Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع وتوصيف مصفوفة نانو قاعدة جانوس طبقة تلو الأخرى لتعزيز تجديد الغضروف

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول تجميع سقالة مصفوفة نانو قاعدة جانوس (JBNm) طبقة تلو الأخرى عن طريق إضافة أنابيب جانوس النانوية الأساسية (JBNts) ، و matrilin-3 ، وتحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-β1) بالتتابع. تم تصنيع JBNm وتمييزه. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر نشاطا حيويا ممتازا ، مما شجع وظائف الخلايا مثل الالتصاق والانتشار والتمايز.

Abstract

تم تطوير سقالات مختلفة من المواد الحيوية لتوجيه التصاق الخلايا وانتشارها على أمل تعزيز وظائف محددة للاستخدامات في المختبر وفي الجسم الحي . تتم إضافة عوامل النمو إلى سقالات المواد الحيوية هذه بشكل عام لتوفير بيئة مثالية لزراعة الخلايا ، ووساطة تمايز الخلايا ووظائفها اللاحقة. ومع ذلك ، فإن عوامل النمو في سقالة المواد الحيوية التقليدية عادة ما يتم تصميمها ليتم إطلاقها عند الزرع ، مما قد يؤدي إلى آثار جانبية غير مقصودة على الأنسجة أو الخلايا المحيطة. هنا ، نجحت مصفوفة النانو الأساسية المستوحاة من الحمض النووي Janus (JBNm) في تحقيق بيئة مجهرية محلية للغاية مع بنية طبقة تلو الأخرى لهياكل أنسجة الغضروف المستدامة ذاتيا. يتم تجميع JBNms ذاتيا من الأنابيب النانوية الأساسية Janus (JBNts) ، و matrilin-3 ، وتحويل عامل النمو beta-1 (TGF-β1) عبر التقارب الحيوي. تم تجميع JBNm بنسبة TGF-β1:matrilin-3:JBNt من 1:4:10 ، حيث كانت هذه هي النسبة المحددة التي يمكن أن يحدث فيها التجميع المناسب في بنية طبقة تلو الأخرى. أولا ، تمت إضافة حل TGF-β1 إلى حل matrilin-3. بعد ذلك ، تم ماصة هذا الخليط عدة مرات لضمان التجانس الكافي قبل إضافة محلول JBNt. شكل هذا JBNm طبقة تلو الأخرى ، بعد السحب عدة مرات مرة أخرى. تم إجراء مجموعة متنوعة من التجارب لتوصيف بنية JBNm طبقة تلو الأخرى ، JBNts وحدها ، matrilin-3 وحدها ، و TGF-β1 وحدها. تمت دراسة تكوين JBNm باستخدام أطياف امتصاص UV-Vis ، ولوحظ هيكل JBNm باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM). نظرا لأن سقالة JBNm المبتكرة طبقة تلو الأخرى تتشكل على نطاق جزيئي ، يمكن ملاحظة JBNm المسمى بصبغة الفلورسنت. يقتصر TGF-β1 داخل الطبقة الداخلية من JBNm القابل للحقن ، والذي يمكن أن يمنع إطلاق عوامل النمو إلى المناطق المحيطة ، ويعزز تكوين الغضروف الموضعي ، ويعزز بيئة دقيقة مضادة للضخامة.

Introduction

تلعب السقالات في هندسة الأنسجة دورا حيويا في توفير الدعم الهيكلي لربط الخلايا وتطوير الأنسجة اللاحق1. عادة ، تعتمد هياكل الأنسجة التقليدية دون أي سقالات على بيئة زراعة الخلايا وعوامل النمو المضافة للتوسط في تمايز الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن هذه الإضافة للجزيئات النشطة بيولوجيا إلى السقالات غالبا ما تكون النهج المفضل في توجيه تمايز الخلايا ووظيفتها 2,3. يمكن لبعض السقالات محاكاة البيئة الدقيقة الكيميائية الحيوية للأنسجة الأصلية بشكل مستقل ، في حين أن البعض الآخر يمكن أن يؤثر بشكل مباشر على وظائف الخلايا عبر عوامل النمو. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه الباحثون تحديات في اختيار السقالات التي يمكن أن تؤثر بشكل إيجابي على التصاق الخلايا ونموها وتمايزها ، مع توفير الدعم الهيكلي الأمثل والاستقرار على مدى فترة طويلة 4,5. غالبا ما ترتبط الجزيئات النشطة بيولوجيا بشكل فضفاض بالسقالة مما يؤدي إلى إطلاق سريع لهذه البروتينات عند الزرع ، مما يؤدي إلى إطلاقها في مواقع غير مرغوب فيها. هذا يبلغ ذروته في الآثار الجانبية على الأنسجة أو الخلايا التي لم يتم استهدافها عمدا 6,7.

عادة ما تكون السقالات مصنوعة من مواد بوليمرية. مصفوفة النانو الأساسية Janus (JBNm) هي منصة سقالة محاكاة حيوية تم إنشاؤها باستخدام طريقة جديدة طبقة تلو الأخرى لبناء أنسجة الغضروف المستدامة ذاتيا8. وقد سميت هذه الأنابيب النانوية الجديدة المستوحاة من الحمض النووي باسم الأنابيب النانوية الأساسية Janus (JBNts) ، لأنها تحاكي بشكل صحيح بنية وكيمياء سطح الكولاجين الموجودة في المصفوفة خارج الخلية (ECM). مع إضافة جزيئات نشطة بيولوجيا ، مثل matrilin-3 وتحويل عامل النمو Beta-1 (TGF-β1) ، يمكن ل JBNm إنشاء بيئة دقيقة مثالية يمكنها بعد ذلك تحفيز وظائف الخلايا والأنسجة المطلوبة9.

JBNts هي أنابيب نانوية جديدة مشتقة من إصدارات اصطناعية من الأدينين والثيمين. يتم تشكيل JBNts من خلال التجميع الذاتي10 ؛ ترتبط ست قواعد نووية اصطناعية لتشكيل حلقة ، وتخضع هذه الحلقات لتفاعلات تكديس π π لإنشاء أنبوب نانوي بطول 200-300 ميكرومتر11. هذه الأنابيب النانوية تشبه هيكليا بروتينات الكولاجين. من خلال محاكاة جانب من البيئة الدقيقة للغضروف الأصلي ، ثبت أن JBNts يوفر موقعا مواتيا للخلايا الغضروفية والخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) 11،12،13،14. نظرا لأن الأنابيب النانوية تخضع للتجميع الذاتي ولا تتطلب أي نوع من البادئ (مثل الأشعة فوق البنفسجية) ، فإنها تظهر إمكانات مثيرة كسقالة قابلة للحقن لمناطق العيوب التي يصعب الوصول إليها15.

Matrilin-3 هو بروتين مصفوفة هيكلي خارج الخلية موجود في الغضروف. يلعب هذا البروتين دورا مهما في تكوين الغضروف ووظيفة الغضروف المناسبة16,17. في الآونة الأخيرة ، تم تضمينه في سقالات المواد الحيوية ، مما شجع على تكوين الغضروف دون تضخم9،18،19. من خلال تضمين هذا البروتين في JBNm ، تنجذب خلايا الغضروف إلى سقالة تحتوي على مكونات مماثلة لتلك الموجودة في بيئتها الدقيقة الأصلية. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن هناك حاجة إلى matrilin-3 لإشارات TGF-β1 المناسبة داخل الخلايا الغضروفية20. تعمل عوامل النمو كجزيئات إشارة ، مما يسبب نموا محددا لخلية أو نسيج معين. وبالتالي ، لتحقيق التجديد الأمثل للغضروف ، فإن matrilin-3 و TGF-β1 هي مكونات أساسية داخل JBNm. يمكن أن تؤدي إضافة TGF-β1 إلى السقالة طبقة تلو الأخرى إلى زيادة تعزيز تجديد الغضروف في بناء الأنسجة. TGF-β1 هو عامل نمو يستخدم لتشجيع عملية الشفاء من العيوب العظمية الغضروفية ، وتشجيع انتشار الخلايا الغضروفية و hMSC والتمايز21,22. وبالتالي ، يلعب TGF-β1 دورا رئيسيا في تجديد الغضروف JBNm (J / T / M JBNm)23 ، مما يشجع على النمو السليم خاصة عندما يتم توطينه داخل طبقات JBNm.

كما ذكرنا سابقا ، يتم تجميع عوامل النمو عادة على السطح الخارجي للسقالات دون طرق محددة للدمج. هنا ، مع البنية النانوية المصممة بدقة للمواد الحيوية ، تم تطوير JBNm لاستهداف محدد للخلايا والأنسجة المقصودة. يتكون JBNm من TGF-β1 ملتصقة على أسطح JBNt في الطبقة الداخلية و matrilin-3 ملتصقة على أسطح JBNt في الطبقة الخارجية24,25. يسمح دمج TGF-β1 في الطبقة الداخلية لهيكل الطبقة تلو الأخرى ببيئة دقيقة موضعية للغاية على طول ألياف JBNm ، مما يخلق بنية أنسجة استتبابية مع إطلاق أبطأ بكثير للبروتين12. إن قابلية حقن JBNm تجعله بنية مثالية لأنسجة الغضروف لمختلف تطبيقات المواد الحيوية المستقبلية26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليف JBNts

  1. تحضير مونومر JBNt باستخدام الطرق المنشورة سابقا ، والتي تنطوي على توليف مجموعة متنوعة من المركبات12.
  2. تنقية مونومر JBNt الخام بعد تصنيعه باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) باستخدام عمود الطور العكسي. استخدم المذيب A: 100٪ ماء ، والمذيب B: 100٪ acetonitrile ، والمذيب C: محلول ماء HCl مع درجة الحموضة = 1. استخدم معدل تدفق 3 مل / دقيقة. جمع أكبر قمة تم الحصول عليها في HPLC في 7.2 دقيقة.

2. تصنيع JBNt / Matn1 / TGF-β1 (فيديو 1)

ملاحظة: يظهر الفيديو 1 أن JBNm عبارة عن مادة صلبة قابلة للحقن تشكلت في بيئة فسيولوجية (محلول مائي ، بدون ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، لا إضافات كيميائية ، ولا تدفئة) ، وهي أيضا مستوحاة بيولوجيا.

  1. أضف 8 ميكرولتر من 1 ملغم / مل TGF-β1 معلقة في H 2 O إلى32 ميكرولتر من 1 ملغ / مل ماتريلين-3 معلقة في H2O. مابيت لضمان الخلط السليم لهذه البروتينات.
  2. أضف 80 ميكرولتر من 1 ملغم/مل من JBNts معلقة في H2O إلى محلول TGF-β1/matrilin-3. ماصة بشكل متكرر لضمان المزج السليم. يمكن ملاحظة وجود اللبد الأبيض مباشرة بعد إضافة JBNts ، مما يشير إلى تكوين JBNm (فيديو 1).

3. مراقبة العينات مع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المرئية (UV-Vis)

ملاحظة: تمت دراسة أطياف امتصاص UV-Vis لتوصيف تجميع JBNm. تم تحليل هذا القياس لأربع فئات: JBNts وحدها ، و matrilin-3 وحدها ، و TGF-β1 وحدها ، و JBNm الكامل طبقة تلو الأخرى ، والتي تتكون من جميع الأجزاء الثلاثة. يتم تعليق جميع التركيزات الأولية في H2O.

  1. بالنسبة لمجموعة JBNt ، أضف 5 ميكرولتر من 1 مجم / مل JBNts إلى 50 ميكرولتر من H2O لصنع محلول 90.9 ميكروغرام / مل.
  2. بالنسبة لمجموعة matrilin-3 ، أضف 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 15 ميكرولتر من H2O لصنع محلول 7.3 ميكروغرام / مل.
  3. بالنسبة لمجموعة TGF-β1 ، أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 إلى 45 ميكرولتر من H2O لصنع محلول 1.8 ميكروغرام / مل.
  4. بالنسبة لمجموعة JBNm ، أضف 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1. قم بالتحريض لضمان الخلط السليم ، ثم أضف 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNts إلى المحلول ، وسحب السحب بشكل متكرر لخلط العينة.
  5. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس طيف الامتصاص لكل مجموعة.

4. قياس زيتا المحتملة للعينات

ملاحظة: تم تحليل إمكانات زيتا للتنبؤ بشكل أفضل بكيفية تفاعل JBNm مع الأنسجة الحية . تم قياس ثلاث مجموعات: matrilin-3 وحدها ، matrilin-3 مع TGF-β1 ، و JBNm الكامل طبقة تلو الأخرى.

  1. بالنسبة لمجموعة matrilin-3 ، أضف 160 ميكرولتر من 10 mg / mL matrilin-3 إلى 640 μL من H2O لصنع محلول 800 μL.
  2. بالنسبة لمركب matrilin-3/TGF-β1، أضف 160 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/مل ماتريلين-3 إلى 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/مل TGF-β1. ماصة مرارا وتكرارا لضمان التجانس السليم. ثم أضفه إلى 600 ميكرولتر من H2O مما أدى إلى محلول 800 ميكرولتر.
  3. بالنسبة لمجموعة JBNm ، أضف 160 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1. ماصة عدة مرات لخلط البروتينات. ثم أضف 20 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts إلى المحلول وماصة لضمان التجانس. أخيرا ، أضف محلول JBNm إلى 580 ميكرولتر من H2O لإنتاج محلول 800 ميكرولتر.
  4. قم بقياس قيم زيتا المحتملة للمجموعات الثلاث.

5. تحضير مصفوفة نانو JBNt/matrilin-3 للمجهر الإلكتروني الناقل (TEM)

ملاحظة: يتم إجراء توصيف TEM لتوصيف مورفولوجيا JBNts و JBNm.

  1. أدخل شبكتين في منظف البلازما لتنظيف الشبكات بشكل صحيح قبل التلطيخ السلبي ل JBNts و JBNm وفقا للبروتوكولات المنشورة وبروتوكولات الشركة المصنعة12.
  2. قم بإنشاء محلول JBNt 200 ميكروغرام / مل عن طريق خلط 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNts مع 40 ميكرولتر من الماء المقطر.
  3. امزج 30 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 مع 20 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل TGF-β1 وماصة عدة مرات. أضف 10 ميكرولتر من 1 ملغم/مل من JBNts إلى خليط matrilin-3/TGF-β1 لإعداد عينة JBNm. مرة أخرى ، ماصة مرارا وتكرارا.
  4. أضف 3 ميكرولتر من محلول JBNt (200 ميكروغرام / مل) و 3 ميكرولتر من محلول JBNm على شبكات منفصلة ، واتركها لمدة 2 دقيقة.
  5. شطف كل شبكة مع 100 ميكرولتر من محلول خلات اليورانيل (0.5 ٪). استخدم أوراق الترشيح لإزالة المحلول الزائد والسماح للشبكات بالجفاف في الهواء.
  6. تشغيل المجهر الإلكتروني الناقل لمراقبة العينات وتوصيفها بشكل صحيح ، كما هو منشور سابقا11,12.

6. قياس أطياف الامتصاص للبروتينات ذات العلامات الفلورية

ملاحظة: يتم التحقق من بنية JBNm من خلال مراقبة هياكل JBNm مع التحليل الطيفي للامتصاص.

  1. قم بتسمية TGF-β1 باستخدام مجموعة ملصقات البروتين باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أضف 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل تحمل علامة TGF-β1 إلى 25 ميكرولتر من H2O لإنشاء حل اختبار 8.9 ميكروغرام / مل.
  2. قم بتسمية matrilin-3 باستخدام مجموعة ملصقات منفصلة. أضف 20 ميكرولتر من 80 ميكروغرام / مل من ماتريلين-3 إلى 25 ميكرولتر من H2O لصنع محلول اختبار 36 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: أدى وسم صبغة الفلورسنت ل TGF-β1 إلى تركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام/مل، في حين أدى وسم الماتريلين-3 إلى تركيز نهائي قدره 80 ميكروغرام/مل.
  3. امزج 20 ميكرولتر من 80 ميكروغرام / مل من ماتريلين-3 مع 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل تحمل علامة TGF-β1 و 5 ميكرولتر من H2O ، مما أدى إلى مركب TGF-β1 / matrilin-3 المسمى . ماصة الخليط عدة مرات للخلط.
  4. أضف 5 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts إلى 40 ميكرولتر من H2O ، مما أدى إلى محلول 111 ميكروغرام / مل.
  5. أضف 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل تحمل علامة TGF-β1 إلى 20 ميكرولتر من 80 ميكروغرام / مل تحمل علامة matrilin-3 وماصة عدة مرات. أضف 5 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts إلى محلول TGF-β1 / matrilin-3 المسمى ، وماصة بشكل متكرر لخلط المركب بشكل صحيح.
    ملاحظة: كانت التركيزات النهائية لعينات JBNt، المسماة TGF-β1، وعينات matrilin-3 المسماة 111 ميكروغرام/مل، و8.9 ميكروغرام/مل، و36 ميكروغرام/مل، على التوالي.
  6. انقل كل مجموعة عينة (أي TGF-β1 (الخطوة 6.1) ، و matrilin-3 (الخطوة 6.2) ، ووصفت TGF-β1 / matrilin-3 (الخطوة 6.3) ، و JBNts (الخطوة 6.4) ، و JBNm (الخطوة 6.5)) إلى بئرها الخاص من لوحة سوداء ذات 384 بئرا.
  7. قم بتحميل اللوحة السوداء ذات ال 384 بئرا في قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع وخذ قياسات بأطوال موجية مثيرة تبلغ 488 نانومتر و 555 نانومتر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

7. في المختبر اختبار الوظيفة البيولوجية

  1. اختبار التصاق الخلايا على الغطاءغرف الزجاجية المطلية مسبقا
    1. قم بإعداد نظارتين من الأغطية مع خمس مجموعات من العينات ، حيث يتم استخدام غطاء واحد لكل نوع من أنواع الخلايا.
    2. أضف 1.25 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts إلى 198.75 ميكرولتر من الماء المقطر ، مما أدى إلى محلول 6.25 ميكروغرام / مل.
    3. أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 190 ميكرولتر من الماء المقطر ، مما يؤدي إلى 0.5 ميكروغرام / مل.
    4. أضف 2.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/مل TGF-β1 إلى 197.5 ميكروغرام/مل من الماء المقطر، مما يؤدي إلى محلول 0.125 ميكروغرام/مل.
    5. بالنسبة لمجموعة JBNm ، أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 2.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / mLTGF-β1 وماصة مرارا وتكرارا. أضف 1.25 ميكرولتر من JBNts بتركيز 1 ملغم/مل إلى محلول الخليط والماصة. وأخيرا، أضف 186.25 ميكرولتر من الماء المقطر لينتج عنه محلول JBNm سعة 200 ميكرولتر.
      1. بالنسبة للمجموعة الضابطة ، استخدم 200 ميكرولتر من الماء المقطر.
    6. أضف كل مجموعة عينة إلى بئرها الخاص من زجاج الغلاف رقم 1.5 ذو الحجرات. ضع الغطاء الزجاجي في ثلاجة -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم قم بتجميده وتجفيفه باستخدام أداة lyophilizer.
    7. زرع الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) والخلايا الغضروفية البشرية (10000 خلية لكل بئر) في كل بئر من نظارات الغلاف المحضرة.
    8. احتضن نظارتي الغطاء لمدة 4 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية. ثم ، استطلع وسط زراعة الخلايا وشطفه مرتين باستخدام PBS.
    9. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 5 دقائق، ومن ثم إزالة وشطف العينات مع PBS. شطف العينة مرة ثانية لإزالة 4٪ بارافورمالديهايد تماما.
    10. احتضان الخلايا مع 100 ميكرولتر من 0.1 ٪ Triton-X لمدة 10 دقائق وغسلها مع PBS. أضف 100 ميكرولتر من 0.165 ميكرومتر من الرودامين-فالويدين إلى كل بئر. انتظر لمدة 30 دقيقة ثم اغسلها باستخدام PBS مرة أخرى.
    11. أضف 0.1 ميكروغرام / مل DAPI إلى كل بئر لتلطيخ النوى. انتظر لمدة 5 دقائق وشطف الآبار باستخدام PBS مرتين.
    12. استخدم المجهر الطيفي البؤري لمراقبة مورفولوجيا الخلية والتقاط الصور الفلورية.
    13. علاوة على ذلك ، قم بتحليل رقم الخلية والمورفولوجيا باستخدام برنامج معالجة الصور. افتح البرنامج وقم بتحميل الصور. أضف شريط مقياس وقم بمعايرة البرنامج. احسب عدد الخلايا في منطقة معينة لكل عينة. ثم استخدم أداة القياس لجمع البيانات حول مورفولوجيا الخلية لكل عينة.
  2. تكاثر الخلايا
    1. قم بإعداد ثلاث صفائح غير معالجة من 96 بئرا ، مع إضافة خمس مجموعات من العينات إلى كل منها.
      1. بالنسبة لمجموعة JBNt ، أضف 3.75 ميكرولتر من 1 mg / mL JBNts إلى 596.25 μL من الماء المقطر ، مما أدى إلى محلول JBNt 600 ميكرولتر بتركيز 6.25 ميكروغرام / مل.
      2. بالنسبة لمجموعة TGF-β1 ، أضف 7.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 إلى 592.5 ميكرولتر من الماء المقطر ، مما أدى إلى محلول اختبار 0.125 ميكروغرام / مل.
      3. بالنسبة لمجموعة matrilin-3 ، أضف 30 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 570 ميكرولتر من الماء المقطر ، مما أدى إلى محلول اختبار 0.5 ميكروغرام / مل.
      4. بالنسبة لمجموعة JBNm ، امزج 7.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 مع 30 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 وماصة عدة مرات ، تليها إضافة 3.75 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNts إلى المحلول.
      5. قم بتخفيف محلول JBNm باستخدام 558.75 ميكرولتر من الماء المقطر للحصول على التركيزات النهائية البالغة 6.25 ميكروغرام / مل ، و 0.125 ميكروغرام / مل ، و 0.5 ميكروغرام / مل ، على التوالي ، لعينات JBNt و TGF-β1 و matrilin-3.
      6. بالنسبة للمجموعة الضابطة ، استخدم 600 ميكرولتر من الماء المقطر.
    2. قسم كل مجموعة عينة إلى ستة آبار (عينة 100 ميكرولتر لكل بئر).
    3. ضع الألواح الثلاثة التي تحتوي على جميع العينات في ثلاجة -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم جففها بالتجميد باستخدام أداة التجفيد.
    4. بذور hMSCs على هذه الصفائح ، يتلقى كل منها تعليق خلية 100 ميكرولتر (لكل بئر) يحتوي على 5000 خلية. احتضن اللوحات الثلاث عند 37 درجة مئوية لمدة 1 يوم أو 3 أيام أو 5 أيام عند 5٪ CO2.
    5. أضف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر مع الخلايا واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أخرى.
    6. قم بقياس قيم الامتصاص لكل بئر باستخدام قارئات الصفائح الدقيقة متعددة الأوضاع عند 450 نانومتر.
    7. زرع تدرج معروف من hMSCs على صفيحة 96 بئر وحضانة لمدة 4 ساعات. استخدم فحص CCK-8 لقياس قيم امتصاص العدد المعروف من الخلايا وإنشاء منحنى قياسي.
    8. احسب تكاثر الخلايا باستخدام منحنى معيار الامتصاص.
  3. اختبار الثبات
    ملاحظة: تم استخدام مجموعة ELISA البشرية المستهدفة TGF-β1 لتحديد النسبة المئوية لإطلاق TGF-β1 من JBNm في هيدروجيل الأغاروز.
    1. تحضير 2٪ من الأغاروز عن طريق إضافة 400 ملغ من مسحوق الأغاروز إلى 20 مل من PBS وتسخينه حتى 100 درجة مئوية لإذابة مسحوق الأغاروز تماما.
    2. تحضير JBNm داخل هيدروجيل الأغاروز المبرد بنسبة 2٪.
      1. الجمع بين 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 ، 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 ، 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNts ، و 195 ميكرولتر من PBS. امزج هذا المحلول مع 250 ميكرولتر من 2٪ من الأغاروز ، مما يخلق هيدروجيل JBNm.
    3. أضف 500 ميكرولتر من PBS ، واستخدمه كحل للإصدار ، وتأكد من تغييره كل 3 أيام. احتفظ بكل حل تم إصداره ، واترك العينة تجلس لمدة 15 يوما.
    4. استخدم مجموعة ELISA لاختبار كل حل من حلول الإصدار التي تم التقاطها ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: بطرح كمية TGF-β1 الصادرة في PBS من قيمة التحميل النظرية البالغة 100٪، يمكن تحديد الكمية المتبقية من TGF-β1.
  4. تحليل تمايز الخلايا باستخدام PCR26.
    1. قم بإعداد سبع مجموعات من العينات مع كل عينة تحتوي على 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا (4 × 104 خلايا) ، و 30 ميكرولتر من المحلول المحدد (أو PBS ، اعتمادا على مجموعة العينة) ، و 50 ميكرولتر من 2 وزن ٪ من الأغاروس.
      1. بالنسبة لمجموعة TGF-β1 ، أضف 5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 إلى 25 ميكرولتر من PBS ، مما أدى إلى حل 1.6 ميكروغرام / مل.
      2. بالنسبة لمجموعة matrilin-3 ، أضف 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 10 ميكرولتر من PBS ، مما أدى إلى محلول 6.7 ميكروغرام / مل.
      3. بالنسبة لمجموعة JBNt ، أضف 2.5 ميكرولتر من 1 mg / mL JBNts إلى 27.5 μL من PBS ، مما أدى إلى محلول 83.3 ميكروغرام / مل.
      4. بالنسبة لمجموعة J / T / M JBNm ، أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 وماصة لأعلى ولأسفل لخلط المحلول. ثم أضف 2.5 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts وماصة مرة أخرى. أخيرا ، تمييع مع 2.5 ميكرولتر من PBS.
      5. لكل مجموعة تحكم ، استخدم 30 ميكرولتر من PBS كعينة.
    2. أضف 0.5 مل من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر ، مع التأكد من استبداله كل 3 أيام.
      1. بالنسبة لمجموعة التحكم الإيجابية ، استخدم وسيطا غضروفيا hMSC متاحا تجاريا يحتوي على TGF-β1 مضاف. هذا TGF-β1 الإضافي يساوي المبلغ في كل من مجموعات TGF-β1 و J / T / M JBNm.
      2. بالنسبة لإحدى مجموعات التحكم السلبية، استخدم وسيطا غضروفيا تجاريا hMSC لا يحتوي على TGF-β1. بالنسبة لمجموعة التحكم السلبية الأخرى ، استخدم وسيط زراعة خلايا DMEM يحتوي على 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS).
      3. لكل مجموعة أخرى ، استخدم وسيطا تجاريا لزراعة الخلايا الغضروفية hMSC بدون TGF-β1.
    3. استزرع العينات لمدة 15 يوما.
    4. استخراج الحمض النووي الريبي للعينات وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لدراسة تمايز العينات كما هو موضح سابقا26.
  5. التلطيخ المناعي لفحص تعبير الكولاجين من النوع X
    1. قم بإعداد سبع عينات قائمة على الأغاروز بنفس طريقة تمايز الخلايا مع قسم طريقة PCR (الخطوة 7.4).
    2. استزرع العينات لمدة 15 يوما.
    3. إصلاح العينات مع 4 ٪ الفورمالديهايد لمدة 1 يوم ، نقع في محلول السكروز 30 ٪ بين عشية وضحاها ، ثم تجميد بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية مع النيتروجين السائل. قم بإصلاح العينات باستخدام كاشف مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) ، وهو مزيج من الجليكولات والراتنجات القابلة للذوبان في الماء ، عند -10 درجة مئوية.
    4. قم بتشغيل ميكروتوم كريوستات للحصول على أقسام مجمدة بسماكة 20 ميكرومتر من كل عينة.
    5. قم بتلطيخ كل قسم بجسم مضاد مضاد للكولاجين X مع تخفيف 1:800 وجسم مضاد ثانوي يحمل علامة الفلورسنت المخفف باستخدام PBS ، وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
    6. راقب كل قسم باستخدام مجهر بؤري ، باستخدام إثارة 488 نانومتر وتكبير 40x على العين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد البروتوكول ، تم تصنيع JBNts بنجاح وتميزت بامتصاص UV-Vis و TEM. JBNm هي سقالة صلبة قابلة للحقن تخضع لعملية محاكاة حيوية سريعة. بعد إضافة JBNts إلى خليط من محلول TGF-β1 / matrilin-3 في بيئة فسيولوجية ، تم تشكيل سقالة شبكية بيضاء صلبة تشير إلى التجميع الناجح ل JBNm ، كما هو موضح في الشكل 1. وقد تجلى ذلك في أساليب التوصيف.

في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون الأمتريلين-3 سالبة الشحنة بسبب النقطة الكهربية المتساوية27 (الشكل 2A). بعد إضافة محلول TGF-β1 إلى محلول matrilin-3 ، زادت إمكانات زيتا لمركب TGF-β1 / matrilin-3 إلى قيمة شبه محايدة ، مما يشير إلى أن البروتينين مرتبطان عبر تفاعلات الشحنة. وكما هو مبين في الشكل 2 ألف، فإن إمكانات زيتا ل JBNm هي الأعلى بين المجموعات الثلاث بسبب JBNts، حيث أن النقطة المتساوية الكهربية للسلسلة الجانبية لليسين تبلغ حوالي 9.74 في بيئة فسيولوجية. تشير الزيادة في قيم زيتا المحتملة ل JBNm إلى التجميع الناجح لهيكلها طبقة تلو الأخرى.

توضح أطياف امتصاص UV-Vis (الشكل 2B) تشكيل الهيكل الداخلي الهرمي طبقة تلو الأخرى ل JBNm. ساهمت الحلقات العطرية للسلاسل الجانبية لليسين و JBNts في قمتي الامتصاص عند 220 نانومتر و 280 نانومتر ، على التوالي. لوحظ الانخفاض في قيمة الامتصاص بعد إضافة TGF-β1 ، مما يشير إلى أن الارتباط يحدث بين TGF-β1 و JBNts. بعد إضافة JBNts إلى matrilin-3 ، لوحظ انخفاض أكثر وضوحا في كثافة امتصاص القمم ، مما يشير مرة أخرى إلى الارتباط الناجح بين matrilin-3 و JBNts. وبالمثل ، بعد إضافة JBNts إلى خليط من TGF-β1 / matrilin-3 ، تم تشكيل JBNm ، وانخفضت قمم الامتصاص في الكثافة. ذروة امتصاص JBNm أقرب إلى خط matrilin-3 / JBNts من خط TGF-β1 / JBNts ، مما يشير إلى أن JBNts تفضل الارتباط ب matrilin-3 ، وتشكل بنية خارجية طبقة تلو الأخرى مع matrilin-3 بينما توجد TGF-β1 في الطبقة الداخلية. يستخدم TEM لتوصيف مورفولوجيا JBNts و JBNm (الشكل 2C). بعد الاندماج مع البروتينات ، لوحظت حزم سميكة من JBNm تشكل بنية سقالة.

أكد الفحص المجهري الفلوري وجود بنية طبقة تلو الأخرى (الشكل 3A) وأظهر المقطع العرضي ل JBNm. بعد وضع العلامات على TGF-β1 و matrilin-3 ، لوحظ أن الفلورسنت الأحمر matrilin-3 يغلف حزم JBNt ، ويشكل الطبقة الخارجية من JBNm. في الشكل 3B ، شكل TGF-β1 الفلورسنت الأخضر طبقة داخلية ، مما ساهم في القدرة على تخزين عوامل النمو والسماح بتوطين TGF-β1. يعرض الشكل 3C عملية نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) بين البروتينات الموسومة بالصبغة الفلورية كما تتميز بأطياف التألق ، مع قمم الانبعاثات عند 520 نانومتر و 570 نانومتر للمجموعتين TGF-β1 و matrilin-3 ، على التوالي28. بعد إضافة JBNts وفقا للبروتوكول ، يتم تشكيل بنية طبقة تلو الأخرى ؛ لوحظت قمم عند كل من 520 نانومتر و 570 نانومتر لمجموعة JBNm ، مما يشير إلى نجاح ربط وتجميع البروتينات و JBNts.

بالإضافة إلى ذلك ، تم استكشاف تأثير JBNm على التصاق hMSCs وتكاثر الخلايا. كما هو موضح في الشكل 4 ، تم تحديد كثافة التصاق الخلايا ل JBNm المطلي على سطح نظارات الغلاف ذات الحجرات. أظهر JBNm أن hMSCs تتجمع على طول نفسه (الشكل 4A) ، في حين التزم عدد أقل من الخلايا ب JBNts. ومع ذلك ، بالنسبة للمجموعات الأخرى ، تم توزيع hMSCs بالتساوي دون محاذاة مقارنة بمجموعة JBNm. أظهرت محاذاة الخلايا ، وكذلك حجم الخلايا على JBNm ، أن JBNts لعبت دورا في التصاق الخلايا ، في حين أن البروتينات في JBNm زادت من تقارب التصاق الخلايا (الشكل 4B ، C).

بعد اليوم الأول من زراعة الخلايا مع JBNm و JBNts و matrilin-3 وحدها و TGF-β1 وحدها والتحكم السلبي ، أظهرت مجموعات JBNm و TGF-β1 تكاثرا كبيرا للخلايا عند مقارنتها بالمجموعات الأخرى. عندما تم زيادة مدة زراعة الخلايا إلى 3 و 5 أيام ، أظهرت مجموعات JBNm و TGF-β1 زيادة أكبر في تكاثر الخلايا ، كما هو موضح في الشكل 5. تم إجراء دراسة دالة طويلة الأجل لتحديد تمايز hMSCs مع JBNm وبدون JBNm (التحكم السلبي). بعد 15 يوما ، لوحظت بقعة زرقاء ألسيان محسنة ، مما يشير إلى تكوين غضروفي ل hMSCs ينمو جنبا إلى جنب مع JBNm26. وبالتالي ، فضلت الخلايا JBNts من JBNm. ومن المحتمل أن يكون هذا بسبب هيكلها الذي يحاكي الحمض النووي وقدرتها على تفكيكها إلى وحدات جزيئية صغيرة، يمكن أن تحدث الأخيرة بسبب انخفاض درجة الحموضة أو النشاط الأنزيمي الكافي (مثل الامتصاص من قبل الخلايا)14،29.

الفيديو 1: تسجيل فيديو لتجميع JBNm. يصور هذا التسجيل تشكيل JBNts و matrilin-3 و TGF-β1 في JBNm. تم تعديل هذا الرقم من Zhou et al. (2021)26. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي للتركيب الكيميائي ل JBNts و J / T / M JBNm وقدرة J / T / M JBNm chondrogenic . (A) التركيب الكيميائي ل JBNts ، مع تسليط الضوء على تكوينها من المونومر إلى حلقة الوردة إلى JBNt. (B) المكونات التي تشكل J / T / M JBNm ، وكذلك كيفية تجميعها في JBNm. (C ) مخطط زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية على J/T/M JBNm. تم تعديل هذا الرقم من Zhou et al. (2021)26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توصيف المواد لأطياف J/T/M JBNm. (A) zeta-potential spectra of matrilin-3 وحدها، ومركب TGF-β1/matrilin-3، وأطياف امتصاص J/T/M JBNm. (B) لأطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ل JBNts وحدها، و matrilin-3 وحده، وTGF-β1 وحده، ومركب Matrilin-3/JBNts، ومركب TGF-β1/JBNts، ومركب J/T/M JBNm. (c) ) صور ل JBNts وحدها و J/T/M JBNm تم الحصول عليها من المجهر الإلكتروني الناقل (TEM). تم تعديل هذا الرقم من Zhou et al. (2021)26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصوير البؤري الفلوري وأطياف التألق ل J/T/M JBNm. (A) صورة ثلاثية الأبعاد متحدة البؤرة ل J/T/M JBNm، مع ماتريلين-3 تحمل علامة الفلورسنت الأحمر وTGF-β1 تحمل علامة الفلورسنت الأخضر. (ب) صور ثنائية البؤرة ل J/T/M JBNm، مع ماتريلين-3 تحمل علامة الفلورسنت الأحمر، وTGF-β1 تحمل علامة الفلورسنت الأخضر، ونسخة مدمجة. (ج) أطياف التألق من المركبات المختلفة لتوصيف عملية FRET بين البروتينات الموسومة. تم تعديل هذا الرقم من Zhou et al. (2021)26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSC). (أ) صور المجهر الضوئي ل hMSCs مع TGF-β1 و matrilin-3 و JBNts ، المستزرعة على هلام الأغاروز. (ب) صور المجهر البؤري ل hMSCs المستزرعة على زجاج الغطاء الحجري المطلي بمجموعة متنوعة من مكونات JBNm. (ج) رسم بياني لعدد الخلايا الملتزمة لكل ملليمتر مربع لكل مجموعة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية. (د) رسم بياني لطول محور الخلية الرئيسي بالميكرومتر لكل مجموعة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية. ملاحظة: N ≥ 3, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001 (مقارنة بالضوابط السلبية, NC). تم تعديل هذا الرقم من Zhou et al. (2021)26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقارنة أرقام الخلايا لمجموعات مختلفة بين الأيام 1 و 3 و 5. إحصائيات عدد الخلايا ل hMSCs بعد زراعتها بمواد مختلفة في الأيام 1 و 3 و 5. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية. ملاحظة: N = 6, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. تم تعديل هذا الرقم من Zhou et al. (2021)26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الهدف من هذه الدراسة هو تطوير منصة سقالة محاكاة حيوية ، JBNm ، للتغلب على قيود هياكل الأنسجة التقليدية التي تعتمد على بيئات زراعة الخلايا للتوسط في تمايز الخلايا. JBNm عبارة عن سقالة بنية طبقة تلو الأخرى لبناء أنسجة غضروفية مستدامة ذاتيا. ويستند التصميم المبتكر إلى مواد نانوية جديدة مستوحاة من الحمض النووي، وهي JBNts. يتم تجميع JBNm ، المكون من JBNts30 و TGF-β1 و matrilin-3 ، من خلال تقنية جديدة طبقة تلو الأخرى حيث تم التحكم في التجميع الذاتي للسقالة على المستوى الجزيئي. وقد لوحظ تجميع JBNm وتميز بقياس جهد زيتا، وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية-Vis، وTEM، والتحليل الطيفي الفلوري.

وقد أظهرت أطياف الأشعة فوق البنفسجية UV-Vis في الشكل 2B (الخطوة 3) تشكيل الجزء الداخلي الهرمي طبقة تلو الأخرى من JBNm. يمكن ملاحظة اختلاف في قمم الامتصاص بسبب اختلاف في تقارب الربط. تحدث تفاعلات رئيسية بين JBNts و matrilin-3 أكثر من التفاعلات بين JBNts و TGF-β1 مما يشير إلى أن JBNts يحاكي بروتينات الكولاجين من حيث مورفولوجيتها الليفية وكيمياء سطح الليسين. هذه التقنية ضرورية لمراقبة ارتباط JBNts ب matrilin-3 بدلا من TGF-β1 ، مما يسمح بتغليف TGF-β1 وبالتالي توفير إطلاق بطيء ل TGF-β1 في الأنسجة المحيطة. الخطوة الأكثر أهمية في تطوير JBNm هي مزيج من البروتينات مع JBNts. يجب إضافة TGF-β1 و matrilin-3 قبل إضافة JBNts لمراقبة التأثير الكامل لظاهرة FRET بين matrilin-3 و TGF-β1. ينبع الحد من هذه التقنية من تسلسل الإضافة غير الصحيح للبروتينات والأنابيب النانوية ، مما يؤدي إلى قياسات متنوعة. هذه خطوة مهمة لتشكيل JBNm للدراسات المستقبلية ، وبالتالي ، سيتم تطبيقها على تلفيقات ودراسات JBNm المستقبلية.

Matrilin-3 هو بروتين سلبي للغاية ، في حين أن TGF-β1 هو بروتين محايد قليلا ، كما هو موضح في الشكل 2A. لوحظ اختلاف الشحنة لتحديد ارتباط هذه البروتينات. من الحالة السالبة الشحنة للماتريلين-3 ، زاد جهد زيتا إلى قيمة شبه محايدة بعد إضافة TGF-β1 (الشكل 2A). هذه الخطوة مهمة لتحديد الطبقة الداخلية الأولى من سقالة المحاكاة الحيوية ، وللإشارة إلى أن الجمع بين كلا البروتينين يتم من خلال تفاعل الشحنة. بعد إضافة JBNts ، وهي الخطوة الثانية من تصنيع JBNm ، تم قياس إمكانات زيتا ل JBNm عند ~ 10 ± 5 mV (الشكل 2A). نظرا لأن JBNts إيجابية للغاية ، فقد لوحظ أن شحنة JBNm تزداد كما هو متوقع. وبالتالي فإن تحديد الشحنات ذات إمكانات زيتا مهم لمراقبة تكوين JBNm خطوة بخطوة عبر تفاعلات الشحنة. على غرار التحليل الطيفي UV-Vis ، فإن تسلسل الإضافة مهم في هذه الخطوة ، وقد يؤدي ترتيب الإضافة غير الصحيح إلى قياسات متنوعة. وبالمثل ، من المهم ماصة الخليط لأعلى ولأسفل قبل القياس.

بعد ذلك ، يتم تصنيف TGF-β1 و matrilin-3 بحيث يمكن ملاحظة تطور JBNm باستخدام المجهر البؤري والتحليل الطيفي الفلوري باستخدام قارئات الصفائح الدقيقة متعددة الأوضاع. كانت العينات متحمسة باستخدام ليزر 488 نانومتر وأظهرت قمم الانبعاثات عند 520 نانومتر و 570 نانومتر (الشكل 3). لم يلاحظ أي ذروة للانبعاثات ل JBNts وحدها لأنها غير موسومة. وحدث هذا الاضطراب من المتبرع ب TGF-β1 إلى مستقبل الأم ماتريلين-3، مما قلل من ذروة الانبعاثات عند 520 نانومتر وزاد من ذروة الانبعاثات عند 570 نانومتر؛ المكونان متباعدان 10 نانومتر في المسافة ، مما يسمح بحدوث ظاهرة FRET. لذلك ، يعتمد تجميع JBNm على العمليات المكانية (أي المسافة المادية) جنبا إلى جنب مع تفاعلات الشحنة. الخطوة الأكثر أهمية في تطوير JBNm هي تسلسل الإضافة. يجب إضافة TGF-β1 و matrilin-3 قبل إضافة JBNts لمراقبة التأثير الكامل لظاهرة FRET. مطلوب تكبير ما لا يقل عن 40x على العدسة لمراقبة JBNm الفلورسنت. الحد من هذه التقنية هو أن JBNts ليست موسومة ، وبالتالي ، لا يمكن ملاحظتها باستخدام المجهر البؤري. ومع ذلك ، يمكن تطبيق تقنية وضع العلامات على البروتين لتسمية JBNt مع بعض التعديلات للتطبيقات المستقبلية.

يمكن أن يساعد JBNm وظائف الخلية ، مثل التصاق الخلايا وتكاثرها. في هذه الدراسة ، تم استزراع hMSCs (بدءا من 5000 خلية) على مواد مختلفة (JBNm و JBNts و TGF-β1 و matrilin-3 وعناصر تحكم سلبية بدون إضافات) لمقارنة أرقام الخلايا بعد الحضانة لمدة 1 و 3 و 5 أيام باستخدام محلول CCK-8 ، باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة الدقيقة لتحديد انتشار الخلايا. أظهر JBNm ، خاصة في وجود TGF-β1 ، و TGF-β1 وحدهما انتشارا كبيرا للخلايا مقارنة بالمجموعات الثلاث الأخرى. يحاكي JBNts الكولاجين في ECM من الناحية المورفولوجية بينما Matrilin-3 هو بروتين خاص بالغضروف ، مما يؤدي إلى زيادة نشاط تكاثر الخلايا بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 و 5 أيام (الشكل 5). وقد أظهرت JBNm إمكانات كبيرة لتكون بمثابة سقالة هندسة الأنسجة عن طريق الحقن والمحاكاة الحيوية للتغلب على القيود المفروضة على بنى الخلايا التقليدية لمختلف التطبيقات المستقبلية كمواد حيوية29,31. يحاكي JBNm الغضروف ECM من الناحية المورفولوجية ، مما يوفر مواقع الالتصاق ويسمح بإطلاق عوامل تمايزية مؤيدة للغضروف في البيئة الدقيقة ، مثل TGF-β132,33. إن قدرة JBNm على دمج TGF-β1 في الطبقة الداخلية للسقالة تمنعها من التسرب إلى مناطق غير مرغوب فيها ، وبالتالي تحسين فعالية السقالة (الشكل 4 والشكل 5). وينظر إلى العديد من hMSCs على طول سقالة JBNm ، في حين يتم توزيع الخلايا بشكل ضئيل في matrilin-3 و TGF-β1 ومجموعات التحكم السلبية (الشكل 4). كما لوحظ مورفولوجيا الخلايا ، مما يشير إلى تقارب ممتاز مع أسطح JBNm. تمنع هذه المواد الحيوية المصممة بدقة الإطلاق السريع للجزيئات النشطة بيولوجيا المدمجة في بيئة زراعة الخلايا وتحسن الاستدامة الذاتية لهياكل الأنسجة داخل المصفوفة34. أحد قيود هذه التقنية هو أن أرقام خلايا البداية ضرورية لتحديد تكاثر الخلايا. تم العثور على عدد خلايا البدء من 5000 الأمثل لهذه الدراسة. هناك حاجة أيضا إلى منحنى قياسي لتحديد رقم الخلية عن طريق رسم عدد معروف من الخلايا وقياسها في قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع. يمكن تطبيق هذه التقنية في المستقبل كطريقة موحدة لتحديد تكاثر الخلايا عبر جميع الدراسات المتعلقة بسقالات JBNm.

تم استزراع hMSCs في كريات الأغاروز 3D مع وبدون JBNm لتحديد دراسة الوظيفة طويلة الأجل لمدة 15 يوما. بعد 15 يوما ، تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من hMSCs في كريات الأغاروز ، التي تحتوي على تحكم إيجابي (تم تزويد الكريات ب TGF-β1 الطازج في كل مرة تم فيها تغيير الوسط) ، JBNm ، JBNts ، matrilin-3 ، TGF-β1 ، وليس هناك إضافات. تم إجراء qPCR في الوقت الفعلي لتحليل الجينات ، واختبار علامات التمايز الغضروفي ، Aggrecan (ACAN) ، وعلامة التضخم من نوع X الكولاجين (COL X). زاد تعبير ACAN في مجموعة JBNm بشكل كبير مقارنة بالمجموعات الأخرى ، مما يدل على أن JBNm يعزز التمايز الغضروفي للخلايا الجذعية بشكل كبير مع تثبيط COL X. وفي الوقت نفسه ، عزز التحكم الإيجابي تكوين الغضروف ، كما لوحظ في الزيادة في ACAN ، وكذلك تضخم الخلية المتمايزة26. هناك قيد آخر لهذه الدراسة هو أن استخراج الحمض النووي الريبي هو من الخلايا المضمنة في هيدروجيل. وبالتالي ، كان إجمالي الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه في هذا البروتوكول منخفضا في التركيز والنقاء. للتغلب على هذا القيد ، تم استزراع المزيد من العينات واستخراجها للحصول على التركيز والنقاء الأمثل للخطوة التالية ، qPCR في الوقت الفعلي. في حين أن qPCR مهم للدراسة ، إلا أن التعديل الطفيف لهذه التقنية ضروري للدراسات المستقبلية لضمان استخراج العينات بكفاءة دون التضحية بعدد كبير من العينات.

تم إجراء اختبار استقرار باستخدام مجموعة TGF-β1 ELISA البشرية لاختبار إطلاق البروتين من هيدروجيل JBNm. في هذه الدراسة ، من المتوقع أن يتم تغليف TGF-β1 في J / T / M JBNm ، وبالتالي لا ينبغي ملاحظة أي إطلاق TGF-β1 (أي أن قيمة التحميل النظرية هي 100٪). أحد قيود هذه الخطوة هو أنه من المفترض أن يتم تغليف جميع TGF-β1 في سقالة JBNm طبقة تلو الأخرى. بعد 15 يوما ، يتم جمع المحاليل التي يتم إطلاقها من الهيدروجيل واختبارها باستخدام المجموعة ، باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، تم حساب مقدار TGF-β1 عن طريق طرح مبلغ TGF-β1 الذي تم إصداره في PBS من قيمة التحميل النظرية. نظرا لأن TGF-β1 كان مغلفا في الطبقة الداخلية من JBNm ، فقد كان من المتوقع الإطلاق البطيء للبروتين. أظهرت الدراسة أن TGF-β1 موضعي داخل سقالة JBNm ولا يطلق بسرعة في المناطق المحيطة26.

تم تحقيق هذا البناء المبتكر لأنسجة غضروف JBNm طبقة تلو الأخرى من خلال التجميع الذاتي عالي التنظيم والتحكم على المستوى الجزيئي. يقتصر TGF-β1 في الطبقة الداخلية من ألياف المصفوفة ، مما يمنع تسربه إلى مواقع غير مرغوب فيها ، ويعزز تكوين الغضروف الموضعي في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توطين matrilin-3 في الطبقة الخارجية من ألياف المصفوفة ، مما يخلق بيئة دقيقة مضادة للضخامة35. وقد ثبت أن JBNts لا تعمل فقط كعمود فقري سقالة هيكلية ولكن أيضا تعزز إرساء الخلايا الجذعية والالتصاق لتوطين الخلايا على طول ألياف المصفوفة30,36. أما بالنسبة للعمل المستقبلي ، تخصيص التصميم طبقة تلو الأخرى للسقالة القائمة على JBNt للتطبيقات في الأنسجة المختلفة 37،38،39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الدكتور يوبينغ تشن هو المؤسس المشارك لشركة Eascra Biotech, Inc. و NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 7R01AR072027 و 7R03AR069383 ، وجائزة NSF المهنية 1905785 ، و NSF 2025362 ، وجامعة كونيتيكت. يتم دعم هذا العمل أيضا جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة S10OD016435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 185،
تصنيع وتوصيف مصفوفة نانو قاعدة جانوس طبقة تلو الأخرى لتعزيز تجديد الغضروف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter