使用 SCAD 检测法可视化瘢痕形成过程 - 一种 原位之外 皮肤瘢痕形成检测

摘要

本方案描述了一种称为“培养皿中的瘢痕样组织”（SCAD）的皮肤-筋膜外植体的制备方法。该模型可实现对瘢痕形成过程中单个成纤维细胞的前所未有的可视化观察。

摘要

哺乳动物对深层组织伤口的总体反应是通过瘢痕形成和组织收缩来实现的，这一过程由特化的筋膜成纤维细胞介导。尽管瘢痕形成及伤口愈合障碍具有重要的临床意义，但由于缺乏能够在皮肤伤口等复杂环境中直接可视化成纤维细胞行为与动态的相关检测方法，目前对筋膜成纤维细胞在伤口愈合过程中动态变化的理解仍十分有限。本文介绍了一种生成 原位之外 使用 SCAD 或治疗皮肤疤痕 "培养皿中的类SCar组织" 模拟皮肤伤口的复杂环境。在该实验中，切除2 mm全层皮肤，将其倒置培养于培养基中5天，在此期间瘢痕和皮肤挛缩均匀形成。该方法结合成纤维细胞谱系特异性的转基因小鼠模型，可实现对整个伤口修复过程中单个成纤维细胞谱系的可视化观察。总体而言，该方案有助于 帮助研究人员理解伤口修复的基本过程和机制， 直接探究调节剂对伤口愈合结果的影响。

引言

伤口愈合是一个修复受损伤口的过程。无脊椎动物的组织损伤会导致部分或完全再生。相比之下，哺乳动物对深层损伤的反应是形成瘢痕，这一过程通过致密的基质纤维栓快速封闭伤口，以最小化受损区域，但同时也会永久性地改变受伤部位^1,2,3。哺乳动物的大面积皮肤烧伤或深部开放性伤口会导致病理性表型，如增生性瘢痕或瘢痕疙瘩^4,5。这些过度形成的瘢痕给临床和全球医疗系统带来了巨大负担。仅在美国，瘢痕管理每年的费用约为100亿美元^6,7。因此，有必要开发相关方法，以更深入地理解瘢痕形成所涉及的基本过程和机制。

近年来，大量针对小鼠的研究揭示了来源于皮肤特定部位的成纤维细胞群体具有高度异质性，并表现出不同的功能潜能^8,9,10。在背部皮肤中，Rinkevich 等人（2015年）发现，一类在胚胎早期表达 Engrailed-1（En1）的特定成纤维细胞群体，称为 EPF（Engrailed 阳性成纤维细胞），在皮肤损伤后参与瘢痕形成。相反， 另一类从未表达过 engrailed 的成纤维细胞谱系，即 Engrailed 阴性成纤维细胞（ENF），则不参与瘢痕形成⁸。通过将 Cre 介导的转基因小鼠品系与荧光报告小鼠品系（如 R26^mTmG）杂交（En1Cre × R26^mTmG），可对这些 En1 谱系进行命运图谱分析，从而实现对 EPF 和 ENF 群体的可视化。

研究成纤维细胞迁移 体内 数天内的观察受到伦理和技术限制。此外，用于调控瘢痕形成相关通路的化合物、病毒及中和抗体文库筛选在技术上具有挑战性。以往使用的方法 体外 或 离体 模型缺乏在真实的皮肤微环境中可视化成纤维细胞迁移和瘢痕形成的能力，以及瘢痕发育的一致性和模拟组织复杂性的能力 体内 皮肤环境^11,12为克服上述局限性，我们开发了一种 离体 一种称为SCAD（培养皿中的瘢痕样组织）的瘢痕检测方法^13,14该简易检测方法可通过切除包含表皮、真皮及皮下筋膜区域的2 mm全层皮肤组织，并将其置于含血清的DMSO培养基中培养最多5天来完成。由SCAD产生的瘢痕能够可靠地复制出瘢痕疙瘩在转录组学和蛋白质组学上的特征性标志 体内 瘢痕。此外，通过将相关转基因小鼠品系（例如 En1 小鼠）与荧光报告小鼠品系杂交所获得的皮肤瘢痕模型（SCADs），能够以前所未有的分辨率可视化成纤维细胞的迁移动态及瘢痕的形成过程。 Furthermore，该模型可轻松适用于各类高通量应用（例如化合物文库、抗体文库或病毒筛选）。^13,14本文中，我们描述了一种优化的方案，用于生成瘢痕相关成纤维细胞（SCADs）及后续的下游处理应用，以研究瘢痕形成过程中的细胞和基质动态变化。

方案

下述模型详细描述了SCAD检测方法的逐步建立过程，该方法在Jiang等（2020）中曾被简要提及¹³。根据国际及上巴伐利亚政府指南，在处死动物后进行SCAD样本制备。动物饲养于慕尼黑亥姆霍兹研究中心的动物设施中，房间环境保持适宜的湿度和恒定温度，并采用12小时光照循环。动物可自由摄食和饮水ad libitum。

1. SCAD 组织制备

1. 在出生后第0天或第1天（P0或P1）处死新生幼鼠。
2. 使用无菌手术刀，仔细切取至少1.5 cm × 1.5 cm的全层背部皮肤，直至露出骨骼肌层。
3. 用无菌弯头镊轻轻剥离皮肤，确保浅筋膜完整地附着于下方的肉膜肌（panniculus carnosus muscle）。
4. 用50–100 mL冷的DMEM/F-12培养基冲洗所取组织，以去除污染的血液。
5. 用Hanks'平衡盐溶液（HBSS）洗涤一次，以维持组织和细胞的活性。
6. 将皮肤倒置（浅筋膜朝上）放入盛有DMEM/F12培养基的10 cm培养皿中。
7. 使用一次性2 mm活检打孔器，切取全层圆形皮肤组织，确保浅筋膜与下方的肉膜肌保持完整，直至表皮，以制备SCAD组织。
8. 配制并分装200 µL DMEM/F12完全培养基（不含酚红）至96孔板的各个孔中，该培养基为添加了10% FBS、1× GlutaMAX、1× MEM非必需氨基酸和1×青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基。
9. 用无菌镊子小心地将单个SCAD组织倒置（筋膜朝上）转移至96孔板的孔中，并完全浸没于培养基中。
10. 将96孔板转移至细胞培养孵箱中，在标准条件下（37 °C、21%（v/v）氧气、5%（v/v）CO₂、95%湿度）培养。

2. SCAD - 组织培养

1. 将 SCADs 在培养箱中培养最多 5 天。
2. 在培养的第 2 天和第 4 天，更换培养基，每孔加入 200μl 新鲜预热的 DMEM/F12 完全培养基，以确保细胞和组织的持续存活条件。每次换液时需重新添加处理化合物。
   注意：换液时确保每孔保留 10 µL 培养基，以避免组织贴附于孔壁。
3. 准备 SCADs 用于以下实验：活体成像（第 3 节）以及组织收获与二维/三维免疫荧光染色（第 4 节）。

3. SCADs 的活体成像

1. 在玻璃瓶中，将 PBS 中的低熔点琼脂糖配制成 2%-3% (w/v) 的溶液，总体积不少于 30 mL，用微波炉加热至沸腾。
2. 立即将瓶子转移至 40 °C 水浴中，冷却液态琼脂糖溶液。
3. 将带有筋膜/瘢痕面朝上的 SCAD 组织转移至 35 mm 培养皿的中央。
4. 使用巴斯德移液管将 40 °C 的液态琼脂糖缓慢转移至 35 mm 培养皿中，在室温（RT）下包埋 SCAD。琼脂糖在 2 分钟内完成聚合。
5. 加入 2 mL 预热的 DMEM/F12 完全培养基（不含酚红指示剂）。
6. 使用配备适当孵育系统的共聚焦或双光子显微镜，在 37 °C、21% (v/v) 氧气、5% (v/v) CO₂ 和 95% 湿度条件下，对第 0 天的 SCAD 进行长达 48 小时的活细胞延时成像 。

4. 组织采集与二维/三维免疫荧光染色

1. 在相应时间点用无菌 PBS 更换培养基，洗涤组织。
2. 使用无菌镊子，将单个 SCAD 轻柔转移至含有 500 µL 2% 多聚甲醛的 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 下固定组织过夜。
3. 用 PBS 洗涤组织三次，随后进行 2D/3D 免疫荧光染色。
4. 3D 免疫荧光染色
   1. 将组织置于含有 500 µL 添加 0.2% 明胶、0.5% Triton-X100 和 0.01% 硫柳汞（PBSGT）的 1.5 mL 微量离心管中，在室温下孵育 24 小时，以通透组织。 
   2. 根据生产商说明书配制适量的一抗溶液，将 SCAD 组织在 150 µL PBSGT 溶液中于室温孵育 24 小时。
      注意：若生产商未提供免疫荧光染色的最佳抗体浓度，需在对照组织上使用不同浓度（例如 1:50、1:200、1:500、1:1000）进行预实验性抗体滴定。
   3. 用 PBS 轻柔洗涤 SCAD 三次，以去除未结合的一抗。
   4. 在室温下用 1:1000 稀释的相应 Alexa Fluor 二抗 PBS 溶液孵育组织过夜。
   5. 用 PBS 轻柔洗涤组织三次，每次 30 分钟，以去除过量未结合的二抗。
   6. 将组织转移至 35 mm 玻底培养皿中，用于共聚焦或双光子成像。
      注意：使用水浸物镜时，将 SCAD 包埋于 2% 低熔点琼脂糖中以固定组织，防止成像过程中发生漂移。
5. 2D 免疫荧光染色
   1. 将组织转移至冷冻模具中，并轻轻加入最佳切割温度（OCT）包埋剂，完全浸没组织。
   2. 轻柔调整组织方向，确保无气泡产生，以获得横切面或纵切面。
   3. 将模具置于干冰上 20–30 分钟，并将组织块在 -80 °C 下孵育过夜。
   4. 设置切片刀温度为 -25 °C，样本块温度为 -17 °C。使用冷冻切片机制备 6 µm 冷冻切片，将切片转移至防脱玻片上，并将玻片存放在 -20 °C 冰箱中。
   5. 用 PBS 将玻片漂洗三次，随后在含 0.05% Tween 的 PBS（PBST）中加入 5% 牛血清白蛋白（BSA, w/v），将玻片在其中孵育 1 小时。 
   6. 将适量一抗加入 150 μL PGST 中，在 4 °C 下孵育过夜
      注意：若生产商未提供免疫荧光染色的最佳抗体浓度，需在对照切片上使用不同浓度（例如 1:50、1:200、1:500、1:1000）进行预实验性抗体滴定。
   7. 用 PBS 轻柔洗涤切片三次，以去除未结合的一抗。
   8. 在室温下用 1:1000 稀释的相应 Alexa Fluor 二抗 PBS 溶液孵育组织 2 小时。
   9. 用 PBS 轻柔洗涤切片三次，每次 5 分钟，以去除过量未结合的二抗。
   10. 使用含 DAPI 的封片剂封片，并在室温避光条件下干燥玻片。
   11. 使用荧光显微镜对切片进行成像。

结果

SCAD 的生成可分为三个关键步骤：从 P0-P1 小鼠身上采集背部皮肤，制备全层活检穿孔，随后在 96 孔板中对单个 SCAD 进行最多 5 天的培养。作为一种检测手段，该实验还可用于分析瘢痕形成的时空特征。空间分析利用组织的二维和三维免疫标记，研究发育中瘢痕组织内细胞和基质成分的空间定位。时空研究则可通过组织固有的或外源性的荧光蛋白，结合相应的三维延时成像技术，实现对这些体外（ex-situ）瘢痕的可视化观察。

该实验的关键步骤包括：仔细制备全层活检穿孔以建立实验体系，确保存在筋膜“凝胶”层，并将组织完全浸没且倒置培养（表皮朝向96孔板底部）。这种方法可形成均一的瘢痕，实现相关成纤维细胞群体一致的迁移动态，以及在SCAD模型中观察到的皮肤收缩现象（图1A）。SCAD实验具有高度灵活性，可在瘢痕发育全过程中的任意阶段收获组织。例如，若实验目的是研究瘢痕形成的早期动态变化，可仅对SCAD培养第1天或第2天（D1或D2）进行空间或时空分析（图1B）...

讨论

目前已开发出多种模型以研究损伤后瘢痕的形成。尽管该领域已取得诸多进展，但其确切机制仍不明确。与以往技术相比，SCAD模型包含了所有细胞类型和皮肤各层，从而保留了天然皮肤的复杂性^18,19。该方法能够生成对理解驱动瘢痕形成分子机制至关重要的基础数据集。该检测方法设计简洁、简约，但仍可产生对理解成纤维细胞迁移、细胞外基质沉积以及表皮/肌肉收缩至关重要的基础性和功能性读数^13,14。该方法相较于 in vivo实验体系相对简单，且可最大限度减少样本间的偏差。此外，该检测方法可轻松与高通量分析流程相结合，从而能够相对容易地将大量抑制剂或激活剂（如化学化合物、中和抗体、siRNA或病毒学方法）应用于少量切除组织，以研究其对瘢痕形成抑制或促进的作用。关于该ex vivo瘢痕模型的局限性，该检测方法无法用于研究以下方面：a）非驻留免疫细胞群在瘢痕形成中的表型或动态变化；b）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 吐温 20，非离子型去污剂	Biorad Laboratories	1610781
牛血清白蛋白，冷乙醇分级	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12，含 HEPES，无酚红-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS，无钙，无镁	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 冷冻切片机	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus 黏附载玻片	Fisher scientific	J1800AMNZ	黏附载玻片
胎牛血清，经鉴定，热灭活，欧盟批准，南美来源-500 mL	LIFE Technologies	10500064
含 DAPI 的 Fluoromount-G 封片剂	Life Technologies	00 4959 52	含 DAPI 的封片介质
带导向针的弯头精细镊子（不锈钢镊子），125 mm 长	Fisher Scientific	12381369
猪皮来源明胶	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX 补充剂-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS，含钙，含镁，无酚红-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi 气体孵育系统，用于 CO2 和 O2	Ibidi	11922
Ibidi 加热系统	Ibidi	10915
Leica SP8 直立显微镜 - 多光子激发 680–1300 nm	Leica		配备 25 倍水浸物镜（HC IRAPO L 25x/1.00 W）和可调谐激光器（Spectra-Physics，InSight DS + Single）
非必需氨基酸	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG 琼脂糖，25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT 包埋基质	Carlroth	6478.1
多聚甲醛，16% W/V 水溶液，10 x 10 mL	VWR International	43368.9M
青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）	Gibco	15140122
Stiefel 2 mm 组织活检打孔器	Stiefel	270130
直型锐/锐解剖剪，11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
硫柳汞 Bioxtra，97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 直立显微镜	Zeiss