Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63808
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Institute of Regenerative Biology and Medicine, Helmholtz Zentrum München, 2School of Medicine, Klinikum Rechts der Isar, Department of Plastic and Hand Surgery, Technical University of Munich

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הדור של אקספלנט עור-פאשיה המכונה "SCar כמו רקמה בצלחת" או SCAD. מודל זה מאפשר הדמיה חסרת תקדים של פיברובלסטים בודדים במהלך היווצרות צלקות.

Abstract

התגובה הגלובלית של היונקים לאיטום פצעי רקמות עמוקים היא באמצעות היווצרות צלקות והתכווצות רקמות, המתווכת על ידי פיברובלסטים מיוחדים של החיתולית. למרות המשמעות הקלינית של היווצרות צלקות וריפוי פצעים לקוי, הבנתנו את הדינמיקה הפיברובלסטית של החיתולית בריפוי פצעים היא מעורפלת בשל היעדר מבחנים רלוונטיים המאפשרים הדמיה ישירה של כוריאוגרפיה פיברובלסטית ודינמיקה בסביבות מורכבות כגון פצעים בעור. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת צלקות עור לשעבר באמצעות SCAD או "רקמה דמוית SCar בצלחת A Dish" המחקה את הסביבה המורכבת של פצעי עור. במבחן זה, עור 2 מ"מ בעובי מלא נכרת ומתורבת הפוך במדיה במשך 5 ימים, שבמהלכם צלקות והתכווצויות עור מתפתחות באופן אחיד. מתודולוגיה זו, יחד עם מודלים של עכברים מהונדסים ספציפיים לשושלת פיברובלסטים, מאפשרת הדמיה של שושלות פיברובלסט בודדות לאורך כל תהליך תיקון הפצע. באופן כללי, פרוטוקול זה מסייע לחוקרים להבין תהליכים ומנגנונים בסיסיים של תיקון פצעים, תוך בחינה ישירה של ההשפעות של מודולטורים על תוצאות ריפוי פצעים.

Introduction

ריפוי פצעים הוא תהליך של שחזור פצעים שנפרצו. פגיעות ברקמות אצל חסרי חוליות גורמות להתחדשות חלקית או מלאה. לעומת זאת, יונקים מגיבים לפציעה עמוקה על ידי הצטלקות, תהליך המותאם לאטום פצעים במהירות עם תקעים צפופים של סיבי מטריצה הממזערים את האזור הפרוע ובמקביל מעוותים לצמיתות את האתר הפגוע 1,2,3. כוויות עור גדולות או פצעים פתוחים עמוקים ביונקים גורמים לפנוטיפים פתולוגיים כגון צלקות היפרטרופיות או קלואידיות 4,5. צלקות נשגבות אלה גורמות לעומס עצום על מערכות הבריאות הקליניות והעולמיות. בארה"ב לבדה, ניהול צלקות עולה כ-10 מיליארד דולר בשנה 6,7. לכן, פיתוח מתודולוגיות רלוונטיות נדרש כדי להבין טוב יותר את התהליכים והמנגנונים המממנים המעורבים ביצירת צלקות.

בשנים האחרונות, מגוון רחב של מחקרים בעכברים גילו אוכלוסיות פיברובלסטים הטרוגניות עם עוצמות תפקודיות מובהקות בהתבסס על מקורותיהם במקומות מסוימים בעור 8,9,10. בעור האחורי, Rinkevich et al., 2015, זיהו כי אוכלוסייה פיברובלסטית ספציפית עם ביטוי עוברי מוקדם של Engrailed-1 (En1), המכונה EPF (פיברובלסט חיובי חרוט) תורמת להצטלקות עורית עם פציעה. לעומת זאת, שושלת פיברובלסטית אחרת ללא היסטוריה של ביטוי חרוט, פיברובלסט שלילי חרוט (ENF), אינה תורמת להיווצרותצלקת 8. מיפוי גורל של שושלות En1 אלה באמצעות קווי עכברים מהונדסים מונעי Cre שנחצה לקווי עכברים פלואורסצנטיים כגון R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) מאפשר הדמיה של אוכלוסיות EPF ו- ENF.

חקר נדידת פיברובלסטים in vivo במשך מספר ימים מוגבל על ידי אילוצים אתיים וטכניים. יתר על כן, מסכי ספריית נוגדנים מורכבים, נגיפיים ומנטרלים כדי לווסת מסלולים המעורבים בהצטלקות הם מאתגרים מבחינה טכנית. בעבר נעשה שימוש במודלים של in vitro או ex vivo חסרים את היכולת לדמיין נדידת פיברובלסטים ויצירת צלקות במיקרו-סביבה אמיתית של העור, אחידות בהתפתחות צלקות, כמו גם מורכבות רקמות המחקה סביבות עור in vivo 11,12. כדי להתגבר על המגבלות הנ"ל, פיתחנו מבחן צלקות ex vivo המכונה SCAD (רקמה דמוית SCar בצלחת A)13,14. בדיקה פשוטה זו יכולה להתבצע על ידי כריתת עור בעובי מלא של 2 מ"מ המכיל את האפידרמיס, הדרמיס ואזורי החיתולית התת עוריים ושילובם במדיית DMSO בתוספת סרום למשך עד 5 ימים. צלקות המופקות מ-SCAD משכפלות באופן מהימן סימני היכר תעתיקיים ופרוטאומיים של צלקות in vivo. בנוסף, SCADs שנוצרו מקווי עכברים מהונדסים רלוונטיים (למשל, עכברי En1) שהוצלבו עם קווי עכברים פלואורסצנטיים מאפשרים הדמיה של דינמיקת נדידת פיברובלסטים והתפתחות צלקות ברזולוציה חסרת תקדים. יתר על כן, מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לכל יישומי תפוקה גבוהה (למשל, ספריית תרכובות, ספריית נוגדנים או סינון ויראלי)13,14. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב ליצירת SCADs ויישומי עיבוד במורד הזרם הבאים כדי לחקור את הדינמיקה התאית והמטריקסית בפיתוח צלקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המודל המוצג להלן מספק תיאור מפורט שלב אחר שלב של יצירת מבחן SCAD כמתואר בקצרה ב- Jiang et al., 202013. תכשירי דגימת SCAD בוצעו לאחר הקרבת בעלי החיים בהתאם להנחיות הבינלאומיות וממשלת בוואריה עילית. בעלי חיים שוכנו במתקן החיות של מרכז הלמהולץ במינכן. החדרים נשמרו עם לחות אופטימלית וטמפרטורה קבועה עם מחזור אור של 12 שעות. בעלי החיים סופקו עם מזון ומים ad libitum.

1. הכנת רקמת SCAD

  1. להקריב גורים שזה עתה נולדו ביום 0 או ביום 1 (P0 או P1).
  2. יש לבלום בזהירות לפחות 1.5 ס"מ על 1.5 ס"מ של עור גב גב בעובי מלא עד לשכבת שריר השלד באמצעות אזמל כירורגי סטרילי.
  3. מקלפים את העור באמצעות מלקחיים מעוקלים סטריליים, ומבטיחים כי החיתולית השטחית שלמה עם שריר panniculus carnosus הבסיסי.
  4. שטפו את הרקמה שנכרתה ב-50-100 מ"ל של מדיית DMEM/F-12 קרה כדי להסיר דם מזהם.
  5. יש לשטוף פעם אחת עם תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס כדי לשמור על כדאיות הרקמות והתאים.
  6. מניחים את העור הפוך (חיתולית שטחית למעלה) בצלחת פטרי 10 ס"מ המכילה מדיית DMEM/F12.
  7. באמצעות אגרוף ביופסיה חד פעמי של 2 מ"מ, הוציאו את הבלו על פיסות עור עגולות בעובי מלא, מה שמבטיח כי החיתולית השטחית תהיה שלמה עם שרירי panniculus carnosus הבסיסיים עד האפידרמיס ליצירת רקמות SCAD.
  8. הכן ומלא 200 μL של DMEM / F12 (ללא פנול אדום) מדיה מלאה - DMEM / F12 מדיה בתוספת 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM חומצות אמינו לא חיוניות, ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין לתוך בארות בודדות של צלחת 96 בארות.
  9. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים בזהירות ומטביעים באופן מלא רקמת SCAD בודדת במהופך (החיתולית פונה כלפי מעלה) לבארות של צלחת בת 96 בארות.
  10. העבר את הצלחת לחממה של תרבית תאים המתוחזקת בתנאים סטנדרטיים (37 °C , 21%(v/v) חמצן, 5% (v/v) C02 ו-95% לחות).

2. SCAD - תרבית רקמה

  1. תרבות SCADs בחממה עד 5 ימים.
  2. ביום 2 וביום 4 של התרבית, החליפו את המדיה ב-200 מיקרול של מדיה מלאה טרייה של DMEM/F12 שחוממה מראש כדי להבטיח את המשך הכדאיות של התאים והרקמות. החלף תרכובות טיפול במהלך כל שינוי במדיה.
    הערה: הקפד להשאיר 10 μL של מדיה בבאר כדי למנוע רקמות להידבק לבארות.
  3. הכינו SCADs לניסויים הבאים: הדמיה חיה (סעיף 3), וקצירת רקמות וצביעת אימונופלואורסצנציה דו-ממדית/תלת-ממדית (סעיף 4).

3. הדמיה חיה של SCADs

  1. הכינו מינימום של 30 מ"ל של 2%-3% (w/v) תמיסת אגרוז נמסה נמוכה ב-PBS בבקבוק זכוכית על ידי חימום במיקרוגל עד להרתחה.
  2. מעבירים מיד את הבקבוק ומקררים את תמיסת האגרוס הנוזלי באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס.
  3. העבירו את רקמת ה-SCAD עם החיתולית/צלקת הפונה כלפי מעלה אל מרכז המנה בקוטר 35 מ"מ.
  4. הטמיעו את ה-SCAD בטמפרטורת החדר (RT) על ידי העברה איטית של אגרוז נוזלי בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס על המנה בקוטר 35 מ"מ באמצעות פיפטה של פסטר. אגרוז מתפלמר תוך 2 דקות.
  5. הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה של DMEM/F12 שחוממה מראש (ללא מחוון אדום פנול).
  6. רכוש תמונות בהילוך מהיר של יום 0 SCADs עד 48 שעות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או רב-פוטון המצויד במערכת דגירה מתאימה המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס, 21% (v/v) חמצן, 5% (v/v) C02 ו-95% לחות.

4. קצירת רקמות וצביעת אימונופלואורסצנציה דו-ממדית/תלת-ממדית

  1. לשטוף את הרקמות בנקודות זמן רלוונטיות על ידי החלפת המדיה עם PBS סטרילי.
  2. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים בזהירות SCADs בודדים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילים 500 μL של 2% paraformaldehyde כדי לתקן את הרקמות במהלך הלילה ב 4 °C (74 °F).
  3. שטפו את הרקמות שלוש פעמים עם PBS והמשיכו עם צביעה אימונופלואורסצנטית דו-ממדית/תלת-ממדית.
  4. צביעה אימונופלואורסצנטית תלת-ממדית
    1. חלחלו לרקמות על ידי דגירה בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של PBS בתוספת 0.2% ג'לטין, 0.5% Triton-X100 ו-0.01% תימרוסל (PBSGT) ב-RT למשך 24 שעות.
    2. להכין כמות נאותה של נוגדנים ראשוניים בהתאם להוראות היצרן ולדגום רקמות SCAD ב 150 μL של תמיסת PBSGT במשך 24 שעות ב RT.
      הערה: אם ריכוז הנוגדנים האופטימלי לפלואורסצנציה חיסונית אינו מדווח על ידי היצרן, יש לבצע טיטרציה קודמת של נוגדנים על רקמות בקרה באמצעות ריכוזים משתנים (למשל, 1:50, 1:200, 1:500, 1:500, 1:1000).
    3. שטפו בעדינות את ה-SCADs שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הראשוני הלא מאוגד.
    4. דגירה רקמה עם 1:1000 נוגדנים משניים רלוונטיים של Alexa Fluor ב- PBS לילה ב- RT.
    5. לשטוף בעדינות את הרקמה במשך 30 דקות ב- PBS שלוש פעמים כדי להסיר עודף נוגדנים משניים לא מאוגדים.
    6. מעבירים את הרקמה לצלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ להדמיה קונפוקלית או מולטי-פוטון.
      הערה: בעת שימוש במטרות טבילה במים, הטמיעו את ה-SCADs באגרוז של נקודת התכה נמוכה ב-2% כדי לשתק את הרקמה כדי למנוע היסחפות במהלך רכישת התמונה
  5. צביעה דו-ממדית של אימונופלואורסצנציה
    1. מעבירים את הרקמה לתבנית קריו וממלאים בעדינות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) כדי לטבול לחלוטין את הרקמה.
    2. כוונון בעדינות את כיוון הרקמה, מה שמבטיח היעדר בועות אוויר כדי להשיג חתך רוחב או חתך אנכי.
    3. הניחו את התבנית על קרח יבש למשך 20-30 דקות ודגרו את הבלוק בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    4. הגדר את טמפרטורת הלהב ל -25 °C (75 °F) ואת טמפרטורת בלוק הדגימה ל -17 °C (74 °F). הכינו מקטע קריו של 6 מיקרומטר באמצעות cryostat, העבירו את החלקים לשקופית הידבקות ואחסנו את השקופיות במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
    5. יש לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS ולדגום את השקופיות ב-5% אלבומין בסרום בקר (BSA) w/v ב-PBST (PBS בתוספת 0.05% Tween) למשך שעה אחת.
    6. מוסיפים כמות מתאימה של נוגדן ראשוני ל-150μl PGST, ודוגרים למשך הלילה ב-4 °C (4 °F)
      הערה: אם היצרן לא מדווח על כך שהיצרן מדווח על ריכוז הנוגדנים האופטימלי לפלואורסצנציה חיסונית, יש לבצע טיטרציה קודמת של נוגדנים במקטעי בקרה באמצעות ריכוזים משתנים (למשל, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
    7. שטפו בעדינות את החלקים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הראשוני הלא מאוגד.
    8. דגירה של רקמות עם 1:1000 נוגדנים משניים רלוונטיים של Alexa Fluor ב- PBS לילה ב- RT למשך שעתיים.
    9. לשטוף בעדינות את הרקמה במשך 5 דקות ב- PBS שלוש פעמים כדי להסיר עודף נוגדנים משניים לא מאוגדים.
    10. הרכיבו את המגלשות עם מדיום הרכבה המכיל DAPI ויבשו את המגלשות בחושך ב-RT.
    11. דמיינו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להפריד את הדור של SCADs לשלושה שלבים חיוניים: קצירת עור בחזרה מעכברי P0-P1, יצירת אגרופי ביופסיה בעובי מלא, והתרבות שלאחר מכן של סקאדים בודדים עד 5 ימים בלוחות של 96 בארות. כקריאה, ניתן ליישם עוד יותר את הבדיקה הזו כדי לנתח את ההיבטים המרחביים והזמניים של הצטלקות. הניתוח המרחבי משתמש בתיוג חיסוני דו-ממדי ותלת-ממדי של רקמות כדי לחקור לוקליזציה מרחבית של רכיבי תאים ומטריצות בתוך רקמת צלקת מתפתחת. מחקרים Spatiotemporal מאפשרים הדמיה של צלקות ex-situ אלה באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים פנימיים או חיצוניים של רקמות שניתן לדמיין באמצעות שיטות הדמיה רלוונטיות של קיטועי זמן תלת-ממדיים.

השלבים המרכזיים במבחן זה הם הגדרת הניסוי על ידי יצירה קפדנית של אגרופי ביופסיה בעובי מלא, הבטחת נוכחות של שכבת "ג'לי" פשית, ועיבוד הרקמה השקועה במלואה במהופך (אפידרמיס הפונה לתחתית הלוחות בני 96 הבאר). זה מאפשר התפתחות של צלקות אחידות, דינמיקת נדידה דומה של אוכלוסיות פיברובלסטים רלוונטיות והתכווצות העור על פני SCADs (איור 1A). הרבגוניות של בדיקת SCAD מאפשרת קצירת הרקמה על פני כל הספקטרום של התפתחות הצלקת. לדוגמה, אם מטרת הניסוי היא לחקור את הדינמיקה המוקדמת של הצטלקות, ניתוח מרחבי וספטיוטמפוראלי יכול להיות מוגבל ל-D1 או D2 של תרבות SCAD (איור 1B).

תמונות מייצגות של SCADs בשדה בהיר בהרכבה מלאה ביום 0 וביום 5 מוצגות באיור 2A ובאיור 2A', בהתאמה. לצורך ניתוח דו-ממדי, חיוני להטמיע את ה-SCADs ב-OCT בכיוון מאונך נטול בועות אוויר נטולות בועות אוויר כדי להבטיח שלמות של רקמה לאחר החתך. מקטעי רקמות אלה יכולים להיות נתונים גם לניתוח היסטולוגי (לדוגמה, צביעת טריכרום של מאסון - איור 2B,2B') או צביעת אימונופלואורסצנציה (איור 2C,2C') על הקריו-אקטציות מ-En1 Cre,R26mTmG עכבר דורמיס גב; EPF בירוק ו-ENF באדום מההתחלה (איור 2D) וצלקת בשלב מאוחר (איור 2D).

הדמיה תלת-ממדית ותלת-ממדית של צלקות בהילוך מהיר דורשת זיהוי אותות פלואורסצנטיים עמוק בתוך הרקמה (400-800 מיקרומטר). עירור באורכי גל כמעט אינפרה-אדומים באמצעות עירור של שני פוטונים מאפשר מדידות כאלה ללא צורך בפינוי רקמות, מתודולוגיה המשמשת בדרך כלל בהדמיה תלת-ממדית כדי להפוך את הרקמה לשקופה על ידי מזעור פיזור האור וספיגתו 15,16,17. השתמשנו במיקרוסקופ מולטי-פוטון זקוף המצויד במטרה לטבילת מים פי 25 בשילוב עם לייזר הניתן לכוונון. רקמות היו נתונות לצביעה חיסונית תלת-ממדית באמצעות בדיקות רלוונטיות. עבור הדמיה תלת-ממדית, הרקמה הוטמעה בתמיסת אגרוז נמסה נמוכה ב-2% כדי לשתק או למנוע סחף ברקמה (איור 3A) ומעליו PBSGT כדי להתאים למקדם השבירה הנדרש למטרת טבילת המים. תמונה מייצגת באיור 3B ובאיור 3B' מראה לוקליזציה בלעדית של חלבון N-Cadherin (פלואור ורוד/מג'נטה-אלקסה 647) באתר הצלקת של יום 5 SCAD מעור אחורי של En1 Cre,R26mTmG; EPF בירוק, ו- ENF באדום. עבור הדמיה תלת-ממדית של קיטועי זמן, נעשה שינוי קל בהגדרה הנ"ל על ידי הטבעת הרקמה בתמיסת אגרוז נמסה נמוכה של 2% ומעליה מדיית DMEM/F12 ללא מחוון אדום פנול במקום PBS. כדי להבטיח תנאים מתאימים לרקמת SCAD "חיה" במהלך ההדמיה, נוסף תא דגירה מתאים כך שכל הפנוטיפים יירשמו כהלכה במהלך ההדמיה (איור 3C). תמונות מייצגות של נחילי פיברובלסטים מוקדמים מוצגות באיור 3D, איור 3D' ואיור 3D'' במהלך 12 השעות הראשונות/ השלבים המוקדמים של התפתחות הצלקת.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה סכמטית של בדיקת SCAD. (A) עור אחורי מהיום שלאחר הלידה 0 / day 1 גורים נכרתים, מה שמבטיח את שלמות הרקמה המכילה את השכבות העוריות הבאות: אפידרמיס (E), דרמיס פפילרי ורטיקולרי (PD ו- RD), ושכבת Fascia (F) ואחריה אגרופים ביופסיה של 2 מ"מ כדי להשיג SCADs של יום 0. (B) לאחר מכן ניתן לתרבת SCADs למשך עד 5 ימים עם שלב קציר/קיבוע רקמות אופציונלי לסירוגין המבוסס על אופי הניסויים הבודדים (חיצים מנוקדים) עם שלב שינוי מדיה של תרבית ביום 2 וביום 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: צביעה דו-ממדית של אימונופלואורסצנציה. קריאות דו-ממדיות מייצגות לחקר צלקות בשלבים מוקדמים ומאוחרים באמצעות (A ו-A') תמונת שדה בהירה של הרכבה מלאה ביום 0 (A) וביום 5 (A'). (B ו-B') צביעת הטריכרום של מאסון על מקטעי רקמות אנכיים כדי לחשוף חתימות של התכווצות רקמות-הצטלקות-רקמה והצטברות של ECM בליבת הצלקת (משולש צהוב מלא) ביום 0 (B) וביום 5 (B'). (C ו-C') ניתוח אימונופלואורסצנציה של SCADs של יום 0 (C) ויום 5 (C') שנוצרו מעור אחורי En1 Cre,R26mTmG. EPFs מוצגים בירוק, ENF באדום, ו- DAPI בכחול מהצלקת המוקדמת (D) והשלב המאוחר (D' ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הגדרה סכמטית וקריאות מייצגות של SCADs עבור אנליזה תלת-ממדית של spatio ו-spatiotemporal. (A) ייצוג סכמטי של הטבעת ה-SCADs בג'ל אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה ב-2% מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף ו-(B) תמונה מייצגת של יום מוכתם אימונופלואורסצנטי תלת-ממדי 5 SCAD שנוצר מ-En1 Cre,R26mTmG דרמיס עכבר ומוכתם במערכת החיסון בנוגדן N-Cadherin (Magenta). EPFs מוצגים בירוק ו- ENFs מוצגים באדום. (C) ייצוג סכמטי מערך SCAD הדמיה תלת-ממדי המצויד בתא דגירה: 37 °C, 21% (v/v) חמצן, 5% (v/v) C02 ו-95% לחות. (D) תוצאות מייצגות של הדמיה חיה המציגות אירועים מוקדמים של התקדמות נחילי פיברובלסטים (עיגול מקווקו לבן) ב-12 השעות הראשונות של היום 0 וביום 1 שלב SCAD. (E) ייצוג גרפי של מסלולים תאיים חד-תאיים במעקב של פיברובלסטים בודדים ב-D, D' ו-D''. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר דגמים כבר פותחו כדי להבין היווצרות צלקות לאחר פציעה. אמנם נעשו הרבה התקדמויות בעניין זה, אך המנגנונים בפועל עדיין אינם ברורים. בניגוד לטכניקה הקודמת, מודל SCAD משלב את כל סוגי התאים והשכבות העוריות, ובכך שומר על המורכבות של עור מקומי18,19. מתודולוגיה זו מסוגלת לייצר מערכי נתונים בסיסיים החשובים להבנת מנגנונים מולקולריים המניעים היווצרות צלקות. הבדיקה מתוכננת באופן פשוט, מינימליסטי, אך מסוגל לייצר קריאות בסיסיות ותפקודיות החיוניות להבנת נדידת פיברובלסטים, תצהיר ECM, כיווץ אפידרמלי/שריר13,14. הוא יחסית פחות מורכב מהגדרות in vivo, וניתן למזער סטיות ביחס למדגם. יתר על כן, ניתן להצמיד בקלות בדיקה זו עם צינורות ניתוח תפוקה גבוהים. כאשר כל הספקטרום או הספריות של מעכבים או מפעילים כגון תרכובות כימיות, נוגדנים מנטרלים, siRNA או מתודולוגיות ויראליות המפחיתות או מקדמות הצטלקות יכולים להיות מיושמים בקלות יחסית לכמויות מינימליות של רקמות שנכרתו. לגבי המגבלה של מודל צלקת ex vivo זה, לא ניתן ליישם בדיקה זו כדי לחקור היבטים פנוטיפיים או דינמיים של א) נחילים חיסוניים שאינם תושבים בהתפתחות צלקת ב) כלי דם ג) התבגרות צלקת מכיוון שרקמה אינה בת קיימא מעבר ל-5 ימים לאחר הפציעה.

לפני שהביופסיה תנקב בכריתה, חשוב שלא יישארו שאריות דם ברקמה מכיוון שהיא עלולה להפריע להליכי הניסוי. אנו ממליצים לשטוף את הרקמה יותר מפעם אחת עם HBSS במידת הצורך, כדי לוודא שכל שאריות הדם מהרקמה מסולקות. כמו כן, שינוי מדיה בימים חלופיים צריך להתבצע בזהירות מיוחדת, כמו, שכבות עור ואפידרמיס עשוי להיפרד בשל גודל קטן של הרקמה. לכן, חובה לתרגל את ההליך כראוי מראש לפני תחילת הניסויים בפועל. כדי למנוע הפרדה חוזרת ונשנית של שכבות הרקמה, אנו מציעים כי במהלך שינוי המדיה, 10 μl של מדיה שיורית ניתן לשמור לפני החלפת עם מדיה טרייה על מנת לייצב את הרקמה ולמזער את השינוי במתח הפנים על הרקמה הנגרם על ידי המדיה שנוספו לבאר.

עבור צינורות ניתוח דו-ממדיים, אנו ממליצים לאזן את הרקמה עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית נוזלית בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות לפני הרכבת הרקמה בבלוק. זה מונע הפרדת רקמות עקב היווצרות גבישי קרח במהלך החתך. יש לשנות כראוי את צינורות ההדמיה התלת-ממדיים/תלת-ממדיים עם קיטועי זמן בהתאם לשיטת המיקרוסקופ הזמינה. עבור מיקרוסקופ זקוף (עם או בלי מטרת טבילת מים), הטבעת הרקמה באגרוז או שימוש בסופרגלו מונעת את התזוזה הפיזית של הרקמה במהלך ההדמיה. מטרות טבילה במים מאפשרות הדמיה תלת-ממדית/תלת-ממדית של קיטועי זמן באמצעות PBS או מדיה חסרת צבע (ללא פנול אדום). עבור מיקרוסקופ הפוך, ניתן היה להניח את הרקמה על תחתית זכוכית/ צלחת הדמיה ולשתק אותה באמצעות טיפה של אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה ומעליה מדיה מתאימה כדי להבטיח את הכדאיות במהלך ההדמיה החיה. בשני האופנים, ניתן להשתמש במערכת דגירה תואמת כדי להבטיח את הטמפרטורה, הלחות ואספקת הגז הנכונים במהלך ההדמיה.

לסיכום, מודל SCAD מאפשר זיהוי ואפיון של רמזים מולקולריים חדשניים ומסלולים מכניסטיים המעורבים בריפוי פצעים של יונקים 13,14. הפרוטוקול מספק תיאור מפורט של יצירת SCADs ויישומים וניתוחים פוטנציאליים במורד הזרם כדי לספק תובנות לגבי התפתחות צלקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל הכותבים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לכל המחברים השותפים של Jiang et al. 2020 על תרומתם לפיתוח מתודולוגיית SCAD13. אנו מודים לד"ר סטפן דיצל ולמתקן הליבה של הדמיה ביולוגית באוניברסיטת לודוויג-מקסימילנס על הגישה למערכת המולטי-פוטון. י.ר. נתמך על ידי קרן אלזה-קרנר-פרסניוס-ספניוס (2016_A21), מענק איחוד המועצה האירופית למחקר (ERC-CoG 819933) וקרן LEO (LF-OC-21-000835).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent Biorad Laboratories 1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract Sigma A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL LIFE Technologies 11039021
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Fisher scientific J1800AMNZ Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL LIFE Technologies  10500064
Fluoromount-G with DAPI Life Technologies 00 4959 52 Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length Fisher Scientific 12381369
Gelatin from porcine skin Sigma G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL LIFE Technologies 35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL LIFE Technologies 14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 Ibidi 11922
Ibidi Heating system Ibidi 10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm Leica Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids LIFE Technologies 11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g Biozym /Lonza 859081
OCT Embedding Matrix Carlroth 6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL VWR International 43368.9M
Pen-Strep Gibco 15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm Stiefel 270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm Fisher Scientific 15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101% Sigma-Aldrich T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
  2. desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
  3. Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
  4. Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
  5. Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
  6. Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
  7. Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
  8. Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
  9. Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
  10. Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
  11. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  12. Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
  13. Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
  14. Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
  15. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
  16. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  17. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  18. Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  19. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).

Tags

ביולוגיה גיליון 182
הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור <em>לשעבר-situ</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramesh, P., Ye, H., Dasgupta, B.,… More

Ramesh, P., Ye, H., Dasgupta, B., Machens, H. G., Rinkevich, Y. Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay. J. Vis. Exp. (182), e63808, doi:10.3791/63808 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter