Summary
Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) protein yapılarını ve fonksiyonlarını değiştirir. Birden fazla PTM tipinin aynı anda zenginleştirilmesi yöntemleri, analizlerde kapsama alanını en üst düzeye çıkarabilir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisini ve ardından pankreas dokularında protein N-glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı zenginleştirilmesi ve analizi için kütle spektrometresini kullanan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kütle spektrometresi, translasyonel modifikasyonların (PTM'ler) derin kapsamını sağlayabilir, ancak bu modifikasyonların karmaşık biyolojik matrislerden zenginleştirilmesi, modifiye edilmemiş analitlere kıyasla düşük stokiyometrileri nedeniyle sıklıkla gereklidir. Elde edilen peptitler analiz edilmeden önce proteinlerin enzimatik olarak sindirildiği aşağıdan yukarıya proteomik iş akışlarında peptitler üzerindeki PTM'lerin çoğu zenginleştirme iş akışı, yalnızca bir tür modifikasyonu zenginleştirir. Bununla birlikte, biyolojik fonksiyonlara yol açan PTM'lerin tüm tamamlayıcısıdır ve tek bir PTM tipinin zenginleştirilmesi, PTM'lerin bu tür çapraz konuşmasını kaçırabilir. PTM çapraz konuşması, protein glikozilasyonu ve fosforilasyon, insan proteinlerindeki en yaygın iki PTM ve ayrıca kütle spektrometrisi iş akışlarını kullanan en çok çalışılan iki PTM arasında gözlenmiştir. Burada açıklanan eşzamanlı zenginleştirme stratejisi kullanılarak, her iki PTM de karmaşık bir biyolojik matris olan ölüm sonrası insan pankreas dokusundan zenginleştirilmiştir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisi, uygun bir spin ucu tabanlı yöntemle çoklu fraksiyonlarda aynı anda çeşitli glikozilasyon ve fosforilasyon formlarını ayırmak için kullanılır ve potansiyel PTM çapraz konuşma etkileşimlerinin aşağı akış analizlerine izin verir. Gliko ve fosfopeptitler için bu zenginleştirme iş akışı, birden fazla PTM'nin derin profilini çıkarmak ve gelecekteki çalışmalar için potansiyel hedef molekülleri tanımlamak için çeşitli numune tiplerine uygulanabilir.
Introduction
Protein post-translasyonel modifikasyonları (PTM'ler), protein yapılarının ve dolayısıyla işlevlerinin ve aşağı akış biyolojik süreçlerinin modüle edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. İnsan proteomunun çeşitliliği, çeşitli PTM'lerin sağladığı kombinatoryal değişkenlik nedeniyle katlanarak artar. Genom tarafından tahmin edildiği gibi kanonik dizilerinden farklı protein varyantları proteoformlar olarak bilinir ve birçok proteoform PTM'lerden kaynaklanır1. Sağlık ve hastalıkta proteoform çeşitliliğinin incelenmesi son yıllarda büyük ilgi gören bir araştırma alanı haline gelmiştir 2,3.
Proteoformların ve daha spesifik olarak büyük derinliğe sahip PTM'lerin incelenmesi, kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik yöntemlerin geliştirilmesiyle daha kolay hale gelmiştir. MS kullanılarak, analitler iyonize edilir, parçalanır ve fragmanların m / z'sine göre tanımlanır. Zenginleştirme yöntemleri, PTM'lerin modifiye edilmemiş protein formlarına kıyasla düşük göreceli bolluğu nedeniyle sıklıkla gereklidir. Bozulmamış proteinlerin ve yukarıdan aşağıya analizler olarak adlandırılan PTM'lerinin analizi daha rutin hale gelmiş olsa da, proteinlerin enzimatik sindirimi ve aşağıdan yukarıya analizlerde bileşen peptitlerinin analizi hala PTM analizi için en yaygın kullanılan yoldur. En çok çalışılan iki PTM ve in vivo olarak en yaygın iki PTM, glikozilasyon ve fosforilasyon4'tür. Bu iki PTM, hücre sinyalizasyonu ve tanınmasında önemli rol oynar ve bu nedenle hastalık araştırmalarında karakterize etmek için önemli modifikasyonlardır.
Çeşitli PTM'lerin kimyasal özellikleri genellikle analizden önce protein ve peptit seviyelerinde bu PTM'lerin zenginleştirilmesine yönelik yollar sağlar. Glikozilasyon, her monosakkarit üzerindeki hidroksil gruplarının bolluğu nedeniyle hidrofilik bir PTM'dir. Bu özellik, hidrofilik etkileşim kromatografisinde (HILIC) glikopeptidleri zenginleştirmek için kullanılabilir, bu da daha fazla hidrofilik glikopeptidi hidrofobik modifiye edilmemiş peptitlerden ayırabilir5. Fosforilasyon, asidik pH dışında negatif yüklü olan fosfat moiety'yi ekler. Bu yük nedeniyle, fosforile edilmemiş türler yıkanırken, fosforeptitleri çekmek ve bağlamak için titanyum da dahil olmak üzere çeşitli metal katyonlar kullanılabilir. Bu, immobilize metal afinite kromatografisinin (IMAC) prensibidir. Glikozilasyon ve fosforilasyon için bu ve diğer zenginleştirme stratejileri hakkında daha fazla tartışma son derlemelerde bulunabilir 6,7.
PTM'lerin peptitler üzerindeki düşük stokiyometrisi nedeniyle zenginleştirme protokolleri için nispeten büyük miktarlarda başlangıç peptid materyaline (0.5 mg veya daha fazla) sıklıkla ihtiyaç duyulur. Tümör çekirdek biyopsisi veya beyin omurilik sıvısı analizleri gibi bu miktarda numunenin kolayca elde edilemeyeceği senaryolarda, maksimum biyomoleküler bilgi ile sonuçlanan kolay iş akışları kullanmak faydalıdır. Laboratuvarımız ve diğerleri tarafından geliştirilen son stratejiler, aynı PTM zenginleştirme iş akışı 8,9,10,11,12 kullanılarak glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı ve paralel analizini vurgulamıştır. Bu iki PTM'nin kimyasal özellikleri farklı olsa da, bu PTM'ler yenilikçi ayırma teknikleri ve kullanılan malzemeler nedeniyle birden fazla adımda analiz edilebilir. Örneğin, elektrostatik itme-hidrofilik etkileşim kromatografisi (ERLIC), analitler ve mobil faz arasındaki hidrofilik etkileşimlere dayanan ayrımları, analitler ve sabit faz malzemesi13,14,15,16 arasındaki yük-yük etkileşimleri ile kaplar. Asidik pH'da, fosforile peptitlerin sabit faza çekilmesi, modifiye edilmemiş peptitlerden tutulmalarını ve ayrılmalarını artırabilir. Hidrofilik mikrosferler üzerinde hareketsiz hale getirilmiş Ti(IV)'den oluşan malzeme, fosfopeptitleri ve nötr, asidik ve mannoz-6-fosforile glikopeptidleri ayırmak için HILIC ve IMAC bazlı elüsyon için kullanılabilir17,18. Bu strateji çift işlevli Ti(IV)-IMAC olarak bilinir. Birden fazla PTM'yi tek bir iş akışında zenginleştirmek için bu stratejileri kullanmak, potansiyel PTM çapraz konuşma etkileşimlerinin analizlerini daha erişilebilir hale getirebilir. Ek olarak, toplam numune miktarı ve zaman gereksinimleri, paralel olarak gerçekleştirildiğinde geleneksel zenginleştirme yöntemlerinden daha azdır (yani, ayrı numune alikotlarında HILIC ve IMAC).
Protein glikozilasyonu ve fosforilasyonun eşzamanlı analizi için çift fonksiyonlu Ti (IV) -IMAC stratejisini göstermek için, ölüm sonrası insan pankreas dokularını analiz etmek için uyguladık. Pankreas hem sindirim enzimleri hem de insülin ve glukagon dahil olmak üzere düzenleyici hormonlar üretir. Pankreas hastalığında pankreas fonksiyonu bozulur. Diyabette, kan şekerinin düzenlenmesi etkilenir ve kanda daha yüksek glikoz seviyelerine yol açar. Pankreatitte, inflamasyon organın otomatik sindiriminden kaynaklanır3. Glikozilasyon ve fosforilasyon dahil olmak üzere PTM profillerindeki değişiklikler, sıklıkla olduğu gibi, diğer hastalıklarda da ortaya çıkabilir.
Burada, pankreas dokusundan ekstrakte edilen proteinlerden türetilen N-glikopeptitler ve fosfopeptitler için çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC stratejisine dayanan spin-tip tabanlı eşzamanlı zenginleştirme yöntemi için bir protokol tarif ediyoruz. Protokol, Şekil 1'de görülebileceği gibi, protein ekstraksiyonu ve sindirimi, zenginleştirme, MS veri toplama ve veri işlemeyi içerir. Bu çalışmadan elde edilen temsili veriler, PXD033065 tanımlayıcılı ProteomeXchange Konsorsiyumu aracılığıyla edinilebilir.
Şekil 1: İnsan pankreas dokularından N-glikopeptidlerin ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için iş akışı. Dokular, deterjan sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak protein ekstraksiyonundan önce ince bir toz haline getirilerek kriyo-toz haline getirilir. Proteinler daha sonra enzimatik sindirime tabi tutulur. Elde edilen peptitler, çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC kullanılarak zenginleştirmeden önce aliquoted edilir. Ham veriler, nano ölçekli ters fazlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (nRPLC-MS) kullanılarak toplanır ve veritabanı arama yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokol, PTM analizlerini daha erişilebilir hale getirmeyi ve aynı iş akışındaki birden fazla PTM'nin daha yaygın analizini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, hücreler ve biyoakışkanlar dahil olmak üzere diğer karmaşık biyolojik matrislere uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pankreas dokularının araştırma için ölen kişinin akrabasından araştırma için onay alınmış ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Sağlık Bilimleri Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından izin alınmıştır. IRB gözetimi gerekli değildir, çünkü 45 CFR 46.102 (f) tarafından tanınan insan denekleri içermez.
DİKKAT: Bu protokolde kullanılan asitler (formik, asetik, trifloroasetik), bazlar (amonyum hidroksit) ve kriyojenler (sıvı azot) içeren reaktifler kullanılırken dikkatli olunmalıdır. İlgili tehlikelere ve gerekli önlemlere aşina olmak için kullanılan reaktifler için güvenlik bilgi formlarını okuyun. Yüzdeler kullanılarak belirtilen konsantrasyonlar hacim / toplam hacimdir (v / v) ve su ile seyreltilir.
1. Doku kriyo-pulverizasyonu, lizis ve protein ekstraksiyonu
- Bir dewar'ı sıvı azotla doldurun. Pankreas dokularıyla temas edecek doku öğütücüsünün parçalarını, yani odacığı, pulverizörü ve geri kazanım kaşığını bir polistiren kapta önceden soğutun.
- Dondurulmuş doku parçalarını önceden soğutulmuş numune tutucuya aktarın ve dokuya bir kaşık sıvı azot ekleyin.
- Öğütücüyü odaya yerleştirin ve numuneyi ezmek için beş ila on kez tokmak kullanarak vurun. Öğütücüyü odadan çıkarın ve yapışkan doku tozunu ve parçalarını kazıyın.
- Dokular erimeye başlarsa odaya bir kaşık sıvı azot ekleyin. Numune büyük doku parçaları olmadan ince bir toz haline gelene kadar pulverizasyon işlemini tekrarlayın. Numuneleri yaklaşık 100 mg alikotlara önceden soğutulmuş tüplere bölün.
- % 4 sodyum dodesil sülfat (SDS), 150 mM NaCl ve 25 mM Tris (pH = 7.4) içeren lizis tamponu hazırlayın. Her biri 20x stok için proteaz ve fosfataz inhibitörünün her biri için bir tableti 500 μL suda çözün. Son 1x konsantrasyon için her bir inhibitörün gerekli hacim 20x stoğunu lizis tamponuna ekleyin.
- Tüpe 100 mg doku başına 600 μL lizis tamponu ekleyin ve 800 rpm'de çalkalayarak 10 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda 95 ° C'de inkübe edin. Numuneleri ısıtma bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
- Örnekleri 60 W enerjide (20 kHz) 45 s için 15 s darbeler kullanarak 30 s dinlenme ile sonikleştirin. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 3.000 x g'de toplayın.
- Süpernatantı 5x çökeltme çözücüsüne, 300 μL lizis tamponunu, %50 aseton, %49,9 etanol ve %0,1 asetik asit içeren 1,5 mL çökeltme çözücüsüne ekleyin. Gece boyunca -20 °C'de soğutun.
- Numuneleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3.000 x g'de tekrar pelet edin ve süpernatanı çıkarın. Peleti bir spatula ile parçalayarak ve aynı miktarda çökeltme çözücüsü ile karıştırarak yıkayın. Pelet tekrar, yıkama adımını 2x tekrarlayarak.
- Numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'de pelet edin. Numune peletini bir davlumbazda 15 dakika boyunca hava ile kurutun ve ilerlemeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
2. Protein sindirimi ve tuzdan arındırma
- Protein peletini, 50 mM trietilammonyum bikarbonat (TEAB) ve 8 M üre içeren 300 μL taze yapılmış sindirim tamponunda yeniden askıya alın.
- Üreticinin protokolüne göre bir protein testi kullanarak çözeltinin protein konsantrasyonunu tahmin edin.
- Çözeltideki proteine, 5 mM'lik son konsantrasyona ditiyotreitol (DTT) ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 1 saat azaltın. Daha sonra, karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 15 mM'lik son konsantrasyona iyodoasetamid (IAA) ekleyin, karıştırın ve alkilat ekleyin. DTT ilavesini öncekiyle aynı hacimde tekrarlayarak alkilasyonu söndürün ve karıştırın.
- 1:100 enzim:protein oranında LysC / tripsin ekleyin ve 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, 1 M'< için kullanılan 8 M üreyi seyreltmek için 50 mM TEAB ekleyin 1:100 enzim: protein oranında tripsin ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Trifloroasetik asit (TFA) ilavesiyle% 0.3 v / v'ye kadar sindirimi söndürün. Her 1 mg başlangıç proteini için, 1 mL asetonitril (ACN) ve 1 mL% 0.1 TFA ile 3x içeren bir tuzdan arındırma kartuşu (1 cc, 10 mg) şartlandırın.
- Sindirilmiş karışımı tuz alma kartuşuna yükleyin. Karışımı 1 mL% 0.1 TFA kullanarak 3x yıkayın. Elüsyon yavaşsa, pozitif basınç uygulayın, ancak saniyede bir damla > bir akış hızından kaçının.
- 1 mL% 60 ACN ve% 0.1 formik asit (FA) çözeltisi kullanan elute peptidler. Çözücü tamamen buharlaşana kadar santrifüjlü bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak yaklaşık 35 ° C'de salınımlı peptitleri kurutun.
- Peptitleri 300 μL suda yeniden askıya alın ve üreticinin protokolüne göre bir peptid testi kullanarak peptid konsantrasyonlarını tahmin edin. Peptitleri 500 μg alikotlara bölün ve tamamen kurutun.
3. ERLIC N-glikopeptid zenginleştirme
NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.
- Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir 200 μL pipet ucuna koyun (spin-tip; bkz.
- Güçlü anyon değişim zenginleştirme malzemesini bir tüpe aktarın ve 10 mg malzeme başına 200 μL% 0.1 TFA ekleyin. 500 μg peptitlerin zenginleştirilmesi için, 15 mg malzeme kullanın. Malzemeyi 15 dakika sallayarak etkinleştirin.
- Bir tüp adaptörü kullanarak, spin-ucunu 2 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin ve uca 15 mg malzeme için yeterli bulamaç ekleyin. Masaüstü santrifüjde döndürerek sıvıyı çıkarın.
- 200 μL ACN ile 3 kat santrifüj yaparak malzemeyi koşullandırın. 100 mM amonyum asetat (NH4Ac), %1 TFA ve %80 ACN/%0,1 TFA (yükleme tamponu) kullanarak üçlü koşullandırmayı tekrarlayın.
- 500 μg peptid numunelerini yaklaşık 200 μL yükleme tamponunda yeniden askıya alın ve spin ucundan geçirin. Tam bağlama sağlamak için akış akışını 2 kat yeniden yükleyin.
- 200 μL %80 ACN/%0,1 TFA kullanarak 5x'i ve ardından %80 ACN/%0,1 FA'lık 200 μL kullanarak 2x'i santrifüj yaparak malzemeyi yıkayın.
- Peptitleri, aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile santrifüj yaparak etkisiz hale getirin: %50 ACN/%0,1 FA (E1); %0,1 FA (E2); %0,1 TFA (E3); 300 mM KH2PO4, %10 ACN (E4).
- Malzemeyi, 200 μL %80 ACN/%5 NH4OH ile 2 kat santrifüj yaparak yıkayın. Kalan peptitleri 200 μL% 10 NH4OH (E5) ile süzün.
- Yaklaşık 35 °C'de santrifüjlü bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüm salınımları tamamen kurutun.
- Üreticinin protokolüne göre bir tuzdan arındırma ucu kullanarak temel elüsyonun (E5) tuzdan arındırılmasını gerçekleştirin.
- Tuzdan arındırma ucundan gelen elüsyonu, yaklaşık 35 °C'de bir santrifüjlü vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tamlığa kavuşturun.
4. Ti(IV)-IMAC fosfopeptid zenginleştirme
NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.
- Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir 200 μL pipet ucuna (spin-tip) koyun.
- Ti-IMAC fosfopeptid zenginleştirme malzemesini bir tüpe aktarın ve 10 mg malzeme başına 200 μL% 0.1 TFA ekleyin. 500 μg peptitlerin zenginleştirilmesi için 10 mg malzeme kullanın.
- Bir tüp adaptörü kullanarak, spin ucunu 2 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin ve uca 10 mg malzeme için yeterli bulamaç ekleyin. Masaüstü santrifüjde döndürerek sıvıyı çıkarın.
- Yukarıda açıklandığı gibi aynı santrifüj ayarlarını kullanarak malzemeyi 200 μL %40 ACN/%3 TFA ile koşullandırın. Peptit numunelerini 200 μL'de %40 ACN/%3 TFA'da yeniden askıya alın ve spin ucundan akın. Daha eksiksiz bağlama sağlamak için akışı iki kez yeniden yükleyin.
- Malzemeyi 200 μL %50 ACN, %6 TFA ve 200 mM NaCl çözeltisi ile santrifüj yaparak yıkayın, ardından 200 μL'de 2x'i %30 ACN ve %0,1 TFA çözeltisi ile yıkayın.
- 200 μL% 10 NH4OH olan elute peptidler. Elüsyonu tamamen vakum altında kurulayın. Üreticinin protokolüne göre bir tuzdan arındırma ucu kullanarak tuzdan arındırma işlemini gerçekleştirin. Tuzdan arındırma ucundaki elüsyonu vakum altında tamlığa kadar kurutun.
5. Çift fonksiyonlu Ti (IV) eşzamanlı zenginleştirme
NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.
- Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir spin-ucu içine paketleyin.
- Yaklaşık 1 g Ti(IV)-IMAC malzemesini bir tüpe aktarın. Bilinen bir malzeme konsantrasyonuna, örneğin 20 mg / 200 μL'ye% 0.1 TFA ekleyin (malzeme bu süspansiyonda 4 ° C'de saklanabilir).
- 500 μg peptitlerden zenginleştirme için, 20 mg malzeme aktarmak için bir spin ucuna yeterli bulamaç ekleyin. Spin ucunu 200 μL% 0,1 TFA ile santrifüj yaparak yıkayın.
- Numuneleri 200 μL yükleme/yıkama çözücüsü (%80 ACN ve %3 TFA) içinde yeniden askıya alın ve sıkma ucundan akın. Akış akışını 2 kat yeniden yükleyin.
- Spin ucunu 6x, 200 μL yükleme/yıkama çözücüsü ile santrifüj yaparak yıkayın. Spin ucunu 200 μL %80 ACN/%0,1 FA çözeltisi ile yıkayın.
- Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 60 ACN / % 0.1 FA (E1) ve% 40 ACN /% 0.1 FA (E2). Her elüsyonu ayrı ayrı analiz edin.
- Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 20 ACN /% 0.1 FA ve% 0.1 FA. İki salınımı birleştirin ve tek bir örnek (E3) olarak analiz edin.
- Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 40 ACN / % 3 TFA; %50 ACN/%6 TFA, 200 mM NaCl; ve% 30 ACN / % 0.1 TFA. Bu salınımları birleştirin ve paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırdıktan sonra bir (E4) olarak analiz edin.
- 3x için 200 μL %90 ACN/%2,5 NH4OH kullanarak malzemeyi temel pH'a koşullandırın. Bu yıkamaları atın.
- Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 60 ACN / % 10 NH 4 OH (E5) ve% 40 ACN / % 10 NH4OH (E6). Paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırmadan sonra bu salınımları ayrı ayrı analiz edin.
- Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 20 ACN / % 10 NH4OH; %10 ACN/%10 NH4OH; ve% 10 NH4OH. Bu salınımları birleştirin ve paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırdıktan sonra bir (E7) olarak analiz edin.
- Tüm salınımları tamamen vakum altında kurutun.
6. Nano akışlı ters fazlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (nRPLC-MS)
NOT: MS veri toplama ve analiz yöntemleri çeşitlidir ve bu nedenle aşağıdaki adımlarda yalnızca bir önerilen LC-MS işlem hattı (ve ilişkili parametreleri) burada açıklanmaktadır. Daha önce özetlenen numune hazırlama ve zenginleştirme adımları kullanılarak oluşturulan numuneler, yeterli veri kalitesi göz önüne alındığında, ticari olarak temin edilebilen kromatografik sütunların kullanılması da dahil olmak üzere diğer enstrümantal kurulumlar kullanılarak analiz edilebilir.
- 19'da açıklandığı gibi C18 malzemesi kullanarak 15 cm uzunluğunda bir kılcal damarı (75 μm iç çap) çekin ve paketleyin. Mobil faz A (suda% 0.1 FA) ve mobil faz B (ACN'de% 0.1 FA) hazırlayın.
- Zenginleştirilmiş peptit numunelerini% 3 mobil faz B'nin 15 μL'sinde yeniden oluşturun. numunenin 2 μL'sini (~% 13 numune hacmi) doğrudan kolona yükleyin. Her örneği teknik kopyada analiz edin.
- Elute peptidler, 0.3 μL / dak akış hızında 90 dakika boyunca% 3 ila% 30 mobil faz B arasında bir gradyan kullanarak. Kolonu 8 dakika boyunca% 75 B'yi, ardından 8 dakika boyunca% 95 B kullanarak yıkayın, yöntemi 12 dakika boyunca% 3 B'de denge ile bitirin.
- Aşağıdaki parametrelerle en üstteki 20 pikin veriye bağlı olarak elde edilmesini kullanarak kütle spektrometresini pozitif iyon modunda çalıştırın: püskürtme voltajı 2 kV; LC/MS'de 120.000 çözünürlükte 400-2.000 m/z'den MS 1 algılama, 2E5 otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi,100 ms maksimum enjeksiyon süresi, %30 RF lens, 1,6 m/z pencereli dörtlü izolasyon, şarj durumları için 2-8 ve belirlenmemiş ve 30 s dinamik dışlama; LC/MS'de MS 2 tespiti, %22, %30 ve %38'de kademeli HCD parçalanması, 30.000 çözünürlükte sabit ilk kütle 120 m/z, 5E4 AGC hedefi ve 2,5E4 minimum yoğunluk gereksinimi kullanılarak tespit edilir.
7. MS veri analizi
NOT: Aynı veri kümesini analiz etmek için iki farklı yazılım kullanan bir veri analizi işlem hattı burada sunulmuştur. Fosforilasyon ve glikozilasyon, burada açıklandığı gibi iki ayrı yazılım yerine tek bir yazılım kullanılarak aynı anda aranabilir, ancak genel olarak, yazılım arama süresi arama alanıyla, yani dikkate alınan PTM sayısıyla orantılıdır. Bu nedenle glikopeptitler ve fosfopeptitlerin aranmasına paralel olarak iki farklı yazılım kullanılmaktadır.
- Ham veri dosyalarını uygun yazılımı kullanarak işleyin (bkz.
- UniProt insan (veya uygun türe özgü) veritabanına karşı spektrumları arayın. Cys'nin karbamidometilasyonunu sabit bir modifikasyon olarak ayarlayın. Maksimum kaçırılan enzimatik bölünme sayısını iki olarak ayarlayın.
- Ham veri dosyalarında, ticari bir yazılım kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), analiz edilecek glikopeptitleri arayın20. 10 ppm öncü kütle toleransı ve minimum dört kalıntı peptid uzunluğu ile 0.01 Da parça kütle toleransı kullanın.
- Yazılıma gömülü N-glikan veritabanını kullanarak arama, HexNAc(2)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Fosfo(1) ve HexNAc(3)Hex(3-4)Fosfo(1) dahil olmak üzere tipik mannoz-6-fosfat(M6P)glikanlarla genişletilmiştir.
- N-glikozilasyonu ortak bir modifikasyon olarak ayarlayın. Peptit spektral eşleşmesi (PSM) başına maksimum toplam modifikasyonları bir ortak ve iki nadir olarak ayarlayın.
- Aşağıdaki değişken modifikasyonları ayarlayın: Met oksidasyonu (nadir), Asn ve Gln'de deamidasyon (nadir) ve Ser, Thr ve Tyr'da fosforilasyon (ortak). Aşağıdaki tanımlama filtrelerini ayarlayın: skor kesme > 150, |log probu| > 1 ve delta mod skoru 10>.
- Arama sonuçlarını Proteinler ve Peptit Grubu sekmelerinde dışa aktarın ve analiz edin.
- M6P glikanları içeren tanımlamaları, MS / MS spektrumlarında FosfoHex oksonyum iyonunun (243 m / z) varlığı açısından manuel olarak tarayın ve bu tanısal iyonu içermeyen yanlış pozitif tanımlamaları kaldırın.
- Ham veri dosyalarında, açık kaynaklı bir yazılım kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), analiz edilecek fosfopeptitleri arayın21. 20 ppm ilk arama peptid toleransı ve 4.5 ppm ana arama peptid toleransı kullanın.
- Peptit başına maksimum değişiklik sayısını 5 olarak ayarlayın. PSM ve protein yanlış keşif oranını (FDR) %1'e ve minimum peptid uzunluğunu 7 kalıntıya ayarlayın.
- Met'te oksidasyon, N-terminal protein asetilasyonu ve Ser, Thr ve Tyr'da fosforilasyon olarak değişken modifikasyonlar ayarlayın. modificationSpecificPeptides dosyalarını kullanarak arama sonuçlarını analiz edin.
- PTM'lerin protein, peptit ve modifikasyon bölgesi seviyelerindeki tanımlama sayısını belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ham dosyalar ve arama sonuçları da dahil olmak üzere temsili kütle spektrometresi verileri, PXD03306522 veri kümesi tanımlayıcısı ile PRIDE iş ortağı deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu'na yatırılmıştır.
Bu çalışmada, her zenginleştirme elüsyonu için çift enjeksiyon replikaları analiz edilmiştir. Her iki teknik replikasyondan yapılan tanımlamalar son analizde harmanlanmıştır. MS / MS parçalanması için peptid öncüllerinin toplanmasında veriye bağımlı edinimin yarı stokastik doğası nedeniyle, teknik kopyalar arasında yaklaşık% 70-80'lik bir tanımlama çakışması beklenmektedir. Bu yöntemlerin kullanıldığı uygulamalarda, en az iki teknik çoğaltma teşvik edilir. Aşağı akış istatistiksel analizleri için, farklı deney koşulları için biyolojik replikasyonlar dikkate alınmalıdır. Veri raporlaması için istenen sıkılığa bağlı olarak, tanımlamalar için filtreler ayarlamak yararlı olabilir, örneğin, raporlanacak en az x sayıda teknik veya biyolojik kopyada tanımlama.
Her zenginleştirmeden elde edilen her bir elüsyon için örnek bir toplam iyon kromatogramı (TIC), Ek Şekil S1, Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3'te görülebilir. Ham MS dosyalarının veritabanı araması sırasında katı filtrelerin kullanılması, MS / MS spektrumlarının PTM'lerle peptit dizilerine daha doğru ve daha güvenli bir şekilde tanımlanmasını sağlayabilir. Her elüsyon için TIC'lerde açıkça görüldüğü gibi, peptid örnekleri zenginleştirmeden fraksiyonasyondan sonra bile hala karmaşıktır. Yüksek çözünürlüklü, yüksek kütle doğruluğu ve hızlı taramalı kütle spektrometresi ile birleştirilen nanoflow kromatografisi, triptik bir sindirimden peptitler gibi karmaşık karışımların büyük hassasiyet ve derinlikle analiz edilmesine yardımcı olabilir. Glikozile ve fosforile spektrumlar için örnek MS/MS spektrumları Şekil 2'de görülebilir. Bunlar gibi iyi açıklamalı spektrumlar, veritabanı arama yazılımı tarafından atanan tanımlamaya olan güveni artıran öncüllerin zengin parçalanmasından kaynaklanır.
Şekil 3 , her bir elüsyon fraksiyonu üzerinde çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC spin-tip zenginleştirme yöntemi kullanılarak yapılan peptid tanımlamalarını göstermektedir. Glikopeptidlerin çoğunluğu ilk dört fraksiyonda süzülürken, fosfopeptidlerin çoğunluğu son üç fraksiyonda süzülür. Farklı PTM'lerin fraksiyonlar arasında bu şekilde ayrılması, salınımlar arasında yeterince ayrılmadıkları takdirde ortaya çıkabilecek iyonizasyondaki herhangi bir parazitin önlenmesine yardımcı olur.
Şekil 4 , ikili Ti yönteminden elde edilen glikoproteomik sonuçları, yalnızca ERLIC glikopeptid zenginleştirme ile karşılaştırmaktadır. Şekil 4A'da görülebileceği gibi, protein, glikoform, PTM ve modifikasyon bölgesi düzeylerindeki birçok tanımlama her iki yöntemde de ortaktır. Bununla birlikte, ERLIC, ikili Ti yöntemine kıyasla her seviyede daha benzersiz tanımlamalara sahiptir. Bu, yanlış pozitif tanımlamaları gidermek için verilerin ek manuel kürasyonunu gerektiren M6P (en az bir fosfat grubuna sahip yüksek mannoz glikanları) glikoformlarını içerir. Ayrıca, her iki yöntem kullanılarak tanımlanan glikan türleri benzerdir. Her bir glikan tipinin, bileşimlerine göre altı kategoriye bağlandıktan sonraki oranları, her iki yöntem arasında benzerdir16.
İkili Ti yönteminden elde edilen fosfoproteomik sonuçlar, Şekil 5'teki geleneksel IMAC fosfopeptid zenginleştirme ile karşılaştırılmıştır. Çift fonksiyonlu Ti(IV) zenginleştirme, protein, peptit ve PTM seviyelerinde önemli örtüşmelerle gösterildiği gibi geleneksel IMAC'ye benzer şekilde performans gösterir. Her iki yöntemi de kullanarak, fosforile amino asitlerin çoğunluğu serin ve treonindir, yaklaşık% 1 fosforile tirozin de tanımlanmıştır. Her iki yöntem de çoklu fosforile peptitleri tanımlamak için kullanılabilir.
Modifiye proteinlerin listeleri genlerle eşleştirilir ve Şekil 6 ve Şekil 7'de gösterildiği gibi gen ontolojisi (GO) zenginleştirmesi kullanılarak analiz edilir. ERLIC ve IMAC kullanılarak tanımlanan modifiye proteinler için GO analizleri Ek Şekil S4 ve Ek Şekil S5'te gösterilmiştir. Ücretsiz, çevrimiçi Metascape aracı zenginleştirmeyi gerçekleştirir ve zenginleştirilmiş yollara ve süreçlere dayanan ağlar oluşturur ve bunları benzerlikle birbirine bağlar23. Her GO analizi için düğüm terimleri Ek Tablo S1, Ek Tablo S2, Ek Tablo S3 ve Ek Tablo S4'te bulunabilir. Glikozilasyon, hücre dışı matrikste önemli bir protein PTM olduğundan, tanımlanan N-glikoproteinlerin listesi kullanılarak zenginleştirilmiş birkaç terimin hücre dışı matrisle ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Fosforilasyon, hücre sinyalizasyonunda rol oynar ve bu, tanımlanan fosfoproteinlerin listesi kullanılarak bulunan birkaç zenginleştirilmiş terimde görülebilir.
Şekil 2: N-glikozile ve fosforile peptitlerden açıklamalı yüksek güvenilirlikli MS/MS spektrumları. (A) Mannoz-6-fosforile peptid GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Fosfo(1))VTR, yedinci zenginleştirme elüsyonundan 53.08-53.33 dakika sonra tutma sürelerinden tanımlanmıştır. 243 m/z'de PhosphoHex oksonyum iyonunun varlığı, bu PTM görevlendirmesine olan güveni artırır. (B) Fosforile peptid VEEEQEADEEDVS(Fosfo)EEEAESK, altıncı zenginleştirme elüsyonundan itibaren 32.31-32.72 dakika retansiyon sürelerinden tioredoksin ile ilişkili transmembran protein 1'den (TMX1) elde edilir. Peptit fragman iyonları ve bunların fosforillenmiş varyantları (fragman ile gösterilir*) arasında -98 (-H3PO4) nötr kayıpların varlığı, bu PTM atamasına olan güveni arttırır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesinden peptid tanımlamalarının yedi salınımda karşılaştırılması. Tanımlamaların sayısı, iki teknik (enjeksiyon) replikasyondan en az birinde tanımlanan peptitleri içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesinden elde edilen glikoproteomik sonuçların geleneksel ERLIC glikopeptid zenginleştirmesi ile karşılaştırılması. (A) Zenginleştirme yöntemleri arasında glikoprotein, glikoform (protein, bölge, glikan), glikan bileşimi ve glikosit tanımlamalarının Venn diyagramları. (B) Zenginleştirme yöntemleri arasında peptid omurgaları üzerinde tanımlanan glikanların pasta çizelgeleri. Glikanlar, bileşimlerine göre altı gruba ayrılır16. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesinden elde edilen fosfoproteomik sonuçların konvansiyonel Ti(IV)-IMAC fosfopeptid zenginleştirmesi ile karşılaştırılması. (A) Zenginleştirme yöntemleri arasında fosfoprotein, fosfopeptid ve fosfosit tanımlamalarının Venn diyagramları. (B) Amino asit kalıntısı ile parçalanmış, güvenle lokalize edilmiş (%75 veya daha yüksek olasılıklı) foskozitlerin pasta grafikleri. (C) Bir dizi fosforile kalıntı ile bağlanmış tanımlanmış fosfopeptitlerin yığılmış çubuk grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesi kullanılarak tanımlanan N-glikoproteinlerin gen ontolojisi zenginleştirilmesi. N-glikoproteinler genlere geri eşlenir ve genomun tamamı arka plan olarak kullanılarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar ve süreç terimleri tanımlanır. Terim benzerliği ile bağlanan terim kümelerini etiketlemek için çeşitli renkler kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesi kullanılarak tanımlanan fosfoproteinlerin gen ontolojisi zenginleştirilmesi. Fosfoproteinler genlere geri eşlenir ve genomun tamamı arka plan olarak kullanılarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar ve süreç terimleri tanımlanır. Terim benzerliği ile birbirine bağlanan terim kümelerini etiketlemek için çeşitli renkler kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC (E1'den E7'ye, paneller A-G) zenginleştirmesinden elde edilen her bir elüsyondan örnek toplam iyon kromatogramları (TIC'ler). Toplam sinyal (iyon akımı) 117 dakikalık veri toplama süresi boyunca çizilir. Baz tepe noktasının yoğunluğu NL değeri ile verilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: ERLIC (E1 ila E5, paneller A-E) zenginleştirmesinden elde edilen her bir elüsyondan örnek toplam iyon kromatogramları (TIC'ler). Toplam sinyal (iyon akımı) 117 dakikalık veri toplama süresi boyunca çizilir. Baz tepe noktasının yoğunluğu NL değeri ile verilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: Ti-IMAC zenginleştirmesinden elde edilen elüsyondan örnek toplam iyon kromatogramı (TIC). Toplam sinyal (iyon akımı) 117 dakikalık veri toplama süresi boyunca çizilir. Baz tepe noktasının yoğunluğu NL değeri ile verilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S4: ERLIC ile konvansiyonel glikopeptid zenginleştirmesi kullanılarak tanımlanan N-glikoproteinlerin gen ontolojisi zenginleştirilmesi. N-glikoproteinler genlere geri eşlenir ve genomun tamamı arka plan olarak kullanılarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar ve süreç terimleri tanımlanır. Terim benzerliği ile birbirine bağlanan terim kümelerini etiketlemek için çeşitli renkler kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S5: Ti(IV)-IMAC ile konvansiyonel fosfopeptid zenginleştirmesi kullanılarak tanımlanan fosfoproteinlerin gen ontolojisi zenginleştirilmesi. Fosfoproteinler genlere geri eşlenir ve genomun tamamı arka plan olarak kullanılarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar ve süreç terimleri tanımlanır. Terim benzerliği ile birbirine bağlanan terim kümelerini etiketlemek için çeşitli renkler kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablolar S1-S4: Gen ontolojisi zenginleştirme analizleri için metascape düğüm bilgisi. Tablolar, çift Ti (Tablo S1 ve Tablo S2), ERLIC (Tablo S3) kullanan N-glikoproteinler ve IMAC (Tablo S4) kullanılarak tanımlanan N-glikoproteinler ve fosfoproteinlerin listeleri için düğüm bilgilerini içerir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC stratejisi, tek bir numune hazırlama iş akışında aynı numuneden N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için kullanışlıdır. ERLIC tabanlı yöntemlerin PTM'lerin eşzamanlı zenginleştirilmesini de sağladığı gösterilmiştir. Her iki strateji de daha önce PTM analizlerinde derin kapsama alanı için kullanılmış14,18. İkili Ti yöntemini, spin uçlarını kullanarak numune inkübasyon süresini azaltmaya uyarlarken, bu protokolün daha az kaynak yoğun ve dolayısıyla daha yaygın olarak erişilebilir hale geldiğini umuyoruz.
Birden fazla PTM'nin eşzamanlı analizi, zenginleştirme malzemesinin yüzeyindeki analitler ve fonksiyonel gruplar arasındaki sinerjik etkileşimler yoluyla elde edilir. Pamuklu ilk paketleme spin uçlarında, glikopeptidlerin HILIC modunda tutulması, selüloz24 üzerindeki hidroksil gruplarının prevalansı nedeniyle artar. Su ve asetonitril (suyla karışabilen bir çözücü) kullanılarak, glikopeptitlerler su ve organik tabakaların oluşumu nedeniyle tutulur ve ayrılır. Çift fonksiyonlu Ti(IV) zenginleştirme malzemesi, fosfopeptitlerin bağlanması için immobilize Ti(IV) katyonlarına bağlıdır. Malzemenin yan zincirlerinin hidrofilik özellikleri, glikopeptitleri bir HILIC modunda tutmak için kullanılır, bunlar ilk önce artan sulu içeriğe sahip asidik elüsyon kullanılarak salınır. Materyal ayrıca, diğer nötr glikopeptidlerden daha sabit faza daha yüksek afiniteye sahip olan sialile glikopeptitleri ortaya çıkarmak için geleneksel IMAC fosfopeptid zenginleştirme tamponları ile yıkanır. Malzemeyi temel pH'a koşullandırdıktan sonra, fosfopeptitleri malzemeye bağlı tutan elektrostatik etkileşimleri kırmak için amonyum hidroksit ve ACN çözeltisi kullanılır. Bu arada, azalan organik içerik, mono ve çoklu fosforile peptitlerin ve M6P glikopeptidlerin ayrılmasına izin verir.
PTM'leri aynı iş akışında birden fazla elüsyon adımı kullanarak ayırırken, sınırlı numunelerden biyomoleküler bilgiler en üst düzeye çıkarılabilir. Bu tür çift PTM analiz iş akışlarıyla ilgili bir uyarı, en az beş fraksiyon toplandığında her zenginleştirme için başlangıç malzemesi olarak nispeten büyük miktarda numunenin (0,5 mg peptit) gerekliliğidir. Bununla birlikte, burada sunulan eşzamanlı zenginleştirme stratejisi, geleneksel stratejilere kıyasla hala önemli miktarda malzeme tasarrufu sağlamaktadır. Zenginleştirmeden önce bile, PTM bütünlüğünü sağlamak ve PTM bilgilerinin yapay kaybını önlemek için birkaç önemli adım gereklidir. Bunlar, numunelerin kullanılmadığında düşük sıcaklıklarda (ideal olarak -80 ° C) uygun şekilde depolanmasını, protein ekstraksiyonu sırasında proteaz ve fosfataz inhibitörlerinin kullanılmasını ve burada kullanılan HLB kartuşları gibi bir hidrofilik peptid temizleme yönteminin kullanılmasını içerir.
ERLIC'in (konvansiyonel glikopeptid zenginleştirme) daha iyi glikoproteom kapsamı ile sonuçlandığı, çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC'ın ise fosfoproteomik sonuçlarda konvansiyonel Ti-IMAC ile benzersiz tanımlamalarda daha iyi performans gösterdiği gözlenmiştir. ERLIC materyalinin fiziksel yapısı ve çift Ti zenginleştirme malzemesininkine kıyasla artan hidrofilisitesi, ERLIC'teki gelişmiş glikoproteom kapsama alanında muhtemelen önemli bir faktördür. Konvansiyonel IMAC'de fosfoproteomun artan kapsamı, ilk elüsyon adımları ve yıkama adımları sırasında glikopeptitlerlerin çıkarılmasından kaynaklanan iyon baskılanmasının azalmasının bir sonucu olabilir. Eşzamanlı çift Ti iş akışı kullanılarak kapsama alanındaki bu küçük düşüşlere rağmen, geleneksel tek PTM zenginleştirme ile önemli ölçüde örtüşme, iki yerine yalnızca bir zenginleştirme iş akışı gerçekleştirmenin ek avantajıyla hala elde edilmektedir.
Zaman kısıtlamaları ile ilgili olarak, ERLIC ve geleneksel Ti-IMAC, çift Ti iş akışından daha az kesirlere sahiptir. İhtiyaç duyulan kaynaklarla ilgili olarak, ERLIC için gereken anyon değişim malzemesi, çift Ti ve geleneksel IMAC iş akışları için gereken işlevselleştirilmiş malzemeden daha ucuzdur. Bu protokollerde, O'ya bağlı olmayan sadece N'ye bağlı glikozilasyon analiz edildi. PNGaz F enzimi, O-glikopeptidleri ararken elde edilen yanlış pozitiflerin sayısını sınırlamak için N-glikanları parçalamak için kullanılabilir (ve kullanılmalıdır). Bununla birlikte, bu stratejinin glikopeptid zenginleştirme25 için HILIC ve ERLIC'in özgüllüğünü azalttığı gösterilmiştir. Protokolde, ham veri dosyalarını analiz etmek için iki ayrı yazılım kullanan bir strateji kullanılır. Ticari bir yazılım olan Byonic, glikoproteomik verilerin analizinde altın standart olarak kabul edilir. N-glikan yapılarının çeşitliliği nedeniyle, peptid arama alanı artar, böylece arama süreleri artar. Fosforilasyon, arama sırasında glikozilasyona ek olarak ortak bir PTM olarak da eklenebilir, ancak peptid çoklu fosforilasyonunun dikkate alınıp alınmadığına bağlı olarak arama süreleri fırlayabilir. Açık kaynaklı bir yazılım olan MaxQuant, fosfoproteomik sonuçlarda FDR'yi en aza indirmek için optimize edilebilir, ancak karmaşık glikozilasyon arama yapmak için kolay değildir. Glikoproteomik verileri aramak için başka açık kaynaklı seçenekler de vardır26,27,28. Mevcut deneysel hedeflere ve kaynaklara bağlı olarak, burada açıklanan LC-MS ve veri analizi işlem hattı sunulduğu gibi kullanılabilir veya değiştirilebilir. Yöntemlerin daha da optimize edilmesinin PTM'lerin kapsamını iyileştirmesi beklenmektedir.
PTM'ler, verdikleri protein yapısındaki değişiklikler nedeniyle biyokimyasal süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Tüm proteomik analizlerin tüm protein PTM'lerini aynı anda dikkate alması idealdir. Örneğin, tüm protein glikozilasyonunun toplamının önemi, meta-heterojenite29 olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte, toplam PTM analizinin amacı, mevcut MS tabanlı teknolojilerle henüz mümkün değildir. Aşağıdan yukarıya proteomiklerin ardından PTM'ye özgü zenginleştirme, yani HILIC ve IMAC, PTM analizleri için hala altın standarttır, ancak burada açıklananlar gibi eşzamanlı zenginleştirme stratejileri kullanılarak, biyomoleküler bilgiler daha iyi aydınlatılabilir. Çapraz konuşma etkileşimlerinin, glikozilasyon ve fosforilasyon32 dahil olmak üzere çeşitli PTM'ler30,31 arasında meydana geldiği bulunmuştur. Hastalıkta, örneğin diyabet ve kanser gibi pankreas hastalıklarında bu tür etkileşimlerin kantitatif analizi, hastalık mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı arttırmada verimli olabilir. Farklı numune tipleri arasında ekstraksiyon yöntemlerinin optimizasyonu ile, burada açıklanan zenginleştirme protokolleri, karmaşık biyolojik matrislerde glikoproteom ve fosfoproteomun derinlemesine profillenmesi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen NIH'den (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 ve R21AG065728) ve Çocuk Diyabet Araştırma Vakfı'ndan (1-PNF-2016-250-S-B ve SRA-2016-168-S-B) hibe fonu ile desteklenmiştir. Burada sunulan veriler kısmen Wisconsin Üniversitesi Klinik ve Translasyonel Araştırma Enstitüsü aracılığıyla bir NIH / NCATS UL1TR002373 ödülünün desteğiyle elde edilmiştir. Orbitrap enstrümanları, NIH paylaşımlı enstrüman hibesi (NIH-NCRR S10RR029531) ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Araştırma ve Lisansüstü Eğitim Rektör Yardımcısı Ofisi desteği ile satın alındı. Ayrıca, araştırma için insan pankreası sağlayan Wisconsin Üniversitesi Organ ve Doku Bağışı Organizasyonu'nun cömert desteğine ve örnekleri laboratuvarımıza sağlamak için Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett ve Prof. Jon Odorico'nun yardımına teşekkür ederiz. Araştırma ekibimiz bu çalışma için doku bağışında bulunan ailelere özel teşekkürlerini sunar. L.L., Wisconsin Üniversitesi Karkemik Kanser Merkezi'nden (233-AAI9632) bir Pankreas Kanseri Pilot hibesi olan NIH hibesi S10OD025084'ün yanı sıra Wisconsin Mezunları Araştırma Vakfı ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Eczacılık Fakültesi tarafından sağlanan fonla Vilas Seçkin Başarı Profesörlüğü ve Charles Melbourne Johnson Seçkin Kürsü Profesörlüğünü kabul etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
