使用 SCAD 检测法可视化瘢痕形成过程 - 一种 原位之外 皮肤瘢痕形成检测

摘要

本方案描述了一种称为“培养皿中的瘢痕样组织”（SCAD）的皮肤-筋膜外植体的制备方法。该模型可实现对瘢痕形成过程中单个成纤维细胞的前所未有的可视化观察。

摘要

哺乳动物对深层组织伤口的总体反应是通过瘢痕形成和组织收缩来实现的，这一过程由特化的筋膜成纤维细胞介导。尽管瘢痕形成及伤口愈合障碍具有重要的临床意义，但由于缺乏能够在皮肤伤口等复杂环境中直接可视化成纤维细胞行为与动态的相关检测方法，目前对筋膜成纤维细胞在伤口愈合过程中动态变化的理解仍十分有限。本文介绍了一种生成 原位之外 使用 SCAD 或治疗皮肤疤痕 "培养皿中的类SCar组织" 模拟皮肤伤口的复杂环境。在该实验中，切除2 mm全层皮肤，将其倒置培养于培养基中5天，在此期间瘢痕和皮肤挛缩均匀形成。该方法结合成纤维细胞谱系特异性的转基因小鼠模型，可实现对整个伤口修复过程中单个成纤维细胞谱系的可视化观察。总体而言，该方案有助于 帮助研究人员理解伤口修复的基本过程和机制， 直接探究调节剂对伤口愈合结果的影响。

引言

伤口愈合是一个修复受损伤口的过程。无脊椎动物的组织损伤会导致部分或完全再生。相比之下，哺乳动物对深层损伤的反应是形成瘢痕，这一过程通过致密的基质纤维栓快速封闭伤口，以最小化受损区域，但同时也会永久性地改变受伤部位^1,2,3。哺乳动物的大面积皮肤烧伤或深部开放性伤口会导致病理性表型，如增生性瘢痕或瘢痕疙瘩^4,5。这些过度形成的瘢痕给临床和全球医疗系统带来了巨大负担。仅在美国，瘢痕管理每年的费用约为100亿美元^6,7。因此，有必要开发相关方法，以更深入地理解瘢痕形成所涉及的基本过程和机制。

近年来，大量针对小鼠的研究揭示了来源于皮肤特定部位的成纤维细胞群体具有高度异质性，并表现出不同的功能潜能^8,9,10。在背部皮肤中，Rinkevich 等人（2015年）发现，一类在胚胎早期表....

方案

下述模型详细描述了SCAD检测方法的逐步建立过程，该方法在Jiang等（2020）中曾被简要提及¹³。根据国际及上巴伐利亚政府指南，在处死动物后进行SCAD样本制备。动物饲养于慕尼黑亥姆霍兹研究中心的动物设施中，房间环境保持适宜的湿度和恒定温度，并采用12小时光照循环。动物可自由摄食和饮水ad libitum。

1. SCAD 组织制备

1. 在出生后第0天或第1天（P0或P1）处死新生幼鼠。
2. 使用无菌手术刀，仔细切取至少1.5 cm × 1.5 cm的全层背部皮肤，直至露出骨骼肌层。
3. 用无菌弯头镊轻轻剥离皮肤，确保浅筋膜完整地附着于下方的肉膜肌（panniculus carnosus muscle）。
4. 用50–100 mL冷的DMEM/F-12培养基冲洗所取组织，以去除污染的血液。
5. 用Hanks'平衡盐溶液（HBSS）洗涤一次，以维持组织和细胞的活性。
6. 将皮肤倒置（浅筋膜朝上）放入盛有DMEM/F12培养基的10 cm培养皿中。
7. 使用一次性2 mm活检打孔器，切取全层圆形皮肤组织，确保浅筋膜与下方的肉膜肌保持完整，直至表皮，以制备SCAD组织。
8. 配制并分装200 µL DMEM/F12完全培养基（不含酚红）至96孔板的各....

结果

SCAD 的生成可分为三个关键步骤：从 P0-P1 小鼠身上采集背部皮肤，制备全层活检穿孔，随后在 96 孔板中对单个 SCAD 进行最多 5 天的培养。作为一种检测手段，该实验还可用于分析瘢痕形成的时空特征。空间分析利用组织的二维和三维免疫标记，研究发育中瘢痕组织内细胞和基质成分的空间定位。时空研究则可通过组织固有的或外源性的荧光蛋白，结合相应的三维延时成像技术，实现对这些体外（ex-situ）瘢痕的可视化观察。

该实验的关键步骤包括：仔细制备全层活检穿孔以建立实验体系，确保存在筋膜“凝胶”层，并将组织完全浸没且倒置培养（表皮朝向96孔板底部）。这种方法可形成均一的瘢痕，实现相关成纤维细胞群体一致的迁移动态，以及在SCAD模型中观察到的皮肤收缩现象（图1A）。SCAD实验具有高度灵活性，可在瘢痕发育全过程中的任意阶段收获组织。例如，若实验目的是研究瘢痕形成的早期动态变化，可仅对SCAD培养第1天或第2天（D1或D2）进行空间或时空分析（图1B）.......

讨论

目前已开发出多种模型以研究损伤后瘢痕的形成。尽管该领域已取得诸多进展，但其确切机制仍不明确。与以往技术相比，SCAD模型包含了所有细胞类型和皮肤各层，从而保留了天然皮肤的复杂性^18,19。该方法能够生成对理解驱动瘢痕形成分子机制至关重要的基础数据集。该检测方法设计简洁、简约，但仍可产生对理解成纤维细胞迁移、细胞外基质沉积以及表皮/肌肉收缩至关重要的基础性和功能性读数^13,14。该方法相较于 in vivo实验体系相对简单，且可最大限度减少样本间的偏差。此外，该检测方法可轻松与高通量分析流程相结合，从而能够相对容易地将大量抑制剂或激活剂（如化学化合物、中和抗体、siRNA或病毒学方法）应用于少量切除组织，以研究其对瘢痕形成抑制或促进的作用。关于该ex vivo瘢痕模型的局限性，该检测方法无法用于研究以下方面：a）非驻留免疫细胞群在瘢痕形成中的表型或动态变化；b）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 吐温 20，非离子型去污剂	Biorad Laboratories	1610781
牛血清白蛋白，冷乙醇分级	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12，含 HEPES，无酚红-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS，无钙，无镁	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 冷冻切片机	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus 黏附载玻片	Fisher scientific	J1800AMNZ	黏附载玻片
胎牛血清，经鉴定，热灭活，欧盟批准，南美来源-500 mL	LIFE Technologies	10500064
含 DAPI 的 Fluoromount-G 封片剂	Life Technologies	00 4959 52	含 DAPI 的封片介质
带导向针的弯头精细镊子（不锈钢镊子），125 mm 长	Fisher Scientific	12381369
猪皮来源明胶	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX 补充剂-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS，含钙，含镁，无酚红-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi 气体孵育系统，用于 CO2 和 O2	Ibidi	11922
Ibidi 加热系统	Ibidi	10915
Leica SP8 直立显微镜 - 多光子激发 680–1300 nm	Leica		配备 25 倍水浸物镜（HC IRAPO L 25x/1.00 W）和可调谐激光器（Spectra-Physics，InSight DS + Single）
非必需氨基酸	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG 琼脂糖，25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT 包埋基质	Carlroth	6478.1
多聚甲醛，16% W/V 水溶液，10 x 10 mL	VWR International	43368.9M
青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）	Gibco	15140122
Stiefel 2 mm 组织活检打孔器	Stiefel	270130
直型锐/锐解剖剪，11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
硫柳汞 Bioxtra，97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 直立显微镜	Zeiss