Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver kulturen av hundens tarmorganoider i ett dubbelkammare, permeabelt stödsystem. Organoid sådd i de permeabla stöden, monolagerunderhållet och efterföljande läkemedelspermeabilitetsexperiment beskrivs.
Abstract
Det permeabla stödsystemet används vanligtvis tillsammans med traditionella tvådimensionella (2D) cellinjer som ett in vitro-verktyg för att utvärdera den orala permeabiliteten hos nya terapeutiska läkemedelskandidater. Användningen av dessa konventionella cellinjer har emellertid begränsningar, såsom förändrat uttryck av täta korsningar, partiell celldifferentiering och frånvaron av viktiga kärnreceptorer. Trots dessa brister är Caco-2- och MDCK-modellerna allmänt accepterade och validerade för förutsägelse av human in vivo oral permeabilitet.
Hundar är en relevant translationell modell för biomedicinsk forskning på grund av deras likheter i gastrointestinal anatomi och tarmmikroflora med människor. Följaktligen, och till stöd för parallell läkemedelsutveckling, är utarbetandet av ett effektivt och exakt in vitro-verktyg för att förutsäga in vivo-läkemedelspermeabilitetsegenskaper både hos hundar och människor mycket önskvärt. Ett sådant verktyg kan vara hundens tarmorganoidsystem, kännetecknat av tredimensionella (3D), självmonterade epitelstrukturer härledda från vuxna stamceller.
(1) Permeable Support Seeding Protocol beskriver de experimentella metoderna för dissociering och sådd av hundorganoider i insatserna. Hundens organoidisolering, kultur och skörd har tidigare beskrivits i en separat uppsättning protokoll i detta specialnummer. Metoder för allmänt underhåll av hundens intestinala organoidmonolager diskuteras noggrant i (2) Monolayer Maintenance Protocol. Dessutom beskriver detta protokoll metoder för att bedöma monolagrets strukturella integritet via transepitelial elektrisk resistans (TEER) mätningar och ljusmikroskopi. Slutligen beskriver (3) Permeability Experimental Protocol de uppgifter som föregår ett experiment, inklusive in vitro-validering av experimentella resultat.
Sammantaget övervinner hundorganoidmodellen, i kombination med en dubbelkammarcellodlingsteknik, begränsningar associerade med 2D-experimentella modeller, vilket förbättrar tillförlitligheten i förutsägelser om den uppenbara orala permeabiliteten hos terapeutiska läkemedelskandidater både hos hunden och den mänskliga patienten.
Introduction
Permeabla stödsystem används vanligtvis för att bestämma den uppenbara permeabiliteten hos terapeutiska läkemedelskandidater genom tarmepitelbarriären 1,2. De kan också användas för att bedöma cellulär utsöndring3, cellmigration4 och läkemedelstoxicitet5. In vitro-analyser av oral läkemedelspermeabilitet är ett viktigt steg i läkemedelsupptäckts- och utvecklingsprocessen2, där enskilda läkemedelskandidater testas i ett tidigt skede av läkemedlets FoU-livscykel6. Det permeabla stödsystemet är en dubbelkammarcellodlingsapparat bestående av en insats med ett halvporöst membran placerat i en multiwellplatta. Detta system möjliggör direkt åtkomst till de apikala och basolaterala sidorna av ett cellmonolager som odlas i insatsen7. Monolagret som används i dessa system härrör vanligtvis från gastrointestinala epitelceller (t.ex. humant kolorektalt adenokarcinom Caco-2 cellinje)8. Cellkulturer växer i ett polariserat tillstånd som efterliknar den naturliga mikroarkitekturen hos tarmepitelceller, vilket möjliggör ytterligare cellulär differentiering, liknande mikroanatomi och funktion7. Detaljer om den permeabla stödinsatsen finns i figur 1. Sådden av insatserna med 2D-cellkulturer, som traditionellt används för att bedöma tarmläkemedelspermeabilitet, är relativt prisvärd och lätt att odla9. Dessa system uppvisar flera stora begränsningar, inklusive deras begränsade förmåga att förutsäga tarmmetabolismen hos terapeutiska läkemedelskandidater10,11. Detta gäller för alla mekanismer för läkemedelsabsorption, vare sig det är passiv absorption genom de täta korsningarna mellan epitelceller, aktiv transepitelabsorption genom efflux eller upptagstransportörer (t.ex. P-glykoprotein, monokarboxylattransportör 1) och läkemedel som metaboliseras av enterocyter.
Hundar delar en gemensam miljö och kost med människor12. Hundens tarmanatomi och mikrobiomkomposition liknar den hos människor13, vilket har tillskrivits domesticering och delade dieter under de senaste 36 000 åren14. Tyvärr kan dessa likheter också vara vanliga orsaker/triggers för sjukdomsutveckling. Hundar utvecklar liknande kroniska sjukligheter hos människor, såsom fetma15, inflammatorisk tarmsjukdom16, kolorektal adenokarcinom17, gastrointestinal stromal tumör (GIST)18 och olika andra patologier associerade med deras relativa livslängd19. Följaktligen kan hundorganoider framgångsrikt användas för omvänd translationell forskning av dessa kroniska multifaktoriella sjukdomar i samma anda som One Health-initiativet20.
Caco-2-celler är de mest använda cellinjerna för orala absorptionsanalyser21. Dessa celler anses för närvarande vara "guldstandard" -modellen för in vitro-tarmpermeabilitetsanalyser 2,22,23. Caco-2-cellinjen uttrycker efflux- och upptagstransportörer som finns i människans tarmkanal, men vid olika uttrycksnivåer 24,25,26. Caco-2-celler används också i stor utsträckning som modeller för att avgöra om ett läkemedel är ett substrat eller en hämmare av intestinala effluxtransportörer22,27. Även om Caco-2-cellerna är av koloniskt ursprung, efterliknar de en enterocytcell. Tyvärr representerar Caco-2-celler endast en celltyp från epitelskiktet i tunntarmen9, vilket misslyckas med att rekapitulera den komplexa tarmepitelcelltypkompositionen exakt. Till exempel är bägare celler dedikerade till slemproduktion frånvarande från Caco-2-kulturer så att slem-läkemedelsinteraktioner inte kan bedömas utan samodling med andra cellinjer28. Dessutom uttrycker Caco-2-kulturer inte flera av de viktiga kärnreceptorer som vanligtvis finns i tarmen, såsom pregnane X-receptor (PXR), steroid X-receptor (SXR) och konstitutiv androstanreceptor (CAR)29. Följaktligen misslyckas Caco-2-kulturer med att modellera induktionen av läkemedelstransportörer och enzymer av vissa läkemedel som inducerar dessa receptorer (t.ex. rifampin)30.
3D-tarmorganoidtekniken adresserar några av dessa begränsningar19. Organoider är självmonterade konstruktioner härledda från vuxna stamceller som kan fastställas från vävnadsprover som skördats med hjälp av mikroinvasiva tekniker20. Humaninducerade pluripotenta stamceller används för tarmpermeabilitetsmodeller31,32. Hundorganoider utgör ett relevant alternativ till mänskliga organoider eftersom forskning på mänskliga stamceller begränsas av etiska frågor33. Dessutom tillhandahåller hundorganoider ett in vitro-system för att utforska hundens läkemedelspermeabilitet, metabolism, aktiv transport och läkemedelsinteraktioner. För att ta itu med detta teknikgap har den konsekventa och tillförlitliga tillväxten av hundens tarmorganoider i ett permeabelt stödsystem beskrivits34. En permeabilitetsanalys med hundens tarmorganoider kan potentiellt förutsäga hundens tarmpermeabilitet och metabolism av små läkemedelsmolekyler jämfört med för närvarande använda analyser (Caco-2). Bekräftelse av dessa avgörande egenskaper ger detta nya in vitro-system möjlighet till framtida arbete med att utforska inducerarnas potentiella inverkan på intracellulär metabolism och aktiv transport.
Hundorganoider består av alla celltyper som vanligtvis finns i tarmens epitelskikt. Ur en funktionell och mikroanatomisk vy replikerar de på ett tillförlitligt sätt miljön i epitelskiktet i hundens tarm19,35. Dessutom är närvaron av slem, hundspecifika läkemedelstransportörer och enzymer och övergripande cellulär differentiering i hundens tarmorganoider jämförbar med vad som ses in vivo hos hundar34. Således kan organoider isoleras från sjuka veterinärpatienter och användas för att modellera effekten av olika sjukdomsprocesser (t.ex. kronisk tarminflammation) på hundens orala läkemedelspermeabilitet 19,36. Hundens tarmorganoidsystem kan också användas i andra inställningar än läkemedelspermeabilitetsexperiment. Dessa 3D-strukturer kan också isoleras från sjuka patienter som tidigare beskrivits av Chandra m.fl. för inflammatorisk tarmsjukdom, kolorektal adenokarcinom och gastrointestinal stromal tumör19.
Permeable Support Seeding Protocol beskriver metoder för att etablera hundens tarmorganoidkulturer i insatserna. Detta första protokoll beskriver metoder för att dissociera etablerade hundorganoidkulturer pläterade i den extracellulära membranmatrisen. Vidare diskuteras förbeläggningen av insatserna med kollagen I och den extracellulära membranmatrisen i detta protokoll. Inbäddning av hundorganoider i de permeabla stödinsatserna beskrivs också i detalj.
Det andra protokollet är Monolayer Maintenance Protocol, som inkluderar allmänt underhåll av hundens 3D-organoider pläterade i en insats. Frekvensen och volymerna hos det organoida mediet som används för att uppdatera kulturen och sätt att förhindra cellodlingsskador presenteras i detta andra protokoll, tillsammans med experimentella metoder för att bedöma sammanflödet av epitelialt monolager.
Slutligen fokuserar Permeability Experimental Protocol på sätt att avgöra om hundens intestinala 3D-organoider i en permeabilitetsanalys är redo för experimentell användning och de verifieringssteg som behövs innan du utför något experiment. Detta avsnitt beskriver också installationen och det framgångsrika genomförandet av ett permeabilitetsexperiment, tillsammans med inkubation och provtagning av terapeutiska läkemedelskandidater i kamrarna i monolagerkulturen. Användningen av fluoresceinisotiocyanat med låg permeabilitet (FITC-dextran) för att övervaka monolagerintegritet diskuteras också. Slutligen beskrivs en in vitro-utvärderingsmetod för validering av resultaten efter avslutad experiment. Permeabilitetsexperiment är ett extremt stort ämne och sammanfattas mycket väl av Hubatsch et al.37. Protokollens arbetsflöde sammanfattas i figur 2.
Figur 1: Hundens tarmorganoider på ett permeabelt stödsystem. Den permeabla stödinsatsen är placerad i en brunn på en 24-brunnsplatta. Det mikroporösa membranet möjliggör sådd av dissocierade hundtarmorganoider, och dessa celler kommer så småningom att bilda ett organoid 2D-monolager. Denna teknik ger åtkomst till både AP- och BL-sidorna på monolagret. Organoidmedium introduceras i både AP- och BL-kamrarna i det permeabla stödet. Läkemedelskandidatens absorption (AP→BL) och utsöndring (BL→AP) illustreras, liksom två möjliga transportsätt. Förkortningar: AP = apikal; BL = basolateral. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Arbetsflöde för hundorganoidpermeabla stödprotokoll. Den permeabla stödinsatsen förbeläggs med en blandning av den extracellulära membranmatrisen och kollagen I och inkuberas i 1 timme. Under inkubationsprocessen dissocieras organoidkulturen. Individuella organoidceller ympas i insatsen, medium i basolateralkammaren tillsätts omedelbart efter sådd, medan medium till den apikala kammaren tillsätts 24 timmar efter såddprocessen avslutad. Underhåll och övervakning av organoiderna inkluderar regelbundna mediumförändringar, TEER-värdemätningar och ljusmikroskopi för att utvärdera monolagrets integritet. Innan experimentet måste organoiderna differentieras genom att ta bort ROCK-hämmare och GSKiβ från media. TEER-värdena mäts på experimentdagen och det organoida monolagret inspekteras via ljusmikroskopi för skador på cellerna. Medium byts sedan ut mot en lämplig buffert och inkuberas före experimentet. FITC-dextran-analysen används under intestinala permeabilitetsexperiment39 som en markör för monolagerintegritet. TEER-mätningar görs efter experimentet, och ljusmikroskopi validerar resultaten efter 24 timmar. Förkortningar: TEER = transepitelial elektriskt motstånd; ROCK = rho-associerat kinas; GSKiβ = glykogensyntaskinas beta; F = fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Forskningen godkändes och utfördes i enlighet med Institutional Animal Care and Use Committee of Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). I följande avsnitt (steg 1.1-1.3) beskrivs Protokollet för permeabel stödsådd och procedurerna sammanfattas i figur 3.
Bild 3: Arbetsflöde för det permeabla support seeding-protokollet. De permeabla stödinsatserna är förbelagda med en kombination av CMGF + R / G, kollagen I och den extracellulära membranmatrisen och inkuberas därefter. Media från hundens organoidkultur aspireras och ersätts med en cellåtervinningslösning, följt av en 30 minuters inkubation vid 4 °C. Kulturen överförs därefter till ett rör, och organoid dissociation utförs med användning av trypsinliknande proteas. Odissocierade organoider avlägsnas genom passage genom en sil för att uppnå en encellssuspension, och cellkoncentrationen bestäms med användning av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare. Cellerna är sådda på en permeabel stödinsats, och CMGF + R / G läggs till basolateralkammaren. Kulturen inkuberas sedan i 24 timmar, och den återstående vätskan avlägsnas från den apikala kammaren och ersätts med CMGF + R / G. Förkortningar: ROCK = rho-associerat kinas; GSKiβ = glykogensyntaskinas beta; CMGF + R/G = Komplett medium med tillväxtfaktorer förstärkta med ROCK-hämmare och GSKiβ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Permeabelt stöd seeding protokoll
- Förbeläggning av de permeabla stödinsatserna
- Förbered komplett medium med tillväxtfaktorer förstärkta med Rho-associerad proteinkinas (ROCK) -hämmare och glykogensyntaskinas-beta-hämmare (GSKiβ) (CMGF + R / G) enligt informationen i tabell 1.
- Förbered en ishink och börja tina den extracellulära membranmatrisen på is. Placera en 24-brunnsplatta som innehåller det nödvändiga antalet insatser i inkubatorn till förvarvning. Samla råttsvanskollagen I (3 mg / ml) och lägg det på is samtidigt som det skyddar mot ljus. Samla CMGF + R / G och lägg den på is.
- Beräkna det totala antalet skär och ämnen som krävs för experimentet, håll 100 μL av beläggningslösningen åt sidan för varje insats.
OBS: Förbered mer beläggningslösning än vad som behövs; att förbereda minst 15% mer än vad som behövs rekommenderas. - Blanda CMGF+ R/G i ett 15 ml rör med den extracellulära membranmatrisen (1%) och kollagen I (1%) och blanda försiktigt pipett.
- Täck varje polyesterinsats med 100 μl av beläggningslösningen och placera skären i inkubatorn (37 °C; 5 % CO2 atmosfär) i 1 timme.
- Efter inkubationen, aspirera försiktigt beläggningslösningen från varje insats med en vakuumaspirator eller en P1000-pipett, var försiktig så att du inte stör insatsfiltret. Placera en förbelagd platta i inkubatorn för att hålla värmen.
- Hundens organoid dissociation
OBS: Använd hundorganoider som har odlats i minst fyra dagar. Innan du börjar dissociera, se Gabriel et al.38 för att avgöra när ett prov är friskt, tätt och tillräckligt för experiment. Det rekommenderas att dissociera en extra brunn av organoider för varje brunnspläteringsförfarande. Dessutom rekommenderas att öka det önskade antalet skär med ~ 20% för att ta hänsyn till ojämn organoidtillväxt eller skador orsakade av felaktig manipulation. Om du planerar att använda FITC-dextran, förbered extra brunnar.- Förbered en ishink och en injektionsflaska med kallt 1x Advanced DMEM/F12-lager i biosäkerhetsskåpet.
- Placera den extracellulära membranmatrisen på is för att börja tina, sänk ner den i is för att skydda mot snabb upptining och undvika stelning. Placera en låda med pipettspetsar (P200) i frysen för plätering av den extracellulära membranmatrisen.
- Förskjut en kylcentrifug till 4 °C.
- Flytta CMGF+ R/G från frys/kyl till ett vattenbad på 37 °C. Undvik direkt ljusexponering när det är möjligt.
- Ta bort allt medium från 24-brunnsplattan med organoidkultur för ett lämpligt antal brunnar (1 brunn av en 24-brunnsplatta per 2-4 insatser) samtidigt som du är noga med att inte störa den extracellulära membranmatrisen.
Volymen kan variera beroende på vilket cellräkningssystem som används. - Tillsätt 0,5 ml prechilled Cell Recovery Solution per brunn för att lösa upp de extracellulära membranmatriskupolerna.
- Inkubera plattan i kylskåp (4 °C) i 30 min.
- Pipettera suspensionen, samla alla organoider och upplöst extracellulär membranmatris och överför dem till ett 15 ml rör.
- Centrifugera (700 × g i 5 minuter vid 4 °C) och ta bort supernatanten tills nivån når 0,5 ml- märket, se till att inte störa pelleten.
- Tillsätt 1 ml av det trypsinliknande proteaset och inkubera i vattenbadet vid 37 °C i 8 minuter. Snärta röret flera gånger under inkubationsperioden för att blanda cellerna.
- Överför röret med provet tillbaka till ett biosäkerhetsskåp och tillsätt långsamt 7 ml prechilled Advanced DMEM / F12 för att inaktivera det trypsinliknande proteaset och stoppa celldissociation.
- Förslut en 40 μm cellsil med 1 ml avancerad DMEM / F12. Pipettera försiktigt blandningen och filtrera suspensionen igenom; pipettera ytterligare Advanced DMEM/F12 för att skölja silen.
- Centrifugera röret (700 × g i 5 min vid 4 °C) och avlägsna supernatanten. Stör inte pelleten.
- Resuspendera cellpelleten i ~ 50-100 μL odlingsmedium (CMGF + R / G) för varje brunn av organoider som avlägsnades.
- Räkna ett delprov av suspensionen (~ 10 μL) med hjälp av en hemocytometer eller lämplig maskin och bestäm det totala cellantalet i suspensionen.
- Hundorganoid sådd
- Späd eller koncentrera cellsuspensionen för att erhålla en cellkoncentration på ~ 75 000 celler per ml.
- Frö 100 μl av suspensionen i varje insats med BSA (1%) förbelagda spetsar för att undvika celladhesion under överföring. Lägg till en belagd insats som ett cellfritt ämne utan att några organoider växer samtidigt som de får regelbundna medieförändringar.
- Snurra försiktigt plattan i en cirkulär rörelse i ~ 30 s för att sprida de sådda cellerna över insatsen. Bekräfta via ljusmikroskopi den jämna fördelningen av celler.
- Tillsätt 700 μL CMGF + R/G till basolateralkammaren och placera plattan i inkubatorn (37 °C; 5 % CO2-atmosfär ) i 24 timmar.
- Efter 24 timmar, ta försiktigt bort cellsuspensionen från den apikala kammaren och ersätt den med 200 μL CMGF + R / G. Återför plattan till inkubatorn.
2. Underhållsprotokoll för organoidcellsmonolager
I följande avsnitt (steg 2.1–2.2) beskrivs underhållsprotokollet för organoidcellsmonolager. Arbetsflödet för procedurer som presenteras i detta protokoll sammanfattas i figur 4. En tabell för anteckningar som kan hjälpa till med standardiseringen av TEER-värdemätningar presenteras i kompletterande tabell 1.
Bild 4: Arbetsflöde för underhåll av den genomsläppliga supportkulturen. TEER-värden mäts med hjälp av elektroder (sonder) och en volt/ohm-mätare. Prober måste steriliseras kemiskt med 70% alkohol innan de sätts in i brunnarna. Blank- och organoidcellinsatserna mäts och TEER-värden beräknas. Medium uppdateras därefter i både apikala och basolaterala kamrar, och hundens organoidkultur på insatsen visualiseras med hjälp av ljusmikroskopi. Tårar i antingen organoidkultur eller mikroporöst membran noteras och hanteras enligt protokollet. Förkortning: TEER = transepitelial elektriskt motstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Mätning av TEER-värde
OBS: TEER-värdemätningar utförs med hjälp av en epitelvolt / ohm-mätare med ätpinnefäste. Se tillverkarens bruksanvisning. TEER-värden ger information om integriteten hos hundens organoidmonolager.- Gör TEER-värdemätningar varje alternativ dag under cellodlingstillväxten.
- Flytta epitelvolt / Ohm-mätaren och dess elektroder till biosäkerhetsskåpet. Sterilisera elektroderna kemiskt i 70% alkohol före användning. Ställ in funktionen på Ohms. Vänta minst en minut tills elektroderna torkar.
- Innan du gör den första mätningen, sätt in trådelektroden i porten och slå på strömmen. Se till att mätaren visar 1 000 Ω med trådelektrodinsatsen istället för att mäta ätpinnar. Om så inte är fallet, justera enheten.
- Sätt in elektroderna i den apikala och basolaterala kammaren i den cellfria insatsen (blank), så att den apikala kammaren innehåller den kortare elektroden och basolateralkammaren innehåller den längre elektroden (som ses i figur 4). Rör inte membranet, men se samtidigt till att elektroderna är nedsänkta i mediet.
- Vänta några sekunder tills värdet stabiliseras och notera värdet i en labbbok. Mät de återstående hundorganoidmonolagren och se till att sterilisera elektroderna med 70% alkohol vid mätning av olika prover. Var försiktig så att du inte rör organoidmonoskiktet med elektroden.
- Efter mätningar, sterilisera elektroderna med 70% alkohol för sista gången. Var noga med att skydda dem från skador orsakade av olämplig manipulation och förvara dem enligt tillverkarens instruktioner.
- Beräkna TEER-värdena för varje brunn med Eq (1), därR-prov ochR-blank är ohm -värdena (Ω) från monolagret respektive tomma brunnar, och arean (cm²) är den för insatsen.
(1)
- Underhåll av monolager
OBS: Granska den rekommenderade planen för mediumändring i tabell 2.- Använd sterila engångs 9 " Pasteur-pipetter och en vakuumaspirator, aspirera försiktigt mediet från apikala och sedan basolaterala kamrar. Luta plattan för att se medelytan tydligt. Undvik att aspirera för nära det mikroporösa membranet i apikalkammaren för att förhindra skador på cellmonoskiktet.
OBS: Använd en ny Pasteur-pipett när du flyttar mellan prover. Pipetter är också en möjlig ersättning för denna procedur. - Lägg långsamt till CMGF + R / G med P1000-pipetter som siktar på en vägg i den apikala eller basolaterala kammaren. Utför mediumförändringen i apikalkammaren mycket noggrant för att undvika att skada monolagret.
- Kontrollera brunnarna varannan dag under ett ljusmikroskop, utvärdera kulturens hälsa och övervaka tårar i organoidmonoskiktet eller det mikroporösa membranet. Använd faskontrastmikroskopi för att markera detaljer om kulturen.
OBS: När det gäller hundens organoida monolagerårar ges monolagret tid att återhämta sig och växa igen. Vid mikroporösa membranårar måste brunnen uteslutas från experimentet.
- Använd sterila engångs 9 " Pasteur-pipetter och en vakuumaspirator, aspirera försiktigt mediet från apikala och sedan basolaterala kamrar. Luta plattan för att se medelytan tydligt. Undvik att aspirera för nära det mikroporösa membranet i apikalkammaren för att förhindra skador på cellmonoskiktet.
(1)Tabell 2: Rekommendation om medieförändring för organoidkulturer. CMGF+ R/G byts ut i brunnarnas apikala och basolaterala kammare varannan dag på varje alternativ dag. Den längre kulturperioden under helgen kräver en ökad volym medium i både basolaterala och apikala kammare, som appliceras på en fredagseftermiddag och ändras på måndag. Förkortningar: ROCK = rho-associerat kinas; GSKiβ = glykogensyntaskinas beta; CMGF + R/G = Komplett medium med tillväxtfaktorer förstärkta med ROCK-hämmare och GSKiβ. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
3. Permeabilitet experimentellt protokoll
OBS: I följande avsnitt (steg 3.1-3.5) beskrivs permeabilitetsexperimentprotokollet. Det experimentella protokollarbetsflödet för att mäta ett läkemedels in vitro-permeabilitet sammanfattas i figur 5.
Bild 5: Arbetsflöde för experimentprotokollet. Organoidmedium måste ändras från CMGF + R / G till CMGF + mellan åtta till tolv dagar efter sådd av insatserna, vilket möjliggör cellulär differentiering. Efter att ha bytt medium (både apikalt och basolateralt) till CMGF+ bör TEER-värdena fortfarande öka, med hundens organoidmonolager som nästan når sammanflöde. Minst fyra dagar efter att mediet har ändrats till CMGF+ utvärderas monolagrens beredskap. När monolagret är helt format och TEER-värdena når en platåfas (vanligtvis mellan 1 500 och 2 500 Ω,cm2) byts mediet ut mot transportbufferten i 30 minuter så att monolagret kan anpassa sig till den nya miljön. Vid tiden 0 min av experimentet utförs FITC-dextran-analysen och det 20 min basolaterala provet samlas in. Resultaten analyseras därefter på en plattläsare. Efter experimentet ändras det apikala och basolaterala kammarinnehållet igen till CMGF+, och TEER-värdeavläsningar tas. Monolagren inkuberas i 24 timmar och monolagrets integritet bedöms genom upprepade TEER-mätningar. Förkortningar: TEER = transepitelial elektriskt motstånd; ROCK = rho-associerat kinas; GSKiβ = glykogensyntaskinas beta; CMGF + R /G = Komplett medium med tillväxtfaktorer förstärkta med ROCK-hämmare och GSKiβ; CMGF+ = Komplett medium med tillväxtfaktorer men utan ROCK-hämmare eller GSKiβ; FITC = fluoresceinitiocyanat; F = fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Utvärdering av organoid monolagerberedskap
OBS: Detta steg inträffar 8-14 dagar efter sådd.- Kontrollera monolagret minst varannan dag under ljusmikroskopet (använd faskontrast för att visualisera monolagrets integritet). Fortsätt till nästa steg när cellmonoskiktet är helt format utan luckor eller uppenbara tecken på tårar.
- Ändra det organoida mediet från CMGF+ R/G till CMGF+ (exklusive ROCK-hämmare och GSKiβ från mediumkompositionen). Vi rekommenderar att du byter medium minst fyra dagar före experimentet.
OBS: Detta steg möjliggör korrekt differentiering av det organoida monolagret. - Fortsätt att mäta TEER-värden ungefär varannan dag. När TEER-värdena börjar platå vid cirka 1 500 till 2 000 Ω × cm² (figur 6), mät TEER-värdena varje dag.
OBS: Detta stabila tillstånd kan bibehållas i cirka 2-3 dagar, vilket är det optimala tidsfönstret för att utföra permeabilitetstestning (vanligtvis vid dag 11 till 13). Platån TEER-värden kan svänga något baserat på tarmlokaliseringen av organoiderna, mättemperatur, ras, ålder och sjukdomstillstånd hos hunden. - Schemalägg läkemedelspermeabilitetsanalysen omedelbart för att undvika en snabb minskning av TEER-värden eller överväxt av organoidmonoskiktet till flera cellskikt.
- Förberedelser för experimentet
OBS: Inkubatorskakare kan användas under experimentet för att undvika effekterna av det oönskade vattenskiktet. Mät TEER-värden vid jämna temperaturer.- På experimentdagen mäter du TEER-värden och bekräftar att värdena nådde ett stabilt tillstånd och inte minskar snabbt.
- Välj de bästa monolagren (via ljusmikroskopi och TEER-värden) från överskottet på 20% skär för att utföra experimentet.
- Observera monolagren under ett ljusmikroskop och uteslut ofullständiga, sönderrivna eller övervuxna organoidmonolager.
- Förbered transportbufferten och justera dess pH till önskade värden.
OBS: Sammansättningen av den experimentella bufferten skiljer sig åt beroende på den experimentella installationen. En ofta använd buffert består av Hanks balanserade saltlösning (HBSS), glukos (12,5 mM) och 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetansulfonsyra (HEPES, 25 mM). Denna komposition säkerställer livskraften hos organoidkulturen under ett experiment. - Aspirera försiktigt mediet från de apikala och basolaterala kamrarna i de valda brunnarna.
- Tillsätt 200 μL transportbuffert till den apikala kammaren och 800 μL till basolateralkammaren.
OBS: Transportbuffert bör först läggas till den apikala kammaren och sedan till basolateralkammaren för att undvika att monoskiktet lossnar från det mikroporösa membranet. - Placera plattan i inkubatorn (37 °C; 5 % CO2-atmosfär ) i 30 minuter för att balansera.
OBS: Hundens organoidmonolager är nu redo för läkemedelspermeabilitetsexperimentet.
- Typisk experimentell layout-IgY-koncentrationslösning
OBS: Den experimentella designen och layouten kan ändras beroende på forskningsfrågan. Permeabiliteten hos immunoglobulin Y (IgY) genom ett organoidmonolager används i protokollet som ett exempel och kan modifieras. Termen donatorkammare avser kammaren där läkemedlet initialt appliceras, medan mottagningskammaren hänvisar till kammaren som accepterar läkemedlet från givarkammaren. Ett typiskt experiment samlar prover i mottagarkamrarna under 2 timmar (t.ex. 15, 30, 60, 90, 120 min).- Förbered IgY-lösningen (valfritt läkemedel eller löst ämne) genom att lösa upp den i transportbufferten till önskad slutkoncentration. Förbered mer läkemedelslösning än vad som behövs.
OBS: Läkemedel med låg vattenlöslighet kan först lösas i ett organiskt lösningsmedel (t.ex. etanol, DMSO) innan de tillsätts till bufferten. Den slutliga koncentrationen av lösningsmedlet bör vara mindre än 1% för att inte skada cellmonoskiktet. - Ta bort bufferten från givarkammaren (antingen apikal eller basolateral kammare) i varje brunn.
- Tillsätt IgY-lösningen (läkemedelslösning) till alla givarkammare. Använd den återstående lösningen som tid 0-donatorlösning för mätning av den initiala läkemedelskoncentrationen.
- Vid de önskade tidpunkterna, ta bort 50 μL från mottagningskammaren och placera den i ett märkt rör. Vid den sista tidpunkten, ta bort ett prov från givarkammaren. I slutet av experimentet överför givaren och mottagaren alikvoter till en frys på -20 °C.
OBS: Om många tidpunkter behövs kan byte av buffert i mottagningskammaren göras men måste beaktas vid beräkningen av den skenbara permeabiliteten. Koncentrationen i mottagarkammaren bör inte nå mer än 10% av givarkammaren i slutet av experimentet för att upprätthålla sjunkförhållandena44.
- Förbered IgY-lösningen (valfritt läkemedel eller löst ämne) genom att lösa upp den i transportbufferten till önskad slutkoncentration. Förbered mer läkemedelslösning än vad som behövs.
- Organoid cell monolayer kvalitetskontroll
OBS: FITC-dextran-lösning kan användas för att bekräfta monolagerintegritet under experimentet. FITC-dextran används som ett exempel på en monolagerintegritetsanalys. Andra inkluderar Lucifer gul, PEG-4000, radiomärkt mannitol och inulin44.- Vid tiden 0 min, aspirera innehållet i den apikala kammaren och ersätt med 250 μL FITC-dextranlösning (5 mg/ml, 4 kDa) i tre exemplar för varje försöksgrupp.
OBS: Utsätt inte FITC-dextran för ljus. - Efter 20 minuter, ta bort bufferten från basolateralkammaren.
- Mät fluorescensintensiteten hos basolateralprovet med hjälp av en fluorescensplattläsare (använd en kalibreringskurva; excitation inställd på 485 nm och emissionsvärde på 528 nm).
OBS:P-appen för FITC kan också beräknas med den metod som beskrivs i diskussionen. - Efter att experimentet har avslutats, aspirera försiktigt överskottsbuffert från apikala och basolaterala kamrar.
- Tillsätt 200 μL CMGF+ i den apikala kammaren och 700 μL till basolateralkammaren.
- Mät TEER-värden i de enskilda brunnarna.
- Placera plattan i inkubatorn (37 °C; 5 % CO2-atmosfär ) i 24 timmar.
- Mät i tillämpliga fall TEER-värden efter 24 timmar för att bedöma eventuella skador på enskiktet under kvalitetskontrolldelen av experimentet. Använd ljusmikroskopi för att visualisera integriteten hos hundens organoidmonolager.
- Vid tiden 0 min, aspirera innehållet i den apikala kammaren och ersätt med 250 μL FITC-dextranlösning (5 mg/ml, 4 kDa) i tre exemplar för varje försöksgrupp.
- Fixering av cellmonolager för nedströmsanalys
- Förbered formalin-ättiksyra-alkohollösning (FAA, sammansättning i tabell 1).
- Ta bort transportbufferten eller CMGF+ från apikala och basolaterala kamrar med hjälp av en P1000-pipett eller sterila engångs 9"-Pasteur-pipetter och en vakuumaspirator.
- Fyll de apikala och basala kamrarna med FAA.
- Efter 24 timmar, aspirera FAA och ersätt den med 70% etanol.
- Vik in plattan med flexibel laboratoriefilm för att förhindra avdunstning och fortsätt att blockera beredningen.
Figur 6: TEER-värden i experimentgrupper. TEER-värden mättes i fem grupper av hundens tarmorganoidmonolager. Tre grupper bestod av hund jejunal enteroider, och två grupper bestod av kolonoider. Varje grupp innehöll 12 till 22 replikat. TEER-värdena för jejunala enteroidkulturer visas från dag 4 till dag 14, och kolonoidkulturer visas från dag 4 till dag 12 (mätningarna avslutades när organoidmonoskiktet nådde steady-state-värden, vilket indikerar att monolagret var redo för experimentell användning). Felstaplar uttrycker SEM för mätningarna. Förkortning: TEER = transepitelial elektriskt motstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Standardrutiner för odling av hundorganoider beskrevs tidigare33, och Canine Organoid Protocol har också diskuterats i detalj i detta specialnummer38. Hundens tarmorganoider odlade på permeabla stöd fixerades och paraffininbäddades för att undersöka mikroanatomin hos monolagret och cellpopulationerna. Paraffininbäddningsprocessen diskuterades tidigare av Gabriel et al.38. Rutinmässig färgning (hematoxylin och eosin) har utförts, och Alcian Blue-färgningstekniken användes för att detektera bägareceller i hundens organoidmonolager (se figur 7).
Figur 7: Färgning av hundens tarmorganoidmonolager. Hundens tarmorganoider av kolonursprung i det permeabla stödet har paraffininbäddats och färgats med H&E och AB. Representativa bilder togs med ljusmikroskopi vid 40x (A) och 60x (B) förstoring. H&E-färgning avslöjar ett kolumnärt epitelialt monolager, och mikrovilli i den apikala delen av cellerna kan observeras vid 60x förstoring. AB-färgning avslöjar ytterligare närvaron av bägare celler (mörkblå) i hundens tarmorganoidmonolager. Skalstänger = 20 μm (A), 50 μm (B). Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; AB = Alcian Blå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Organoidkulturen på det permeabla stödet bör odlas i 10 till 14 dagar för att vara redo för ett permeabilitetsexperiment. Ljusmikroskopi används tillsammans med TEER-värdemätningar för att bekräfta organoidkulturens beredskap för permeabilitetstestning av läkemedelskandidater. Representativa ljusmikroskopiska bilder av olika hundorganoida monolager från friska och sjuka djur presenteras i figur 8.
Figur 8: Hundens tarmorganoid monolagermikroskopi. Bilder av växande monolager sett under ljusmikroskopi. Organoidmonolager härledda från friska givare representeras av jejunal enteroid (10x; 40x) och colonoid (20x; 40x) kulturer. Organoidmonolager av sjuka givare representeras av duodenala (5x; 10x) och ileala (5x; 10x) enteroider härledda från en hundpatient diagnostiserad med PLE. Båda PLE-organoidkulturerna är exempel på felaktig cellisolering under sådd av organoider, och dessa kulturer kunde inte användas för läkemedelspermeabilitetsanalyser på grund av närvaron av 3D-organoider. Exempel på avvikelser från korrekt monolagerbildning, såsom monolagerårar (5x), orsakas av ovårdande manipulation av de biologiska proverna. Den långvariga kulturen av organoider (10x; 20x) orsakas av det långa underhållet av organoiderna på insatsen när organoiderna börjar likna sin ursprungliga 3D-struktur. Som jämförelse presenteras bilder av traditionella 2D-cellinjer på de permeabla stöd som vanligtvis används för läkemedelspermeabilitetsstudier (MDCK-10x; 40x och Caco-2-10x; 20x). Förkortningar: PLE = proteinförstörande enteropati; MDCK = Madin-Darby hundnjure. Skalstänger = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Organoidmonolager fixerades också i 3% Paraformaldehyd-3% Glutaraldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Transmissionselektronmikroskopi (TEM) användes för att karakterisera organoidkulturens ultrastruktur på de permeabla stöden. Mikroanatomiska strukturer av mikrovilli och täta korsningar kan ses i figur 9.
Figur 9: TEM-bilder av friska hundorganoida monolager. TEM användes för att avslöja den cellulära mikroarkitekturen av jejunal (A), ileal (B) och kolon (C) organoid monolayers. Det mikroporösa membranet i den permeabla stödinsatsen är markerad med en gul pil. Närvaron av mikrovilli (blå pil) och snäva korsningar (röd pil) avgränsas i bilderna. Förkortning: TEM = Transmissionselektronmikroskopi. Skalstänger = 5 μm (A), 2 μm (B, C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Både TEER-mätningar och ljusmikroskopi bör utföras för att säkerställa att systemet är redo för permeabilitetstestning. Analysen är klar för användning när TEER når ett stabilt tillstånd, medan ljusmikroskopi hjälper till att utesluta skador eller överväxt av organoiderna. En sammanfattning av typiska TEER-mätningar av fem grupper bestående av hund jejunal enteroider och kolonoider presenteras i figur 6.
Tabell 1: Sammansättning av organoidmedia och FAA. Den fullständiga sammansättningen av CMGF+, CMGF+ R/G och FAA sammanfattas i denna tabell. Förkortningar: ROCK = rho-associerat kinas; GSKiβ = glykogensyntaskinas beta; CMGF + R /G = Komplett medium med tillväxtfaktorer förstärkta med ROCK-hämmare och GSKiβ; CMGF+ = Komplett medium med tillväxtfaktorer men utan ROCK-hämmare eller GSKiβ; FAA = formalin-ättiksyra-alkohol; EGF =epidermal tillväxtfaktor. Denna tabell är anpassad från 38. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande tabell 1: Tabell för anteckningar om hundorganoid det permeabla stödsystemet. Förkortningar: TEER = transepitelial elektriskt motstånd; ROCK = rho-associerat kinas; GSKiβ = glykogensyntaskinas beta; CMGF + R /G = Komplett medium med tillväxtfaktorer förstärkta med ROCK-hämmare och GSKiβ; CMGF+ = Komplett medium med tillväxtfaktorer men utan ROCK-hämmare eller GSKiβ. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Hundens tarmorganoidkulturer i den permeabla stödapparaten är ett unikt koncept som förbinder traditionella läkemedelspermeabilitetsanalyser40 med en ny in vitro-hundmodell 41. Olika typer av hundens tarmorganoider kan användas och utvärderas baserat på experimentets mål med minimala justeringar. Testning av flera koncentrationer av läkemedlet av intresse i 3-4 brunnar per grupp rekommenderas. Koncentrationerna kan baseras på läkemedlets förväntade tarmkoncentration. Dessutom kan användning av tidigare forskning hjälpa till att bestämma lämpliga tidpunkter för studiedesignen. Lämplig dokumentation av studiedesign bör göras för att öka replikerbarheten och hjälpa till med felsökning.
Denna teknik har flera begränsningar på grund av nyheten i metoden42, främst på grund av bristen på standardisering i experimentell design och utförande av protokollet över laboratorier. Denna brist på standardisering har erkänts av andra grupper43, och Canine 3D Organoid Monolayer-protokollen kommer att leda till reproducerbarhet mellan laboratorier och införa standardisering till detta system. Standardiserade metoder för dataanalys förbättrar replikerbarheten och kan stärka resultaten av preliminära drogtester med hjälp av hundorganoiderna i det permeabla stödsystemet i olika laboratorier. Hundens 3D-organoidmodell saknar också datamängder som jämför in vitro P-appvärden för modellläkemedel med deras kända humana eller hundin vivo intestinal absorption, ungefär som Caco-2-celler 44,45,46. När sådana data har genererats kan denna hundorganoidmodell användas för att bedöma tarmpermeabiliteten under läkemedelsutveckling.
Det är viktigt att försiktighet vidtas vid sådd av organoiderna på det permeabla stödsystemet för att så en tillräckligt hög densitet av lämpligt dissocierade celler. Systemets TEER-värden är mer tillförlitliga och reproducerbara när de odlas i strikta monolager. Långvarig odling av monolagren kan leda till en exponentiell ökning av TEER-värden som når längre från tarmens fysiologiska värden. H&E-sektioner av sådana 3D-strukturer visar sedan flera lager av celler ovanför varandra med förändrade strukturer av enterocyter närmare membranet.
Efter framgångsrik expansion av hundens tarmorganoidmonolager kan resultaten analyseras på samma sätt som traditionella 2D-cellanalyser genom att beräkna ett läkemedels uppenbara permeabilitetskoefficient (Papp) formel44. P-appvärdet (se Eq (2)) beskriver transporthastigheten över det cellulära monolagret47.
(2)
Den 
är koncentrationens initiala lutning kontra tidskurvan (t.ex. nmol/s). A är insatsens yta (cm2) och C0 är den initiala koncentrationen av läkemedlet eller föreningen i givarkammaren37. Tillförlitligt erkännande av monolagerintegritet är en avgörande del av permeabilitetsanalysen som kräver standardisering. Ljusmikroskopi och TEER-mätningar rekommenderas för att bedöma hundorganoider i ett permeabelt stödsystem och hjälpa till att bestämma rätt tidpunkt för experimentet. Dessutom kan nollmolekylära permeabilitetsmarkörer (t.ex. FITC-dextran, Lucifer gul, PEG-400) användas för att funktionellt utvärdera organoid monolagerintegritet. Uppmärksamhet måste ägnas om den testade föreningen påverkas av en transportör. P-glykoprotein (P-gp) används som ett vanligt exempel på effluxpump. Ett efflux-förhållande måste genereras (P-app, BL-AP /P-app, AP-BL) jämfört med ett välkänt P-gp-sondsubstrat.
Ljusmikroskopi (vanlig eller förbättrad med faskontrast) är en ovärderlig metod för att kontrollera integriteten hos 2D- eller 3D-monolagret och filterinsatsen vid bedömning av eventuell cellulär överväxt. Figur 7 kan fungera som en guide för att känna igen friska hundorganoidcellkulturer. TEER-värden är ett viktigt mått på bildandet av intercellulära korsningar och differentiering av organoidkulturerna till ett intakt tarmepitel. Hundens tarmorganoider differentieras till enterocyter och bägare celler (Figur 6). Dessa slemproducerande celler möjliggör studier av läkemedels-sleminteraktioner, vilket har varit svårt att uppnå med traditionella 2D-cellkulturer48. Förekomsten av enteroendokrina celler har tidigare bekräftats i hundens tarmorganoider av Chandra et al.33.
Ytterligare karakterisering av hundens organoidmonolager härledda från jejunal-, ileal- och kolonorganoider med användning av TEM tillhandahålls. TEM-bilder visar cellulär mikroarkitektur, inklusive täta korsningar och mikrovillibildning, vilket ytterligare illustrerar komplexiteten och användbarheten av dessa organoidmodeller inom translationell medicin. Baserat på de experimentella resultaten var organoidkulturerna på det permeabla stödet redo för experiment mellan dag 11 och dag 13 efter sådd (figur 9). TEER-värdena vid denna tidpunkt varierade mellan 1 500 och 2 500 Ω,cm2. Platåfasen för TEER-värden varar under ett mycket begränsat tidsfönster där experimentet måste startas innan TEER-värdena börjar minska långsamt. TEER-värden kan också vara en viktig del av att visa viktiga experimentella resultat eftersom vissa läkemedel eller hjälpämnen för läkemedelsprodukter kan interagera med monolagret (t.ex. täta korsningar), vilket i hög grad kan påverka TEER-värdeavläsningar. Bara detta kan fungera som data för ett experiment.
Hundens tarmorganoider i en dubbelkammarcellodlingsapparat kan appliceras i andra fält än oral läkemedelspermeabilitet på grund av den unika arkitekturen hos det resulterande cellmonoskiktet. De kan till exempel användas i mikrobiologisk forskning (t.ex. effekterna av att förändra GI-mikrobiell flora), virusupptagsstudier, läkemedelsinteraktioner och läkemedelstransportmekanismer49. Donatorkammaren är vanligtvis fylld med det valda testläkemedlet eller den valda föreningen, och alikvoter från mottagarkammaren tas vid olika tidpunkter. Dessa alikvoter kan analyseras med hjälp av högpresterande vätskekromatografi, masspektrometri, enzymbunden immunosorbentanalys eller andra tekniker för att bestämma mängden och hastigheten med vilken det lösta ämnet tränger igenom monolagret.
Dessa studier kräver ett intakt monolager för att bedöma läkemedelspermeabiliteten exakt. Detta kräver vanligtvis växande monolager utöver de som behövs för att redovisa oanvändbara brunnar. Organoidcellmonolager kan också användas för att mäta viralt upptag antingen från den apikala eller basala sidan av ett monolager, med avläsningar inklusive immunofluorescensanalyser som använder antikroppar för att detektera virusets cellulära upptag. Slutligen kan flera läkemedel (dvs substrat och hämmare) appliceras på givarkammaren för att identifiera transportörbaserade läkemedelsinteraktioner.
Baserat på de nuvarande observationerna kommer dessa metoder inte bara att vara tillämpliga på hundorganoider i odlingsinsatser utan kommer också att vara lämpliga för andra veterinära arter och organsystem, med mindre modifieringar som behövs för att bäst passa den valda arten eller organmodellen. Protokoll för hundens intestinala organoidtillväxt måste justeras baserat på kulturens unika egenskaper. Således kan protokollet justeras till en annan art men kommer att kräva subtila ändringar av protokollet. Modifieringar kan börja med förändringar i cellens sådddensitet och expandera till förändringar i mediekompositionen för att korrekt differentiera organoiderna av intresse.
Standardiseringen, detaljerad dokumentation av experimentella procedurer och konsekvent övervakning av cellmonolagren är avgörande metoder som behövs i de permeabla stödanalyserna och är inte begränsade till hundsystemet. Dessa möjliga art- eller organändringar är avgörande för att dokumentera och rapportera för ytterligare framsteg inom området. Denna modell har flera begränsningar, till exempel dess kostnadskrav, interlaboratorievariation och begränsade data om förmågan att förutsäga tarmabsorption in vivo. Hundar har i vissa fall olika läkemedelstransportörer och metaboliserande enzymer än människor50.
Vidare måste hundens organoidsystem testas på en mängd andra dubbelkammarapparater från andra tillverkare för att bestämma lämpligheten hos en sådan modell (t.ex. måste lämpligheten hos olika filtermembrankompositioner bestämmas). En annan nackdel är att läkemedelspermeabilitetsexperimentdelen av manuskriptet är mindre beskrivande än de tidigare delarna. Detta orsakas av ett överskott av information inom detta område. Målet för denna del av manuskriptet var att beskriva dessa metoder på ett modifierbart sätt utan att skära kanterna på hörnstenarna i dessa experiment. Mer detaljerad information om permeabilitetsexperiment har samlats in av Hubatsch et al.37. Dessutom kan permeabla skär användas i kokultur, cellmigration och invasionsanalysexperiment4.
Sammanfattningsvis har hundens tarmorganoider i odlingsapparater med dubbla kammare potential att användas i ett brett spektrum av applikationer, inklusive biomedicinska fält och translationell medicin, för att nämna några. Protokollen skapar flera strategier för att planera ett experiment och främja interlaboratorisk datatillförlitlighet för organoidmodeller inom biologiområdet.
Disclosures
K. Allenspach är en av grundarna av LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions. Hon fungerar som konsult för Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics och Mars. J.P. Mochel är en av grundarna av LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions och fungerar som konsult för Ceva Animal Health och Ethos Animal Health. Den här artikeln återspeglar författarnas åsikter och bör inte tolkas för att representera Food and Drug Administration godkännande, åsikt eller policyer. Andra författare har ingen intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Vi vill uttrycka tacksamhet till Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University-anställda, nämligen Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green och Jennifer Groeltz-Thrush, för snabb behandling av prover. Vi vill också tacka Jodi Smith och Bethann Valentine för att ha tillhandahållit material för permeabilitetsexperimenten. Vi vill också tacka David Diaz-Reganon för hans hjälp med Figur 9. Förutom figur 6 skapades alla figurer i BioRender.com. Författarna vill erkänna stöd från fakultetsstart, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award och NSF SBIR underordnad ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638 (2013).
- Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
- Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204 (2019).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046 (2014).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411 (2019).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
- Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
- Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330 (2018).
- Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
- Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
- Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333 (2007).
- Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
- Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
- Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824 (2021).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
- Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
- Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
- Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515 (2022).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
- Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
- Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
- Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
- Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
- Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761 (2013).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59 (2021).
