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方法文章

利用组织透明化后三维重建方法检测和定量小鼠门齿中的标记滞留细胞

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DOI：

10.3791/63721

⸱

2022年6月10日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Texas A&M School of Dentistry

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

小鼠门齿的干细胞微环境中含有宝贵的标记滞留细胞。我们建立了一种无偏倚检测和定量标记滞留细胞的新方法；本研究采用EdU标记，并在对下颌骨进行PEGASOS组织透明化处理后，结合三维重建技术进行分析。

摘要

小鼠门齿是一种在其整个生命周期中持续生长的器官。位于门齿近端组织中的上皮和间充质干细胞可产生子代细胞，进而分化为成釉细胞、成牙本质细胞和牙髓成纤维细胞。这些细胞对于维持门齿组织的持续更新至关重要，因此小鼠门齿是研究成体干细胞稳态的优良模型。研究表明，干细胞群体中包含长期存活的静息细胞，这类细胞可通过核苷酸类似物（如5-乙炔基-2′-脱氧尿苷，EdU）进行标记。这些细胞能够长期保留该标记，因而被称为 标记保留细胞（LRCs）。标记保留细胞的可视化方法 体内 为监测干细胞稳态提供了强有力的工具。在本研究中，我们描述了一种可视化和分析滞留细胞（LRCs）的方法。该创新性方法通过对小鼠门齿组织透明化处理后进行整体EdU染色，继而结合共聚焦显微镜观察及成像软件的三维（3D）重建，实现对LRCs的呈现。与传统的基于切片样本的LRCs分析相比，该方法可实现三维成像采集和无偏定量分析。

引言

不断生长的小鼠门齿是研究成体干细胞的优良模型1位于门齿近端侧的上皮性（唇侧和舌侧颈环）及间充质干细胞（位于唇侧与舌侧颈环之间）可分化为成釉细胞、成牙本质细胞和牙髓细胞。这一独特过程为组织损耗的补偿与更新提供了细胞来源。2尽管已鉴定出多种干细胞标志物，如 Sox2、Gli1、Thy1/CD90、Bmi1 等 体内 对于小鼠门齿中的成体干细胞亚群而言，单独使用时，这些方法在代表干细胞群体方面存在不足1,3,4,5通过核苷酸类似物DNA标记与滞留技术可视化长寿命静息细胞，可为大多数成体干细胞亚群提供无偏倚的检测方法6此外，该方法在多种干细胞鉴定技术中具有重要应用价值7 用于理解细胞行为及牙源性干细胞群体的稳态3,8尽管分裂的干细胞在经过较长时间的追踪后会失去其DNA标记，但假定的静息干细胞仍保留其DNA标记，因而被称为标记滞留细胞（LRCs）。6非分裂干细胞对DNA的标记与滞留可标记并定位其微环境中的成体干细胞。

近年来，胸腺嘧啶类似物5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记已取代了繁琐、耗时且与高分辨率显微镜不兼容的3H-胸腺嘧啶DNA标记方法，用于细胞增殖检测6,9近年来，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）标记技术的使用已逐渐取代溴脱氧尿苷（BrdU）方法。这一趋势的出现主要基于以下几个原因。首先，BrdU方法操作耗时且劳动强度大。实验条件多变，且会因DNA变性而无法保持样本的超微结构。同样，BrdU方法会导致细胞抗原性的丧失，从而影响后续功能分析和检测的效率，例如共定位实验 体内 干细胞移植3,7,9,10,11,12BrdU 还是一种致畸剂，因此不适用于胚胎发育过程中标记滞留细胞（LRCs）6此外，BrdU 方法在整体标本中使用时效率较低，其缺点包括抗体在标本深层部位渗透性差，或需要较长的抗体孵育时间以实现充分渗透。13EdU标记避免了样本变性步骤，从而保护了超微结构。这一特性有利于后续功能分析，如共定位实验和干细胞移植。11,12此外，EdU标记具有高灵敏度和快速性；由于采用可快速吸收且分子较小的荧光叠氮化物，通过Cu(I)催化的[3 + 2]环加成反应检测EdU标记，使样本穿透性显著提高"点击" 化学14.

另一种日益广泛应用的 DNA标记方法是使用基因工程转基因小鼠。这些小鼠表达由四环素响应调控元件控制的组蛋白2B绿色荧光蛋白（H2B-GFP）5,14。在给予小鼠含四环素的食物或饮水进行为期4周至4个月的追踪后，GFP荧光将在增殖细胞中逐渐减弱，仅有滞留细胞（LRCs）保留荧光信号6。该方法的优势在于，标记的滞留细胞可被分离并保持活性，适用于细胞培养或后续功能分析6,7。一些研究报道，在长期追踪条件下，该方法对静息态干细胞的标记存在不准确现象，其原因是H2B-GFP品系存在背景渗漏表达，以及四环素调控反应不够严谨所致15。

此外，过去大多数文献主要在切片的二维切片上使用LRCs检测，而二维切片在显示LRCs的准确位置和数量时常存在错误偏差。该方法在复杂组织结构切片时呈现的角度不正确16。另一种方法是通过连续切片获取三维图像，并进行图像后期重建。但由于连续切片中各切片存在压缩或拉伸导致的图像失真，这些步骤容易造成信息缺失，因此不够准确16,17,18。此外，该方法还费时费力。

为了便于对滞留细胞（LRCs）进行整体成像，样品需要在保持荧光信号的同时实现透明化处理。 保存良好。目前的组织透明化技术可分为三大类：基于有机溶剂的组织透明化技术、基于水相试剂的组织透明化技术以及基于水凝胶的组织透明化技术17,19聚乙二醇（PEG）相关溶剂系统（PEGASOS） recently developed。该方法可使几乎所有类型的组织变得透明，并保留内源性荧光，包括骨和牙齿等硬组织20PEGASOS 方法相较于其他组织透明化方法具有优势，尤其在牙齿和骨组织材料的透明化方面表现突出。大多数其他方法仅能部分透明化硬组织，处理时间较长，或需要使用昂贵的试剂。21此外，与其他方法相比，PEGASOS 方法能够更高效地保存内源性荧光。

这项文献研究促使我们创建了一种新的细胞研究方法。我们将EdU检测LRCs的优势相结合 使用最先进的3D全组织成像技术对透明化组织样本进行标记；样品经以下处理： 先进的聚乙二醇（PEG）相关溶剂系统（PEGASOS）组织透明化技术15硬组织透明化使我们能够重建LRCs荧光的三维信号 体内 在不损坏牙齿或下颌骨的情况下，实现更精确地可视化和定量LRCs的方法。

本研究提供了一种创新性的方法，用于可视化小鼠门齿中的滞留细胞（LRCs）。我们采用三维可视化技术，精确定位并定量小鼠门齿干细胞微环境中的LRCs分布。本项目结合了EdU标记、PEGASOS组织透明化技术以及共聚焦显微镜成像。通过在整体组织样本上进行EdU标记，并利用透明化后透明的标本，我们的方法克服了传统切片技术及其他不利DNA标记方法的局限性。因此，该技术特别适用于需要检测LRCs的干细胞稳态研究，尤其是针对硬组织的研究。本实验方案同样可为其他组织和器官中干细胞稳态研究提供显著优势。

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方案

本文所述所有方法均已获得德克萨斯农工大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准&M大学牙科学院

1. EdU 标记混合液的制备

  1. 按照表1所述配制鸡尾酒储存液。
  2. 按照表1所述配制EdU标记鸡尾酒。

2. 小鼠与EdU溶液的制备

  1. 配制 EdU 溶液。将 EdU 溶于 DMSO 中，配制成 20 mg/mL 的溶液，并于 -20 °C 冰箱中保存。
    注意：EdU 为诱变剂，操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
  2. 向 5 日龄的 C57BL/6J 小鼠腹腔注射已配制的 EdU 溶液，剂量为每克体重 3 µL。小鼠需连续 7 天每日注射一次。随后进行为期 6 周的追踪期，之后处死取材用于分析（图 1）。
    ​注意：向小鼠注射 EdU 时需小心避免针头刺伤。连续注射 7 天后，将小鼠转移至新笼具中。待小鼠安置到新笼后，应按照适当的生物危害物处理规范处置原笼中的垫料。

3. 通过心脏灌注进行样本制备（6周示踪期后的出生后53天小鼠）

注意：小鼠肝脏在灌注后应变为苍白 成功的心脏灌注

  1. 通过腹腔注射麻醉小鼠。需给予赛拉嗪和氯胺酮麻醉剂的组合（赛拉嗪 10–12.5 mg/kg；氯胺酮 80–100 mg/kg 体重）。
  2. 等待约 10 分钟，直至小鼠对疼痛刺激（如足垫夹捏反射）不再有反应。
  3. 将小鼠仰卧固定在 聚苯乙烯泡沫板上，四肢用针固定。
  4. 使用镊子和解剖剪剪开覆盖的皮肤，暴露胸腔。
  5. 用锋利的剪刀剪开膈肌。注意不要刺破心脏。
  6. 剪开肋骨，用持剪钳夹住胸骨基部以暴露心脏。
  7. 将小鼠转移至通风橱内循环泵附近的灌注台。
  8. 将连接管路（内含磷酸盐缓冲液（PBS）/4% 多聚甲醛（PFA）溶液）的 25 G 针头插入左心室心尖。注意保持针尖位于心室腔内。
    警告：PFA 具有中等毒性，且可能为致癌物。操作时应穿戴个人防护装备（PPE），并在化学通风橱内配制溶液。废弃的 PFA 应根据机构规定妥善处理。
  9. 在将针头插入左心室后，立即用锋利剪刀剪开右心室。此步骤可使血液从小鼠体内流出并排入收集皿中。
  10. 以 7 mL/min 的流速灌注 50 mL PBS 溶液。
  11. PBS 灌注完成后，切换三通阀，以 5 mL/min 的相同流速灌注 20 mL 的 4% PFA 溶液。
  12. 在循环泵仍在运行时，从左心室中取出针头。
    ​注意：小鼠组织现已固定，可进行后续取材。为保持荧光信号，整个实验过程中应尽可能避免光照。组织处理期间，盛有组织样本的 50 mL 锥形管可用铝箔包裹避光。

4. 使用 PEGASOS 技术对下颌骨进行组织透明化处理

注意：可根据组织体积选用15 mL或50 mL的锥形管，用于在各步骤中保存待处理的样品。从步骤4.2至4.7，样品在37 °C摇床（约100 rpm）中进行处理。应使用耐有机溶剂的聚丙烯材质塑料容器，以避免塑料被溶解 。也可选用玻璃器皿。

警告：PEGASOS 组织透明化技术使用了Quadrol、聚乙二醇（PEG）、苯甲酸苄酯（BB）、MMA500等有毒溶液。必须佩戴适当的个人防护装备，以避免潜在暴露风险。

  1. 解剖下颌骨，并用4%多聚甲醛（PFA）进一步固定样本，在室温下放置过夜。
  2. 从下颌骨上移除肌肉组织，将其浸入0.5 M EDTA溶液（pH 8.0）中脱钙4天。在此期间，每天在37 °C摇床上更换一次溶液。
    注意：应尽可能彻底清除样本中的肌肉组织。此步骤有助于简化成像过程，并减少肌肉组织产生的自发荧光。
  3. 用25% Quadrol溶液（v/v，溶于H2O）在37 °C摇床上处理下颌骨一天，以去除残留的血红素。
  4. 完成整体EdU染色。
    1. 根据表1配制新鲜的EdU标记混合液。
      注意：每次均需新鲜配制EdU标记混合液，并加入新配制的抗坏血酸溶液，以获得最佳的EdU标记效果。
    2. 在37 °C摇床上用PBST清洗下颌骨30分钟。
    3. 用PBS清洗下颌骨三次，每次3分钟。
    4. 在37 °C摇床上用新鲜配制的EdU标记混合液孵育下颌骨过夜。
    5. 用PBS清洗下颌骨三次，每次3分钟。
  5. 依次在下列溶液中进行逐级去脂处理，每步在37 °C下持续6小时：
    30% 叔丁醇（tB）溶液：75% v/v H2O、22% v/v tB 和 3% v/v Quadrol。
    50% tB溶液：50% v/v H2O、47% v/v tB 和 3% v/v Quadrol。
    70% tB溶液：30% v/v H2O、67% v/v tB 和 3% v/v Quadrol。
    注意：去脂步骤至关重要。在30%和50% tB溶液中可进行4–6小时的去脂处理，在70% tB溶液中则需处理1天。
  6. 在tB-PEG溶液中对下颌骨进行脱水处理，共2天，每日更换一次溶液：含75% tB、22% v/v 聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯（平均MMA500）和3% v/v Quadrol的溶液，于37 °C下进行。
  7. 将下颌骨置于苯甲酸苄酯（BB）-PEG透明介质中进行透明化处理，以实现折射率匹配：75% v/v BB、22% v/v PEG-MMA500 和 3% Quadrol，直至组织完全透明。
    注意：我们有关于折射率匹配的信息。组织中的无机和有机成分（如水、脂质、蛋白质、矿物质、细胞器等）具有不同的折射率（RI），范围在1.33至1.55之间。组织成分间的折射率不匹配会阻碍成像过程。通过消除组织内部的折射率差异可实现透明化。建议将透明化后的样本浸入BB-PEG透明介质中。此步骤可使整个样本内部折射率达到约1.54的均匀值（称为折射率匹配），从而便于成像。
  8. 将下颌骨保存在BB-PEG组织透明介质中，于室温下存放以备后续成像。
    ​注意：应尽快完成成像，以避免荧光报告分子逐渐降解。然而，PEGASOS方法即使在数周的储存后仍能良好地保持荧光信号20,21。如需长期保存，样本也可存放于4°C环境中。

5. 组织透明化下颌骨的共聚焦成像

  1. 将透明化处理后的完整下颌骨置于载玻片的凹槽内，使用BB-PEG透明介质封片，并加盖盖玻片。避免产生任何气泡。
  2. 使用合适的激光扫描共聚焦显微镜进行图像采集。选择采集模式，并在显微镜控制软件的采集模式菜单中设置图像采集参数：分辨率为512 x 512像素，采集速度为400 Hz。
  3. 在荧光激发面板中，激活所需的激光（TRITC），以最佳激发荧光染料（我们用于LRCs可视化的探针具有类似Cy3的荧光特性，激发波长为548 nm，发射波长为563 nm）。
  4. 在荧光检测面板中，移动滑块以选择将要检测的波长范围（例如，对于类似Cy3的荧光染料，可选择555至625 nm之间的波长）。
  5. 将装有样本的下颌骨放置于显微镜载物台上，使用白光和低倍物镜（2–10x）观察并定位样本。
  6. 在盖玻片上方滴加一滴折射率为1.52的浸油，以匹配盖玻片玻璃与物镜的折射率。
    注：应尽可能使物镜、成像介质和组织的折射率相匹配，以最大限度减少图像采集过程中的光学畸变。
  7. 打开荧光光源，选择合适的放大倍数物镜以成像目标区域。我们使用了20倍物镜，其 数值孔径为0.9，工作距离为1.95 mm。当在共聚焦显微镜中成像较大组织样本时，可能需要更长工作距离的物镜。或者，也可使用光片显微镜更方便地对较大组织样本进行成像。
  8. 在共聚焦成像软件中，点击实时按钮以启动实时扫描模式。为最大化图像的动态范围并避免像素饱和，请调节所选通道的增益和激光强度。
  9. 确定视野范围，以在X和Y方向上完整显示下颌骨区域。设定上下Z轴采集参数，准确覆盖小鼠门齿干细胞微环境的三维体积。Z轴步进大小设为2 µm，或根据实际需求调整。新型号的共聚焦显微镜应能自动采集多个重叠区域的Z层图像序列（z-stacks）。
  10. 采集并以.lif格式保存Z层图像文件。
    ​注：.lif文件可转换为.tiff格式，用于其他三维分析软件。

6. 通过创建表面、对感兴趣区域（ROI）进行分割、对ROI进行掩膜处理以及创建斑点，实现图像处理、三维图像重建及标记保留细胞的定量分析

注意：我们使用 Imaris（Bitplane 9.0.1）进行图像处理和三维重建，但类似的图像处理步骤也可使用其他软件套件完成（例如 ImageJ/Fiji、3D Slicer、Avizo、Arivis、Amira 等）。

  1. 在成像软件中，点击 场域 按钮，然后选择 图像。选择原始的 .lif 文件 并选择合并文件，图像将被导入成像软件中。
    注意： 也可使用成像软件的文件转换器，将Z轴堆栈图像文件转换为该软件的原生格式文件类型。例如：使用Imaris文件转换器将.lif文件转换为.ims文件，并在成像软件中打开.ims文件。将数据转换为软件的原生文件格式可实现快速文件转换并最大限度减少错误。
  2. 双击导入的文件以打开图像数据集。
  3. 前往 显示调整 面板，点击通道名称。默认模式下通常标记为红色。
    1. 在 图像属性 窗口中，点击 映射颜色 选项卡。在 颜色表文件 选项中选择 Fire Flow，然后点击 确定。通常选择显示颜色以区分背景荧光与样本中的阳性荧光。
  4. 在屏幕左上方的 场景 – 属性 窗格中，点击标有 添加新表面 的蓝色图标。取消选中 体积 图标，这将去除大部分背景荧光，使阳性荧光清晰可见（参见步骤6.4.2）。
    1. 通过点击 创建 选项卡并选择 跳过自动创建，手动编辑 选项卡，开始对感兴趣区域（ROI）进行手动分割。在手动表面创建向导中，点击 轮廓 选项卡，根据样本选择方向（XY、YZ或XZ），以便于勾勒ROI轮廓。此处我们选择XY方向。
    2. 接下来，确保右上角的指针菜单处于 选择 模式。调整 切片位置 以定位组织中的ROI。您会注意到，如步骤6.4所述，大部分背景荧光已被去除，阳性荧光清晰可见。点击 绘制 按钮并绘制初步的感兴趣区域。将 可见性 选项设为 无，以避免非ROI区域的干扰。
    3. 逐层重复步骤6.4.2，绘制完整的感兴趣区域。
    4. 完成ROI绘制后，点击 创建表面 以获得ROI的三维几何结构。
    5. 在手动表面创建向导中点击 编辑 按钮，并选择 遮罩全部。
    6. 在弹出的 遮罩通道 窗口中，在通道选择选项中选择 通道1。随后，选择 应用遮罩前复制通道。在遮罩设置中选择 表面内外恒定，并将表面外体素设为0。
    7. 在 场景-属性 窗格中，取消选中 表面对象，选中 体积对象。在 显示调整 中，取消选中原有的 "红色”通道，选择 遮罩红色 通道，并调整颜色强度，以获得理想的三维渲染且阳性标记的荧光ROI。
  5. 创建一个新的点状对象。首先点击 添加 点 图标，通过创建与三维渲染LRCs大致重叠的三维点来量化三维渲染的LRCs。使用底部箭头在点创建向导的各步骤间切换。
    1. 在点创建向导中，将有四个连续步骤指导软件自动创建点。确保在第一步中选中“仅分割感兴趣区域”选项。点击 下一步 图标。
    2. 在第二步中，会出现一个 "XYZ三维框"。调整XYZ框以覆盖ROI。点击 下一步 图标。
    3. 在第三步中，进入 源通道 选项。选择遮罩后的红色通道；输入估计的XY点直径，使其适配并重叠样本荧光点。点击 下一步 图标。
    4. 在第四步中，添加 "质量" 滤波类型，并通过在“质量”直方图上移动滑动窗口来调整最低强度阈值，直到大多数可识别的LRCs被标记。
      注意：分割结果及其统计输出（例如：细胞数量）高度依赖于强度阈值的设定。请谨慎精确设置合适的阈值。
    5. 点击 完成 按钮，并选择 统计 按钮。选择 总体 选项卡以查找图像中点总数的数值。
    6. 通过点击 表格显示到文件 按钮导出统计数据，并以.xls文件格式获取结果。
    7. 使用合适的图表展示定量分析结果。

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结果

在进行 EdU 标记和 PEGASOS 组织透明化处理后（图 2），我们获得了透明化的下颌骨，如图像所示（图 3B）。我们将该改良样品与未经组织透明化处理的正常下颌骨进行了比较（图 3A）。对带有 EdU 标记的透明下颌骨（图 3B）进行共聚焦成像。我们重点关注了切牙尖端的干细胞微环境区域（补充图 1）。切牙的光学切片在 XY 平面上显示了切牙尖端干细胞微环境中存在的滞留标记细胞（LRCs）（图 4A）。我们重建了切牙尖端的三维图像，展示了上皮性（绿色）和间充质性（红色）干细胞微环境中均存在 EdU+ 标记滞留的静息干细胞（图 4B）。将 EdU+ 细胞转化为用于定量分析的信号点，这些信号点与间充质来源的 ...

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讨论

通常对生长中的新生小鼠进行多次注射（BrdU、EdU），以尽可能标记更多的增殖细胞1,6,13。追踪时间的设定被认为是反映组织更新速率的关键步骤6,13。小鼠的门齿大约每月自我更新一次。这一特性使研究者可将追踪期设定为4周或更长时间4,5,22。我们的6周追踪期能够标记间充质和上皮（唇侧和舌侧颈环）区室中的干细胞。该区域还包括来自上皮和间充质区室的部分过渡扩增细胞（Transit-Amplifying Cells, TACs）前体细胞群体。更长的追踪时间更有助于识别真正保留在上皮和间充质干细胞微环境中的标记保留细胞。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Meghann K. Holt 对稿件的编辑。本研究得到美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）资助 DE026461 和 DE0283445 以及德克萨斯 A&M牙科学院授予王小芳博士

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 M EDTASigma AldrcihE9884
20 × 物镜/数值孔径 0.9Leica507702
50 mL Falcon 离心管Falcon352070
BD PrecisionGlide 针头BDREF 305111
苯甲酸苄酯 (BB)Sigma Aldrcih409529
Bitplane 9.0.1Imaris
BRAND 凹面载玻片Millipore SigmaBR475505
C57BL/6J 小鼠Jackson Laboratory品系 #:000664
循环泵VWR23609-170
CuSO4Sigma Aldrcih451657
DMSOSigma AldrcihD8418
EdUCarboynthNE08701
肝素Miiilipore SigmaH3149
成像系统OlympusDP27
LAS X 软件Leica
Olympus 体视显微镜OlympusSZX16
多聚甲醛Sigma AldrichP6148
PBSSigma AldrichP4417
PEGMMA500Sigma Aldrich447943
QuadrolSigma Aldrich122262
抗坏血酸钠Sigma Aldrich11140
磺化氰 3 叠氮化物LumiprobeD1330
TBS-10XCell Signaling Technology12498
TCS SP8 共聚焦显微镜Leica
叔丁醇 (tB)Sigma Aldrich360538
吐温 X-100Sigma AldrichX100

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