसे आगे उपनिवेश रणनीति के संकेतक के रूप में उपयोग किया गया था। औपनिवेशीकरण रणनीति के समग्र मूल्यांकन ने माइकोराइजल विकास के चार अलग-अलग परिदृश्यों का प्रस्ताव दिया: 1) प्रचार रणनीति, 2) हस्तांतरण रणनीति, 3) भंडारण रणनीति, और 4) संयंत्र-प्रतिरोध रणनीति। सबसे अधिक प्रतिनिधि माइकोराइजल मानचित्रों के निष्कर्षण के लिए, दोनों डेटाबेस को आवृत्ति और उपनिवेशीकरण की तीव्रता के रूपांतरित औसत मूल्यों के आधार पर खोजा गया था, जिसके परिणामस्वरूप विश्लेषण किए गए प्रत्येक संस्करण के लिए तीन अलग-अलग मानचित्रों का निष्कर्षण हुआ (तालिका 1 और तालिका 2)। तीन नक्शे मूल खंडों से एएम उपनिवेशीकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनके पास निम्नलिखित के निकटतम मान हैं: प्रत्येक संस्करण का औसत (एवी), जिसकी गणना एक संस्करण के लिए उपलब्ध सभी डेटा के आधार पर की जाती है; Av−, जो औसत और औसत/2 (Av-Av/2) के बीच अंतर द्वारा गणना किए गए मान का प्रतिनिधित्व करता है और कम सामान्य उपनिवेश क्षमता दिखाता है; और एवी + , जो औसत और औसत / 2 (एवी + एवी / 2) के बीच योग द्वारा गणना किए गए मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है और एक उच्च सामान्य उपनिवेश क्षमता दिखाता है। इस निष्कर्षण सूत्र का उपयोग उपयोगकर्ता को उपनिवेशीकरण की चरम सीमाओं (उच्चतम या निम्नतम) से बचने की अनुमति देता है। विधि माइकोराइजल औपनिवेशीकरण के सबसे संभावित मामलों के निष्कर्षण की अनुमति देती है।

ज़िया मेस ने अत्यधिक उतार-चढ़ाव वाली उपनिवेशीकरण क्षमता प्रस्तुत की, जो पौधे के विकास चरण पर निर्भर थी (तालिका 1, चित्रा 11)। औपनिवेशीकरण आवृत्ति के मूल्य 3.67% -69.60% के बीच बहुत भिन्न होते हैं, जो उपनिवेशीकरण की तीव्रता के लिए 50% पर मूल्यों द्वारा समर्थित होते हैं। इस घटना का मुख्य कारण यह है कि पूरे वनस्पति काल के दौरान जड़ प्रणाली लगातार विकसित होती है। आर्बुस्कल्स ने 6 पत्तियों (बी 2) विकास चरण में अधिकतम मूल्य प्रस्तुत किए, जिसमें निम्नलिखित विकास चरणों में कमी आई। पुटिकाएं छिटपुट रूप से दिखाई दीं, जिनका मान 1% से कम था। माइकोराइजल पैटर्न की खोज से पता चला कि हाइफे को सीमित विस्तार के साथ जड़ों के विभिन्न क्षेत्रों में विकसित किया गया था। उपनिवेशीकरण के केंद्रीय बिंदु के आसपास हाइफे के अनियमित विकास के साथ उपनिवेशित क्षेत्रों के बीच बड़े अंतर देखे गए। औपनिवेशीकरण रणनीति ने प्रोलिफेरेटिव और स्थानांतरण रणनीतियों के लिए पौधे-प्रतिरोध के अंतराल में बड़ी भिन्नताएं दिखाईं। 6 पत्तियों (बी 2) के चरण के बाद कोब गठन (बी 4) के चरण ने उपनिवेशीकरण की एक हस्तांतरण रणनीति का प्रदर्शन किया, जो माइकोराइज्ड / गैर-माइकोराइज्ड क्षेत्र रिपोर्टों द्वारा 0.14 से कम होने से बनी हुई थी। एक दृश्यमान उच्च हस्तांतरण रणनीति के साथ एकमात्र मामला बी 2 चरण में दर्ज किया गया था जब जड़ों के बड़े क्षेत्रों ने आर्बस्कुल्स प्रस्तुत किए थे। उनकी समग्र स्थिति ने उस क्षेत्र के बीच एक स्पष्ट अलगाव दिखाया जहां आर्बसक्यूल्स विकसित किए गए थे और उस क्षेत्र में जहां आर्बसकुल्स एक आकस्मिक चरण में थे। सबसे समरूप औसत उपनिवेशीकरण पैटर्न बी 5 विकास चरण में देखा गया था, जिसमें उपनिवेशित लोगों के बीच निरंतर गैर-उपनिवेशित क्षेत्र थे। इस दृश्य घटना का समग्र मूल्यांकन अंतिम वनस्पति अवधि के अनुरूप था, जिसमें आर्बसकुल्स के छोटे मूल्य थे, जिसने इन संरचनाओं के प्रतिगमन का संकेत दिया।

फेस्टुका रूबरा एक बारहमासी जड़ प्रणाली के साथ पहाड़ी घास के मैदानों में एक प्रमुख प्रजाति है। इस अनुकूलन के कारण, अधिकांश उपनिवेशीकरण प्रक्रियाएं जड़ों के अंदर होती हैं, और हाइफल नेटवर्क का विकास जड़ों की कम विकास गति के साथ सहसंबद्ध होता है (तालिका 2, चित्रा 12)। उर्वरकों के आवेदन के कारण, उपनिवेश मापदंडों ने वेरिएंट के बीच उच्च अंतर प्रस्तुत किए। उपनिवेशीकरण आवृत्ति में अंतर 65% था, जो दर्ज तीव्रता में 36% अंतर से बना हुआ था। प्रत्येक संस्करण ने एक अलग उपनिवेश पैटर्न दिखाया, जो उपचार के दीर्घकालिक अनुप्रयोग के साथ सहसंबद्ध था, और माइकोराइज्ड / गैर-माइकोराइज्ड क्षेत्रों की रिपोर्ट में 0.09-0.96 और आर्बसकुल्स / पुटिकाओं की रिपोर्ट में 0-9.43 के बीच भिन्नता के साथ। नियंत्रण संस्करण (वी 1) ने एक औसत भंडारण-उन्मुख रणनीति दिखाई, जिसमें एक सीमित क्षेत्र ने एवी + उपनिवेश मानचित्र के लिए आर्बसकुल्स के विकास को प्रतिबंधित किया। औपनिवेशीकरण (Av-) की सरलीकृत छवि ने हाइफे के रैखिक और पार्श्व विकास को दिखाया, जो दो ऊपरी मॉडल (Av− और Av+) के लिए अनियमित उपनिवेशीकरण के लिए पूरी तरह से उन्मुख था। कार्बनिक उपचार (वी 2) के आवेदन ने जड़ों में दोहरे, रैखिक और अनियमित हाइफल विकास को प्रेरित किया। जैविक उपचार के लिए पहचानी गई उपनिवेशीकरण रणनीति ने भंडारण रणनीति की ओर एक अभिविन्यास दिखाया, जो मिट्टी में खाद की धीमी रिहाई और एक मौसम से अगले मौसम तक इसकी दृढ़ता से जुड़ा हुआ है। एवी + मॉडल ने पुटिकाओं की तीव्र उपस्थिति के साथ उच्चतम उपनिवेश क्षमता प्रस्तुत की। गैर-माइकोराइज्ड क्षेत्रों की रिपोर्ट ने समरूप उपनिवेशीकरण प्रस्तुत किया, जिसमें उपनिवेशित क्षेत्रों के बीच दुर्लभ अंतर थे। इसके विपरीत, खनिज उर्वरकों (वी 4) के आवेदन ने माइकोराइजल औपनिवेशीकरण के प्रतिगमन को प्रेरित किया। उपनिवेशित क्षेत्रों ने एक अनियमित पैटर्न प्रस्तुत किया, जिसमें उनके बीच बड़े अनकलोनाइज्ड अंतर थे। देखी गई रणनीति आम तौर पर पौधे-प्रतिरोध की ओर उन्मुख थी, जिसमें छोटे क्षेत्र थे जहां या तो एक समयबद्ध भंडारण या स्थानांतरण रणनीति दिखाई दे रही थी। कम खनिज कार्बनिक (वी 3) और उच्च-खनिज कार्बनिक (वी 5) उपचारों के बीच तुलनात्मक विश्लेषण ने उपनिवेशीकरण और उपनिवेशीकरण रणनीति में बदलाव का निरंतर प्रतिगमन दिखाया, जो दो विपरीत उपचारों (वी 2 और वी 4) के बीच फिट किया गया था। उपनिवेशित सभी क्षेत्र एक केंद्रीय बिंदु के आसपास अनियमित रूप से विकसित हुए, जिसमें गैर-उपनिवेशित क्षेत्रों की समरूप उपस्थिति थी। उपनिवेशीकरण रणनीति सीमित क्षेत्रों में पुटिकाओं की उपस्थिति के साथ एक प्रोलिफेरेटिव-ट्रांसफर की ओर उन्मुख थी। खनिज उर्वरक (वी 5) की उच्च मात्रा वाले संस्करण में सबसे बड़े गैर-उपनिवेशित अंतर की पहचान की गई थी।

Figure 1
चित्र 1: जड़ नमूना प्रक्रियाएं( A) जड़ों की अखंडता की रक्षा के लिए मिट्टी के साथ नमूनों का निष्कर्षण। (बी) पहली समाशोधन प्रक्रिया के बाद जड़ प्रणाली का माप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: दाग वाली जड़ों को प्रसंस्करण तक नल के पानी के साथ एक जार में बनाए रखा जाता है। जड़ें कमरे के तापमान पर 1 सप्ताह तक अपना रंग बनाए रखती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: रूट प्रोसेसिंग। (A) पेट्री डिश में पानी में एक नमूने से सभी जड़ों को रखें। (B) जड़ों को 1 सेमी लंबाई के खंडों में काटें। (सी-डी) जड़ों को कुचलने के लिए लैमिनेटिंग थैली पर धीरे से दबाएं और धीरे-धीरे उन्हें स्लाइड पर प्रदर्शित करें। (E-F) रूट सेगमेंट को कवरस्लिप से कवर करें और एक कोने पर नल के पानी की एक बूंद जोड़ें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: छवि प्रसंस्करण. (A) प्रस्तुति में एक नमूने से कैप्चर की गई सभी छवियों को जोड़ें. प्रत्येक जड़ के सूक्ष्म दृश्य के पुनर्निर्माण के लिए सभी छवियों को संरेखित करें। (बी) ग्रिड तैयार करने के लिए एक तालिका जोड़ें, जिसमें प्रत्येक छवि के लिए 10 कोशिकाओं x 10 कोशिकाओं की लंबाई की चौड़ाई है। आंतरिक सीमाओं को किसी के लिए सेट न करें। आंतरिक सीमा अभी भी दिखाई देगी, लेकिन उनकी पारदर्शिता माइकोराइजल विश्लेषण में हस्तक्षेप नहीं करेगी। (सी-डी) छवि पर दिखाई देने वाली प्रत्येक संरचना को स्कोर करने के लिए MycoPatt की किंवदंती का उपयोग करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: माइकोपैट में डेटा का सम्मिलन। प्रस्तुति से MycoPatt तक टिप्पणियों के साथ पूरे डेटाबेस की प्रतिलिपि बनाएँ। इसे संख्याओं के रूप में पेस्ट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: कच्चा डेटा निष्कर्षण और प्राथमिक डेटा विश्लेषण। (ए) एक पंक्ति से सभी 10 क्षैतिज कोशिकाओं के लिए औपनिवेशीकरण मूल्यांकन। (बी) माइकोपैट से 10 कोशिकाओं में से प्रत्येक में एक कॉलम (ऊर्ध्वाधर) से सभी 10 कोशिकाओं के लिए औपनिवेशीकरण मूल्यांकन। (सी) ट्रांसवर्सल कॉलोनाइजेशन मूल्यांकन और औसत उपनिवेश मापदंडों की गणना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: माइकोराइजल पैटर्न मानचित्रों का निष्कर्षण। (A) पूरे डेटा सेट के लिए, MycoPatt के ग्राफ़ शीट में 10 कोशिकाओं x 150 कोशिकाओं का एक बड़ा नक्शा उपलब्ध है। (बी) एक छवि के रूप में उपनिवेश मानचित्र निकालें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: ज़िया मेस की संसाधित जड़ों में एएमएफ संरचनाओं की सूक्ष्म छवियां( ए) हाइफल नेटवर्क इंटरसेलुलर और आर्बसकुल्स का इंट्रासेल्युलर विकास। (बी) इंट्रासेल्युलर रूप से विकसित होने वाले कई आर्बसक्यूल्स के साथ घने हाइफल नेटवर्क। (ग) विभिन्न आयामों के पुटिकाओं की श्रृंखला। संक्षेप: एच = हाइफे; ए = आर्बसकुल्स; वी = पुटिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्र 9: फेस्टुका रूब्रा की संसाधित जड़ों में एएमएफ संरचनाओं की सूक्ष्म छवियां। (ए) पुटिकाओं और आर्बस्कुल्स के साथ कई हाइफल नेटवर्क अलग-अलग क्षेत्रों में विकसित हुए। (बी) एक कुंडलित हाइफल नेटवर्क का विस्तार। (ग) एक प्रवेश बिंदु और दो कुंडलित हाइप का विवरण। (डी) कुंडलित हाइफा के अंत में एक पुटिका का विस्तार। (ई) एक इंट्रासेल्युलर आर्बसक्यूल का विस्तार, एक कुंडलित हाइफा का विवरण, और एक हाइफा के अंत में एक पुटिका की उपस्थिति। संक्षेप: एच = हाइफे; ए = आर्बसकुल्स; वी = पुटिका; ईपी = प्रवेश बिंदु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्र 10: अपूर्ण साफ और दाग वाली जड़ों में फेस्टुका रूब्रा (ए-सी) और ज़िया मेस (डी-ई) की जड़ों में एएमएफ संरचनाओं की अस्पष्ट सूक्ष्म छवियां। (ए) अस्पष्ट दाग वाली जड़ जिसमें हाइप की कम संख्या दिखाई देती है और जड़ों का मूल रंग दिखाई देता है। (बी) जड़ कोशिकाओं और हाइप के बीच अस्पष्ट अंतर के साथ नीले और तीव्र नीले रंग ढाल का हाइफे। (सी) छवि के ऊपरी भाग में स्पष्ट दाग वाला हाइफल नेटवर्क और छवि के निचले हिस्से में अधूरा सना हुआ हाइप। (डी) तीव्र दाग वाली जड़ और हाइप, जो एएम संरचनाओं की पहचान को असंभव बनाता है। (ई) कोशिकाओं में मौजूद कलाकृतियों के साथ एक तीव्र दाग वाली जड़ का विवरण, जो एएम संरचनाओं की पहचान को असंभव बनाता है। संक्षेप: एच = हाइफे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्रा 11: इलाज किए गए ज़िया मेयस की जड़ों में माइकोराइजल औपनिवेशीकरण पैटर्न (एवी, एवी-, और एवी +)। संक्षेप: ए 0 = उपचार आवेदन का क्षण; ए 1 = नियंत्रण संस्करण (कोई उपचार नहीं)/ए 2 = उपचारित संस्करण; बी 1 = 2-4 पत्तियां (माइकोराइजल औपनिवेशीकरण की शुरुआत के लिए एक नियंत्रण बिंदु के रूप में); बी 2 = 6 पत्तियां; बी 3 = 8-10 पत्ते; बी 4 = कोब गठन; बी 5 = शारीरिक परिपक्वता। वेरिएंट संयोजन ए0-बी 1 हैं; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; और A1B5/A2-B5. उपचार का पूरा विवरण पॉप-मोल्दोवन एट अल.12 में पाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 12
चित्र 12: लंबे समय तक इलाज किए गए फेस्टुका रूबरा की जड़ों में माइकोराइजल औपनिवेशीकरण पैटर्न (एवी, एवी-, और एवी +)। संक्षेप: वी 1 = नियंत्रण, गैर-निषेचित; V2 = 10 t.ha-1 खाद; V3 = 10 t.ha-1 खाद + N 50 kg.ha-1, P2O5 25 kg.ha-1, K2O 25 kg.ha-1; V4 = N 100 kg.ha-1, P2O5 50 kg.ha-1, K2O 50 kg.ha-1; V5 = 10 t.ha-1 खाद + N 100 kg.ha-1, P2O5 50 kg.ha-1, K2O 50 kg.ha-1 उपचार का पूरा विवरण पिछले काम13,14 में पाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: विकास चरण के आधार पर ज़िया मेस की जड़ों में माइकोराइजल औपनिवेशीकरण मापदंडों के मूल्य। किंवदंती: ए 0 = उपचार आवेदन का क्षण; ए 1 = नियंत्रण संस्करण (कोई उपचार नहीं)/ए 2 = उपचारित संस्करण; बी 1 = 2-4 पत्तियां (माइकोराइजल औपनिवेशीकरण की शुरुआत के लिए एक नियंत्रण बिंदु के रूप में); बी 2 = 6 पत्तियां; बी 3 = 8-10 पत्ते; बी 4 = कोब गठन; बी 5 = शारीरिक परिपक्वता। वेरिएंट संयोजन ए0-बी 1 हैं; A1-B2/A2-B2; A1-B3/A2-B3; A1-B4/A2-B4; और A1B5/A2-B5. उपचार का पूरा विवरण पॉप-मोल्दोवन एट अल.12 में पाया जा सकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: लागू निषेचन के आधार पर फेस्टुका रूबरा की जड़ों में माइकोराइजल औपनिवेशीकरण मापदंडों के मूल्य। किंवदंती: वी 1 = नियंत्रण, गैर-निषेचित; V2 = 10 t.ha-1 खाद; V3 = 10 t.ha-1 खाद + N 50 kg.ha-1, P2O5 25 kg.ha-1, K2O 25 kg.ha-1; V4 = N 100 kg.ha-1, P2O5 50 kg-ha-1 K2O 50 kg.ha-1; V5 = 10 t.ha-1 खाद + N 100 kg.ha-1, P2O5 50 kg-ha-1 K2O 50 kg.ha-1 उपचार का पूरा विवरण पिछले काम13,14 में पाया जा सकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: जड़ों के क्षेत्र नमूने से लेकर कच्चे डेटा विश्लेषण और माइकोराइजल मानचित्र निष्कर्षण तक विस्तृत प्रोटोकॉल चरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कृषि विज्ञान क्षेत्र में नई रणनीति के विकास के लिए माइकोराइजल औपनिवेशीकरण पर अध्ययन महत्वपूर्ण हैं। आर्बसकुलर माइकोराइजा के साथ सहजीवी संबंध बनाने के लिए कई खेती वाले पौधों की क्षमता ने उन्हें कृषि पारिस्थितिकी तंत्र के सतत विकास और इसके स्वास्थ्य के रखरखाव का एक महत्वपूर्ण घटक बना दिया 16,17,18,19,20। इस प्रकार, उपनिवेश तंत्र और कवक रणनीतियों की बेहतर समझ की आवश्यकता है, जो आवश्यक डेटा प्रदान करते हैं कि एक पौधा मिट्टी, इसकी उपज और इसकी अस्तित्व क्षमता से पोषण नेटवर्क से कैसे जुड़ सकता है। इसलिए, स्मार्ट कृषि संदर्भ में, यह इस सदी का एक अनिवार्य है, उपनिवेशीकरण का गहन मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है, और अध्ययनों को जड़ों में फंगल स्थिति की यथार्थवादी छवि प्रदान करने की आवश्यकता है।

रूट माइकोराइजल पैटर्न विधि जड़ों का इतना गहरा स्कैन प्रदान करती है, लेकिन यह सीमाओं और लाभ दोनों के साथ आतीहै। प्रस्तुत सीमाएं बड़ी संख्या में नमूने हैं जिन्हें पहली बार किसी पौधे का विश्लेषण किए जाने पर स्कोर करने की आवश्यकता होती है, छवि हेरफेर की आवश्यकता, और जड़ों में माइकोराइजल संरचनाओं का मैन्युअल आवंटन, लेकिन इन सभी को कई दीर्घकालिक लाभों से दूर किया जा सकता है। इस पद्धति के आवेदन और माइकोपैट टूल के साथ माइक्रोस्कोपी के एकीकरण से उत्पन्न बड़ा डेटाबेस परिणामों की तुलना के संदर्भ में स्थिरता, परिणामों का सांख्यिकीय आश्वासन और बारहमासीता प्रदान करता है। एक विशिष्ट पौधे की जड़ों के लिए माइकोराइजल पैटर्न की पहचान तुलना के संदर्भ में बाद के अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी। इसके अलावा, यह नए पैटर्न की पहचान में सुधार करता है, जो उपनिवेश तंत्र और फंगल रणनीति के विकास के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है। क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर विकास के आधार पर औसत उपनिवेश मापदंडों की गणना दृश्य अनुमान विधियों की तुलना में अधिक यथार्थवादी और जटिल मूल्यों के अधिग्रहण की अनुमति देती है, जैसे ग्रिड इंटरसेक्शन, रूट सेगमेंट आकलन, और आवर्धित चौराहा 9,11। कुल मिलाकर, माइकोराइजल पैटर्न विधि जड़ों में फंगल प्रगति और शाखाओं के आकलन और बाहरी उपनिवेशीकरण के नए बिंदुओं की पहचान और जड़ों के साथ हाइप के विस्तार की अनुमति देती है। यह आर्बसकुल्स और पुटिकाओं की स्थिति की अनुमति देता है और उन्हें वैश्विक पैटर्न में यथार्थवादी स्थिति और आयाम आवंटित करता है।

माइकोपैट विधि का सही अनुप्रयोग प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण के सफल समापन पर निर्भर करता है (तालिका 3)। उच्च दक्षता के लिए, विधि का पूरा प्रवाह विभिन्न प्रशिक्षण स्तरों के साथ एक या कई व्यक्तियों द्वारा आयोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस तरह, प्रत्येक चरण से कई परिणाम निकाले जाते हैं और निरंतर विश्लेषण संभव है। जैविक सामग्री, जड़ नमूनाकरण और भंडारण चरण के चयन के लिए, यह आवश्यक है कि एक उच्च प्रशिक्षित व्यक्ति प्रजातियों की सही पहचान करे, इसके विकास चरण की परवाह किए बिना। एक बार प्रजातियों की पहचान हो जाने के बाद, जड़ का नमूना किसी भी व्यक्ति द्वारा किया जा सकता है, कोमल मिट्टी के कण हटाने के लिए न्यूनतम प्रशिक्षण के साथ। माइक्रोस्कोपी के लिए दूसरा चरण, रूट प्रोसेसिंग, क्लियरिंग और धुंधला करने के लिए प्रशिक्षित व्यक्तियों की आवश्यकता होती है; प्रक्रिया में कई सत्यापन चरण हैं, और प्रक्रिया की सफलता के लिए प्रत्येक चरण आवश्यक है। पहले दो चरणों में एक ही समय में कई नमूने संसाधित किए जा सकते हैं। माइक्रोस्कोपी (चरण 3) के लिए रूट प्रोसेसिंग और रूट नमूनों का सूक्ष्म विश्लेषण (चरण 4) स्लाइड तैयार करने के लिए उनके कोमल क्रशिंग के साथ संयुक्त खंडों को 1 सेमी टुकड़ों में काटने के लिए आवश्यक उच्च ध्यान के कारण बहुत महत्वपूर्ण हैं। माइक्रोस्कोपी को प्रकाश के अंशांकन और उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर पर ध्यान देने की आवश्यकता है। दोनों चरणों में एक विशेषज्ञ की देखरेख में उच्च प्रशिक्षित व्यक्तियों या मध्यम प्रशिक्षित व्यक्तियों की आवश्यकता होती है। पोस्ट-माइक्रोस्कोपी छवि संयोजन के लिए खंड के पुनर्निर्माण के लिए छवियों के सही ओवरलैप और क्रम के लिए उच्च प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है। माइकोराइजल औपनिवेशीकरण का स्कोरिंग एक ऐसा कदम है जिसके लिए एएम कवक में एक विशेषज्ञ को उनकी संरचनाओं और औपनिवेशीकरण प्रदर्शन की पहचान करने की आवश्यकता होती है, साथ ही ग्रिड की गई छवियों पर प्रत्येक संरचना के लिए स्कोर आवंटित करने की आवश्यकता होती है। अंतिम चरण, कच्चे डेटा विश्लेषण और परिणाम निष्कर्षण के लिए एक उच्च प्रशिक्षित डेटा विश्लेषक की आवश्यकता होती है जो डेटाबेस को संकलित करता है और डेटा फ़िल्टरिंग और सबसे प्रासंगिक मानचित्रों के निष्कर्षण के पीछे के आंकड़ों का प्रबंधन करता है। इस चरण को प्रक्रिया की अधिकतम दक्षता के लिए माइकोराइजल विशेषज्ञ के काम के साथ जोड़ा जा सकता है। कुल मिलाकर, पूरा प्रवाह एक अंतःविषय अध्ययन के भीतर कई विशेषज्ञों की भागीदारी की अनुमति देता है, जो उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों की ओर जाता है।

किसी भी नई विधि की तरह, माइकोराइजल पैटर्न विधि को विकसित करने और सुधारने की आवश्यकता है। कुछ संशोधन हैं, जो भविष्य में, इस विधि का उपयोग करना आसान बना देंगे और कई परिणाम प्रदान करेंगे। यदि यह धीमी समाशोधन और धुंधला तकनीक द्वारा किया जाता है, तो यह विधि प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के बाद विश्लेषण को रोकने / पुनरारंभ करने और कई डिजिटल डेटाबेस प्राप्त करने के लिए एक समय में कई नमूनों के हेरफेर की अनुमति देती है। एक महत्वपूर्ण सुधार तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए प्रदर्शन स्कैनर का उपयोग होगा और, माइकोराइजल संरचना पहचान के लिए उपयुक्त और कुशल उपकरणों के विकास के बाद, इस प्रक्रिया का स्वचालितकरण होगा। तकनीक विकास के संदर्भ में, माइकोराइजल पैटर्न का त्वरित अधिग्रहण क्षेत्र में भविष्य के अध्ययन को बनाए रखेगा।

स्वचालित सॉफ्टवेयर के उपयोग में कई कठिनाइयाँ हैं। 1) एएम संरचनाओं की विभिन्न स्थितियों के कारण - हाइफे और पुटिकाएं - जड़ कोशिकाओं के बाहर और जड़ कोशिकाओं के अंदर आर्बस्कुल्स, एक ही तस्वीर में उन्हें पहचानने के लिए सॉफ्टवेयर को कैलिब्रेट और प्रशिक्षित करना मुश्किल है। 2) एक खंड से चित्रों के संयोजन के लिए, सॉफ्टवेयर हमेशा सेगमेंट को फिर से बनाने के लिए चित्रों को संरेखित नहीं करेगा, और यह संभव है कि यह उन्हें यादृच्छिक रूप से रख सकता है, जो प्रक्रिया को बदल देगा। 3) एक और समस्या यह है कि सॉफ्टवेयर भेदभाव नहीं कर सकता है यदि दो चित्रों के कुछ हिस्से समान हैं या यदि, माइक्रोस्कोपी प्रक्रियाओं में, कुछ फ़ील्ड अतिव्यापी थे। इस प्रकार, प्रक्रिया को प्रशिक्षित विशेषज्ञों द्वारा मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए।

कुल मिलाकर, प्रत्येक संस्करण से 60 सेमी जड़ का विश्लेषण कई पौधों से किया गया था। वर्तमान पांडुलिपि को माइकोपैट सिस्टम और टूल का उपयोग करने की अवधारणा को प्रस्तुत करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और परिणाम इस विधि की कार्यक्षमता प्रस्तुत करते हैं। इस विधि की तुलना में, दाग जड़ों के यादृच्छिक प्लेसमेंट के कारण ग्रिड इंटरसेक्शन विधि में उच्च व्यक्तिपरकता है। हमारा मानना है कि भविष्य के लिए प्रत्येक एएम संयंत्र के लिए उपयोग किए जाने वाले खंडों की संख्या स्थापित करना आवश्यक होगा। यह शोध है जिसे माइकोराइजा के क्षेत्र में सभी शोधकर्ताओं द्वारा किया जाना चाहिए। कई तरीकों की तुलना करने वाले लेखों में से एक9 ने 50 से 200 रूट सेगमेंट / पौधे की समान उपनिवेश दर प्रस्तुत की। उनके निष्कर्षों में कहा गया है कि प्रत्येक खंड का विश्लेषण करने के लिए एक अधिक उद्देश्य विधि की आवश्यकता है। हमारे शोध के आधार पर, माइकोपैट व्यक्तिपरकता को 0 तक कम कर देता है। प्रत्येक खंड को गहराई से स्कैन और विश्लेषण किया जाता है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग करके सभी विश्लेषण किए गए सेगमेंट परिणामों के लिए एक छवि डेटाबेस विकसित किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो तो डेटा के पुन: विश्लेषण के लिए भी इसका उपयोग किया जा सकता है।

पूरी विधि ऐसे परिणाम प्रदान करती है जो कई अनुसंधान और वाणिज्यिक क्षेत्रों के लिए आवश्यक हैं। प्लांट ब्रीडर लगातार अधिक प्रतिरोधी किस्में और संकर बनाने की कोशिश करते हैं जो विशिष्ट मिट्टी की स्थिति के अनुकूल होते हैं। इस संदर्भ में, पौधे प्रजनन प्रक्रियाओं को प्रारंभिक चयन चरणों से मिट्टी से माइकोराइजल नेटवर्क के लिए पौधे कनेक्टिविटी के संदर्भ में लाभ होगा। माइकोराइजल पैटर्न विश्लेषण मिट्टी से माइकोराइजल कटाई और साइट की स्थिति के अनुकूलन के संदर्भ में संकरों के बीच अंतर दिखाएगा। प्रजनन क्षेत्र के शोधकर्ता इस विधि का उपयोग चयन प्रक्रियाओं के शुरुआती चरणों से, मिट्टी के माइकोराइजल स्थितियों के लिए नई किस्मों / संकरों की उपयुक्तता का पता लगाने के लिए कर सकते हैं। इस तरह, ऐसी किस्में/संकर होंगे जो बड़ी संख्या में स्थितियों और प्रौद्योगिकियों के लिए आसानी से अनुकूल हो जाते हैं, लेकिन संकीर्ण परिस्थितियों के लिए कम स्वीकृति और उच्च विशिष्टता वाली किस्में/संकर भी होंगी। चरागाह पारिस्थितिक तंत्र के लिए, माइकोराइजल पैटर्न विधि कई अनुप्रयोगों के लिए पूरी तरह से फिट होगी: फंगल समर्थन से संबंधित विभिन्न वनस्पति संयोजनों में पौधे के अस्तित्व की बेहतर समझ; स्थानिक और लुप्तप्राय प्रजातियों में विशिष्ट उपनिवेश पैटर्न का विश्लेषण; बहिर्जात प्रजातियों की आक्रामक क्षमता; और विभिन्न इनपुट21 के आवेदन के कारण प्रभुत्व-सह-प्रभुत्व में उतार-चढ़ाव। पैटर्न का उपयोग इनोकुलम उत्पादकों द्वारा किया जा सकता है जिन्हें सक्रिय प्रोपेगुल्स और प्रवेश बिंदुओं के आधार पर संभावित खुराक की गणना करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अत्यधिक विशिष्ट जैव उर्वरक विकसित किए जा सकते हैं जिनमें उन पौधों के लिए उपयुक्त इनोकुलम होगा जो समान जेनिटर साझा करते हैं। अनुसंधान में, माइकोराइजल पैटर्न एक अत्यधिक तुलनात्मक अध्ययन का प्रतिनिधित्व करते हैं, दोनों दृश्य और संख्यात्मक दृष्टिकोण से। कई डेटाबेसहैं 22,23,24 जो माइकोराइजल प्रजातियों और संरचनाओं को प्रस्तुत करते हैं जो वे परीक्षक पौधों की जड़ों में विकसित कर सकते हैं, लेकिन उनमें से कोई भी, आज तक, पूर्ण उपनिवेश छवि प्रस्तुत नहीं करता है। इन सभी आवश्यकताओं और अधिक यथार्थवादी और प्रयोज्य अध्ययनों की आवश्यकता मिट्टी-माइक्रोब-प्लांट इंटरैक्शन अध्ययनों में माइकोराइजल पैटर्न विधि के एकीकरण का समर्थन करती है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यह पेपर विक्टोरिया पॉप-मोल्दोवन द्वारा आयोजित "कॉर्न माइकोराइजल पैटर्न संचालित एग्रोनोमिक इनपुट्स" और "माउंटेन ग्रासलैंड प्रमुख प्रजातियों में माइकोराइजल स्थिति और उपनिवेशीकरण का विकास" के विषयगत क्षेत्र में दो पीएचडी अध्ययनों से उत्पन्न डेटा का उपयोग करता है, जो प्रोफेसर डॉ रोक्साना विडिकन के समन्वय में लारिसा कॉर्कोज़ द्वारा आयोजित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Apple vinegar 5% FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. O?ET DE MERE https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink Pelikan 4001 https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips Menzel-Glaser D 263 M https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP Vitalab 9.171 411 http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK.
htm?UID=55005bf838d8000000000000
&OFS=33
Glass jar 47 mL Indigo Cards BORCAN 47 ML HEXAGONAL https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches Peach PP525-08 Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet Bioquell UK Ltd Microflow Class II ABS Cabinet http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides Deltalab D100001 https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign=
google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc&
utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu
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Microsoft Office 365 Microsoft Office 365 Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH Oltchim 01-2119457892-27-0065 http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves SemperGuard 816780637 https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd
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Optika camera OPTIKA CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope OPTIKA B383pL https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3 Hermes Gift HERMES000100 EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel Cutfix 9409814 https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA
663588CD1CBE65BF
100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9% FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. O?ET DE VIN ALB https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb

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जीव विज्ञान अंक 186 प्लांट-फंगल इंटरैक्शन सहजीवन उपनिवेश पैटर्न औपनिवेशीकरण अनुक्रम फंगल रणनीति माइकोराइजल पैरामीटर संरचना की स्थिति।
<em>फेस्टुका रूब्रा</em> और <em>ज़िया मेस</em> की जड़ों में औपनिवेशीकरण पैटर्न और फंगल रणनीतियों का पता लगाने के लिए एक उपकरण के रूप में माइकोराइजल मैप्स
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Stoian, V., Vidican, R., Corcoz, L., Pop-Moldovan, V. Mycorrhizal Maps as a Tool to Explore Colonization Patterns and Fungal Strategies in the Roots of Festuca rubra and Zea mays. J. Vis. Exp. (186), e63599, doi:10.3791/63599 (2022).

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