Summary
Oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu içeren bu metodoloji, midgut ve / veya tükürük bezi bariyerlerinin arbovirüs enfeksiyonu üzerindeki etkisini etkili bir şekilde değerlendirebilir.
Abstract
Omurgalılar için bulaşıcı patojenler olan sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV'ler), birçok sivrisinek türü tarafından yayılmakta ve halk sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Yutulduktan sonra, virüsler potansiyel olarak tükürük bezlerine yayılabilecekleri hemolenfe ulaşmak için sivrisinek midgut bariyerinin üstesinden gelmelidir. Bir sivrisinek ısırdığında, bu virüsler yeni omurgalı konakçılara yayılır. Benzer şekilde, sivrisinek farklı virüsleri alabilir. Genel olarak, virüslerin sadece küçük bir kısmı tükürük bezlerine bağırsak yoluyla girebilir. Bu virüslerin bezlere bulaşma etkinliği, farklı sivrisinek türlerinde bulunan iki fiziksel bariyerden etkilenir: midgut bariyerleri ve tükürük bezleri bariyerleri. Bu protokol, Aedes aegypti'nin tükürük bezlerinde oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon enfeksiyonunu takiben virüs tespiti için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bağırsakların ve / veya tükürük bezlerinin viral yayılmayı engelleyip engellemediğini belirlemek, Aedes aegypti tarafından iletilen MBV'lerin risk değerlendirmelerine yardımcı olabilir.
Introduction
Heterojen bir RNA virüsü grubu olan sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV'ler), sivrisinek vektörlerinde kalabilir ve daha sonra omurgalı konakçılara yayılabilir1. Klinik olarak önemli MBV'ler büyük ölçüde Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae ve Peribunyavividae 2,3 olmak üzere dört virüs ailesine dağılmıştır. Son yıllarda, bu virüsler tüm dünyada rapor edilmiş ve halk sağlığı sorunlarına neden olmuştur. En iyi bilinen MBV'lerden biri olan Dang virüsü (DENV), son 20 yılda 100'den fazla ülkede en yaygın olarak ortaya çıkan veya yeniden ortaya çıkan arbovirüs haline gelmiştir4. İç kesimlerde Zika virüsünün (ZIKV) keşfinden bu yana, kıtanın hemen hemen tüm tropikal ve subtropikal ülkeleri ve bölgeleri insan ZIKV enfeksiyonlarını bildirmiştir5. Virüs bulaşma riskini değerlendirmek için son yıllarda yapılan çok sayıda çalışma, bu virüsler için sivrisinek vektör yeterliliğine odaklanmıştır 6,7. Sonuç olarak, vektör kaynaklı hastalıkları etkili bir şekilde önlemek ve kontrol etmek kritik öneme sahiptir.
Laboratuvarda en kolay yetiştirilen sivrisineklerden biri olan Aedes aegypti (Ae. aegypti), DENV, ZIKV, Chikungunya virüsü (CHIKV) ve sarı humma virüsünün (YFV)8 önemli bir vektörüdür. Uzun bir süre boyunca, Ae. aegypti sadece Afrika kıtasında ve Güneydoğu Asya'da bulundu, ancak son yıllarda neredeyse tüm kıtaları sömürgeleştirdi9. Dahası, Ae. aegypti'nin küresel bolluğu sürekli olarak büyümekte ve yüzyılın sonuna kadar tahminen% 20'lik bir artış göstermektedir10. Çin'de 2004'ten 2009'a kadar, daha yüksek günlük sıcaklıklar nedeniyle DENV için Ae ae. aegypti vektör yeterliliğinde belirgin bir artış oldu11. Ae. aegypti'nin patojenik vektör olarak statüsü Çin'de önemli ölçüde artmıştır. Sonuç olarak, bu zorlukları ele almak için, Ae. aegypti'nin virüsleri iletme vektör yeterliliğini araştırmak gerekir.
Bir hematofagus eklembacaklı olarak, dişi sivrisinek omurgalı bir konağın derisini deler ve kanla beslenir. Sivrisinekler zaman zaman virüs bulaşmış konakçılardan virüs alır ve daha sonra virüsleri yeni bir konakçıya aktarır. Bu nedenle, vektör yeterliliğini belirlemek için, sivrisinekler laboratuvar ortamında bir besleme sistemi aracılığıyla arbovirüsler içeren yapay bir kan unu ile beslenir12. Bireysel sivrisinekler, enfeksiyondan birkaç gün sonra kafalara, vücutlara ve tükürük salgılarına ayrılır. Virüs enfeksiyonunu, yayılımını ve bulaşma oranlarını ölçmek için, virüs titreleri kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) veya plak testi ile tespit edilmiştir. Bununla birlikte, tüm sivrisinekler midgut enfeksiyonları ve kan beslemeyi takiben bir virüsü bir sonraki konakçıya aktarma kapasitesi geliştirmez. Patojenlerin vücuda nüfuz etmesini önleyen ve doğuştan gelen bağışıklıklarında hayati bir rol oynayan sivrisineklerin fizyolojik bariyerleri ile bağlantılıdır13. Midgut bariyerleri, özellikle midgut enfeksiyonu bariyeri (MIB) ve midgut kaçış bariyeri (MEB), virüsün vektörü sistemik olarak enfekte edip edemeyeceğini ve yayıldığı etkinliği etkiler. Tükürük bezi enfeksiyonu ve kaçış bariyerleri de sergileyen tükürük bezleri gibi diğer dokuların enfeksiyonlarının analizini engeller13,14. Vektördeki midgutların ve tükürük bezlerinin enfeksiyonunu daha iyi karakterize etmek için, Ae'de arbovirüsün oral beslenmesi ve intratorasik aşılaması için ayrıntılı bir protokol. aegypti burada sunulmuştur. Bu protokol, Aedes spp.'deki DENV ve ZIKV enfeksiyonu gibi çeşitli sivrisinek vektörlerinde ek arbovirüs enfeksiyonlarına uygulanabilir ve uygulanabilir bir prosedür olduğu kanıtlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Virüs ve sivrisineklerin hazırlanması
- Virüslerin hazırlanması
NOT: Tüm süreçler biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Kullanılan biyogüvenlik kontaminasyonu seviyesi, patojenin risk değerlendirmesi ve ülkelere ve bölgelere özgü düzenlemeler tarafından belirlenmelidir. İşlem bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.- 1 x 106 C6/36 hücrelerini bir T75 kültür şişesine aşılayın. Şişeyi,% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) içeren 10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı ile doldurun.
NOT: Leibovitz'in L-15 besiyeri (L15) veya Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) de C6/36 hücrelerini korumak için kullanılabilir. - Hücreleri gece boyunca 28 ° C'de% 5 CO2'de tutun ve hücreler% 80 -% 90 birleştiğinde ertesi gün hücre süpernatantını çıkarın.
- Şişeye 1 mL virüs seyreltmesi (Multiplicity of Infection (MOI) = 0.01) ekleyin ve hücreleri 28 ° C'de% 5 CO2'de 1 saat boyunca inkübe edin. Sivrisinek kaynaklı bir ortobunya virüsü olan Ebinur Lake virüsü (EBIV)15, bu protokol için model virüs olarak kullanılmıştır.
- Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 5 mL PBS ile 3x yıkayın. Şişeyi% 2 FBS ile 15 mL yeni RPMI ortamı ile doldurun. Şişeyi 28 °C'de %5 CO2'de tutun.
- Gerekli viral titreye ulaşıldığında süpernatant içeren virüsü toplayın (kullanılan virüse bağlı olarak yaklaşık 5 gün sonra). EBIV için bu titre değeri 107 plak oluşturan birim (PFU) / mL idi. Bunları ayrı ayrı 2 mL vidalı kapaklı depolama tüplerine alt paketleyin ve 0,5-1 mL virüs içeren tüpleri -80 ° C'de saklayın.
- 1 x 106 C6/36 hücrelerini bir T75 kültür şişesine aşılayın. Şişeyi,% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) içeren 10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı ile doldurun.
- Viral titre tayini
NOT: Plak tahlilleri yoluyla viral titreyi belirleyin16. BHK-21, enfekte hücrelerde gözlenen bariz sitopatik etki (CPE) nedeniyle EBIV'in viral titresini belirlemek için kullanıldı.- 1 x 105 BHK-21 hücrelerini 24 delikli plakaların her bir kuyucuğuna aşılayın. Her bir kuyucuğu% 10 FBS ve% 1 P / S içeren 1 mL DMEM ortamı ile doldurun. hücreleri gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2'de tutun.
- %10 FBS ve %1 P/S içeren taze DMEM ortamı ile altı (10-6) ardışık 10 kat virüs içeren süpernatant seyreltmesi yapın.
- Tek katmanlı BHK-21'i içeren 24 delikli plakaların her bir kuyucuğuna 100 μL virüs seyreltici ekleyin. 37 ° C'de% 5 CO2'de 1 saat boyunca inkübasyondan sonra virüs seyrelticiyi atın. Her bir kuyucuğa% 1.5 metilselüloz içeren 500 μL DMEM ekleyin.
- 48 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2'de kültür hücreleri (görünür CPE, EBIV için 48 saat sonra bulundu). Hücreleri gece boyunca 750 μL% 3.7 formaldehit ile sabitleyin.
- Onları 15 dakika boyunca 200 μL% 2 kristal menekşe ile lekeleyin. Viral titreyi hesaplamak için plak sayısını sayın.
- Laboratuvarda sivrisinek ıslahı
NOT: Bir eklembacaklı muhafaza seviyesi 1 (ACL-1) laboratuvarında arka sivrisinekler.- Klorsuz suyun hazırlanması için, 20 L'lik bir kovayı musluk suyuyla doldurun ve ışıksız 7-8 gün bekletin. Kapağı kapatmayın.
- Aşağıdaki koşullara sahip bir sivrisinek odasında yumurta ve Ae ae. aegypti larvalarını saklayın: 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ve% 75 ±% 5 bağıl nem ile 28 ± 1 ° C.
- Yumurtadan çıktıktan sonra yaklaşık 1.000 larvayı klorsuz su içeren sığ bir kapta (22 cm x 15 cm x 6 cm) saklayın. Onları yaklaşık 1/8 çay kaşığı fare yem maddesi tozu ile besleyin. Yiyecekleri günlük olarak yenileyin ve suyu her 2 günde bir değiştirin.
- Larvalar 5-7 gün sonra yavrulaştıktan sonra, pupaları klorsuz suyla dolu plastik bir kaba (7 oz) aktarmak için bir kerelik bir damlalık kullanın.
- Pupa içeren beş bardağı (fincan başına yaklaşık 200) bir ağ kafesine (30 cm x 30 cm x 30 cm) koyun ve kafesleri böcek inkübatöründe adım 1.3.2'deki gibi aynı koşullarda tutun.
- Yetişkin sivrisinekleri beslemek için her bir ağ kafesine% 8 (m / w) glikoz çözeltisi içeren küçük bir sünger koyun. Yetişkin ortaya çıktıktan sonra, bardakları pupasız çıkarın. Ağ kafeslerini, kafes başına yaklaşık 1.000 yetişkin sivrisinek ile aynı böcek inkübatöründe tutun.
2. Oral enfeksiyon için hazırlık
- Dişi sivrisinekleri oral enfeksiyon için hazırlayın. 5-8 günlük sivrisinekleri toplamak için sivrisinek emici makineyi kullanın. Onları -20 ° C'de 1 dakika boyunca uyuşturun ve sivrisineklerin başının dönmüş olup olmadığını kontrol edin. Değilse, -20 ° C'de bir dakika daha anestezi yapın.
- Bunları hızlı bir şekilde plastik bardaklara (24 oz) fincan başına yaklaşık 200 sivrisinek (dişi ve erkek) dökün. Her bardağı iyi kesilmiş bir cibinlik ile hızlı bir şekilde örtün, ardından ortasında bir delik (yaklaşık 6 cm çapında) olan bir kapak izleyin.
- Oral enfeksiyondan önce sivrisinekleri 24 saat aç bırakın ve aşağıdaki gibi bulaşıcı kan unu hazırlayın.
- BSL-2 koşulları altındaki bir biyogüvenlik kabininde, virüs stokunu -80 ° C dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözün. Virüs stoğunu% 10 FBS ve% 1 P / S içeren RPMI 1640 ortamı ile 2 x 106 PFU / mL konsantrasyonuna seyreltin.
NOT: İşlemler bir ACL-2 laboratuvarındaki bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmiştir.
3. Oral enfeksiyon gerçekleştirin
NOT: Tüm adımlar bir ACL-2 laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. İşlem, sivrisineklerin kaçmasını önlemek için torpido gözünde yapılmalıdır.
- Yapay sivrisinek besleme sistemini 1 saat boyunca kullanarak yapay besleme yapın.
- Kollajen membranlarını uygun boyutta (yaklaşık 5 cm çapında) kesin, o-ringlerle rezervuarlara sabitleyin, ardından virüs-kan karışımını (yaklaşık 3 mL) rezervuarlara ekleyin. Rezervuarları kapatmak ve sızıntıları önlemek için plastik tapalar kullanın.
NOT: Bu adımlar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmiştir. - Sivrisinek içeren plastik bardakları (24 oz) torpido gözüne koyun. Sızdırmaz rezervuarları FU1 Besleyiciye vidalayın ve bir hazneyi bir kaba koyun, ardından güç ünitesini açın. Sivrisinekleri 1 saat besleyin
- Kollajen membranlarını uygun boyutta (yaklaşık 5 cm çapında) kesin, o-ringlerle rezervuarlara sabitleyin, ardından virüs-kan karışımını (yaklaşık 3 mL) rezervuarlara ekleyin. Rezervuarları kapatmak ve sızıntıları önlemek için plastik tapalar kullanın.
- Sivrisinekleri bayılıncaya kadar birkaç saniye boyunca CO2 ile uyuşturun. Kısacası, karbondioksit püskürtme tabancasını ağ ağının ortasına sivrisinek içeren fincan üzerindeki delikten yerleştirin, değeri açın ve sivrisinekleri uyuşturmak için büyük miktarda karbondioksitin dışarı atılmasına izin verin.
- Onları buzun üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına dökün ve kapağı hızlıca örtün. Forseps ile engorged dişi sivrisinekleri seçin. Tanımlamak için, erkeklerin tüylü antenleri vardır ve dişilerin düz antenleri vardır. Onları fincan başına 50 dişi sivrisinek ile yeni plastik kaplara aktarın.
NOT: Beslenme miktarı viral içeriği etkilediği için tutarlılığı korumak için engorged dişi sivrisinekler seçilmiştir. - Bardağı kesilmiş bir cibinlik ağı ile sarın ve ardından ortasında bir delik bulunan bir kapakla örtün. Süngeri küçük bir parçaya bölün ve bardağa koyun.
- Plastik tek kullanımlık bir damlalık kullanarak sünger üzerine% 8 glikoz çözeltisi ekleyin. Dişi sivrisinek içeren bardakları inkübatörde 27 °C'de 10 gün boyunca% 80 nemde tutun. Her 72 saatte bir yeni bir glikoza doymuş sünger değiştirin.
4. İntratorasik aşılama için hazırlık
- Mikroenjeksiyon iğnelerini aşağıdaki gibi hazırlayın. İğne çektirme programında aşağıdaki parametrelerle mikroenjeksiyon iğneleri yapmak için bir PUL-1000 kullanın (Şekil 1A): Isı indeksi = 450, kuvvet (g) = 110, mesafe (mm) = 1.00 ve gecikme (s) = 0.
- Çekilen bir iğnenin ucunu diseksiyon mikroskobunun altında cımbızla 16x büyütmede kesin (Şekil 1B). Ucu çok büyük yapmayın, aksi takdirde sivrisineklere zarar verebilir.
- Adım 2.1'deki gibi dişi sivrisinekleri hazırlayın.
NOT: Aşağıdaki işlemler bir ACL-2 laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. - Enfeksiyöz virüs seyreltmesini aşağıdaki gibi hazırlayın:
- Virüs stoğunu -80 °C dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözün. Virüsü, %10 FBS ve %1 P/S içeren RPMI 1640 ortamı ile 100-500 PFU virüsü içeren 100 nL'lik bir virüs seyreltmesine seyreltin.
- İğneyi tek kullanımlık steril bir şırıngadan mineral yağ ile doldurun. Makinedeki talimatları izleyerek iğneyi enjektöre takın.
- İğneyi bulaşıcı virüs seyreltmesini içeren bir tüpe yerleştirin. İğnenin ucunu kırmayın. İğneyi virüs çözeltisiyle doldurmak için FILL düğmesine basın. İğnedeki virüs çözeltisinin son hacmi yaklaşık 4.0 μL'dir. İğne virüsle doldurulduktan sonra, dokunmamaya ve zarar vermemeye dikkat edin.
NOT: Adımlar bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmiştir.
5. Diseksiyon mikroskobu altında viral enjeksiyon yapın
NOT: Tüm adımlar bir ACL-2 laboratuvarında gerçekleştirilmiştir.
- Sivrisinekleri -20 ° C'de 1 dakika boyunca uyuşturun. Onları buzun üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına dökün ve kapağı hızlıca örtün.
- Cımbızla yaklaşık 50 dişi sivrisinek seçin ve buz plakasına koyun. Buz plakasını enjektörün altına yerleştirin ve iğneyi diseksiyon mikroskobunun altındaki sivrisinek göğüs boşluğuna yerleştirin (Şekil 1C).
- Enjeksiyon hacmini 100 nL'ye ayarlayın ve hızı 50 nL / s'ye ayarlayın. Virüs çözeltisinin sivrisinek içine akmasına izin vermek için INJECT düğmesine basın. Başarılı enjeksiyon gerçekleşirse, karın hafifçe şişecektir.
- Enfekte olmuş sivrisineği buzun üzerine yerleştirilmiş yeni bir plastik kaba (24 oz) koyun. Enfekte sivrisineklerin sayısı yeterli olduğunda, bardağı kesilmiş bir cibinlik ağı ile sarın ve ardından kapakla örtün.
- Enfeksiyöz sivrisinekler içeren bardağı inkübatörde 27 ° C'de 10 gün boyunca% 80 nemde tutun. Sivrisinekleri adım 3.5'teki gibi besleyin.
6. Enfekte dişi sivrisineklerin işlenmesi
NOT: Her dişi sivrisinekten üç farklı doku / organ diseke edildi: virüs enfeksiyon oranını (VIR) hesaplamak için bağırsak, virüs yayılma hızını (VDR) hesaplamak için kafa ve virüs bulaşma hızını (VTR) hesaplamak için tükürük. VIR, virüs pozitif bağırsaklara sahip sivrisineklerin sayısı olarak tanımlandı. VDR, virüs pozitif kafalı sivrisinek sayısının, virüs pozitif bağırsaklı sivrisinek sayısına 100'e bölünmesiyle tanımlandı. VTR, virüs pozitif tükürüğü olan sivrisinek sayısının, virüs pozitif bağırsaklara sahip sivrisinek sayısının 100'e bölünmesi olarak tanımlandı.
- Enfekte dişi sivrisineklerden tükürük toplanması
NOT: İşlemler bir ACL-2 laboratuvarında yapılmalıdır.- Enfekte dişi sivrisinekleri adım 3.2'de olduğu gibi karbondioksit anestezisi ile uyuşturun. Onları buzun üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına dökün ve kapağı hızla kapatın.
- Daldırma yağı ile doldurulmuş 10 μL pipet uçlarını kauçuk çamurun üzerine yan yana yerleştirin.
- Cımbızla dişi sivrisinekleri seçin ve bir buz plakasına koyun. Bacaklarını ve kanatlarını cımbızla çıkarın. Her pipet ucuna bir sivrisinek ağız kısmını yerleştirin.
- Sivrisinekler tarafından yağa salgılanan tükürüğü oda sıcaklığında sonraki 45-60 dakika boyunca toplayın.
- Pipet uçlarını 200 μL virüs seyreltici ortam (%10 FBS ve %1 P/S içeren RPMI 1640 ortamı) içeren 1,5 mL tüplere yerleştirin. Tükürüğü tüplere atmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin. İletim hızlarının daha sonra belirlenmesi için bu tüpleri -80 ° C'de saklayın.
- Enfekte dişi sivrisinekleri disseke edin
NOT: İşlemler bir ACL-2 laboratuvarında yapılmalıdır.- Tükürük toplandıktan sonra dişi sivrisineklerin kafalarını kesmek için cımbız kullanın. Her kafayı 200 μL RPMI 1640 ortamı içeren ayrı bir tüpe yerleştirin.
- Toraksı bir cımbızla tutun, sonra karın sondan bir önceki bölümünü başka bir cımbızla tutun ve dışarı çekin. Bağırsak dışarı çekilecektir. Herhangi bir başıboş doku ve organın dışarı çekilmiş bağırsağını temizleyin.
- Bağırsağı PBS ile yıkayın ve her bir bağırsağı 200 μL RPMI 1640 ortamı içeren ayrı bir tüpe yerleştirin. Virüs enfeksiyon hızının ve yayılma hızının daha sonra belirlenmesi için bu tüpleri -80 ° C'de saklayın.
7. Veri analizi
- RNA ekstraksiyonu
- Aşağıdaki parametrelere ayarlanmış düşük sıcaklıklı bir doku homojenizatörü taşlama makinesi ile dokuları parçalara ayırın: çalışma frekansı = 60 Hz, çalışma süresi = 15 s, duraklama süresi = 10 s, döngüler = 2 ve ayar sıcaklığı = 4.0 °C.
- Numuneleri 12.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Cihaz talimatlarını izleyerek otomatik nükleik asit ekstraksiyon sistemi ile her numunenin toplam RNA'sını çıkarın.
- qRT-PCR gerçekleştirme
- Kantitatif PCR cihazı17 kullanarak viral RNA kopyalarını ölçmek için tek adımlı RT-PCR kitini kullanın. EBIV S segmenti F: ATGGCATCACCTGGGAAAG ve R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA'nın tespiti için aşağıdaki primerleri kullanın. Reaksiyon prosesini şu şekilde ayarlayın: aşama 1: 5 dakika boyunca 42 °C, 10 s için 95 °C; 2. aşama: 5 s için 95 °C ve 20 s için 60 °C'lik 40 döngü.
- Hücrelere aşılanan seri 10 kat seyreltme yoluyla hücrelerdeki enfeksiyon için en düşük virüs dozunu belirleyin. EBIV'in en düşük virüs dozunu belirlemek için BHK-21 hücrelerini kullanın, adım 1.2'de açıklandığı gibi 10-7'ye kadar seyreltmeler kullanın.
- qRT-PCR ile en düşük virüs dozunun Ct değerini hesaplayın. qRT-PCR tarafından EBIV-pozitif için kesme değerini < 35 olarak kullanın. Her örneklemdeki EBIV kopyalarını hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
y = -4.0312x + 3.384 [x = log (EBIV kopyaları), y = Ct değeri, R2 = 0.9905] - Enfeksiyon hızını, yayılma hızını ve bulaşma hızını aşağıdaki gibi hesaplayın:
Enfeksiyon oranı (%) = 100 x (virüs pozitif sivrisinek bağırsaklarının sayısı / toplam sivrisinek sayısı)
Yayılma hızı (%) = 100 x (virüs pozitif sivrisinek kafalarının sayısı / virüs pozitif sivrisinek bağırsaklarının sayısı)
İletim hızı (%) = 100 x (virüs pozitif sivrisinek tükürüğü sayısı / virüs pozitif sivrisinek bağırsağı sayısı) - Sürekli değişkenlerdeki farklılıkları ve sivrisinek enfeksiyon oranları, yayılma oranları ve bulaşma oranlarındaki farklılıkları, çoklu karşılaştırmalar için parametrik olmayan Kruskal-Wallis analizini ve uygun olduğunda Fisher'ın kesin testini kullanarak analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enfekte sivrisineklerde yapay kan besleme (viral son titre 6.4 x 106 PFU/mL idi) ve intratorasik enjeksiyon (viral doz 340 PFU idi) yoluyla EBIV dağılımını incelemek için, enfeksiyondan 10 gün sonra sivrisineklerin tükürük, kafa ve bağırsaklarındaki viral RNA'lar (dpi) belirlendi.
Ae. aegypti için, intratorasik olarak aşılanmış dişi sivrisineklerin bağırsaklarındaki, kafalarındaki ve tükürüklerindeki EBIV virüs titresi, oral enfekte dişi sivrisineklerden çok daha yüksekti (Şekil 2A-C). İntratorasik olarak aşılanmış dişi sivrisinekler için enfeksiyon oranı ve yayılma oranı %100 iken, oral enfekte dişi sivrisinekler için sırasıyla %70 ve %38.1 idi (Şekil 2D, E). İntratorasik olarak aşılanmış dişi sivrisinekler için bulaşma oranı% 90'a kadar ulaşmıştır, ancak oral enfekte dişi sivrisinekler için sadece% 4.8 idi. Ae. aegypti bağırsağının virüs bulaşması için güçlü bir inhibitör etkiye sahip olduğunu gösterdi.
Şekil 1: Mikropipet ucu şeması ve intratorasik enjeksiyon . (A) Ucu kırmadan önce mikropipet ucunu çekin. (B) İntratorasik aşılama için uygun şekilde hazırlanmış mikropipet ucu. (C) Sivrisinekler için intratorasik enjeksiyon şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yetişkin sivrisineklerin oral beslenme ve intratorasik aşılama yoluyla vektör yeterliliği. Enfekte dişi sivrisinekler 10 gün boyunca 28 ° C'de inkübe edildi. P değeri 0,05 ≤ istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Parametrik olmayan Kruskal-Wallis analizi, çoklu karşılaştırmalar ve uygun olduğunda Fisher'ın kesin testi için kullanıldı. Bu rakam Xia ve ark.18 tarafından yapılan çalışmadan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemin amacı, oral beslenme ve intratorasik aşılama yoluyla vektör yeterliliğini değerlendirerek sivrisinek kaynaklı bir virüsün kapsamlı bir risk değerlendirmesini sağlamaktır.
Oral beslenme deneyinde, engorged-sivrisineklerin toplanması ve operatörler için ciddi bir risk oluşturan yeni bir kaba aktarılması gerekir. Bunun nedeni, enfekte olmamış sivrisinekler de dahil olmak üzere herhangi bir sivrisineğin bir enfeksiyon kaynağı olabileceğidir19. Sonuç olarak, protokolde belirtildiği gibi önce sivrisinekler uyuşturulmalı ve daha sonra takip adımları gerçekleştirilmelidir. Engorged sivrisineklerin seçilmesinin ve aktarılmasının kapalı bir torpido gözünde yapılması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Kutuda serbestçe hareket eden sivrisinekler olmadığı sürece işlem sırasında torpido gözünü kapalı tutun.
Enfeksiyon deneyinde, iki kişinin birlikte çalışması daha iyidir ve iki kişi aynı anda kaçan sivrisinek olmadığını doğruladıktan sonra, enfekte sivrisineklerin kaçmasını önlemek için torpido gözünü açabilirler. Bir kaçış gerçekleşirse, bu sivrisinekler öldürülmeli veya yeniden yakalanmalıdır. Enfekte sivrisinekleri çıplak elle öldürmeniz önerilmez. Operatörlerin enfeksiyon riski, vakumlu aspiratörler veya diğer uygun aletler (örneğin, forseps, boya fırçaları, eldivenli eller) kullanılarak azaltılabilir. Deneyden sonra, torpido gözünün içini ve tezgahın yüzeyini geleneksel bir dezenfektanla dezenfekte edin.
Sivrisinek tarafından taşınan virüsler için sivrisinek vektör yeterliliği ile ilgili araştırmaların çoğunluğu sadece oral enfeksiyona odaklanmıştır20,21. Oral enfeksiyon için, virüslerin tükürük14'e salınacak midgut ve tükürük bezleriyle ilişkili çeşitli doku bariyerlerinin üstesinden gelmesi gerekir. Midgut bezi ve tükürük bezinin sivrisinek vektörel kapasitesi üzerindeki etkisi bu deneyde gösterilmemiştir. Oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon kombine edildiğinde, farklı doku bariyerleri iyice değerlendirilebilir. Bu işlemin sonuçlarına göre, Ae. aegypti bağırsağı virüsün vektör yeterliliğinde baskın bir rol oynar ve tükürük bezi bariyeri mevcut olmayabilir (Şekil 2). Bunun için protokolümüz, arbovirüs enfeksiyonuna karşı midgut veya tükürük bezi bariyerlerinin varlığını doğrulamak için faydalıdır.
Metodolojiye göre, örneklerde sadece viral RNA tanımlandı. Virion'u bir transmisyon elektron mikroskobu ile görmek, plak tahlillerini kullanarak enfeksiyonu doğrulamak veya bir immünofloresan testi ile viral proteini tespit etmek gibi diğer araştırmalar, çeşitli örneklerdeki bulaşıcı virüsleri doğrulamak için gereklidir. Bu metodoloji değiştirilebilir ve ilgilenilen ek virüsleri çok çeşitli sivrisinek vektörlerine aşılamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Wuhan Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2018201261638501) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al.
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
