Summary
乳がん細胞は、非腫瘍乳房上皮細胞とは異なる誘電特性を示します。この誘電特性の違いに基づいて、免疫療法の目的で2つの集団を分離できるという仮説が立てられています。これをサポートするために、MCF-7およびMCF-10A細胞を分類するマイクロ流体デバイスをモデル化します。
Abstract
誘電泳動装置は、外部電場を印加することにより、サンプル体積中の癌細胞の分極の原理を使用して、ラベルフリー、費用対効果、堅牢、かつ正確な方法で癌細胞を検出および操作することができます。この記事では、細胞混合物からの流体力学的誘電泳動(HDEP)を使用して、非転移性乳がん細胞(MCF-7)および非腫瘍性乳腺上皮細胞(MCF-10A)のハイスループット連続ソーティングにマイクロ流体プラットフォームを利用する方法を示します。HDEPマイクロ流体チップ内にミクロンサイズのギャップを空けて並べた2つの電極間に電界を発生させることで、非腫瘍性乳房上皮細胞(MCF-10A)を押しのけてメインチャネル内で負のDEPを示し、非転移性乳がん細胞は膜伝導率よりも高い導電性を有するため、細胞培地に懸濁しても影響を受けずに経過をたどることができます。この概念を実証するために、培地導電率の異なる値についてシミュレーションを実行し、細胞の選別を研究しました。パラメトリック分析を実施し、適切なセル混合物の導電率は0.4 S/mであることがわかりました。媒質導電率を一定に保つことで、0.8MHzの適切なAC周波数を確立し、電界周波数を変化させることで最大の選別効率を実現しました。実証された方法を使用して、適切な細胞混合物懸濁培地の導電率および適用されるACの頻度を選択した後、最大の選別効率を達成することができる。
Introduction
乳房組織の内外に発生する悪性腫瘍は、世界中の女性の乳がんの頻繁な原因であり、重大な健康問題を引き起こしています1。転移前の乳房腫瘍は、早期に発見されれば手術で治療できますが、無視すると、肺、脳、骨に転移して患者の生活に深刻な影響を与える可能性があります。放射線療法や化学物質ベースの治療など、後の段階で提供される治療法には重篤な副作用があります2。最近の研究では、乳がんの早期診断により死亡率が60%低下することが報告されています3。したがって、パーソナライズされた早期発見方法に向けて取り組むことが不可欠です。この目的のために、科学技術のさまざまな分野で働く研究者は、マイクロフルイディクスを使用して乳がんの早期診断のためのデバイスを開発してきました4。これらの方法には、細胞親和性マイクロクロマトグラフィー、磁気活性化マイクロセルソーター、サイズベースのがん細胞の捕捉と分離、およびオンチップ誘電泳動(DEP)5,6が含まれます。文献で報告されているこれらのマイクロ流体技術は、正確な細胞操作、リアルタイムモニタリング、および明確に定義されたサンプルの選別を可能にし、多くの診断および治療アプリケーションの中間ステップとして機能します5。これらの選別機構とマイクロ流体との統合は、標的細胞の柔軟で信頼性の高い操作を提供する7、8、9、10。このような統合の主な利点の1つは、ナノからマイクロリットルの容量の流体サンプルを扱うことができ、サンプル流体の電気的特性を操作できることです。マイクロ流体デバイス内の懸濁流体の導電率を調整することにより、生体細胞は、そのサイズおよび誘電特性の違いに基づいて選別することができる11,12。
これらの技術の中で、オンチップDEPは、生物学的サンプルの電気的特性を利用するラベルフリーのセルソーティング技術であるため、しばしば好まれます。DEPは、DNA13、RNA14、タンパク質15、細菌16、血球17、循環腫瘍細胞(CTC)18、幹細胞19などのバイオサンプルを操作することが報告されています。生体試料の選別にDEPを採用したマイクロ流体デバイスは、文献20において広く報告されている。生存および非生存酵母細胞を選別するためのリザーバベースのDEPマイクロ流体(rDEP)デバイスは、電気化学反応の悪影響から細胞を保護することが報告されている21、22。Piacentiniらは、赤血球を血小板から97%の効率で分離するキャスタレーションマイクロ流体セルソーターを報告しました23。非対称オリフィスおよび埋め込み電極を有するオンチップDEPデバイスは、生存可能および非生存セル24を選別することも報告されている。ValeroおよびDemierreらは、チャネル25,26の両側に微小電極の2つのアレイを導入することによって、キャスタレーションマイクロ流体セルソーターを改変した。これは、チャネルの中央にあるセルに焦点を合わせるのに役立ちました。Zeynepらは、白血球からMCF7乳がん細胞を分離して濃縮するためのDEPベースのマイクロ流体デバイスを発表しました27。彼らは、1MHzの周波数と10〜12 Vppの範囲の印加電圧で74%〜98%の白血球からMCF7細胞を抽出する効率を報告しました。補足表1は、DEPベースのマイクロ流体選別装置を、その設計、電極構成、および動作パラメータ(印加周波数および電圧)に基づいて定性的および定量的に比較したものです。
最近では、研究者らは、マイクロ流体チップ内の乳房上皮細胞(MCF-10A)と非転移性乳癌細胞(MCF-7)の誘電挙動の違いを測定しようとしました28,29。Jithinらはまた、200MHz〜13.6GHzの周波数を有するオープンエンド同軸プローブ技術を用いて、異なる癌細胞株の誘電応答を特徴づけた30。MCF-7細胞株とMCF-10A細胞株の誘電体応答のこれらの違いを利用して、実行時にそれらを分離することができ、パーソナライズされた初期段階の診断装置の開発につながる可能性があります。
本稿では、非転移性乳がん細胞(MCF-7)と非腫瘍乳腺上皮細胞(MCF-10A)の制御された選別をAC誘電泳動を用いてシミュレーションします。電界の変化領域は、マイクロ流体チップ内の選別に影響を与えます。提案手法は実装が容易であり、様々なマイクロ流体チップレイアウトへの選別技術の統合を可能にする。数値流体力学(CFD)シミュレーションを行い、細胞を懸濁した流体培地の導電率を変化させることによって、非転移性乳がん細胞と非腫瘍乳腺上皮細胞の分離を検討した。これらのシミュレーションでは、導電率を一定に保ち、印加周波数を変更することにより、癌細胞と健常細胞の分離を制御できることを示しています。
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Protocol
注:ここでのプロトコルは、マルチフィジックスシミュレーションソフトウェアであるCOMSOLを使用して、AC誘電泳動を使用して非転移性乳がん細胞(MCF-7)および非腫瘍乳腺上皮細胞(MCF-10A)の制御された選別をシミュレートします。
1. チップ設計とパラメータ選択
- マルチフィジックスソフトウェアを開き、 ブランクモデルを選択します。 [グローバル定義 ] を右クリックし 、[パラメーター] を選択します。 表 1 に示すパラメーターをテキスト・ファイルとしてグローバル定義にインポートするか、値を個別に入力します。
- [ ホーム ]タブから[コンポーネントの追加]を選択し、 2Dコンポーネントを追加します。ジオメトリを右クリックし、ファイルをダブルクリックしてモデルファイルをインポートします。
- 空白の材料を選択し、 表 1 の材料特性を使用します。
- [ホーム] タブから [物理演算の追加 ] を選択し、「AC/DC」と入力します。AC/DCノードで、電界と電流のサブ ノードの下で物理 として電流を選択します。
- 電流を右クリックし、[電流保存]、[絶縁]、および[電位]サブノードを選択して、チャネル壁を絶縁し、電極に電位を割り当てます。
- ホームタブから[物理を追加]を選択し、[流体の流れ]ノードで、[単相流]のサブノードの下にある[クリーピングフロー物理]を選択します。「単相流」(Single-Phase Flow) を右クリックし、「壁」(Wall) サブノードを使用してチップ境界を壁としてレンダリングします。
- 単相流を右クリックし、2つの入口サブノードと1つの出口サブノードを追加します。
- 流入口サブノードを使用して流入口を割り当て、[ 流速 の法線]を 境界条件として使用します。アウトレットサブノードを使用してアウトレットを割り当てます。
- ホーム タブから[物理を追加]を選択し、[流体の流れ]ノードで、[パーティクル トレース]のサブノードの下にある[パーティクル トレース フロー物理]を選択します。
- パーティクル トレース ノードを右クリックし、サブノードの壁、2 つの パーティクル プロパティ サブノード、2 つの入口サブノード、1 つの出口サブノード、2 つの誘電泳動力サブノード、および 1 つのドラッグ力サブノードを追加します。
- パーティクルプロパティサブノードを使用して、MCF-7セルとMCF-10Aセルの両方のパーティクルプロパティを設定します。[グローバル定義]セクションのパラメータからパーティクルのプロパティを選択します。
- ドラッグフォースサブノードを追加して、両方のタイプのセルに誘電泳動 フォース を割り当てます。
- この場合、パラメータセクションから パーティクルプロパティ を追加します。シェルサブノードを追加して、哺乳類細胞をモデル化します。
- ホーム タブで、[メッシュ の追加 ] を選択し、[ ファイン メッシュ] を選択します。[ホーム] タブから [メッシュの構築] を選択して、メッシュを構築します。
- ホームタブで、スタディの追加をクリックして、3つの スタディ ステップを追加します。 スタディステップ1 は、周波数応答をシミュレートするためのものです。 周波数ドメイン サブノードを使用します。
- クリーピング流れをシミュレートするには、 定常スタディ ノードを選択します。誘電泳動力のある条件と泳電力のない条件をシミュレートするために、2つの時間依存ステップを追加します。
- 誘電泳動なし条件の場合は、 物理と変数の選択を選択し、スタディステップの モデル設定の変更 というタイトルのチェックボックスをオンにして、 誘電泳動ステップを無効にします。誘電泳動条件の場合は、無効にしないでください。ファイルを保存し、[ 計算] を押してシミュレーションを実行します。
注:非転移性乳がん細胞(MCF-7)および非腫瘍乳腺上皮細胞(MCF-10A)の選別用に設計されたマイクロ流体チップには、 補足図1 および補足図2に示すように、それぞれ20μmおよび40μmの幅の細胞混合フローおよび流体力学的フローフォーカシング用の 2つの別々の入口があります。 - 周波数領域サブノードの下の周波数(f0)と電位サブノードを使用した電圧を、選別室の上側壁に沿って配置されたプレーナ電極(幅295μm)に割り当てます。出口で、「フリーズ」壁条件を使用して、ソートされたパーティクルを視覚化します。
2. 数理モデルと計算解析
- 計算流体力学(CFD)研究を設定して、マイクロ流体デバイス内の非転移性乳がん細胞と非腫瘍乳腺上皮細胞を分離するための動作パラメータを検証します。
注:この目的のために、マルチフィジックスソフトウェア(AC / DC、マイクロ流体工学、および粒子追跡モジュール)が使用されました。支配方程式と理論的背景は、補足ファイル1で詳細に示されています。このモデルは、表1に要約されている文献31、32で報告されている非転移性乳癌細胞(MCF7)および非腫瘍乳腺上皮細胞(MCF-10A)の誘電特性を使用してテストされました。 - 非転移性乳がん(MCF7)および非腫瘍乳腺上皮(MCF-10A)細胞株を細胞混合物の入口に1:1の比率で導入することにより、CFDシミュレーションを実行します。
- 最初に、メッシュ独立性スタディを実行して、シミュレーション33のメッシュサイズを最適化します。
注:動作パラメータの最適なソリューションを見つけるために、メッシュ独立性調査が実施されました。解の収束に最適な要素サイズを定量化するために、5つの異なるメッシュサイズのセットが選択されました。補足図3Aに示すように、メッシュを定義する要素の総数が635(メッシュが粗い)の場合、ソート効率が最も低く、補足図3Bに示すように、MCF7セルの一部が下部の出口に移動することが観察されました。メッシュ サイズを細かくすると、メッシュを定義する要素の数も 2,288 に増加しました。この場合、選別効率は最大になり、MCF7細胞とMCF-10A細胞の両方がそれぞれの出口に向かって移動しました。より細かいメッシュもシミュレートされ、メッシュを定義する要素の数は3,188に増加しました。この時点以降、選別効率は影響を受けませんでした。したがって、この場合、細かいメッシュサイズが最適であると言っても過言ではありません。 - 2 セットの CFD スタディを解きます。
- 最初のセットでは、 スタディ 1を右クリックし、 パラメトリックスイープ サブノードを追加します。 + 記号を押して、流体媒体導電率「σm」をスイープ変数として追加します。0.01 S/m から 2.5 S/m の範囲の流体媒体導電率 σm に対して、適用される周波数 f (Hz) を 800 kHz の値で一定に保ちながら、パラメトリック スイープ スタディを実行します。
- 2番目のセットでは、流体媒体の導電率σ mを各ケースで0.4 S/mに固定しながら、適用されるAC周波数を100 kHzから100 MHzまで変化させてパラメトリックスイープスタディを実施します。このσm値は、MCF-7とMCF-10Aとの間の最大分離がこの値で観察されたため、最初のCFD研究の結果に基づいて選択された。
- 導電性媒体中の誘電体球状粒子に加えられる誘電泳動(DEP)力FDEP (−)の強さは、式1T34で与えられる。
F出発
[1]
誘電泳動力サブノードの下で式1を使用します。式1において、 r はFDEPが適用される粒子の半径を示す。K(-)はクラウジウス-モソッティ因子として知られています。 εm(-)は媒体の誘電率を示します。E(V/m)は電界の二乗平均平方根値です。 - 式2は、誘電泳動力サブノードの下の球状粒子に使用します。
[2]
式2において、(-)はDEP力が加わる粒子の複素誘電率を示し、
(-)は粒子を取り囲む流体の複素誘電率を示す。複素誘電率は35と定義される: - 誘電泳動力サブノードの下の球状粒子に対して式3を使用します。
[3]
式3において、εp (-)は粒子の複素誘電率の実部を示す。εm (-)は、粒子を取り囲む流体の複素誘電率の実数部を示します。σp (S / m)は粒子の導電率を示します。σm (S / m)は、粒子を囲む媒体の導電率を示します。ω(Hz)は印加電界の周波数です。
注意: Re(K)の符号は、FDEPの極性を決定します。Re(K)の符号が負の場合、粒子は負の誘電泳動力(nDEP)を受けます。これとは反対に、Re(K)の符号が正の場合、それは正の誘電泳動力(pDEP)を意味します。クラウジウス-モソッティ因子(K)の場合、変動は-1から1の範囲内です。
- 最初に、メッシュ独立性スタディを実行して、シミュレーション33のメッシュサイズを最適化します。
- 式3の修飾形式を使用して、より複雑で多層構造を持つ哺乳類細胞などの生物学的細胞をモデル化します。
K (
) = 
[4]
式4において、(-)は細胞質の複素誘電率(
-)と細胞膜の複素誘電率( 
-)の両方を含み、 
以下のように与えられる36。 - 式 5 を使用して "
" を解きます。
[5]
式5において、Rサイト(m)およびRmem(m)は、それぞれ細胞質および細胞膜の半径を示す。 - 次に、式4を使用して、癌細胞と健康な細胞の両方に適用される電界の関数としてRe(K)をプロットします。クラウジウス・モッソッティ(CM)因子Re(K)の実数部を計算して、粒子が受ける誘電電気泳動力(DEP)を定量化します。
- 結果ノードを右クリックし、[粒子評価]サブノードを追加し、[式]セクションに「fpt.deff1.K」と入力して、粒子1のCM係数と粒子2のfpt.deff2.Kをプロットします。
メモ: 本文に記載されているすべてのプロトコル手順は、プロトコルビデオ(ビデオ1)で確認できます。
[1]
[2]
(-)は粒子を取り囲む流体の複素誘電率を示す。複素誘電率は
[3]
) = 
[4]
-)と細胞膜の複素誘電率( 
-)の両方を含み、 
以下のように与えられる36。
" を解きます。
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Representative Results
非転移性乳がん(MCF-7)および非腫瘍乳腺上皮(MCF-10A)細胞の効果的なDEPベースの選別のための最適な操作パラメータの調査
誘電泳動を受けたときに誘電特性が異なる非転移性乳がん(MCF-7)細胞と非腫瘍乳腺上皮細胞(MCF-10A)の分離を成功させるには、印加周波数を固定してそれらのK因子を区別する必要があります37,38。印加電界下での非転移性乳癌細胞および非腫瘍乳腺上皮細胞の誘電応答の定量化および両細胞株の印加頻度の関数としての「K」因子の計算は、式4を用いて達成された。図1に示す結果は、非転移性乳癌細胞および非腫瘍乳腺上皮細胞の全ての誘電パラメータを固定したまま、電界の印加周波数を細胞懸濁培地の導電率の3つの異なる値σmについて変化させることによって生成された。
図1に示すように、いずれの場合も、Kの値は、以前の研究39、40と一致して、−1〜1の範囲内である。それにもかかわらず、real(K)対頻度のプロットは、培地伝導率(σm)の値に応じて、非転移性乳がん細胞(MCF-7)と非腫瘍乳腺上皮細胞(MCF-10A)の両方で変化します。図1に示す結果は、MCF-7細胞のRe(K)に対するσmの効果が定量化された最近の研究と一致しています41。
図1:クラウジウス-モソッティ因子。 (A)σ m = 0.01 S /m の導電率を特徴とする培地に懸濁されたMCF-7およびMCF-10A細胞について、頻度の関数としてプロットされたクラウジウス-モソッティ因子Kの実数部。(B) σ m = 0.4 S/m ;(C) σ m = 1.2 S/m . この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図1は、MyDEPツールを使用して、印加AC周波数を100kHzから100MHzまで維持および変化させながら、3つの異なるσm値に対してプロットしたものです。最初に、σmは0.01S/mに選択され、図1Aに示すように、印加AC周波数は100kHzから100MHzの間で変化しました。印加AC周波数100kHzでは、MCF-10A細胞のRe(K)の値は0.82であり、これは正の誘電泳動(pDEP)を経験し、電界強度の高い領域に向かって移動することを意味します。同様に、100 kHzのMCF-7細胞も、Re(K)値が0.76のpDEPを経験します。周波数は100kHz刻みで増加し、両細胞タイプのCM因子の値は印加周波数スペクトルを通して正側にとどまった。図1Bに示すように、他のすべての動作パラメータを一定に保つことにより、媒体導電率を0.4 S/mに増やしてRe(K)をプロットしました。MCF-10AおよびMCF-7は、100kHzでそれぞれ-0.46および-0.31のRe(k)値で負の誘電泳動(nDEP)挙動を示した。周波数が0.8MHzに増加すると、MCF-10細胞のDEP応答が変化し、Re(K)値が0.014のpDEPを経験しました。MCF-7細胞のこの挙動は、細胞膜と周囲の細胞懸濁培地との間の界面におけるマクスウェル・ワーグナー分極によって引き起こされる39,41。DEP応答のこの変化が観測される周波数は、図1A42,22に示すように、クロスオーバー周波数として知られています。この場合、MCF-7細胞はnDEPを経験しました。周波数はさらに100MHzまで増加しましたが、両方のセルタイプはDEP挙動を変化させなかったため、印加電界周波数の変動の影響を受けませんでした。導電率が1.2 S/mに上昇すると、MCF-10AおよびMCF-7セルは100 kHzでnDEPを経験しました。この場合、MCF-10A細胞とMCF-7細胞のRe(k)値は、図1Cに示すように、それぞれ-0.49と-0.43でした。周波数が0.8MHzに増加しても、セルのDEP応答は変化せず、nDEPが発生し続けました。高い値の細胞懸濁培地伝導率におけるMCF-7およびMCF-10A細胞株の両方の負のDEP挙動は、以前に報告された研究39、43、44と一致している。第1のクロスオーバー周波数よりも高い周波数での細胞のDEP挙動は、細胞質伝導性と懸濁溶液45,46との間の相互作用によって支配される。一方、第1のクロスオーバー周波数よりも低い周波数では、細胞の誘電応答は、細胞膜伝導性と細胞懸濁培地との間の相互作用によって決定される。
図1に示す結果に基づいて、COMSOLシミュレーションを設定しました。最初に、図2に示すように、このシミュレーションソフトウェアを使用して電界強度を定量化しました。選別チャネルの上壁に並べて配置した2つの電極によって発生する全電界の大きさの最大値が電極端部付近に位置していることがわかる。矢印は電界の方向を示す。
図2:電界強度。 並べて配置された2つの電極によって生成される電界。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
MCF-7およびMCF-10Aセルをソートするシミュレーションは、印加AC周波数を0.8MHz(クロスオーバー周波数)に固定し、σ mの値を変更して設定しました。 σmの3つの値は、図1に示すRe(K)プロットに従って選択されました。当初、σmが0.01 S/mの場合、図3Aに示すように、両方の細胞タイプでDEPが正になり、電界強度の高い領域に向かって移動し、上部の出口から移動しました。両方の細胞株の細胞質σ細胞質伝導率は、この特定の場合の培地導電率σmよりも高かったため、両方の細胞株をマイクロ流体チャネル47の上部にある電極に近づけました。MCF-10AセルのDEP応答は変化し、印加周波数を0.8MHzに固定してσmを0.4 S/mに増加させると、DEPが負になりました。 図3Bは、MCF-10Aセルが上部のコンセントに移動し、MCF-7セルが下部のコンセントに移動することを示しています。この分離の理由は、細胞選別ビデオ(ビデオ2)に示すように、細胞質σ細胞質伝導度が培地伝導率σmよりも大きいため、MCF-7細胞はMCF-10Aと比較して分極されているためです。
図3:セルソーティング固定頻度。 設計されたマイクロ流体デバイスにおけるDEPによるMCF-7と健康な細胞分離の経時的なシミュレーション。懸濁培地の導電率の3つの異なる値でのMCF-7および健康な細胞分離:(A)0.01 S/m;(B) 0.4 秒/月;(C) 1.2 秒/メートルいずれの場合も、印加周波数は0.8MHz、印加電圧Vpp は1.5V、流束入口の流速は184μm/s、流束入口の流速は853μm/sであった。シミュレーションでは、MCF-7細胞とMCF-10A細胞はそれぞれ青と赤の円で表されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
培地の導電率がさらに1.2 S/mに上昇すると、MCF-7細胞とMCF-10A細胞は、細胞質伝導度σ細胞 質値が低いため、周囲の培地よりも分極性が低下しました。その結果、彼らはnDEPを経験し、 図3Cに示すように、高電界の領域から離れました。
これらの結果は、培地の導電性が、DEPに基づくMCF-10A非腫瘍性乳癌細胞からMCF-7非転移性乳癌細胞を分離する上で重要な役割を果たすことを実証する。さらに、 図3Bに示すように、効果的な分離を実現するには、それぞれの誘電特性に基づいて、セルがpDEPまたはnDEPのいずれかを経験するように媒体導電率を調整する必要があります。
最後に、印加された誘電泳動力F DEPが両方の細胞株の選別挙動に及ぼす影響を、培地伝導率を0.4 S/mに一定に保つことによって調べた。 FDEPは印加電界の周波数48,49の関数であり、印加電場の周波数が変化するにつれて、 セルは DEP の動作を変更します。シミュレーションは周波数を100kHzに設定して開始し、MCF-10AとMCF-7の両方の細胞株がnDEPを経験し、図4Aに示すように、高電界の領域から下部出口に向かって移動することが観察されました。周波数が増加するにつれて、両方の細胞株のDEP挙動は、MCF-10AがDEP挙動を変化させてpDEP領域にクロスオーバーする0.8MHzまで変化しなかった。これは、図4Bに示すように、調査中のDEP応答セル間の最大の分離と最大のソート効率を持つポイントです。周波数を100MHzに上げると、図4Cに示すように、両方の細胞株がpDEPを経験し、上部の出口に向かって移動することが観察されました。0.8MHzを超えるより高い周波数では、細胞はチャネル壁で固定化し始めました。チャネル壁での細胞の固定化は、選別プロセス中に細胞の損失につながる可能性があり、それがデバイスの全体的な効率に影響を与えます。これらの力の影響はまた、長期間曝露された場合、細胞の生存率に深刻な損失を引き起こす可能性があります。Yangらは、リステリア・モノサイトゲネス細胞株を5MHzのAC電界および20VPP50のピーク間電圧に曝露することにより、DEP力の影響を定量化した。彼らの結果は、DEP力の影響下に4時間置いた場合、56%〜89%の生存細胞損失を示した。同様に、DEP力も分極性媒体に懸濁した場合の細胞の動きに影響を与えることが報告されており、細胞を固定化するために使用されています。Ettehadらは、酵母細胞を固定化するために1MHzのAC周波数および20VPPを使用するインターディジット電極(IDE)を備えたマイクロ流体デバイスを報告した51。彼らは、酵母細胞の固定化がIDE間の間隔と印加電圧のアスペクト比に依存することを示しました。IDE間隔のアスペクト比の増加は、細胞の固定化の急激な減少をもたらし、IDE間の間隔が大きいデバイスに細胞を固定化するためには、より高いVPPが必要でした。細胞固定化は、分析または増殖のために細胞をトラップする必要がある場合に望ましいアプリケーションです。以前の結果は、印加されたAC周波数と電圧が細胞の固定化に影響を与えることを明確に示しました。ハイスループットのソーティングまたはスクリーニングが望ましい結果であるアプリケーションでは、細胞固定化は細胞損失をもたらし、デバイスの出力効率を低下させます。
細胞固定化に対する印加周波数と電圧の影響を定量化するために、1.5 VPPの固定印加電圧でキロヘルツからメガヘルツの周波数範囲までの一連のシミュレーションを実行しました。結果を 補足図S4に示す。その結果、kHz域の周波数では、チャネル壁での細胞の固定化はMHz域の周波数に比べてはるかに少ないことが明らかになりました。DEP力は印加されたAC周波数に正比例するため、高いDEP力では細胞の固定化がより顕著であると推測できます。このマイクロ流体デバイスの場合、0.8MHzを超える周波数で動作する必要があるため、MCF7およびMCF-10Aセルのソーティング中にセル損失が発生します。入口での細胞のランダム分布の影響は、ランダム分布境界条件を選択することによってさらに調査されました。この場合、 補足図5に示すように、より多くの細胞チャネル壁相互作用が観察されました。
図4:培地導電率を固定したセルソーティング。 マイクロ流体デバイスにおける非転移性乳癌細胞(MCF-7)および非腫瘍性乳腺上皮細胞(MCF-10A)の分離に及ぼす印加AC電界の周波数の影響をシミュレートした。(A) f= 100 KHz;(B) f= 0.8 MHz;(C) f= 100 MHz流体媒体の導電率はσm = 0.4 S/mに固定されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| シミュレーション用の誘電特性 | ε細胞質 | σ細胞質 (秒/月) |
ε膜 | σメンブレン (秒/月) |
| MCF-7 | 50 | 0.8 | 11 | 6×10-6 |
| MCF-10A | 100 | 0.1 | 11 | 6 |
| F0 キー | 800 [キロヘルツ] | 1.2 x 103 Hz | 電界の周波数 |
| sigma_f | 0.4 [秒/メートル] | 0.8秒/メートル | 流体媒体伝導率 |
| epsilon_f | 80 | 80 | 流体比誘電率 |
| rho_f | 1000 [キログラム/メートル3] | 1000 kg/m³ | 流体密度 |
| mu_f | 1 x 10-3 [パ·秒] | 0.001 Pa·s | 流体動粘度 |
| rho_p | 1050 [キログラム/メートル3] | 1050 kg/m³ | 粒子密度 |
| DP1 | 17 [μm] | 1.7×10-5 メートル | 粒子径 |
| DP2 | 16 [うーん] | 1.6×10-5 メートル | 粒子径 |
| sigma_p1 | 0.8 [秒/メートル] | 0.6秒/メートル | 粒子伝導率 |
| sigma_p2 | 0.1 [秒/月] | 1.1 秒/メートル | 粒子伝導率 |
| epsilon_p1 | 50 | 55 | 健全な比誘電率 |
| epsilon_p2 | 100 | 65 | がん比誘電率 |
| sigma_s1 | 6 x 10-6 [秒/メートル] | 6 x 10-6 S/m | シェル電気伝導率 |
| sigma_s2 | 6 [秒/月] | 6秒/メートル | シェル電気伝導率 |
| epsilon_s1 | 11 | 11 | シェル比誘電率 |
| epsilon_s2 | 11 | 11 | シェル比誘電率 |
| th_s1 | 7 [ナノメートル] | 7×10-9 メートル | シェルの厚さ |
| th_s2 | 7 [ナノメートル] | 7×10-9 メートル | シェルの厚さ |
表1:動作パラメータ。 MCF-7およびMCF-10Aの誘電特性
ビデオ1:プロトコルステップを示すビデオ。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:セルソートビデオ。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:支配方程式と理論的背景。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:デバイスの設計とパラメータ。 デバイスのさまざまな部分を強調するマイクロ流体デバイス設計。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:電極間のギャップ。 2つのパッチ電極間のギャップ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:メッシュ独立性調査。 MCF-7およびMCF-10A細胞の選別に対する異なるメッシュサイズの影響を示すメッシュ独立性研究。(A)マイクロ流体デバイスの異なるメッシュサイズで、各メッシュの要素数を示す。メッシュを構成する要素の数は、粗いメッシュから細かいメッシュへと増加します。(B)他のすべての動作パラメータを一定に保つことにより、異なるメッシュサイズでMCF7およびMCF-10Aセルをソートします。細かいメッシュサイズと細かいメッシュサイズにより、ソートに最適な結果が得られます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:細胞固定化およびランダム分布試験。 細胞固定化に対するDEP力の影響を検証するために、10KHz〜6MHzの周波数でシミュレーションを実施しました。(A)f = 10 kHzでは、ソーティングおよび細胞固定化は観察されません。(B)f = 200kHzでは、選別および細胞固定化は観察されない。(C)f = 0.8 MHzでは、出口壁での選別と細胞固定化が観察されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:ランダム分布。 チップの入口にランダムに分布した粒子。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:異なるDEPベースのマイクロ流体選別装置の比較。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マイクロ流体デバイスは、細胞培養、トラップ、およびソーティングについて以前に報告されています47,52,53。クリーンルームでのこれらのデバイスの製造は高価なプロセスであり、CFDシミュレーションを通じて提案されたマイクロ流体デバイスの出力と効率を定量化することが不可欠です。この研究は、非転移性乳がん細胞(MCF-7)と非腫瘍乳腺上皮細胞(MCF-10A)の誘電特性に基づいて連続的に分離するためのAC誘電泳動マイクロ流体デバイスの設計とシミュレーションを提示します23。
このデバイスは、単一のマイクロ流体選別チャネルに埋め込まれた2つの微小電極のセットを介してAC電界を印加し、誘電特性に基づいてMCF-7およびMCF-10Aセルを分離することによって動作します。デバイスの分離効率は、媒体導電率のさまざまな値と印加されたAC周波数の範囲について計算的にシミュレートされました。最適な印加AC周波数と媒体導電率の値は、それぞれ0.8MHzと0.4S/mであることがわかりました。シミュレーション全体で1.5Vp-pの低電圧を使用しました。印加AC周波数範囲および印加電圧は、既報文献23,47に匹敵する。1MHzを超える周波数では、細胞固定化効果が観察され、将来のデバイスの設計と製造のために考慮する必要があります。この細胞固定化は、細胞選別アプリケーションのコンテキストにおける私たちの方法の制限としてリストされています。我々は、文献54で以前に報告されているように、より高い周波数での細胞固定化を細胞分化に利用できると考えており、この提案されたデザインに新しい方向性を与えています。このアプリケーションは、合成生物学の研究者にとって非常に興味深いものになるでしょう。
このプロトコルを正しく実装するための重要なステップには、適切な物理ノードとサブノードの選択が含まれます(ステップ1.5-1.9)。これらのステップは、シミュレーションプロトコル全体の基礎を形成し、各セルタイプ、印加力、および印加電圧のパラメータ値を選択するのに役立ちます。もう一つの重要なステップは、正しい流体媒体の導電率と適用周波数を選択することです。これは、パラメトリックスイープのトラブルシューティング手順を実行することで実現できます。これら2つのパラメータのパラメトリックスイープは、将来のシミュレーションに最適な値を決定するのに役立ちます。最後に、メッシュ独立性スタディは、将来のシミュレーションに適したメッシュサイズを選択するという文脈でも重要です。メッシュ独立性スタディは、今後のシミュレーションを完了する前にトラブルシューティング手順として実行することを強くお勧めします。
この研究は、非転移性乳がん細胞(MCF-7)と非腫瘍乳腺上皮細胞(MCF-10A)の誘電特性に基づくインライン分離の最初のシミュレーションベースの例を提供します。この設計は、生存可能および非生存細胞の選別にさらに実装できると考えています。
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Disclosures
著者は、潜在的な利益相反を宣言していません。
Acknowledgments
この研究は、パキスタン高等教育委員会の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMSOL | COMSOL | multiphysics simulation software |
References
- Liang, L., et al. Microfluidic-based cancer cell separation using active and passive mechanisms. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (4), 26 (2020).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9 (2), 103 (2018).
- Pashayan, N., et al. Personalized early detection and prevention of breast cancer: ENVISION consensus statement. Nature Reviews Clinical Oncology. 17 (11), 687-705 (2020).
- Panesar, S., Neethirajan, S. Microfluidics: Rapid diagnosis for breast cancer. Nano-micro Letters. 8 (3), 204-220 (2016).
- Chen, J., Li, J., Sun, Y. Microfluidic approaches for cancer cell detection, characterization and separation. Lab on a Chip. 12 (10), 1753-1767 (2012).
- Beech, J. P., Holm, S. H., Adolfsson, K., Tegenfeldt, J. O. Sorting cells by size, shape and deformability. Lab on a Chip. 12 (6), 1048-1051 (2012).
- Kang, Y., Li, D. Electrokinetic motion of particles and cells in microchannels. Microfluidics and Nanofluidics. 6 (4), 431-460 (2009).
- Schmid, L., Weitz, D. A., Franke, T. Acoustic microfluidic fluorescence-activated cell sorter. Lab on a Chip. 14 (19), 3710-3718 (2014).
- Yu, B. Y., Elbuken, C., Shen, C., Huissoon, J. P., Ren, C. L. An integrated microfluidic device for the sorting of yeast cells using image processing. Scientific Reports. 8, 3550 (2014).
- Asiaei, S., Darvishi, V., Davari, M. H., Zohrevandi, D., Moghadasi, H. Thermophoretic isolation of circulating tumor cells, numerical simulation and design of a microfluidic chip. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 137 (3), 831-839 (2019).
- Song, Y., Li, M., Pan, X., Wang, Q., Li, D. Size-based cell sorting with a resistive pulse sensor and an electromagnetic pump in a microfluidic chip. Electrophoresis. 36 (3), 398-404 (2014).
- Giraud, G., et al.
- Valero, A., Braschler, T., Demierre, N., Renaud, P. A miniaturized continuous dielectrophoretic cell sorter and its applications. Biomicrofluidics. 4 (2), 022807 (2010).
- Allahrabbi, N., Chia, Y. S. M., Saifullah, M. S. M., Lim, K. M., Lanry Yung, L. Y. A hybrid dielectrophoretic system for trapping of microorganisms from water. Biomicrofluidics. 9 (3), 034110 (2015).
- Vykoukal, D. M., Gascoyne, P. R. C., Vykoukal, J. Dielectric characterization of complete mononuclear and polymorphonuclear blood cell subpopulations for label-free discrimination. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 1 (7), 477-484 (2009).
- Shim, S., et al. Antibody-independent isolation of circulating tumor cells by continuous-flow dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 7 (1), 11807 (2013).
- Jeon, H. J., Lee, H., Yoon, D. S., Kim, B. M. Dielectrophoretic force measurement of red blood cells exposed to oxidative stress using optical tweezers and a microfluidic chip. Biomedical Engineering Letters. 7 (4), 317-323 (2017).
- Song, H., et al. Continuous-flow sorting of stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15 (5), 1320-1328 (2015).
- Tsai, S. L., Chiang, Y., Wang, M. H., Chen, M. K., Jang, L. S. Battery-powered portable instrument system for single-cell trapping, impedance measurements, and modeling analyses. Electrophoresis. 35 (16), 2392-2400 (2014).
- Chan, J. Y., et al. Dielectrophoresis-based microfluidic platforms for cancer diagnostics. Biomicrofluidics. 12 (1), 011503 (2018).
- Patel, S., et al. Microfluidic separation of live and dead yeast cells using reservoir-based dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6 (3), 34102 (2012).
- Yildizhan, Y., Erdem, N., Islam, M., Martinez-Duarte, R., Elitas, M. Dielectrophoretic separation of live and dead monocytes using 3D carbon-electrodes. Sensors. 17 (11), 2691-2704 (2017).
- Piacentini, N., Mernier, G., Tornay, R., Renaud, P. Separation of platelets from other blood cells in continuous-flow by dielectrophoresis field-flow-fractionation. Biomicrofluidics. 5 (3), 34122 (2011).
- Zhao, K., Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
- Valero, A., et al. Tracking and synchronization of the yeast cell cycle using dielectrophoretic opacity. Lab on a Chip. 11 (10), 1754-1760 (2011).
- Demierre, N., Braschler, T., Muller, R., Renaud, P. Focusing and continuous separation Of cells in a microfluidic device using lateral dielectrophoresis. International Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference. 430 (98), 1777-1780 (2007).
- Arslan, Z. C., Yalçın, Y. D., Külah, H. Label-free enrichment of MCF7 breast cancer cells from leukocytes using continuous flow dielectrophoresis. Electrophoresis. 43 (13-14), 1531-1544 (2022).
- Turcan, I., Olariu, M. A. Dielectrophoretic manipulation of cancer cells and their electrical characterization. ACS Combinatorial Science. 22 (11), 554-578 (2020).
- Park, J., et al. Sequential cell-processing system by integrating hydrodynamic purification and dielectrophoretic trapping for analyses of suspended cancer cells. Micromachines. 11 (1), 47 (2020).
- Hussein, M., et al. Breast cancer cells exhibits specific dielectric signature in vitro using the open-ended coaxial probe technique from 200 MHz to 13.6 GHz. Scientific Reports. 9, 4681 (2019).
- Fornes-Leal, A., Garcia-Pardo, C., Frasson, M., Pons Beltrán, V., Cardona, N. Dielectric characterization of healthy and malignant colon tissues in the 0.5-18 GHz frequency band. Physics in Medicine and Biology. 61 (20), 7334-7346 (2016).
- Çetin, B., Li, D.
- Khan, S., Khulief, Y. A., Al-Shuhail, A. A. Effects of reservoir size and boundary conditions on pore-pressure buildup and fault reactivation during CO2 injection in deep geological reservoirs. Environmental Earth Sciences. 79, 294 (2020).
- Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cellsand the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), 054109 (2014).
- Lo, Y. J., et al. Measurement of the Clausius-Mossotti factor of generalized dielectrophoresis. Applied Physics Letters. 104, 083701 (2014).
- Lo, Y. J., Lei, U. Measurement of the real part of the Clausius-Mossotti factor of dielectrophoresis for Brownian particles. Electrophoresis. 41 (1), 137-147 (2020).
- Ohta, A. T., et al. Optically controlled cell discrimination and trapping using optoelectronic Tweezers. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 13 (2), 235-242 (2007).
- Sun, T., Morgan, H.
- Weng, P. Y., et al. Size-dependent dielectrophoretic cross-over frequency of spherical particles. Biomicrofluidics. 10 (1), 1909-1921 (2016).
- Lu, Y. W., Sun, C., Kao, Y. C., Hung, C. L., Juang, J. Y. Dielectrophoretic cross-over frequency of single particles: Quantifying the effect of surface functional groups and electrohydrodynamic flow drag force. Nanomaterials. 10 (7), 1364 (2020).
- Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32 (18), 2523-2529 (2011).
- Chan, J. Y., et al. Dielectrophoresis-based microfluidic platforms for cancer diagnostics. Biomicrofluidics. 12 (1), 11503-11525 (2018).
- Gascoyne, P. R. C., Shim, S. Isolation of circulating tumor cells by dielectrophoresis. Cancers. 6 (1), 545-579 (2014).
- Liang, W., et al. Determination of dielectric properties of cells using ac electrokinetic-based microfluidic platform. Micromachines. 11 (5), 513-537 (2020).
- Frusawa, H., et al. Frequency-modulated wave dielectrophoresis of vesicles and cells periodic U-turns at the crossover frequency. Nanoscale Research Letters. 13 (169), 2583-2589 (2018).
- Wei, M. T., Junio, J., Ou-Yang, D. H. Direct measurements of the frequency-dependent dielectrophoresis force. Biomicrofluidics. 3 (1), 12003 (2009).
- Mustafa, A., Pedone, E., Marucci, L., Moschou, D., Lorenzo, M. D. A flow-through microfluidic chip for continuous dielectrophoretic separation of viable and non-viable human T-cells. Electrophoresis. 43 (3), 501-508 (2021).
- Wang, L., et al. Dual frequency dielectrophoresis with interdigitated sidewall electrodes for microfluidic flow-through separation of beads and cells. Electrophoresis. 30 (5), 782-791 (2021).
- Alazzam, A., Mathew, B., Alhammadi, F. Novel microfluidic device for the continuous separation of cancer cells using dielectrophoresis. Journal of Separation Science. 40 (5), 1193-1200 (2017).
- Yang, L., Banada, P. P., Bhunia, A. K., Bashir, R. Effects of dielectrophoresis on growth viability and immuno-reactivity of listeria monocytogenes. Journal of Biological Engineering. 2, 6 (2008).
- Matbaechi, H., Soltani, P., Hölzel, R., Wenger, C. Dielectrophoretic immobilization of yeast cells using CMOS integrated microfluidics. Micromachines. 11 (5), 501-518 (2020).
- Mustafa, A., Pedone, E., La Regina, A., Erten, A. A., Marucci, L. Development of a single layer microfluidic device for dynamic stimulation, culture and imaging of mammalian cells. bioRxiv. , (2022).
- Mustafa, A., et al. Enhanced dissolution of liquid microdroplets in the extensional creeping flow of a hydrodynamic trap. Langmuir. 32 (37), 9460-9467 (2016).
- Chang, H. F., Chou, S. E., Cheng, J. Y. Electric-field-induced neural precursor cell differentiation in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (170), e61917 (2021).
