Summary
Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.
Abstract
Door muggen overgedragen virussen (MBV's), die infectieuze pathogenen zijn voor gewervelde dieren, worden door veel muggensoorten verspreid en vormen een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid. Eenmaal ingenomen, moeten de virussen de midgut-barrière van de mug overwinnen om de hemolymfe te bereiken, van waaruit ze zich mogelijk naar de speekselklieren kunnen verspreiden. Wanneer een mug bijt, worden deze virussen verspreid naar nieuwe gewervelde gastheren. Op dezelfde manier kan de mug verschillende virussen oppikken. Over het algemeen kan slechts een klein deel van de virussen via de darm de speekselklieren binnendringen. De transmissie-efficiëntie van deze virussen naar de klieren wordt beïnvloed door de twee fysieke barrières die worden aangetroffen in verschillende muggensoorten: midgutbarrières en speekselklierbarrières. Dit protocol presenteert een methode voor virusdetectie in speekselklieren van Aedes aegypti's na orale voeding en intrathoracale injectie-infectie. Bovendien kan het bepalen of de darmen en/of speekselklieren de virale verspreiding belemmeren, helpen bij de risicobeoordelingen van MBV's die door Aedes aegypti worden overgedragen.
Introduction
Door muggen overgedragen virussen (MBV's), een heterogene groep RNA-virussen, kunnen blijven bestaan in muggenvectoren en zich vervolgens verspreiden naar gewervelde gastheren1. De klinisch belangrijke MBV's zijn grotendeels verdeeld in vier virusfamilies, namelijk Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae en Peribunyavividae 2,3. In de afgelopen decennia zijn deze virussen over de hele wereld gemeld en veroorzaken ze problemen met de volksgezondheid. Als een van de meest bekende MBV's is het Dengue-virus (DENV) de afgelopen 20 jaar het meest voorkomende opkomende of opnieuw opkomende arbovirus geworden in meer dan 100 landen4. Sinds de ontdekking van het Zika-virus (ZIKV) in het binnenland hebben bijna alle tropische en subtropische landen en gebieden van het continent menselijke ZIKV-infecties gemeld5. Om het risico op virusoverdracht te beoordelen, hebben talrijke studies in de afgelopen jaren zich gericht op de competentie van muggenvectoren voor deze virussen 6,7. Als gevolg hiervan is het van cruciaal belang om door vectoren overgedragen ziekten effectief te voorkomen en te beheersen.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), een van de gemakkelijkst te kweken muggen in het laboratorium, is een belangrijke vector van DENV, ZIKV, Chikungunya-virus (CHIKV) en gelekoortsvirus (YFV)8. Lange tijd werd Ae. aegypti alleen gevonden op het Afrikaanse continent en in Zuidoost-Azië, maar in de afgelopen jaren heeft het bijna alle continenten gekoloniseerd9. Bovendien is de wereldwijde overvloed aan Ae. aegypti voortdurend gegroeid, met een geschatte toename van 20% tegen het einde van de eeuw10. Van 2004 tot 2009 was er in China een duidelijke toename van de Ae. aegypti-vectorcompetentie voor DENV als gevolg van hogere dag-tot-dagtemperaturen11. De status van Ae. aegypti als de pathogene vector is aanzienlijk gestegen in China. Om deze uitdagingen aan te pakken, is het daarom noodzakelijk om de vectorcompetentie van Ae. aegypti's om virussen over te brengen te onderzoeken.
Als een hematofaag geleedpotige doorboort de vrouwelijke mug de huid van een gewervelde gastheer en voedt zich met het bloed. Muggen krijgen af en toe virussen van met virussen geïnfecteerde gastheren en brengen de virussen vervolgens over naar een nieuwe gastheer. Om de vectorcompetentie te bepalen, krijgen muggen een kunstmatig bloedmeel met arbovirussen toegediend via een voedingssysteem in de laboratoriumomgeving12. Individuele muggen worden enkele dagen na infectie gescheiden in hoofden, lichamen en speekselafscheidingen. Om virusinfectie, verspreiding en transmissiesnelheden te meten, zijn virustiters gedetecteerd door kwantitatieve reverse-transcription PCR (qRT-PCR) of plaque-assay. Niet alle muggen ontwikkelen echter midgut-infecties en het vermogen om een virus over te brengen naar de volgende gastheer na bloedvoeding. Het is gekoppeld aan de fysiologische barrières van muggen, die voorkomen dat ziekteverwekkers het lichaam binnendringen en een vitale rol spelen in hun aangeboren immuniteit13. De midgutbarrières, met name de midgut-infectiebarrière (MIB) en midgut-ontsnappingsbarrière (MEB), beïnvloeden of het virus de vector systemisch kan infecteren en de efficiëntie waarmee het zich verspreidt. Het belemmert de analyse van de infectie van andere weefsels, zoals speekselklieren die ook speekselklierinfectie vertonen en aan barrières ontsnappen13,14. Om de infectie van midguts en speekselklieren in de vector beter te karakteriseren, wordt hierin een gedetailleerd protocol voor orale voeding en intrathoracale inenting van arbovirus in Ae. aegypti gepresenteerd. Dit protocol kan worden toegepast op aanvullende arbovirusinfecties in verschillende muggenvectoren, zoals DENV- en ZIKV-infectie in Aedes spp., en kan een praktische procedure blijken te zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van virussen en muggen
- Bereiding van virussen
OPMERKING: Alle processen werden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) laboratorium. Het niveau van bioveiligheidscontaiment dat wordt gebruikt, moet worden bepaald door de risicobeoordeling van het pathogeen en de regelgeving die specifiek is voor landen en regio's. Het proces moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.- Ent 1 x 106 C6/36 cellen in een T75-kweekkolf. Vul de kolf met 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S).
OPMERKING: Leibovitz's L-15 medium (L15) of Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) kan ook worden gebruikt om C6/36 cellen te onderhouden. - Houd de cellen 's nachts in 5% CO2 bij 28 °C en verwijder het celsupernatant de volgende dag wanneer de cellen voor 80% -90% confluent zijn.
- Voeg 1 ml virusverdunning (Multiplicity of Infection (MOI) = 0,01) toe aan de kolf en incubeer de cellen gedurende 1 uur in 5% CO2 bij 28 °C. Ebinur Lake virus (EBIV)15, een door muggen overgedragen orthobunyavirus, werd gebruikt als modelvirus voor dit protocol.
- Verwijder het supernatant en was de cellen 3x met 5 ml PBS. Vul de kolf met 15 ml nieuw RPMI-medium met 2% FBS. Houd de kolf in 5% CO2 bij 28 °C.
- Verzamel het supernatant bevattende virus wanneer de vereiste virale titer is bereikt (na bijna 5 dagen, afhankelijk van het gebruikte virus). Voor EBIV was deze titerwaarde 107 plaquevormende eenheden (PFU)/ml. Verpak ze in afzonderlijke opslagbuizen met schroefdop van 2 ml en bewaar de buizen met 0,5-1 ml virus bij -80 °C.
- Ent 1 x 106 C6/36 cellen in een T75-kweekkolf. Vul de kolf met 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S).
- Bepaling van virale titer
OPMERKING: Bepaal de virale titer via de plaquetests16. BHK-21 werd gebruikt om de virale titer van EBIV te bepalen, vanwege het duidelijke cytopathische effect (CPE) dat werd waargenomen in geïnfecteerde cellen.- Ent 1 x 105 BHK-21 cellen in elke put van 24-putplaten. Vul elk putje met 1 ml DMEM-medium met 10% FBS en 1% P/S. Houd de cellen een nacht in 5% CO2 bij 37 °C.
- Maak zes (10-6) opeenvolgende 10-voudige verdunningen van virusbevattend supernatant met vers DMEM-medium dat 10% FBS en 1% P / S bevat.
- Voeg 100 μL virusverdunningsmiddel toe aan elk putje van 24-putplaten met de monolaag BHK-21. Gooi het virusverdunningsmiddel na incubatie gedurende 1 uur weg in 5% CO2 bij 37 °C. Voeg 500 μL DMEM met 1,5% methylcellulose toe aan elk putje.
- Kweekcellen in 5% CO2 bij 37 °C gedurende 48 uur (de schijnbare CPE werd na 48 uur gevonden voor EBIV). Bevestig de cellen 's nachts met 750 μL van 3,7% formaldehyde.
- Bevlek ze met 200 μL van 2% kristalviolet gedurende 15 minuten. Tel het aantal plaques om de virale titer te berekenen.
- Muggen kweken in het lab
OPMERKING: Achterste muggen in een geleedpotige containment niveau 1 (ACL-1) laboratorium.- Voor de bereiding van het gedechloreerde water, vul een emmer van 20 L met kraanwater en laat het 7-8 dagen zonder licht staan. Dek het deksel niet af.
- Bewaar eieren en larven van Ae. aegypti in een muggenkamer met de volgende omstandigheden: 28 ± 1 °C met een licht/donker cyclus van 12 uur en een relatieve vochtigheid van 75% ± 5%.
- Bewaar bijna 1.000 larven in een ondiepe schaal (22 cm x 15 cm x 6 cm) met gedechloreerd water nadat de eieren zijn uitgekomen. Voed ze met bijna 1/8 theelepel muizenvoerpoeder. Ververs het voedsel dagelijks en ververs het water om de 2 dagen.
- Zodra de larven na 5-7 dagen verpoppen, gebruik dan een eenmalige druppelaar om poppen over te brengen naar een plastic beker (7 oz) gevuld met gedechloreerd water.
- Plaats vijf kopjes met poppen (ongeveer 200 per kopje) in één gaaskooi (30 cm x 30 cm x 30 cm) en bewaar de kooien in de insectenincubator onder dezelfde omstandigheden als in stap 1.3.2.
- Plaats een kleine spons met een 8% (m / w) glucose-oplossing op elke gaaskooi om volwassen muggen te voeden. Na volwassen opkomst haal je de kopjes eruit zonder poppen. Houd de gaaskooien met ongeveer 1.000 volwassen muggen per kooi in dezelfde insectenincubator.
2. Voorbereiding op orale infectie
- Bereid vrouwelijke muggen voor op orale infectie. Gebruik de muggenabsorberende machine om 5-8 dagen oude muggen te verzamelen. Verdoof ze bij -20 °C gedurende 1 minuut en controleer of de muggen duizelig zijn. Zo niet, verdoof ze dan nog een minuut bij -20 °C.
- Giet ze snel in de plastic bekers (24 oz) met ongeveer 200 muggen (vrouwelijk en mannelijk) per kopje. Bedek elke beker snel met een goed gesneden klamboe, gevolgd door een deksel met een gat (ongeveer 6 cm in diameter) in het midden.
- Verhonger de muggen gedurende 24 uur vóór de orale infectie en bereid infectieus bloedmeel als volgt.
- Haal in een bioveiligheidskast onder BSL-2-omstandigheden de virusvoorraad uit de vriezer van -80 °C en ontdooi ze op ijs. Verdun de virusvoorraad tot een concentratie van 2 x 106 PFU/ml met RPMI 1640 medium met 10% FBS en 1% P/S. Meng de virusverdunning met een gelijk volume gedefibreerd paardenbloed.
OPMERKING: De processen werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast in een ACL-2-laboratorium.
3. Voer een orale infectie uit
OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd in een ACL-2 laboratorium. Het proces moet worden uitgevoerd in het handschoenenkastje om te voorkomen dat muggen ontsnappen.
- Voer kunstmatige voeding uit door het kunstmatige muggenvoersysteem gedurende 1 uur te gebruiken.
- Snijd de collageenmembranen op de juiste grootte (ongeveer 5 cm in diameter), bevestig ze met o-ringen aan de reservoirs en voeg vervolgens het virus-bloedmengsel (ongeveer 3 ml) toe aan de reservoirs. Gebruik plastic pluggen om reservoirs af te dichten en lekken te voorkomen.
OPMERKING: Deze stappen werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. - Doe de plastic bekers (24 oz) met muggen in het handschoenenkastje. Schroef de verzegelde reservoirs op de FU1 Feeder en plaats één reservoir op één beker en schakel vervolgens de voedingseenheid in. Voer de muggen gedurende 1 uur
- Snijd de collageenmembranen op de juiste grootte (ongeveer 5 cm in diameter), bevestig ze met o-ringen aan de reservoirs en voeg vervolgens het virus-bloedmengsel (ongeveer 3 ml) toe aan de reservoirs. Gebruik plastic pluggen om reservoirs af te dichten en lekken te voorkomen.
- Verdoof muggen door CO2 gedurende enkele seconden totdat ze flauwvallen. Kortom, plaats het kooldioxidespuitpistool in het midden van het netgaas door het gat op de beker met muggen, open de waarde en laat enorme hoeveelheden koolstofdioxide uitspuwen om muggen te verdoven.
- Giet ze in een petrischaaltje op ijs en dek het deksel snel af. Pluk de opgezwollen vrouwelijke muggen eruit met een tang. Om te identificeren, hebben mannetjes gevederde antennes en vrouwtjes hebben gewone antennes. Breng ze over in nieuwe plastic bekers met 50 vrouwelijke muggen per kopje.
OPMERKING: De opgezwollen vrouwelijke muggen werden geplukt om consistentie te behouden, omdat de voedingshoeveelheid de virale inhoud beïnvloedt. - Wikkel de beker in met een gesneden klamboegaas en bedek deze vervolgens met een deksel met een gat in het midden. Snijd de spons in een klein stukje en leg het op de beker.
- Voeg 8% glucose-oplossing toe aan de spons met behulp van een plastic wegwerpdruppel. Bewaar de bekers met vrouwelijke muggen in de couveuse bij 27 °C bij 80% luchtvochtigheid gedurende 10 dagen. Vervang elke 72 uur een nieuwe met glucose verzadigde spons.
4. Voorbereiding voor intrathoracale inenting
- Bereid de microinjectienaalden als volgt voor. Gebruik een PUL-1000 om micro-injectienaalden te maken (figuur 1A) met de volgende parameters in het naaldtrekkerprogramma: warmte-index = 450, kracht (g) = 110, afstand (mm) = 1,00 en vertraging (s) = 0.
- Snijd de punt van een getrokken naald met een pincet onder de ontleedmicroscoop bij een vergroting van 16x (figuur 1B). Maak de punt niet te groot, anders kan het de muggen schaden.
- Bereid vrouwelijke muggen voor zoals in stap 2.1.
OPMERKING: De volgende processen werden uitgevoerd in een ACL-2 laboratorium. - Bereid de infectieuze virusverdunning als volgt voor:
- Haal de virusvoorraad uit de -80 °C vriezer en ontdooi ze op ijs. Verdun het virus tot een virusverdunning van 100 nL die 100-500 PFU-virus bevat met RPMI 1640-medium met 10% FBS en 1% P/S. Houd de virusverdunning op ijs.
- Vul de naald met minerale olie door een steriele wegwerpspuit. Bevestig de naald in de injector volgens de instructies op de machine.
- Steek de naald in een buis met de verdunning van het infectieuze virus. Breek de punt van de naald niet. Druk op de knop FILL om de naald te vullen met een virusoplossing. Het uiteindelijke volume van de virusoplossing in de naald is ongeveer 4,0 μl. Zodra de naald is gevuld met het virus, moet u ervoor zorgen dat u deze niet aanraakt en beschadigt.
OPMERKING: De stappen werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
5. Voer virale injectie uit onder een ontleedmicroscoop
OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd in een ACL-2 laboratorium.
- Verdoof muggen bij -20 °C gedurende 1 min. Giet ze in een petrischaaltje op ijs en dek het deksel snel af.
- Pluk bijna 50 vrouwelijke muggen uit met een pincet en leg ze op de ijsplaat. Plaats de ijsplaat onder de injector en steek de naald in de borstholte van de mug onder de ontleedmicroscoop (figuur 1C).
- Stel het injectievolume in op 100 nL en op 50 nL/s. Druk op de INJECT-knop om de virusoplossing in de mug te laten stromen. Als een succesvolle injectie optreedt, zal de buik enigszins uitpuilen.
- Doe de geïnfecteerde mug in een nieuwe plastic beker (24 oz) op ijs. Wanneer het aantal geïnfecteerde muggen voldoende is, wikkelt u de beker in met een gesneden klamboegaas en bedekt u deze vervolgens met het deksel.
- Bewaar de beker met besmettelijke muggen in de couveuse bij 27 °C bij 80% luchtvochtigheid gedurende 10 dagen. Voer de muggen zoals in stap 3.5.
6. Verwerking van de geïnfecteerde vrouwelijke muggen
OPMERKING: Drie verschillende weefsels / organen werden ontleed van elke vrouwelijke mug: de darm voor het berekenen van de virusinfectiesnelheid (VIR), het hoofd voor het berekenen van de virusverspreidingssnelheid (VDR) en speeksel voor het berekenen van de virusoverdrachtssnelheid (VTR). VIR werd gedefinieerd als het aantal muggen met viruspositieve darmen. VDR werd gedefinieerd als het aantal muggen met viruspositieve koppen gedeeld door het aantal muggen met viruspositieve darmen door 100. VTR werd gedefinieerd als het aantal muggen met viruspositief speeksel gedeeld door het aantal muggen met viruspositieve darmen met 100.
- Verzameling van speeksel van de geïnfecteerde vrouwelijke muggen
OPMERKING: De processen moeten worden uitgevoerd in een ACL-2-laboratorium.- Verdoof de geïnfecteerde vrouwelijke muggen door verdoving van koolstofdioxide zoals in stap 3.2. Giet ze in een petrischaaltje op ijs en sluit het deksel snel.
- Leg 10 μL pipetpunten gevuld met dompelolie naast elkaar op de rubberen modder.
- Pluk vrouwelijke muggen uit met een pincet en leg ze op een ijsplaat. Verwijder hun poten en vleugels met een pincet. Plaats het monddeel van één mug op elke pipetpunt.
- Verzamel het speeksel zoals uitgescheiden in de olie door de muggen voor de volgende 45-60 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de pipetpunten in buisjes van 1,5 ml met 200 μL virusverdunningsmedium (RPMI 1640-medium met 10% FBS en 1% P/S). Centrifugeer ze bij 5.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om speeksel in buisjes te verdrijven. Bewaar deze buizen bij -80 °C voor latere bepaling van de transmissiesnelheden.
- Ontleed de geïnfecteerde vrouwelijke muggen
OPMERKING: De processen moeten worden uitgevoerd in een ACL-2-laboratorium.- Gebruik een pincet om de hoofden van de vrouwelijke muggen af te snijden na het verzamelen van speeksel. Plaats elke kop in een afzonderlijke buis met 200 μL RPMI 1640-medium.
- Pak de thorax met een pincet, dan het voorlaatste deel van de buik met een ander pincet en trek het eruit. De darm wordt eruit getrokken. Reinig de uitgetrokken darm van verdwaald weefsel en organen.
- Was de darm met PBS en plaats elke darm in een afzonderlijke buis met 200 μL RPMI 1640 medium. Bewaar deze buisjes bij -80 °C voor latere bepaling van de infectiesnelheid en verspreidingssnelheid van het virus.
7. Data-analyse
- RNA-extractie
- Vermaal de weefsels in stukken met een lage temperatuur weefselhomogenisatorslijpmachine ingesteld op de volgende parameters: bedrijfsfrequentie = 60 Hz, bedrijfstijd = 15 s, pauzetijd = 10 s, cycli = 2 en insteltemperatuur = 4,0 °C.
- Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 12.000 x g . Extraheer het totale RNA van elk monster door een geautomatiseerd nucleïnezuurextractiesysteem volgens instrumentinstructies.
- qRT-PCR uitvoeren
- Gebruik de RT-PCR-kit in één stap om de virale RNA-kopieën te kwantificeren met behulp van een kwantitatief PCR-instrument17. Gebruik de volgende primers voor de detectie van EBIV S segment F: ATGGCATCACCTGGGAAAG en R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Stel het reactieproces in als: fase 1: 42 °C gedurende 5 min, 95 °C gedurende 10 s; fase 2: 40 cycli van 95 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 20 s.
- Bepaal de laagste virusdosis voor de infectie in de cellen door de seriële 10-voudige verdunningen die op cellen zijn ingeënt. Gebruik de BHK-21-cellen om de laagste virusdosis EBIV te bepalen, met verdunningen tot 10-7 zoals beschreven in stap 1.2.
- Bereken de Ct-waarde van de laagste virusdosis met qRT-PCR. Gebruik de ondergrens voor EBIV-positief door qRT-PCR als < 35. Gebruik de volgende vergelijking om de kopieën van EBIV in elke steekproef te berekenen:
y = -4,0312x + 3,384 [x = log (de kopieën van EBIV), y = Ct-waarde, R2 = 0,9905] - Bereken de infectiegraad, verspreidingssnelheid en transmissiesnelheid als volgt:
Infectiegraad (%) = 100 x (het aantal viruspositieve muggendarmen / het aantal totale muggen)
Verspreidingssnelheid (%) = 100 x (het aantal viruspositieve muggenkoppen / het aantal viruspositieve muggendarmen)
Overdrachtssnelheid (%) = 100 x (het aantal viruspositieve muggenspeeksel / het aantal viruspositieve muggendarmen) - Analyseer de verschillen in continue variabelen en verschillen in muggeninfectiepercentages, verspreidingssnelheden en transmissiesnelheden door de niet-parametrische Kruskal-Wallis-analyse te gebruiken voor meerdere vergelijkingen en fisher's exacte test waar van toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de EBIV-verdeling in de geïnfecteerde muggen te onderzoeken via kunstmatige bloedvoeding (de virale eindtiter was 6,4 x 106 PFU / ml) en intrathoracale injectie (de virale dosis was 340 PFU), werden virale RNA's in speeksel, hoofden en ingewanden van de muggen 10 dagen na infectie (dpi) bepaald.
Voor Ae. aegypti was de virustiter van EBIV in de ingewanden, hoofden en speeksel van de intrathoracaal geënte vrouwelijke muggen veel hoger dan die van de oraal geïnfecteerde vrouwelijke muggen (figuur 2A-C). Infectiegraad en verspreidingspercentage voor de intrathoracaal geënte vrouwelijke muggen was 100%, maar voor de oraal geïnfecteerde vrouwelijke muggen was respectievelijk 70% en 38,1% (figuur 2D, E). De overdrachtssnelheid voor de intrathoracaal geënte vrouwelijke muggen bereikte tot 90%, maar voor de oraal geïnfecteerde vrouwelijke muggen was slechts 4,8%. Het gaf aan dat de darm van Ae. aegypti een sterk remmend effect had voor virusoverdracht.
Figuur 1: Schema van micropipetpunt en intrathoracale injectie . (A) Getrokken micropipetpunt voordat de punt wordt gebroken. (B) Goed voorbereide micropipetpunt geschikt voor intrathoracale inenting. (C) Schema van intrathoracale injectie voor de muggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vectorcompetentie van volwassen muggen door orale voeding en intrathoracale inenting. De geïnfecteerde vrouwelijke muggen werden gedurende 10 dagen bij 28 °C geïncubeerd. P-waarde ≤ 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. De niet-parametrische Kruskal-Wallis-analyse werd gebruikt voor meerdere vergelijkingen en fisher's exacte test waar van toepassing. Dit cijfer is aangepast uit onderzoek van Xia et al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze methode was om een uitgebreide risicobeoordeling van één door muggen overgedragen virus te bieden door vectorcompetentie te evalueren door orale voeding en intrathoracale inenting.
In het orale voedingsexperiment moeten opgezwollen muggen worden uitgezocht en overgebracht naar een nieuwe container, wat een ernstig risico vormt voor de operators. De reden hiervoor is dat elke mug, inclusief niet-geïnfecteerde muggen, een bron van infectie kan zijn19. Bijgevolg moeten muggen eerst worden verdoofd, zoals gespecificeerd in het protocol, en vervolgens moeten de vervolgstappen worden uitgevoerd. Het is belangrijk op te merken dat het selecteren van opgezwollen muggen en het overbrengen ervan moet worden uitgevoerd in een verzegeld handschoenenkastje. Houd het handschoenenkastje gesloten tijdens het proces, tenzij er geen vrij bewegende muggen in de doos zijn.
In het infectie-experiment is het beter voor twee individuen om samen te werken, en nadat de twee mensen hebben bevestigd dat er niet tegelijkertijd ontsnappende muggen zijn, kunnen ze het handschoenenkastje openen om te voorkomen dat geïnfecteerde muggen ontsnappen. Als er een ontsnapping plaatsvindt, moeten die muggen worden gedood of heroverd. Het wordt niet aanbevolen om geïnfecteerde muggen met blote handen te doden. Het infectierisico van operators kan worden verminderd door vacuümaspiratoren of ander geschikt gereedschap te gebruiken (bijv. Tang, penselen, gehandschoende handen). Desinfecteer na het experiment de binnenkant van het handschoenenkastje en het oppervlak van de werkbank met een conventioneel ontsmettingsmiddel.
Het grootste deel van het onderzoek naar de competentie van muggenvectoren voor door muggen overgedragen virussen heeft zich uitsluitend gericht op orale infectie20,21. Voor orale infectie moeten virussen verschillende weefselbarrières overwinnen die verband houden met het middendarm en de speekselklieren om te worden vrijgegeven in speeksel14. Het effect van de midgut klier en speekselklier op de vectoriële capaciteit van muggen werd niet aangetoond in dit experiment. Wanneer orale voeding en intrathoracale injectie worden gecombineerd, kunnen de verschillende weefselbarrières grondig worden geëvalueerd. Volgens de resultaten van deze procedure speelt de darm van Ae. aegypti een dominante rol in de vectorcompetentie voor het virus en is de speekselklierbarrière mogelijk niet aanwezig (figuur 2). Hiervoor is ons protocol gunstig om de aanwezigheid van midgut- of speekselklierbarrières voor arbovirusseninfectie te bevestigen.
Volgens de methodologie werd alleen viraal RNA geïdentificeerd in de monsters. Andere onderzoeken, zoals het zien van het virion met een transmissie-elektronenmicroscoop, het bevestigen van de infectie met behulp van plaque-assays of het detecteren van viraal eiwit met een immunofluorescentietest, zijn nodig om de infectieuze virussen in de verschillende monsters te bevestigen. Deze methode kan worden gewijzigd en gebruikt om extra virussen van belang in te enten in een breed scala van muggenvectoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al.
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
