Summary
De muizensnijtand bevat waardevolle labelhoudende cellen in zijn stamcelniche. We hebben een nieuwe manier om de labelvasthoudende cellen onbevooroordeeld te detecteren en te kwantificeren; onze studie gebruikte EdU-etikettering en een 3D-reconstructiebenadering na PEGASOS-weefselverwijdering van de onderkaak.
Abstract
De muriene snijtand is een orgaan dat continu groeit gedurende de levensduur van de muis. De epitheliale en mesenchymale stamcellen die zich in de proximale weefsels van snijtanden bevinden, geven aanleiding tot nakomelingen die zullen differentiëren in ameloblasten, odontoblasten en pulpfibroblasten. Deze cellen zijn cruciaal bij het ondersteunen van de aanhoudende omzet van snijtanden, waardoor de muizensnijtand een uitstekend model is voor het bestuderen van de homeostase van volwassen stamcellen. Stamcellen worden verondersteld langlevende rustcellen te bevatten die kunnen worden gelabeld door nucleotide-analogen zoals 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU). De cellen behouden dit label na verloop van tijd en worden daarom label-retaining cells (LRC's) genoemd. Benaderingen voor het visualiseren van LRC's in vivo bieden een robuust hulpmiddel voor het monitoren van stamcelhomeostase. In deze studie beschreven we een methode voor het visualiseren en analyseren van LRC's. Onze innovatieve aanpak omvat LRC's in muissnijtanden na weefselverwijdering en EdU-kleuring met hele montage, gevolgd door confocale microscopie en een 3-dimensionale (3D) reconstructie met de beeldvormingssoftware. Deze methode maakt 3D-beeldvormingsacquisitie en niet-bevooroordeelde kwantificering mogelijk in vergelijking met traditionele LRC-analyse op doorsnededia's.
Introduction
De continu groeiende muizensnijtand is een uitstekend model voor het bestuderen van volwassen stamcellen1. De epitheliale (labiale en linguale cervicale lus) en mesenchymale stamcellen (tussen de labiale en linguale cervicale lus) die zich aan de proximale kant van de snijtand bevinden, differentiëren in ameloblasten, odontoblasten en tandpulpcellen. Dit unieke proces biedt een bron van cellen voor compensatie van weefselverlies en omzet2. Hoewel verschillende stamcelmarkers zoals Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, enz. in vivo zijn geïdentificeerd voor de subgroepen van volwassen stamcellen in muizensnijtanden, zijn zij ontoereikend om de stamcelpopulaties weer te geven wanneer zij alleen worden gebruikt 1,3,4,5. Het visualiseren van langlevende rustcellen door nucleotide analoge DNA-labeling en -retentie zou onbevooroordeelde detectie kunnen bieden voor de meeste subsets van volwassen stamcellen6. Verder is deze benadering nuttig bij veel stamcelidentificatiemethoden7 voor het begrijpen van celgedrag en de homeostase van tandheelkundige stamcelpopulaties 3,8. Terwijl de delende stamcellen na een aanzienlijke achtervolging hun DNA-labeling zouden verliezen, behouden de vermeende rustige stamcellen hun DNA-label en beschouwen ze ze als label-retaining cells (LRC's)6. DNA-etikettering en -retentie door niet-delende stamcellen zal de vermeende volwassen stamcellen in hun niches markeren en lokaliseren.
In de afgelopen jaren heeft thymidine analoge 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) etikettering de omslachtige, tijdrovende en hoge resolutie microscopie incompatibele 3H-thymidine DNA etiketteringsmethode voor celproliferatie assays 6,9 vervangen. In de afgelopen jaren is de 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) etiketteringstechniek steeds vaker gebruikt dan BrdU. Dit patroon ontstond om verschillende redenen. Ten eerste is de BrdU-methode traag en arbeidsintensief. De gebruikersomstandigheden zijn variabel en het is niet in staat om de ultrastructuur in monsters te behouden (vanwege DNA-denaturatie). Evenzo verliest de BrdU-methode de antigeniciteit van cellen, waardoor deze inefficiënt wordt voor downstream functionele analyses en assays zoals de co-lokalisatie-experimenten en in vivo stamceltransplantatie 3,7,9,10,11,12. BrdU is ook een teratogeen, dat niet geschikt is voor het labelen van LRC's in embryonale ontwikkeling6. Ook is de BrdU-methode inefficiënt wanneer deze wordt gebruikt in de monsters met een hele montage. De nadelen zijn een lage penetratie van antilichamen in het diepe deel van monsters of de vereiste van een lange incubatietijd van antilichamen voor diepe penetratie13. EdU-etikettering ontsnapt aan de stappen van denaturerende exemplaren, waardoor de ultrastructuur behouden blijft. Deze functie is voordelig voor downstream functionele analyses zoals co-lokalisatie-experimenten en stamceltransplantatie11,12. Ook is EdU-etikettering zeer gevoelig en snel; de penetratie van monsters is hoog vanwege het gebruik van snel geabsorbeerde en kleinere fluorescerende aziden voor het detecteren van EdU-labels via een Cu(I)-gekatalyseerde [3 + 2] cycloadditiereactie ("klik"-chemie)14.
Een andere steeds meer toegepaste DNA-etiketteringsmethode is het gebruik van gemanipuleerde transgene muizen. Deze muizen drukken histon 2B groen fluorescerend eiwit (H2B-GFP) uit, gecontroleerd door een tetracycline-responsief regulatorelement 5,14. Na het voeden van muizen met tetracycline chow / water gedurende een achtervolgingsperiode van 4 weken tot 4 maanden, zal de GFP-fluorescentie afnemen in cyclische cellen en behouden alleen LRC's de fluorescentie6. Het voordeel van deze methode is dat de gelabelde LRC's kunnen worden geïsoleerd en levensvatbaar blijven voor celkweek of downstream functionele analyses 6,7. Sommige studies meldden onnauwkeurige etikettering van rustige stamcellen wanneer ze werden achtervolgd voor langdurig gebruik. Dit resultaat was te wijten aan een lekkende achtergrondexpressie van de H2B-GFP-stam en niet aan de juiste tetracycline-gereguleerde respons15.
Bovendien gebruikte de meeste literatuur in het verleden de detectie van LRC's voornamelijk op doorsnededia's, die tweedimensionaal zijn en vaak ten onrechte bevooroordeeld bij het weergeven van de nauwkeurige locatie en het aantal LRC's. De benadering toonde onjuiste hoeken voor secties van complexe weefselstructuren16. De andere methode was om 3D-beelden te verkrijgen uit seriële secties en post-image reconstructies uit te voeren. Deze stappen waren onnauwkeurig vanwege beeldvervorming van variaties in elke seriële sectie als gevolg van gecomprimeerde of uitgerekte secties, wat resulteerde in ontbrekende informatie16,17,18. De methode was ook bewerkelijk en tijdrovend.
Om de beeldvorming van LRC's met volledige montage te vergemakkelijken, moeten monsters duidelijk worden gemaakt terwijl de fluorescentie goed wordt onderhouden. De huidige weefselopruimingstechnieken kunnen worden ingedeeld in drie hoofdcategorieën: organische op oplosmiddelen gebaseerde weefselopruimingstechnieken, op water gebaseerde weefselopruimingstechnieken en op hydrogel gebaseerde weefselopruimingstechnieken17,19. Het polyethyleenglycol (PEG)-geassocieerde oplosmiddelsysteem (PEGASOS) is onlangs ontwikkeld. Deze aanpak maakt bijna alle soorten weefsels transparant en behoudt endogene fluorescentie, inclusief harde weefsels zoals bot en tanden20. De PEGASOS-methode heeft voordelen ten opzichte van andere weefselverwijderingsmethoden, vooral bij het opruimen van tand- en botmaterialen. De meeste andere methoden kunnen harde weefsels slechts gedeeltelijk verwijderen, hebben lange verwerkingstijden of vereisen dure reagentia21. Ook kan de PEGASOS-methode endogene fluorescentie efficiënt behouden ten opzichte van andere methoden.
Deze literatuur bracht ons ertoe een nieuwe methode voor celstudie te creëren. We combineerden de LRC-detectievoordelen van EdU-etikettering met de meest superieure 3D-beeldvorming van weefselgeklaarde monsters; monsters werden verwerkt met geavanceerde polyethyleenglycol (PEG)-geassocieerde oplosmiddelsysteem (PEGASOS) weefselzuiveringstechniek15. Harde weefseltransparantie stelde ons in staat om het 3D-signaal van LRC's fluorescentie in vivo te reconstrueren zonder de tanden of onderkaak te breken, waardoor een nauwkeurigere manier ontstond om LRC's te visualiseren en te kwantificeren.
In deze studie bieden we een innovatieve gids om LRC's in de muizensnijtand te visualiseren. We hebben een visuele 3D-benadering gemaakt om de locatie en hoeveelheid LRC's in de stamcelniche van de muissnijtand te bepalen. Dit project maakte gebruik van EdU-etikettering, PEGASOS-weefselopruimingstechnieken en confocale microscopie. Onze methode van EdU labelen van de LRC's op whole-mount weefsel en het gebruik van een gewist en transparant monster overwint zowel de beperkingen van traditionele doorgesneden dia's als andere nadelige DNA-etiketteringsmethoden. Onze techniek zal dus geschikt zijn voor studies naar stamcelhomeostase die LRC-detectie vereisen, vooral op harde weefsels. Het protocol kan even voordelig zijn voor degenen die zich richten op stamcelhomeostase in andere weefsels en organen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) voor Texas A &M University College of Dentistry.
1. Bereiding van de EdU labeling cocktail
- Bereid de cocktailbouillonoplossingen zoals beschreven in tabel 1.
- Bereid de EdU-etiketteringscocktail zoals beschreven in tabel 1.
2. Bereiding van de muizen en EdU-oplossing
- Bereid de EdU-oplossing voor. Los EdU op in DMSO bij 20 mg/ml en bewaar in een vriezer van -20 °C.
LET OP: EdU is een mutageen. Gebruikers moeten geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) dragen wanneer zij met deze stof omgaan. - Injecteer 5 dagen oude C57BL/6J-muizen intraperitoneaal met de bereide EdU-oplossing bij een lichaamsgewicht van 3 μl/g. Muizen moeten de oplossing eenmaal per dag gedurende 7 opeenvolgende dagen ontvangen. Vervolgens ondergaan ze een achtervolgingsperiode van 6 weken voordat ze worden geoogst voor analyse (figuur 1).
LET OP: Wees voorzichtig om naaldprikken te voorkomen bij het injecteren van EdU in de muizen. Na het injecteren van EdU gedurende 7 opeenvolgende dagen, plaatst u de muizen in een nieuwe kooi. Nadat de muizen in hun nieuwe huis zijn, gooit u het beddengoed in de oude kooi weg met behulp van de juiste biohazard-regels.
3. Monstervoorbereiding door transcardiale perfusie (postnatale muizen van 53 dagen oud na de achtervolgingsperiode van 6 weken)
OPMERKING: De muizenlever moet bleek worden na succesvolle transcardiale perfusie.
- Verdoof muizen met een intraperitoneale injectie. Ze moeten een combinatie van xylazine en ketamine-anesthetica krijgen (Xylazine 10-12,5 mg / kg; Ketamine, 80-100 mg/kg lichaamsgewicht).
- Wacht ~10 min totdat de muis niet meer reageert op pijnlijke prikkels (zoals pootknijpreflexen).
- Plaats de muizen in een liggende positie gestabiliseerd op piepschuimsteun met naalden in elke poot.
- Leg de borstholte bloot door de bovenliggende huid te openen met een pincet en een schaar te ontleden.
- Knip het diafragma open met een scherpe schaar. Zorg ervoor dat je het hart niet doorboort.
- Knip door de ribbenkast en grijp de basis van het borstbeen met een klemschaar om het hart bloot te leggen.
- Breng de muis over naar de perfusiefase in de buurt van de circulatiepomp in een zuurkast.
- Steek de naald van 25 G (uit de slang gevuld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)/4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing) in de top van de linker ventrikel. Zorg ervoor dat u de punt van de naald in het lumen van de ventrikel houdt.
LET OP: PFA is matig giftig en waarschijnlijk kankerverwekkend. Gebruik PBM om PFA te hanteren en bereid de oplossing onder een chemische zuurkast. Afval PFA vereist een goede verwijdering volgens de richtlijnen van de instelling. - Knip de rechterkamer met een scherpe schaar onmiddellijk na het inbrengen van de naald in de linker ventrikel. Deze stap zorgt ervoor dat bloed uit de muis stroomt en in de opvangschaal loopt.
- Perfuseer de monsters met 50 ml PBS-oplossing met een stroomsnelheid van 7 ml/min.
- Schakel na PBS-perfusie de stopkraan om een stroom van 20 ml 4% PFA-oplossing mogelijk te maken bij hetzelfde debiet van 5 ml / min.
- Terwijl de circulatiepomp nog steeds aan staat, verwijdert u de naald uit de linker ventrikel.
OPMERKING: De muis is nu gefixeerd voor weefselverzameling. Om de fluorescentie te behouden, moet blootstelling aan licht zoveel mogelijk worden vermeden in het hele protocol. Terwijl het weefsel wordt verwerkt, kan de 50 ml conische buis met de weefselmonsters worden bedekt met aluminiumfolie.
4. Weefselreiniging van de onderkaak met behulp van de PEGASOS-techniek
OPMERKING: Een conische buis van 15 ml of 50 ml volgens het volume van de weefsels kan worden gebruikt om de monsters klaar te houden voor behandeling in elke stap. Monsters worden verwerkt bij 37 °C schudders (~100 rpm) van stap 4.2 tot 4.7. Gebruik plastic containers op basis van polypropyleen die bestand zijn tegen organische oplosmiddelen om te voorkomen dat het plastic smelt. Als alternatief kan glaswerk worden gebruikt.
LET OP: De PEGASOS-weefselzuiveringstechniek maakt gebruik van toxische oplossingen zoals Quadrol, polyethyleenglycol (PEG), benzylbenzoaat (BB), MMA500, enz. Geschikte PBM zijn vereist om mogelijke blootstelling te voorkomen.
- Ontleed kaken en fixeer verder monsters in 4% PFA. Bewaar ze een nacht op kamertemperatuur.
- Verwijder de spieren uit de kaken en dompel ze onder in 0,5 M EDTA-oplossing (pH 8,0) om gedurende 4 dagen te ontkalken. Voer tijdens deze periode een dagelijkse mediumwissel uit op een 37 °C shaker.
OPMERKING: Het is wenselijk om de spieren zoveel mogelijk uit het monster te verwijderen. Deze voorzorgsmaatregel vereenvoudigt het beeldvormingsproces en vermindert de autofluorescentie van de spieren. - Ontkleur de kaken met een 25% Quadrol-oplossing (v/v in H2O) op een 37 °C shaker gedurende één dag om het resterende bloedheem te verwijderen.
- Complete hele mount EdU-beitsing.
- Bereid een verse EdU-etiketteringscocktail volgens tabel 1.
OPMERKING: De EdU-etiketteringscocktail moet elke keer vers worden gemaakt met vers bereide ascorbaatoplossing toegevoegd voor het verkrijgen van optimale EdU-etiketteringsresultaten. - Spoel de kaken met PBST gedurende 30 minuten op een 37 °C shaker.
- Spoel de kaken drie keer af met PBS gedurende telkens 3 minuten.
- Incubeer de kaken in een vers gemaakte EdU-etiketteringscocktail op een shaker van 37 °C.
- Spoel de kaken drie keer af met PBS gedurende telkens 3 minuten.
- Bereid een verse EdU-etiketteringscocktail volgens tabel 1.
- Voer seriële delipidatie uit in elk van de volgende oplossingen gedurende 6 uur bij 37 °C:
30% tert-butanol (tB) oplossing: 75% v/v H2O, 22% v/v tB en 3% v/v Quadrol.
50% tB-oplossing: 50% v/v H2O, 47% v/v tB en 3% v/v Quadrol.
70% tB-oplossing: 30% v/v H2O, 67% v/v tB en 3% v/v Quadrol
OPMERKING: De de-lipidatiestap is van cruciaal belang. De-lipidatie kan worden gedaan tussen 4-6 uur in 30% en 50% tB-oplossing en gedurende 1 dag in 70% tB-oplossing. - Droog de kaken uit in tB-PEG-oplossing gedurende 2 dagen met de volgende dagelijkse mediumverandering: 75% tB, 22% v/v polyethyleenglycolmethylethermethacrylaat gemiddeld MMA500 en 3% v/v Quadrol bij 37 °C.
- Verwijder de onderkaak in benzylbenzoaat (BB)-PEG-reinigingsmedium om brekingsindexmatching te verkrijgen: 75% v / v BB, 22% v / v PEG-MMA500 en 3% Quadrol totdat transparantie is bereikt.
OPMERKING: We hebben informatie over refractieve indexmatching. De anorganische en organische componenten in weefsels zoals water, lipiden, eiwitten, mineralen, organellen, enz. hebben een andere brekingsindex (RI) in het bereik van 1,33 tot 1,55. Deze RI-mismatch tussen de weefselcomponenten belemmert het beeldvormingsproces. Transparantie kan worden bereikt door RI-mismatch in het weefsel te elimineren. Het onderdompelen van de weefsel-geklaarde monsters in het clearingmedium van BB-PEG wordt geadviseerd. Deze stap geeft de uniforme interne RI van ~ 1,54 (RI-matching genoemd) aan het hele monster, waardoor het beeldvormingsproces wordt vergemakkelijkt. - Bewaar de kaken in het BB-PEG weefselreinigingsmedium bij kamertemperatuur voor opslag en beeldvorming.
OPMERKING: Het is goed om de beeldvorming zo snel mogelijk te voltooien om het geleidelijke verlies van fluorescerende verslaggevers te voorkomen. De PEGASOS-methode houdt fluorescentiemelders echter goed bewaard, zelfs na enkele weken opslag20,21. Voor langdurige opslag kunnen de monsters ook bij 4°C worden bewaard.
5. Confocale beeldvorming van de weefselgeklaarde onderkaak
- Monteer het weefsel dat de hele onderkaak vrijmaakt op merkholteglaasjes in het BB-PEG-reinigingsmedium en dek af met glazen afdekglaasjes. Vermijd bubbels.
- Voer beeldacquisitie uit met een geschikte laserscanning confocale microscoop. Selecteer Verkrijgen en stel de beeldacquisitieparameters in op een resolutie van 512 x 512 pixels en een acquisitiesnelheid van 400 Hz. Deze instellingen zijn te vinden in het acquisitiemodusmenu van de software die de microscoop bestuurt.
- Activeer in het paneel voor fluorescerende excitatie de vereiste laser (TRITC) om fluoroforen optimaal te exciteren (de sonde die we gebruikten voor LRC-visualisatie heeft fluorescerende eigenschappen zoals Cy3 met excitatie bij 548 nm en emissie bij 563 nm lasergolflengte).
- Verplaats in het paneel voor fluorescerende detectie de schuifregelaar om de golflengten te selecteren die worden gemeten (bijvoorbeeld tussen 555 en 625 nm voor een Cy3-achtige fluorofoor).
- Plaats de gemonteerde onderkaak op het microscooppodium om het monster te visualiseren en te vinden met behulp van wit licht en een lager vergrotingsobjectief (2-10x).
- Voeg een druppel dompelolie met een brekingsindex van 1,52 toe aan de bovenkant van de dekplaat om overeen te komen met de brekingsindex van de glazen dekplaat en het objectief.
OPMERKING: Pas de brekingsindex van objectieven, beeldmedia en weefsel zo goed mogelijk af om de introductie van optische vervormingen tijdens beeldacquisitie te minimaliseren. - Schakel de fluorescentielampen in en kies een geschikt vergrotingsobjectief om interessante gebieden in beeld te brengen. We gebruikten een 20x objectief met een numeriek diafragma van 0,9 met een werkafstand van 1,95 mm. Een langere werkafstandslens kan nodig zijn bij het afbeelden van grotere weefselmonsters in de confocale microscoop. Als alternatief kan beeldvorming eenvoudig worden gedaan met behulp van een lichtplaatmicroscoop voor grotere weefselmonsters.
- Druk in de confocale beeldvormingssoftware op de knop Live om de live-scanmodus te starten. Om het dynamische bereik van de afbeeldingen te maximaliseren en pixelverzadiging te voorkomen, past u de versterking en laserintensiteit voor het geselecteerde kanaal aan.
- Identificeer het gezichtsveld om het hele gebied van de onderkaak in de X- en Y-dimensies te visualiseren. Stel de bovenste en onderste Z-fase acquisitieparameters in die nauwkeurig het volume van de stamcelnis in de muizensnijtand dekken. Gebruik een Z-stapgrootte van 2 μm of volgens uw vereisten. De nieuwere versies van confocale microscopen moeten in staat zijn om automatisch z-stacks van de verschillende overlappende gebieden te verkrijgen.
- Verkrijg en bewaar Z-stack afbeeldingsbestanden in .lif-indeling.
OPMERKING: De .lif-vliegen kunnen worden omgezet in .tiff bestanden en worden gebruikt voor andere 3D-analysesoftware.
6. Beeldverwerking, 3D-beeldreconstructie en kwantificering van labelbehoudende cellen door een oppervlak te maken, segmentatie van de regio van belang (ROI), de ROI te maskeren en vlekken te maken
OPMERKING: We hebben Imaris (Bitplane 9.0.1) gebruikt voor beeldverwerking en 3D-reconstructie, maar vergelijkbare beeldverwerkingsstappen kunnen worden uitgevoerd met behulp van andere softwaresuites (bijv. ImageJ / Fiji, 3D-slicer, Avizo, Arivis, Amira, enz.).
- Klik in de beeldbewerkingssoftware op de knop Arena en kies vervolgens Afbeelding. Selecteer het originele .lif-bestand en kies een samengevoegd bestand, de afbeeldingen worden geïmporteerd in de beeldbewerkingssoftware.
OPMERKING: U kunt ook een bestandsconverter voor beeldbewerkingssoftware gebruiken om het Z-stackafbeeldingsbestand te converteren naar het bestandstype in het oorspronkelijke formaat voor de software. Bijvoorbeeld: converteer de .lif-bestanden naar .ims-bestanden met behulp van de Imaris File Converter en open de .ims-bestanden in de imingsoftware. Het converteren van gegevens naar het oorspronkelijke bestandsformaat van de software maakt een snelle bestandsconversie mogelijk en minimaliseert fouten. - Dubbelklik op het geïmporteerde bestand om de afbeeldingsgegevensset te openen.
- Ga naar het deelvenster Beeldschermaanpassing , klik op de naam van het kanaal. Het wordt meestal gelabeld als Rood in de standaardmodus.
- Klik in het venster Afbeeldingseigenschappen op het tabblad Toegewezen kleur . Kies in de optie Kleurentabelbestand de optie Fire Flow en klik vervolgens op OK. De weergavekleur wordt normaal gesproken gekozen om de achtergrondfluorescentie en de positieve fluorescentie van het monster te onderscheiden.
- Klik linksboven in het scherm in het deelvenster Scène – Eigenschappen op het blauwe pictogram met het label Nieuw oppervlak toevoegen. Schakel het volumepictogram uit, waardoor het grootste deel van de achtergrondfluorescentie wordt verwijderd en de positieve fluorescentie duidelijk zichtbaar is (zie stap 6.4.2).
- Start het proces van handmatige segmentatie van de regio van belang (ROI) door op het tabblad Maken te klikken en het tabblad Automatisch maken overslaan, Handmatig bewerken te selecteren. Klik in de wizard voor het handmatig maken van oppervlakken op het tabblad Contour om de oriëntatie (XY, of YZ of XZ) te kiezen op basis van de voorbeelden om de ROI eenvoudig te contouren. Hier kiezen we voor XY-oriëntatie.
- Zorg er vervolgens voor dat het aanwijzermenu in de rechterhoek in de modus Selecteren staat. Pas de segmentpositie aan om de ROI in het weefsel te lokaliseren. U zult merken dat het grootste deel van de achtergrondfluorescentie is verwijderd met duidelijke positieve fluorescentie zoals vermeld in stap 6.4. Klik op de knop Tekenen en teken een voorlopig interessegebied. Selecteer de optie Zichtbaarheid op geen om interferentie van andere gebieden dan ROI te voorkomen.
- Herhaal stap 6.4.2. Plak voor plak om het hele interessegebied te tekenen.
- Nadat de ROI-tekening is voltooid, klikt u op Surface maken om een 3D-geometrie van de ROI te krijgen.
- Klik op de knop Bewerken in de wizard voor het handmatig maken van oppervlakken en selecteer Alles maskeren.
- Selecteer in het uitgeklapte venster Maskerkanaal de optie Kanaal 1 in de kanaalselectieopties. Selecteer daarna Kanaal dupliceren voordat u het masker toepast. Selecteer in de maskerinstellingen Constant binnen/Buiten en stel het voxelbuitenoppervlak in op 0.
- Schakel in het deelvenster Scène-eigenschappen de selectie van het Surface-object uit en selecteer het volumeobject. Schakel in de weergaveaanpassing het oorspronkelijke "Rode" kanaal uit en selecteer het kanaal Gemaskeerd rood en pas de kleurintensiteiten aan om de gewenste 3D-gerenderde en positief gelabelde fluorescentie-ROI te krijgen.
- Maak een nieuw steunpuntobject. Klik eerst op het pictogram Vlekken toevoegen om de 3D-gerenderde LRC's te kwantificeren door 3D-spots te maken die vergelijkbaar overlappen met 3D-gerenderde LRC's. Gebruik de onderste pijlen om te schakelen tussen stappen in de wizard voor het maken van spots.
- In de wizard voor het maken van spots zijn er vier opeenvolgende stappen met instructies om automatisch spots te maken met de software. Zorg ervoor dat de optie Alleen een interessegebied segmenteren in de eerste stap is geselecteerd. Klik op het pictogram Volgende .
- In de tweede stap is er een "XYZ 3D-box". Pas de XYZ-box aan om de ROI te dekken. Klik op het pictogram Volgende .
- Ga in de derde stap naar de opties voor bronkanalen . Kies het gemaskeerde rode kanaal; voer de geschatte XY-spotdiameter in die vergelijkbaar is met de pasvorm en overlap de fluorescentiepunten van het monster. Klik op het pictogram Volgende .
- Voeg in de vierde stap het filtertype "Kwaliteit" toe en pas de lagere intensiteitsdrempel aan door het schuifvenster over het histogram 'Kwaliteit' te verplaatsen totdat de meeste identificeerbare LRC's zijn gelabeld.
OPMERKING: De segmentatie en dus statistische uitlezingen (voorbeeld: aantal cellen) zijn sterk afhankelijk van de intensiteitsdrempelwaarden. Zorg ervoor dat u de juiste drempelwaarden nauwkeurig instelt. - Klik op de knop Voltooien en selecteer de knop Statistiek . Selecteer het tabblad Algemeen om de waarde voor het totale aantal plekken in de afbeelding te vinden.
- Exporteer statistieken door op de knop Tab Weergeven naar bestand te klikken en ontvang de resultaten in een .xls bestand.
- Gebruik een geschikt diagram om de kwantificeringsresultaten te presenteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na EdU-etikettering en het PEGASOS-weefselreinigingsproces (figuur 2) werd de transparante onderkaak verkregen zoals weergegeven in onze afbeelding (figuur 3B). We vergeleken het gemodificeerde monster met een normale onderkaak zonder weefselzuiveringsproces (figuur 3A). De transparante onderkaak (figuur 3B) met EdU-etikettering werd onderworpen aan confocale beeldvorming. We concentreerden ons op de snijtandtop met de stamcelniche zoals weergegeven in (aanvullende figuur 1). Het optische gedeelte van de snijtand toonde LRC's in de stamcelnis van de snijtandtop in het XY-vlak (figuur 4A). We reconstrueerden een 3D-beeld van een snijtandtop met EdU + labelbehoudende rustcellen in zowel de epitheliale (groene) als mesenchymale (rode) stamcelniche (figuur 4B). EdU+ -cellen werden overgebracht naar plekken voor kwantificering die vergelijkbaar overlapten met de mesenchymale LRC's (figuur 4C). Figuur 4D toont de vlekken die alleen voor mesenchymale LRC's zijn gemaakt. Figuur 4E toont de vlekken die alleen voor epitheliale LRC's zijn gemaakt. Vervolgens voltooiden we de kwantificering van epitheliale en mesenchymale LRC's (figuur 4F).
Figuur 1: EdU-injectieprotocol om LRC's te labelen. Wild-type (WT) muizen werden geïnjecteerd met EdU vanaf P5. De injecties duurden 7 opeenvolgende dagen tot P11. Vervolgens ondergingen de muizen een achtervolgingsperiode van 6 weken. We hebben ze geoogst op postnatale dag 53. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow van het protocol. Muizen werden gedurende 7 opeenvolgende dagen geïnjecteerd met EdU en vervolgens gedurende 6 weken in een achtervolgingsperiode geplaatst. De kaken werden geoogst en gefixeerd na transcardiale perfusie. Vervolgens werden de kaken ontkalkt en onderworpen aan de weefselopruimingsstappen van ontkalking, ontkleuring, EdU-kleuring met hele mount, de-lipidatie, uitdroging en refractieve index (RI) matching. De beeldvorming voor de geklaarde kaken werd uitgevoerd onder een confocale microscoop gevolgd door data-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beelden van een postnatale 53 dagen oude WT-muisonderkaak vóór weefselzuivering (A) en na weefselzuivering (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Een optisch gedeelte van de snijtand met LRC's in de stamcelnis van de snijtandtop in het XY-vlak (A). Een 3D-beeldreconstructie van epitheliale en mesenchymale LRC's in muis mandibulaire snijtanden naar de top (B). Overlappende mesenchymale LRC's (rood) met gecreëerde 3D-vlekken (grijs) (C). Vlekken die alleen zijn gemaakt voor mesenchymale LRC's (D). Spots die alleen zijn gemaakt voor epitheliale LRC's (E). Kwantificeringsresultaten voor epitheliale en mesenchymale LRC's (F). Bar: 300 μm in A en 150 μm in B-E. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Bereiding van EdU Labeling Cocktail |
| Bereiding van stamoplossingen (waterig) |
| TBS (10x) 1 M, pH 7,6 |
| CuSO 4 (100x),0,4 m |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide (100x), 300 μM in DMSO |
| Natriumascorbaat (10x), 0,2 g/ml in H2O |
| PBST (0,1% Triton X-100 in PBS, v/v) |
| Bereiding van EdU Labeling Cocktail |
| Voeg de volgende reagentia in de aangegeven volgorde toe: |
| Tris-gebufferde zoutoplossing (100 mM finale, pH 7,6) |
| CuSO 4 (4 mM finale) |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide (3 μM finale) |
| Natriumascorbaat (100 mM definitief, vers gemaakt voor elk gebruik) |
Tabel 1: Bereiding van de EdU-etiketteringscocktail
Aanvullende figuur: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meerdere doses injecties (BrdU, EdU) worden meestal gebruikt op groeiende neonatale muizen om prolifererende cellen zoveel mogelijk te labelen 1,6,13. De achtervolgingsperiode wordt beschouwd als een cruciale stap met betrekking tot de vernieuwingssnelheid van weefsels 6,13. De muizensnijtand vernieuwt zichzelf ongeveer elke maand. Met deze eigenschap kunnen onderzoekers de achtervolgingsperiode instellen op 4 weken of langer 4,5,22. Onze achtervolgingsperiode van 6 weken kon de stamcellen labelen in mesenchymale en epitheliale (labiale en linguale cervicale lus) compartimenten. Dit gebied omvatte enkele van de voorloperpopulaties in TAC's (Transit-Amplifying Cells) uit zowel epitheliale als mesenchymale compartimenten. Een langere achtervolgingsperiode zou wenselijk zijn bij het tonen van echte labelbehoudende cellen die zich uitsluitend in de epitheliale en mesenchymale stamcelniches bevinden.
Er zijn meerdere kritieke stappen in de weefselverwerkings- en opruimfasen voor dit protocol. De eerste opmerking is voor de weefselperfusie- en fixatiestap. Muizensnijtanden bevatten pulpweefsels die een rijke toevoer van bloedvaten hebben en een grote hoeveelheid bloedweefsels bevatten. De heparine PBS-perfusie moet dus zo snel mogelijk worden gestart nadat de muizen diep zijn verdoofd en in bedwang zijn gehouden. De reden is om de vorming van bloedstolsels te voorkomen die leidt tot autofluorescentie19. Er moet voor worden gezorgd dat overfixatie met PFA wordt vermeden, wat kan leiden tot onvoldoende transparantie en gelige verkleuring van het weefsel na het opruimen. Overmatige verkleuring verlaagt de signaalkwaliteit in de monsters tijdens beeldvorming19. De actieve transcardiale perfusiestap heeft de voorkeur boven passieve onderdompelingsfixatie van organen / weefsels, die de weefsels snel zal fixeren om verlies van endogene fluorescentie in de weefselzuiveringsstappen te voorkomen. Bij passieve fixatie kunnen de gebieden dieper in het weefsel minder transparant blijven; De monsters hebben mogelijk geen bevredigende beeldvormingsresultaten19. Een goede verwijdering van spieren uit de kaken zorgt voor een goede visualisatie van structuren die onderzoekers interesseren. Verder voorkomt effectieve verwijdering dat autofluorescentiestoornissen spierweefsels beïnvloeden. Een goede ontkalking is onmisbaar bij het opruimen van hard weefsel. Er moet voor worden gezorgd dat weefsels adequaat worden ontkalkt door de EDTA-onderdompelingstijd aan te passen aan de grootte en het mineraalgehalte van de monsters. EDTA-concentratie is van cruciaal belang om overkrimping van de weefsels te voorkomen. Daarom moet de concentratie worden gekozen op basis van de monsters en experimenten in vraag16,19. Evenzo is een ontkleuringsstap van cruciaal belang om het resterende heem adequaat te verwijderen om de autofluorescentie te verminderen. Onvoldoende de-lipidatietijd kan leiden tot minder transparant weefsel en wordt afgeraden. Over het algemeen kan de-lipidatie voor harde weefsels zoals muiskaken worden gedaan van 4-6 uur in 30% en 50% tB-oplossing en gedurende 1 dag in 70% tB-oplossing20. De incubatietijd is afhankelijk van de grootte van het monster en het lipidegehalte. De tijd kan worden verlengd om volledige delipidatie19,20 te garanderen. Individuele laboratoria kunnen de timing aanpassen volgens hun vereisten zonder de minimale tijd die nodig is voor de-lipidatie te verminderen.
Het meest voorkomende probleem bij weefselopruimingstechnieken betreft de ontoereikende transparantie van weefsel veroorzaakt door onjuiste weefselverwerking en opruimingsstappen. Deze situatie leidt tot problemen bij het verkrijgen van duidelijke beelden, waardoor een goede visualisatie van de fluorescerend gelabelde cellulaire of subcellulaire structuren wordt belemmerd. Het oplossen van problemen met de onvoldoende transparante weefsels moet worden gedaan door ervoor te zorgen dat elke kritieke stap correct wordt uitgevoerd. Deze praktijk moet beginnen met weefselperfusie- en fixatiestappen tot de weefselopruimingsstappen. De eigenschappen van elk weefsel of orgaan zijn anders. Daarom moeten de weefselverwerkings- en opruimingsstappen worden geoptimaliseerd om bevredigende clearingresultaten te verkrijgen19.
De beeldvorming van geklaarde weefselmonsters kan worden aangevuld met een confocale laserscanmicroscoop (CLSM) of een fluorescentiemicroscoop (LSFM) voor lichtvellen, afhankelijk van de vereisten en experimentele vraag en beschikbaarheid van de apparatuur17. We gebruikten CLSM voor het in beeld brengen van de onderkaak, wat een hogere resolutie beeldvorming geeft bij een hogere vergroting, maar langer duurt in vergelijking met LSFM17,20. Wanneer een hoge resolutie en een hogere vergroting geen vereiste zijn, kan de snelle lichtplaatfluorescentiemicroscoop (LSFM) wenselijk zijn19. LSFM is duur en is mogelijk niet gemakkelijk beschikbaar voor reguliere laboratoria. Voor confocale microscopie is het kiezen van de juiste objectieflenzen met het juiste numerieke diafragma van cruciaal belang voor een goede beeldvorming19,20. Voor grote weefselmonsters kunnen lagere vergrotingsobjectieven zoals 10x met een klein numeriek diafragma en een grotere werkafstand geschikt zijn19,21. Voor kleinere weefselmonsters kunnen hogere vergrotingsobjectieven zoals 20x met een hoog numeriek diafragma en een kleinere werkafstand wenselijk zijn. Ook het gebruik van een dompelolie met een bijpassende brekingsindex voor het clearingmedium en een objectieflens is van cruciaal belang om beeldvervorming te voorkomen en helderheidte verkrijgen 17,19. Voor beeldvorming zijn verschillende softwaresuites voor beeldverwerking en -analyse beschikbaar. Hoewel sommige softwaresuites gratis zijn, zijn andere duur en mogelijk onbetaalbaar voor individuele laboratoria. Deze beeldvormingsplatforms genereren enorme bestanden (in gigabytes) die geavanceerde computerwerkstations vereisen voor gegevensvisualisatie en kwantificering 17,20,21.
Hoewel sneller en gemakkelijker uit te voeren dan andere DNA-etiketteringsmethoden zoals BrdU, zijn er beperkingen aan het detecteren van LRC's via EdU-etikettering in vivo in vergelijking met het labelen van LRC's met H2B-GFP-transgene muizen. Ten eerste is het moeilijk om de LRC's van de epitheliale oorsprong of mesenchymale oorsprong te onderscheiden. H2B-GFP-etikettering kan worden gebruikt in een weefselspecifieke, promotorgestuurde tetracyclineactivator die specifiek de rustige stamcellen in verschillende weefsels kan labelen. In het geval van muizensnijtanden kan de H2B-GFP-methode specifiek de stamcellen uit het epitheel of mesenchym labelen 4,22. De weefselopruimings- en 3D-beeldconstructiemethoden die in dit protocol worden beschreven, zijn echter ook van toepassing op LRC's met H2B-GFP-fluorescentielabel, wat flexibiliteit en een verscheidenheid aan opties biedt. Ons werk maakt het mogelijk om LRC's te labelen en te karakteriseren volgens wetenschappelijke behoeften. De H2B-GFP-methode vereist transgene muizenproductie en kruising met andere stammen, wat tijdrovend en duurder is dan EdU-etikettering. De andere beperking van EdU-etikettering met de weefselopruimingsmethode is dat de monsters niet verder kunnen worden gebruikt voor downstream functionele analyses.
Dit protocol is voordelig voor onderzoekers die geen weefselspecifieke etikettering nodig hebben en snellere resultaten willen van het labelen van rustige stamcellen. Deze methode kan worden aangepast om te gebruiken voor het traceren van celafstamming; wanneer geïntegreerd met Cre-driven fluorescentie-etikettering van stam/voorlopercellen, verkrijgt onze methode meer details over de locatie van het nageslacht en nauwkeurigere kwantificering/bijdragen23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Meghann K. Holt voor het bewerken van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door NIH / NIDCR-subsidies DE026461 en DE028345 en de opstartfinanciering van de Texas A &M School of Dentistry aan Dr. Xiaofang Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712 (2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
- de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595 (2021).
- Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
- Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
- Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).
- Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
- Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).
- Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).
