层层自组装制备与表征双面纳米基质以促进软骨再生

摘要

本方案描述了通过依次添加Janus碱基纳米管（JBNts）、matrilin-3和转化生长因子β-1（TGF-β1）来组装逐层Janus碱基纳米基质（JBNm）支架的方法。该JBNm已被制备并表征，此外还表现出优异的生物活性，可促进细胞黏附、增殖和分化等功能。

摘要

已开发出多种生物材料支架，以引导细胞黏附和增殖，旨在促进特定功能的实现 体外 和 体内 应用。通常将生长因子添加到这些生物材料支架中，以提供最佳的细胞培养环境，介导细胞分化及其后续功能。然而，传统生物材料支架中的生长因子通常设计为在植入后释放，可能对周围组织或细胞产生 unintended 的副作用。在此，受DNA启发的Janus碱基纳米基质（JBNm）成功构建了具有逐层结构的高度局部化微环境，用于自持性软骨组织的构建。JBNm由Janus碱基纳米管（JBNts）、matrilin-3和转化生长因子β-1（TGF-β1）自组装而成。 通过 亲和结合。JBNm 按照 TGF-β1:matrilin-3:JBNt 质量比为 1:4:10 进行组装，该比例已被确定为可实现逐层结构正确组装的最佳比例。首先，将 TGF-β1 溶液加入 matrilin-3 溶液中，随后反复吹打混合液以确保充分均一，再加入 JBNt 溶液。再次反复吹打后，形成逐层结构的 JBNm。通过多种实验对逐层结构 JBNm、单独 JBNt、单独 matrilin-3 以及单独 TGF-β1 进行表征。采用紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）研究 JBNm 的形成过程，并利用透射电子显微镜（TEM）观察其结构。由于这种创新的逐层 JBNm 支架在分子尺度上构建，因此可通过荧光染料标记的 JBNm 进行观察。TGF-β1 被限制在可注射 JBNm 的内层，从而防止生长因子向周围区域释放，促进局部软骨形成，并营造抗肥大性分化微环境。

引言

在组织工程中，支架对于为细胞附着及后续组织发育提供结构支持具有至关重要的作用¹。通常，不使用任何支架的传统组织构建体依赖细胞培养环境和添加的生长因子来介导细胞分化。此外，将生物活性分子引入支架中通常是引导细胞分化与功能的首选方法^2,3。某些支架可独立模拟天然组织的生化微环境，而另一些则可通过生长因子直接影响细胞功能。via然而，研究人员在选择支架时常面临挑战：既要确保支架能对细胞黏附、增殖和分化产生积极影响，又需在较长时间内提供最佳的结构支持与稳定性^4,5。生物活性分子通常与支架结合不牢固，导致植入后这些蛋白迅速释放，进而在非预期部位产生释放效应。这最终可能导致对非靶向组织或细胞产生不良影响^6,7。

支架通常由高分子材料制成。Janus基底纳米基质（JBNm）是一种仿生支架平台，采用新型逐层自组装方法制备，可用于构建自维持的软骨组织⁸。这些新型的DNA启发纳米管被称为Janus基底纳米管（JBNts），因其能够准确模....

方案

1. JBNts 的合成

1. 采用先前发表的方法制备 JBNt 单体，该过程涉及多种化合物的合成¹²。
2. 合成后，使用反相柱通过高效液相色谱法（HPLC）纯化粗制的 JBNt 单体。使用溶剂 A：100% 水，溶剂 B：100% 乙腈，以及溶剂 C：pH = 1 的盐酸水溶液。流速为 3 mL/min。收集 HPLC 在 7.2 分钟处得到的最大峰组分。

2. JBNt/Matn1/TGF-β1 的制备（视频 1）

注意：视频 1 显示，JBNm 是一种在生理环境中（水溶液、无紫外线、无化学添加剂、无加热）可注射形成的固体，且具有生物启发性。

1. 将8 µL溶于H₂O中的1 mg/mL TGF-β1加入32 µL溶于H₂O中的1 mg/mL matrilin-3中。用移液器吹打以确保这些蛋白质充分混合。
2. 将80 µL溶于H₂O中的1 mg/mL JBNts加入TGF-β1/matrilin-3溶液中。反复吹打以确保充分混匀。加入JBNts后立即可见白色絮状物，表明JBNm的形成（视频1....

结果

按照方案，JBNts 成功合成，并通过紫外-可见吸收光谱和透射电子显微镜（TEM）进行了表征。JBNm 是一种可注射的固体支架，可在生理环境中经历快速的仿生过程。当将 JBNts 加入含 TGF-β1/matrilin-3 溶液的混合物后，在生理环境下形成了一种白色网状固体支架，表明 JBNm 成功组装，如图1所示。这一结果已在表征方法中得到验证。

在生理条件下，由于聚集体蛋白-3的等电点呈负电性²⁷ (图2A加入TGF-β1溶液至matrilin-3溶液后，TGF-β1/matrilin-3复合物的zeta电位升高至接近中性值，表明两种蛋白已结合。 通过 电荷相互作用。如图所示 图 2A，由于JBNts的存在，JBNm的zeta电位在三组中最高，因为赖氨酸侧链在生理环境中的等电点约为9.74。JBNm的zeta电位值升高表明其逐层结构的成.......

讨论

本研究的目标是开发一种仿生支架平台——JBNm，以克服传统组织构建物依赖细胞培养环境来介导细胞分化的局限性。JBNm是一种逐层结构的支架，可用于构建自持性的软骨组织。该创新设计基于一种新型DNA启发的纳米材料——JBNts。JBNm由JBNts³⁰、TGF-β1和matrilin-3组成，通过一种新颖的逐层组装技术构建而成，其支架的自组装过程在分子水平上得以控制。通过zeta电位测量、紫外-可见吸收光谱、透射电子显微镜（TEM）以及荧光光谱分析对JBNm的组装过程进行了观察和表征。

紫外-可见光谱在 图2B （步骤3）已证实JBNm具有分层逐层构建的内部结构。由于结合亲和力的差异，可观察到吸光度峰的不同。JBNts与matrilin-3之间的相互作用强于JBNts与TGF-β1之间的相互作用，表明JBNts在纤维形态和赖氨酸表面化学特性方面模拟了胶原蛋白。该技术对于观察JBNts与matrilin-3而非TGF-β1的结合至关重要，从而实现TGF-β1的包封，进而使其向周围组.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 正常山羊血清	Thermo Fisher	50062Z	用于在染色过程中阻断非特异性抗体结合的试剂。
24孔板	Corning	07-200-740	用于比较性细胞培养的24孔板。
384孔黑色未处理板	Thermo Fisher	262260	用于吸收测量的384孔板。
8孔腔室盖玻片	Thermo Fisher	155409PK	用于比较性细胞培养的8孔盖玻片。
96孔平底板	Corning	07-200-91	用于比较性细胞培养的96孔板。
96孔未处理板	Thermo Fisher	260895	用于比较性细胞培养和分析的96孔板。
琼脂糖凝胶	Sigma-Aldrich	A9539	用于细胞培养的水凝胶。
琼脂糖凝胶	Sigma Aldrich	A9539	作为细胞培养环境使用的水凝胶。
Alexa Fluor 微量蛋白质标记试剂盒	Thermo Fisher	A30006 (488) 和 A30007 (555)	用于标记蛋白质的荧光染料。
抗胶原X抗体	Thermo Fisher	41-9771-82	用于染色胶原X的抗体。
Bio-Rad PCR仪	Bio-Rad		用于对样品进行PCR扩增的设备。
C28/I2 软骨细胞系			用于分析不同样品增殖能力的细胞。
细胞计数试剂盒8	Milipore Sigma	96992	细胞增殖检测。
Cell Profiler	Broad Institute		用于分析细胞图像的软件。
冷冻切片机			用于制备样品薄片以进行染色和显微镜观察的设备。
DAPI	Invitrogen	D1306	可与腺嘌呤-胸腺嘧啶DNA区域结合的蓝色荧光染料。
一次性比色皿	FISHER Scientific	14-955-128	用于分光光度法的容器。
DMEM细胞培养基	Thermo Fisher	10566032	用于支持细胞生长的培养基。
胎牛血清	GIBCO	A4766801	用于细胞培养基中以支持细胞生长的血清。
Fluoromount-G封片剂	Thermo Fisher	00-4958-02	用于免疫染色载玻片封片的溶液。
甲醛			用于在切片前固定样品的化合物。
山羊抗兔IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗	Thermo Fisher	A16110	用于蛋白质染色的抗体。
人源间充质干细胞	LONZA	PT-2501	用于分析不同样品分化能力的细胞。
人源间充质干细胞软骨形成培养基	LONZA	PT-3003	用于促进软骨分化过程的细胞培养基。
ImageJ	National Institutes of Health		与显微镜联用的图像分析软件。
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	用于PCR的试剂盒。
Janus碱基纳米管 (JBNts)			由合成碱基构成的纳米管，用作细胞支架工具。
LaB6 20-120 kV 透射电子显微镜	Tecnai		用于对样品进行透射电子显微镜观察的设备。
MATLAB	MathWorks		用于建模和数据分析的统计软件。
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	作为软骨细胞黏附位点的结构蛋白。
NanoDrop 分光光度计	Thermo Fisher		用于测量样品吸光度值的设备。
Nikon A1R 光谱共聚焦显微镜	Nikon	A1R HD25	用于分析样品的共聚焦显微镜。
1.5号腔室盖玻片	Thermo Fisher	152250	用于无菌细胞培养和成像的环境。
最佳切割温度（OCT）包埋剂			用于在切片前包埋细胞的化合物。
多聚甲醛	Thermo Scientific	AAJ19943K2	用于固定细胞的化合物。
PDC-32G 等离子清洗仪	Harrick Plasma		用于在透射电子显微镜前处理载网的清洗设备。
青霉素-链霉素	GIBCO	15-140-148	用于抑制细胞培养过程中细菌生长的抗生素试剂。
磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	10010023	用于洗涤细胞培养基并在实验过程中作为缓冲液的溶液。
罗丹明-鬼笔环肽	Invitrogen	R415	F-肌动蛋白红色荧光染料。
RNeasy 植物微型试剂盒	QIAGEN	74904	用于RNA提取过程中过滤和均质化样品的试剂盒。
蔗糖溶液			用于切片前处理样品的溶液。
TGF beta-1 人ELISA试剂盒	Invitrogen	BMS249-4	用于检测样品中TGF-β1存在的检测试剂盒。
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	用于刺激软骨分化和增殖的生长因子。
曲拉通X-100	Invitrogen	HFH10	用于裂解染色过程中未固定的细胞的化合物。
TRIzol试剂	Thermo Fisher	15596026	用于分离RNA的试剂。
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		用于测量样品Zeta电位值的设备。