Summary
형광 표지된 글루코스의 세포외 고갈은 글루코스 흡수와 상관관계가 있으며, 적출된 기관 및 세포 배양물에서 글루코스 흡수의 고처리량 스크리닝에 사용될 수 있다.
Abstract
전 세계적으로 진행중인 당뇨병 유행은 포도당 섭취에 영향을 미치는 환경, 영양, 내분비, 유전 및 후성 유전 적 요인의 확인에 대한 수요를 증가시킵니다. 세포내 형광의 측정은 시험관 내에서 세포에서 형광 표지된 글루코스(FD-glucose)의 흡수를 시험하거나 생체내에서 글루코스 소비 조직을 영상화하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이 분석은 선택된 시점에서 글루코스 흡수를 평가합니다. 세포 내 분석은 FD-글루코스의 신진 대사가 이화 작용 및 단백 동화 반응 및 신호 전달에 참여하는 내인성 포도당의 신진 대사보다 느리다고 가정합니다. 그러나 동적 포도당 대사는 또한 흡수 메커니즘을 변경하며, 이는 다양한 요인에 대한 반응으로 포도당 섭취의 운동 학적 측정이 필요합니다. 이 글에서는 세포외 FD-글루코스 고갈을 측정하는 방법을 설명하고, 세포 및 조직 ex 생체내에서 세포내 FD-글루코스 흡수와의 상관관계를 검증한다. 세포외 글루코스 고갈은 고처리량 동역학 및 용량-의존적 연구뿐만 아니라 혈당 활성 및 그들의 조직-특이적 효과를 갖는 화합물을 확인하는 데 잠재적으로 적용될 수 있다.
Introduction
포도당 섭취량 측정에 대한 요구는 포도당 대사에 의존하는 수많은 질병의 전염병 증가를 해결해야 할 중요한 필요성과 함께 증가합니다. 퇴행성 대사성 질환, 신경 및인지 장애1, 염증성2 및 전염병3, 암4,5 및 노화6의 기본 메커니즘은 에너지 및 그 저장, 단백 동화 과정, 단백질 및 유전자 변형, 신호 전달, 유전자의 조절, 핵산 합성 및 복제에 대한 포도당 대사에 의존합니다 7,8,9 . 당뇨병 (DM)은 포도당 흡수 조절의 오작동과 직접 관련이 있습니다. DM은 제1형, -2형, -3형 진성 당뇨병, 임신성 당뇨병, 젊은 성숙 발병 당뇨병 및 환경 및/또는 유전적 요인에 의해 유발되는 다른 유형의 질환과 같은 만성 질환의 스펙트럼이다. 2016 년 당뇨병에 관한 최초의 WHO 글로벌 보고서에 따르면 가장 널리 퍼진 DM을 앓고있는 성인의 수는 1980 년 이후 422 백만 명의 성인10 명으로 거의 4 배로 증가했으며이 DM 환자 수는 지난 수십 년 동안 기하 급수적으로 증가하고 있습니다. 2019 년에만 DM10에 의해 1.5 백만 명의 사망자가 직접 발생한 것으로 추정됩니다. 이러한 극적인 상승은 유형 2 DM의 증가와 과체중 및 비만10을 포함하여 그것을 유발하는 조건 때문입니다. COVID-19 전염병은 일반 인구에 비해 DM 환자의 사망률이 두 배 증가한 것으로 나타 났으며, 이는 면역 방어에서 포도당 대사의 심오하지만 잘 이해되지 않은 역할을 시사합니다3. DM, 비만 및 기타 질병의 예방, 조기 진단 및 치료에는 다양한 조직에 의한 포도당 흡수 측정의 최적화와 포도당 섭취에 영향을 미치는 환경 11, 영양 12, 내분비13, 유전 적14 및 후성 유전 학적 15 요인의 확인이 필요합니다.
연구에서, 글루코스의 세포내 및/또는 조직 흡수는 일반적으로 시험관내 16,17,18 및 생체내19에서 형광 표지된 글루코스(FD-glucose)에 의해 측정된다. FD-글루코오스는 방사성 표지된 글루코스 20, 분석 질량 분광법 분석 21, 대사체학 22, 핵 자기 공명 방법(23), 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영(PET/CT)5,24를 사용하는 보다 정밀한 방법에 비해 선호되는 방법이 되었다. FD-글루코스 섭취와는 달리, 더 많은 생물학적 물질을 필요로 하는 분석 방법에는 다단계 샘플 준비, 고가의 장비 및 복잡한 데이터 분석이 포함될 수 있습니다. 세포 배양물에서 FD-글루코스 흡수의 효과적이고 저렴한 측정은 개념 증명 실험에 활용되었으며 다른 방법에 의한 검증이 필요할 수 있습니다.
포도당 흡수 연구를위한 FD-글루코스 적용의 기초는 내인성 포도당25에 비해 FD-포도당의 신진 대사 감소입니다. 그럼에도 불구하고, 내인성 글루코스와 FD-글루코오스 둘 모두는 동화작용, 이화작용 및 신호전달 과정에 사용하기 위해 모든 세포 구획들 사이에 동적으로 분포된다. FD-글루코오스의 구획화 및 시간 의존적 처리(25 )는 형광 측정을 방해하고, 고처리량 스크리닝 실험, 동역학 분석, 3D 세포 배양, 공동 배양, 및 조직 외래 실험에서 이러한 분석의 사용에 대한 주요 제한 인자를 나타낸다. 여기에서, 우리는 FD-글루코스의 세포외 고갈과 그 세포내 흡수 사이의 높은 상관관계를 보여주는 데이터를 제공하여, 세포내 글루코스 흡수를 위한 대리 측정으로서 FD-글루코오스의 세포외 고갈을 시사한다. 글루코스의 세포외 고갈의 측정은 이 방법의 원리 증명을 제공하기 위해 인슐린 및 실험 약물18 로 처리된 마우스에서 글루코스 흡수의 조직 특이적 차이를 검증하기 위해 적용되었다.
현재 프로토콜은 3T3-L1 세포에서 FD-글루코스 흡수의 세포내 및 세포외(그림 1) 측정을 기술한다. 프로토콜 섹션 1-7은 48 h 동안 세포의 배양 및 성장을 설명합니다. 세포 기아, 자극, 및 기준선 세포외 측정; 및 세포외 FD-글루코오스의 자극 후 측정 및 FD-글루코스 및 단백질의 세포내 측정. 프로토콜 섹션 8은 다른 곳(18)에 기술된 인슐린 및 아미노산 화합물 2(AAC2)의 존재 및 부재 하에 ob/ob 마우스로부터 해부된 조직에서 FD-글루코스의 세포외 흡수의 생체외 측정을 기술한다.
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Protocol
동물 연구는 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (OSU, 프로토콜 2007A0262-R4)에 의해 승인되었습니다.
참고 : 모든 절차는 송풍기를 켜고 표시등이 꺼진 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행되어야합니다.
1. 재료의 제조
참고: 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.
- 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 표 1에 따른 배지 1, 원심분리 배지 2, 및 형광 2-데옥시-2-[(7-니트로-2,1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]-D-글루코오스(2-NBDG 또는 FD-글루코스)의 저장 및 작업 용액을 준비한다. 후드 아래의 모든 조명을 꺼서 실험 전반에 걸쳐 빛으로부터 FD-포도당을 보호하십시오.
- 즉시 사용 가능한 세포 배양 시약을 사용하십시오: 트립신-EDTA, 인산염 완충 식염수(PBS), 무글루코스 및 페놀 무함유 둘베코의 변형 이글 배지(이하, 무당 DMEM).
- 20 mL의 방사선면역침전 분석법(RIPA) 용해 완충액을 사용하십시오.
참고: 다음 섹션에서는 인슐린 자극이 있거나없는 3T3-L1 섬유아세포에서 다른 FD-글루코스 용량의 세포외 고갈 및 세포 내 흡수를 비교합니다 (그림 2).
2. 3T3-L1 세포 배양 및 유지
- 배지 1 20 mL에 희석된 1 x 10 6 세포를 두 개의96 -웰 플레이트에 플레이팅하여 3T3-L1 마우스 섬유아세포를 배양하였다. 웰 당 100 μL의 세포 현탁액을 플레이트하고, 혼합함으로써 이 현탁액의 균질성을 유지하도록 보장한다. 세포를 약 70%-80% 컨플루언시가 될 때까지 배지를 변화시키지 않고 37°C 인큐베이터(5%CO2 및 95% 습도)에서 48시간 동안 성장시킨다.
- 세포를 합류시키고 48 h 동안 동일한 배지에서 배양하여 금식시킨다. 원하는 공복 이화 상태에 따라 24-72 h에서 배양 시간을 변화시킨다.
3. 3T3-L1 세포의 굶주림
- 96-웰 플레이트에 있는 세포로부터의 데칸트 배지. 멸균 종이 타월을 사용하여 나머지 액체를 흡수하십시오.
- 96-웰 플레이트를 웰 당 100 μL의 PBS로 헹구고 남은 유체를 멸균 종이 타월로 흡수한다.
- 웰 당 100 μL의 글루코스가 없는 DMEM을 첨가하고, 40분 동안 인큐베이션한다. 세포 유형, 자극 및 원하는 금식 수준에 따라 배양 시간을 조정하십시오.
참고 : 인큐베이션 시간은 계절에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
4. 다양한 농도의 FD-글루코스 용액의 제조
참고: 그림 2 의 실험은 인슐린 자극 유무에 관계없이 세포외 및 세포간 배지를 검사합니다.
- 각 자극 조건에 대해 여덟 번의 반복실험(96웰 플레이트에서 한 줄)을 사용합니다. 따라서, 각 자극 조건에 대해 1 mL를 준비한다( 표 2 및 하기에 특정됨).
- 인슐린이 없는 여덟 가지 자극 조건을 사용하십시오: 하나의 96웰 플레이트에서 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.05 μg/mL 및 0 μg/mL(FD-글루코스 없이 대조군)의 FD-글루코스.
- 인슐린 (10 μg/mL, 최종 농도)과 함께 여덟 가지 자극 조건을 사용하십시오 : 2.5 μg / mL의 FD 포도당, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL 및 0 μg / mL (FD 포도당이없는 대조군)를 다른 96 웰 플레이트에서 사용하십시오.
- 자극 조건을 준비하기 위해, 999 μL의 글루코스가 없는 DMEM에 5 mg/mL FD-글루코스 작동 용액 1 μL를 희석하여 1 mL의 작업 원액(1:1000 희석 또는 5 μg/mL)을 얻었다.
- 이 작업 원액을 사용하여 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000 및 1:100,000 희석액의 FD-글루코스를 준비하여 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL 및 0.05 μg/mL(표 2)를 조명이 없는 생물 안전 캐비닛에서 실험 직전에 2 mL 튜브에 넣습니다.
- 4.4단계를 반복하고 위에 명시된 각 조건에 인슐린 1μL(10mg/mL, 최종 농도)를 추가합니다.
참고: 이 샘플에서 인슐린의 최종 농도는 10 μg/mL = 1.7 nmol/mL입니다. 균질화를 달성하려면 다른 용액을 추가하기 전에 튜브에 인슐린을 첨가하십시오.
5. 굶주린 3T3-L1 세포 치료
- 40분 인큐베이션 후, 96-웰 플레이트에서 각 웰로부터 글루코스가 없는 DMEM을 데칸트하고 나머지 유체를 멸균 종이 타월로 흡수한다.
- 상기에 기술된 다양한 처리 조건으로부터 각각 100 μL(웰 당)를 하나의 컬럼을 따라 웰에 첨가하고, 동일한 처리 조건으로부터 100 μL(웰 당)를 두 96-웰 플레이트 모두에서 행(8회 반복실험)을 따라 웰에 첨가한다. 인슐린 유무에 관계없이 조건을 활용한 플레이트에 라벨을 붙입니다. 무글루코스 DMEM 단독을 대조군 웰에 첨가한다(n=8).
- 플레이트를 어둠 속에서 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2, 및 95% 습도)에서 40분 동안 인큐베이션한다.
6. 자극된 3T3-L1 세포에 대한 세포외 및 세포간 측정
- 세포를 40분 동안 자극한 후, 두 플레이트로부터 자극 배지를 동일한 실험 레이아웃을 유지하는 새로운 96-웰 플레이트로 옮긴다.
- 멸균 종이 타월에 세포가있는 원래의 자극 된 96 웰 플레이트에서 남아있는 용액을 데칸트하십시오.
- 임의로, 세포를 PBS로 세척한다. PBS를 제거하고 멸균 종이 타월에 남아있는 용액을 데칸트하십시오.
- 100 μL의 RIPA 용해 완충액을 각 웰에 첨가한다. 임의로, 단백질을 보호하기 위해 프로테아제 억제제를 RIPA 완충액에 첨가한다. RIPA가 들어있는 플레이트를 셰이커에 30분 동안 놓습니다.
- 마이크로플레이트 리더 (표 of Materials)를 사용하여, 각각 485 및 535 nm의 여기(Ex) 및 방출(Em) 파장에서 형광을 측정하고, 먼저 세포외 FD-글루코스를 함유하는 배지에서, 이어서, 플레이트를 RIPA-용해된 세포와 함께 30분 인큐베이션의 끝에서 (단계 6.4 참조).
7. 세포 내 포도당 흡수의 단백질 기반 정상화
참고: 세포내 FD-글루코스 흡수는 세포 수에 따라 다릅니다. 세포 용해물의 단백질 수준은 각 웰의 세포 수에 대한 세포 내 FD-글루코스 수준을 정상화할 수 있는 세포 수에 비례합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석을 수행하십시오 ( 물질 표 참조). RIPA-용해된 세포를 함유하는 각 웰에서의 단백질 농도를 정량화한다.
- 10μL의 RIPA 균질액을 사용하고 삼중으로 단백질 농도를 측정하여 96웰 플레이트에서 측정의 정확도를 높입니다.
- 각 96웰 플레이트의 샘플과 함께 분석한 단백질 표준물질(0, 10, 20, 30, 40, 50 및 60 μg/mL 단백질)을 기반으로 단백질을 정량화합니다.
- 562nm에서 흡광도를 측정하고 단백질 표준에 대해 얻은 선형 회귀 공식을 기반으로 각 샘플의 단백질 농도를 정량화합니다.
- 각 웰에서 형광 값 / 단백질 농도를 사용하여 세포 내 FD-포도당 수준을 정상화하십시오. 세포외 FD-글루코스 고갈은 정상화를 필요로 하지 않는다.
- 선택적으로, 추가 정규화를 위해 대조군 샘플의 평균 기준선 값을 사용하십시오(100%).
8. 장기의 세포외 FD 포도당 고갈의 생체외 측정
- 마우스를 장기 해부 전에 포도당 대사를 자극하는 화합물로 전처리하면 다음과 같다.
- 아홉 주 된 Lepob 수컷 마우스(n=11)를 사용한다. 실험 전에 모든 마우스에게 정기적 인 차우 식단을 먹이십시오.
- 마우스를 복강내(i.p.) 주사를 위해 무작위로 세 그룹으로 할당한다.
- 대조군 Lepob 그룹으로부터의 마우스를 0.1 mL의 멸균 PBS (n=4)와 함께 주입한다.
- 인슐린 Lepob 그룹으로부터의 마우스를 체중 (BW) 그램 당 12 IU의 인간 인슐린을 함유하는 멸균 PBS 0.1 mL와 함께 주사한다 (n=3).
- AAC2 Lepob 그룹으로부터의 마우스를 체중 (BW) 그램 당 0.1 nmol AAC2를 함유하는 멸균 PBS 0.1 mL와 함께 주입한다 (n=4).
- 15분 후, 피험자 마우스는 5% 이소플루란을 흡입하고 마취된 동물26으로부터 심장 천자에 의해 혈액을 exsanguinate한다.
- 각 동물로부터 내장 epidydimal 백색 지방 조직 (200 mg), 간 (200 mg) 및 전뇌를 해부하십시오. 조직 취급을 위해 Class II 생물 안전 후드를 사용하십시오.
- 빛이 없는 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 글루코스가 없는 DMEM에 FD-글루코스(0.29mM) 작업 용액을 준비합니다.
- 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 각각 485 및 535 nm의 여기 및 방출 파장에서 FD-글루코스 작동 용액 (0.29 mM)의 형광을 측정하였다.
- 수확된 조직/기관을 PBS를 함유하는 6-웰 플레이트에서 1분 동안 인큐베이션한다. 각 조직이나 기관을 별도의 우물에서 다루십시오.
- 1분 후, 각 조직을 멸균된 종이 타월 위에 올려놓고 PBS를 흡수한다. 조직/장기를 4,000μL의 글루코스가 없는 DMEM을 함유하는 별도의 6-웰 플레이트에 옮기고 2분 동안 배양한다.
- 2분 후, 조직을 제거하고 0.29mM FD-글루코스 작동 용액(1mL/웰)이 들어있는 6-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 조직을 함유하는 6-웰 플레이트를 FD-글루코스 작동 용액에서 37°C(5%CO2 및 95% 습도)에서 인큐베이션한다.
- 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 및 120분 배양 후 각 웰로부터 FD-글루코스 작동 용액 100 μL를 수집하여, 세포외 FD 글루코스 고갈의 동역학을 분석하였다. 수집 전후에 흔들어 주십시오.
- 100 μL의 FD-글루코오스 작동 용액을 96-웰 플레이트로 옮기고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 각각 485 및 535 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광을 측정하였다.
- 형광을 각 동물의 각 장기에 대해 0분 값(100%)으로 정규화합니다(그림 3).
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Representative Results
세포내 섭취 및 세포외 글루코스 고갈은 인슐린 자극 유무에 관계없이 FD-글루코오스의 상이한 농도(도 2)에 반응하여 3T3-L1 지방전구세포에서 측정되었다. 도 2A는 FD-글루코스의 세포내 흡수의 용량-의존적 증가를 보여주며, 이는 인슐린의 존재하에서 유의하게 증가되었다. 동일한 세포에서 세포외 FD-글루코오스의 수반되는 감소는 도 2B에 나타나 있으며, 여기서 인슐린 자극은 인슐린 자극이 없는 샘플에 비해 세포외 FD-글루코스 수준을 유의하게 감소시켰다. FD-글루코스의 세포내 섭취는 인슐린이 있거나없는 샘플에서 용량 의존적 방식으로 FD-글루코스의 세포외 고갈과 상관 관계가 있습니다 (그림 2C). 따라서, FD-글루코오스의 세포외 고갈은 세포내 FD-글루코스 흡수로서 대등한 정확도(R2= 0.99, P< 0.001)로 글루코스 흡수의 변화를 측정할 수 있다.
다음으로, 포도당 흡수의 정경 및 실험적 유도제로 자극시 다른 조직을 조사하는 운동 연구에서 세포외 FD-포도당 흡수 적용을 검증하기 위한 실험 설정이 개발되었다(그림 3). 내장 백색 지방 조직27,28을 포함하는 말초 조직에서 인슐린 저항성의 Lepob 마우스 모델을 선택하였다. 이들 마우스에서 인슐린에 대한 잘 확립된 반응은 렙틴 수용체 및 글루코스 수송체 GLUT1 의존성 기작(18)을 통해 말초 및 신경 조직 모두에 작용하는 신규한 화합물 AAC2의 효과와 비교되었다. Lepob 마우스는 i.p. 인슐린 또는 AAC2를 주사하였다. 장기는 주사 후 15분 후에 해부되었다. 이어서, 세포외 FD-글루코스 고갈의 동역학을 내장 지방, 간 및 뇌 생체외에서 연구하였다(도 3). 말초 조직에서 보고된 인슐린 저항성과 일치하여, 세포외 FD-글루코스는 인큐베이션 120분 동안 자극되지 않은 대조군 내장 지방에서 고갈되지 않았다(도 3A). 대조적으로, 해부 전에 인슐린 또는 AAC2로 마우스를 전처리한 결과, 각각 30분 및 60분의 시간 간격 내에 세포외 FD-글루코오스의 상당한 고갈이 초래되었다.
포도당의 간 흡수는 인슐린 자극29,30과 무관하게 GLUT2를 포함하는 글루코스 수송체를 이용한다. 따라서, 세포외 FD-글루코스는 초기에 인슐린 자극을 받은 간 외식편에서 고갈되지 않았으며 자극되지 않은 간 외식편과 비교하였으나 (도 3B), 인슐린으로 자극된 간 외식편에서 배양 120분 후에 FD-글루코오스의 현저한 고갈이 초기 수준(0분)과 비교하여 관찰되었다. 한편, 세포외 FD 글루코오스는 AAC2로 전처리된 간 외식편에서 시간 의존적으로 유의하게 감소하였다.
뇌에서, 주요 수송체는 다른 수송체들(31) 중에서 GLUT1이다. FD-글루코스 고갈 동역학은 다른 조직과 비교하여 뇌에서 현저하게 달랐다(도 3C). 글루코스의 현저한 고갈은 인큐베이션 60분 후에 처리되지 않은 뇌를 함유하는 세포외 배지에서 관찰되었다(0분에서 100% 내지 78%). 인슐린으로 처리된 Lepob 마우스로부터의 뇌와 함께 인큐베이션된 배지는 FD-글루코스의 중등도이지만 유의한 선형 감소를 나타내었다(0분에서 100%에서 95%까지). AAC2 자극을받은 뇌는 처음 20 분 동안 세포 외 FD-포도당의 심오한 급속한 감소를 초래합니다 (0 분에서 100 %에서 67.4 %까지). 함께, 세포외 글루코스 고갈의 측정은 생체내32에서 이들 조직에서의 글루코스 흡수의 이전에 보고된 차이를 지지한다.
도 1: 세포외 FD-글루코오스 고갈 방법의 원리. 96-웰 포맷으로 배양된 세포는 이 검정에 적합하다. 생존을 위해, 세포는 포도당을 차지하고이 유입은 세포 외 포도당의 수준을 감소시킵니다. 포도당을 FD-글루코스로 대체하면 이러한 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 시험 관 내에서 세포내 흡수와 상관관계가 있는 세포외 FD-글루코스의 고갈. 3T3-L1 지방전구세포는 인슐린이 있거나없는 FD-글루코오스의 상이한 농도로 인큐베이션하기 전에 40분 동안 글루코스가 없는 배지에서 인큐베이션되었다(1.7 mM; 40분 인큐베이션). (A, B) FD-글루코오스 (A) 및 세포외 FD-글루코스 고갈 (B)의 용량-의존적 흡수는 대조군 (즉, 인슐린 없이) (부화 막대) 및 인슐린 자극 세포 (검정 막대)에서 증가한다. FD-글루코스 흡수는 단백질 농도에 의해 정상화되었다. 데이터는 FD-글루코스 없이 인큐베이션된 대조군에서 측정된 값의 %로서 나타내었다(조건 당 평균 SD, n=8). 유의성은 짝을 이루지 않은 t-검정에 의해 조사되었다. (C) (A) 및 (B)에 기재된 실험에서 인슐린과 (사각형) 또는 없는 (원) 인슐린과 세포외 FD-글루코오스 (%) 사이의 상관관계를 측정한다. 피어슨 상관관계, P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 생체외 다른 기관에서의 세포외 FD-글루코스 고갈의 동역학. (A-C) Lepob 마우스에 비히클 (PBS, n = 4), 인슐린 (12 IU/kg BW, n = 3) 및 AAC2 (1 nmol/g BW, n = 3)를 주사하였다. 15분 후, 조직을 해부하고 분리하였다. (A) 내장 지방, (B) 간, 및 (C) 뇌의 외식편을 FD-글루코스 (0.29 mM)에서 인큐베이션하였다. 세포외 글루코스 고갈의 동역학은 상이한 시점에서 배지의 분취량으로 측정되었다. 데이터(평균 SD)는 0분 인큐베이션에서 각 기관에서의 형광의 %로서 나타내었다. 유의 P < 0.05, 짝을 이루지 않은 t-검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션/중간 | 구성 요소 |
| 에탄올 : DMSO (1 : 1 / v / v) | 에탄올 (200 μL) 및 DMSO (200 μL) 중의 1-1.5 mL 튜브; 세포 배양 등급 에탄올 및 DMSO를 사용하십시오. |
| 중형 1 | 멸균 50 mL 튜브에 DMEM (89 mL), 페니실린/스트렙토마이신 (1%)(1 mL) 및 송아지 혈청(10%)(10 mL) |
| 원심분리 배지 2 | 멸균 50 mL 튜브에 DMEM (89 mL), 페니실린/스트렙토마이신 (1 mL) 및 소 혈청 (10 mL) (10 mL) |
| 저장 FD 포도당 용액 5 mg / mL (14.5 mM) | FD 글루코스 (1 mg) 및 에탄올 : 0.5 mL 튜브에 DMSO (1 : 1 / v / v) (200 μL); -80°C에서, 우선적으로 아르곤 또는 질소 분위기 하에서 저장 |
| 작동 FD 포도당 용액 5 μg / mL (14.5 mM) | 저장 FD 글루코스 용액 5 mg/mL (1 μL), 글루코스 프리 DMEM (999 μL); 실험 직전에 준비하십시오. |
표 1: 배양 배지 및 FD-글루코스 용액의 제조.
| 희석 | 제어 | 1시 2분103분 | 1:5x103 | 1시 1분10분4초 | 1:2.5x104 | 1시 5분104분 | 1시 1분105분 |
| 농도(μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| 무당 DMEM (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD 포도당 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
표 2: 도 2에 나타낸 실험을 위해 상이한 농도의 FD-글루코오스 용액의 제조.
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Discussion
세포외 FD-글루코스 고갈과 세포 배양에서의 정상화된 세포내 글루코스 흡수의 직접적인 비교는 높은 상관관계를 나타냈으며, 이는 세포외 글루코스 고갈이 글루코스 흡수 평가를 위한 대리 측정이 될 수 있음을 시사한다. 세포외 FD-글루코스의 측정은 광범위한 FD 글루코스 농도를 사용할 수 있으며, 또한 0.5-2.5 μg FD-글루코스 / mL가 최적의 범위를 제공하는 것으로 보입니다. 세포외 FD-글루코오스는 세포내 FD-글루코스 섭취에 필요한 세포 수 또는 단백질 농도로의 정상화를 필요로 하지 않는다. 세포외 FD-글루코스 측정의 예상되는 한계는 반응성 산소 종 유도제와 형광을 냉각시킬 수 있는 외식식물 내의 혈액의 흔적에 대한 조사이다. 빛과 같은 형광에 영향을 미치는 다른 환경 요인도 고려해야합니다. 여러 조직 외식편을 사용하는 동안 필요한 장시간 처리 시간은 조직 생존력과 포도당 대사를 손상시킬 수 있습니다. 이는 추가적인 제한 사항이 될 수 있습니다. 적출 된 조직은 조직 내부의 포도당의 투과성을 허용하기 위해 작은 크기 범위 (50-300mg)에 있어야합니다. 여러 작업자가 조직을 동시에 취급하면 처리 시간을 줄일 수 있습니다. 비록 우리가 조직 외식편 내의 글루코스 흡수를 측정하지는 않았지만, 배양된 조직 외식편에서 축적된 관찰은 이들이 기능성의 점진적 손실과 함께 최대 17일 동안 글루코스 함유 배지에서 생존한다는 것을 시사한다(33). 이 프로토콜에서, 외식편에 대한 짧은 배양 시간은 비교적 기능적인 조직에서 포도당 대사를 모니터링 할 수있게합니다. 뇌와 같은 복잡한 세포 조직을 가진 조직에서, 크기는 복잡한 조직의 붕해와 그로 인한 세포 사멸이 포도당 흡수에 영향을 미치기 때문에 해결할 수없는 한계를 제시합니다. 그러나, 24시간 동안 뇌의 인큐베이션은 이전에 내인성 조절 메카니즘의 확인에 사용되어왔으며, 글루코스 함유 배지(34)에서 적출된 마우스 뇌의 상대적 생리학적 기능성을 지원한다. 그럼에도 불구하고, 단순화된 절차와 세포외 FD-글루코스의 쉬운 접근성은 이 검정을 고처리량 포맷으로 사용할 수 있게 한다. 기본 및 인슐린 자극 세포외 FD-글루코스 고갈의 비교는 이 분석이 체액성, 영양적, 병원성, 환경적 요인 또는 포도당 섭취를 조절하는 약제학적 약물을 확인하기 위해 적용될 수 있음을 시사한다. 이 분석이 발견을 단순화하지만, 그 발견은 경로의 엄격한 기계론적 해명을 위해 정량적 방사성 표지 20 분석 방법21,22,23 및/또는 이미징 방법(5,24)을 통한 검증을 필요로 하였다.
이 프로토콜의 중요한 단계에는 기저 및 자극 된 FD-포도당 섭취에 모두 영향을 미치는 합류 및 금식 시간의 최적화가 포함됩니다. 이러한 매개 변수는 저자의 관찰에 따라 계절에 따라 영향을받을 수도 있습니다. 또한, 상이한 세포 유형은 상이한 글루코스 수송체 및 조절 호르몬/수용체 상호작용32,35,36을 포함하는 글루코스 흡수를 위한 특정 메카니즘을 이용한다. 따라서 인슐린 이외의 양성 대조군은 인슐린 / GLUT4 축에 의해 조절되는 근육 또는 지방 조직 이외의 조직을 나타내는 세포 배양에 대해 고려되어야합니다. 문제 해결에는 세포 합류도를 조정하고 FD-포도당으로 금식 / 재 공급을위한 시간을 최적화하는 것도 포함됩니다. 또한, 세포외 글루코스 측정의 민감도는 글루코스 섭취에 필요한 역치 수준을 고려하여 세포외 FD-글루코오스의 수준을 감소시킴으로써 개선될 수 있었다. 그림 2에 설명 된 실험은 연구자가 다른 세포 배양 또는 문제 해결과 함께 사용하기 위해이 분석을 사용자 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다.
포도당 대사의 본질적인 변동성은 또한 더 높은 표본 크기 (n = 5-8)를 필요로했습니다. FD-글루코스 손실의 세포외 측정이 단백질에 의해 정규화된 FD-글루코오스의 세포내 흡수와 동일한 정확도를 나타내었지만, 정상화는 분석 가변성을 감소시킬 수 있다. 단백질 농도의 측정에 더하여, 세포 내의 DNA 함량의 측정은 세포 수37의 또 다른 신뢰할 수 있는 대리 평가가 될 수 있다.
세포외 FD-글루코오스는 동역학적 측정을 위해 접근가능하다. 여기에서, 글루코스 섭취의 매개자에 대한 기관 특이적 반응을 확인하기 위해 세포외 FD-글루코오스의 동역학적 측정의 간단한 절차가 개발되었다. 이러한 시험관내 연구는 도 3에 도시된 바와 같이, FD-글루코스 및 생체외 동역학적 측정에 대한 장기의 노출과 결합되는 생체내 다양한 자극에 대한 장기 반응을 직접 시험할 수 있다. 생체외 연구가 생체 내 조건과 완전히 유사하지는 않지만, 여러 가지 장점이 있습니다. 장기 외식편은 변경된 유전자 발현을 나타내는 불멸의 세포 배양물과는 달리 복잡한 다세포 일차 세포 구조를 유지한다. 현대 약물 개발은 모델 유기체, 전사체 또는 대사체22, 포괄적 인 인슐린 클램프 기술 (38) 또는 값비싼 이미징 (32)에 기초한 포도당 흡수의 간접 평가를 이용한다. 외래 기관에서의 세포외 FD-글루코오스의 측정이 이러한 기술을 대체하지는 않지만, 조직 특이적 방식으로 글루코스 흡수를 조절하는 새로운 치료 표적의 발견을 용이하게 하기 위해 화합물, 대사산물 및 유전자의 신속한 평가를 제공할 것이다. 특정 조직에서 포도당 대사를 다루는 안전한 치료법의 개발은 암, 치매, 노화, 당뇨병, 자가면역 질환, 비만 및 기타 관련 응용 분야에 대한 솔루션을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 문제가 없으며 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 Ralph와 Marian Falk Medical Research Catalyst Award와 Kathleen Kelly Award의 지원을 받았습니다. 다른 지원으로는 국립 연구 자원 센터 UL1RR025755 및 NCI P30CA16058 (OSUCCC), 의학 연구를위한 NIH 로드맵이 포함되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 연구 자원 센터 또는 NIH의 공식 견해를 대표하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
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