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Neuroscience

Microtrasplante de membranas sinápticas para reactivar los receptores sinápticos humanos para estudios funcionales

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64024
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

El protocolo demuestra que mediante la realización de microtrasplante de membranas sinápticas en ovocitos de Xenopus laevis , es posible registrar respuestas consistentes y confiables de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico y los receptores de ácido γ-aminobutírico.

Abstract

Los receptores ionotrópicos excitatorios e inhibitorios son las principales puertas de los flujos iónicos que determinan la actividad de las sinapsis durante la comunicación neuronal fisiológica. Por lo tanto, las alteraciones en su abundancia, función y relaciones con otros elementos sinápticos se han observado como un correlato importante de alteraciones en la función cerebral y deterioro cognitivo en enfermedades neurodegenerativas y trastornos mentales. Comprender cómo la función de los receptores sinápticos excitatorios e inhibitorios se ve alterada por la enfermedad es de importancia crítica para el desarrollo de terapias efectivas. Para obtener información relevante para la enfermedad, es importante registrar la actividad eléctrica de los receptores de neurotransmisores que permanecen funcionales en el cerebro humano enfermo. Hasta ahora, este es el enfoque más cercano para evaluar las alteraciones patológicas en la función de los receptores. En este trabajo, se presenta una metodología para realizar el microtrasplante de membranas sinápticas, que consiste en reactivar las membranas sinápticas a partir de tejido cerebral humano congelado por snap que contiene receptores humanos, mediante su inyección y posterior fusión en la membrana de ovocitos de Xenopus laevis . El protocolo también proporciona la estrategia metodológica para obtener respuestas consistentes y confiables de los receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) y ácido γ-aminobutírico (GABA), así como nuevos métodos detallados que se utilizan para la normalización y el análisis riguroso de datos.

Introduction

Los trastornos neurodegenerativos afectan a un gran porcentaje de la población. Aunque sus consecuencias devastadoras son bien conocidas, el vínculo entre las alteraciones funcionales de los receptores de neurotransmisores, que son críticos para la función cerebral, y su sintomatología aún no se conoce bien. La variabilidad interindividual, la naturaleza crónica de la enfermedad y la aparición insidiosa de los síntomas son solo algunas de las razones que han retrasado la comprensión de los muchos trastornos cerebrales donde los desequilibrios químicos están bien documentados 1,2. Los modelos animales han generado información invaluable y ampliado nuestro conocimiento sobre los mecanismos subyacentes a la fisiología y la fisiopatología en los sistemas evolutivos conservados; sin embargo, varias diferencias entre especies entre roedores y humanos impiden la extrapolación directa de la función del receptor de modelos animales al cerebro humano3. Por lo tanto, los esfuerzos iniciales para estudiar los receptores humanos nativos fueron desarrollados por el laboratorio de Ricardo Miledi utilizando tejido extirpado quirúrgicamente y muestras congeladas. Estos experimentos iniciales utilizaron membranas enteras que incluyen receptores sinápticos neuronales y sinápticos adicionales, así como receptores de neurotransmisores no neuronales, y aunque proporcionan información importante sobre los estados enfermos, existe la preocupación de que la mezcla de receptores complique la interpretación de los datos 4,5,6,7. Es importante destacar que las sinapsis son el objetivo principal en muchos trastornos neurodegenerativos 8,9; por lo tanto, los ensayos para probar las propiedades funcionales de las sinapsis afectadas son fundamentales para obtener información sobre los cambios relevantes para la enfermedad que afectan la comunicación sináptica. Aquí, se describe una modificación del método original: microtrasplante de membranas sinápticas (MSM), que se centra en la caracterización fisiológica de preparaciones de proteínas sinápticas enriquecidas y se ha aplicado con éxito para estudiar sinaptosomas de ratas y humanos 10,11,12,13,14,15 . Con esta metodología, es posible trasplantar receptores sinápticos que alguna vez estuvieron trabajando en el cerebro humano, incrustados en sus propios lípidos nativos y con su propia cohorte de proteínas asociadas. Además, debido a que los datos de HSH son cuantitativos, es posible utilizar estos datos para integrarse con grandes conjuntos de datos proteómicos o de secuenciación10.

Es importante señalar que muchos análisis farmacológicos y biofísicos de los receptores sinápticos se realizan sobre proteínas recombinantes16,17. Si bien este enfoque proporciona una mejor comprensión de las relaciones estructura-función de los receptores, no puede proporcionar información sobre complejos de receptores multiméricos que se encuentran en las neuronas y sus cambios en la enfermedad. Por lo tanto, una combinación de proteínas nativas y recombinantes debería proporcionar un análisis más completo de los receptores sinápticos.

Hay muchos métodos para preparar sinaptosomas 10,11,12,13,14,15 que se pueden ajustar a los requisitos de un laboratorio. El protocolo comienza con la suposición de que las preparaciones enriquecidas con sinaptosomal fueron aisladas y están listas para ser procesadas para experimentos de microtrasplante. En el laboratorio, el método Syn-Per se utiliza siguiendo las instrucciones del fabricante. Esto se hace debido a la alta reproducibilidad en experimentos electrofisiológicos10,11. También existe abundante literatura que explica cómo aislar los ovocitos de Xenopus 18,19, que también se pueden comprar listos para la inyección20.

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Protocol

Toda la investigación se realiza de conformidad con las directrices institucionales y aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California Irvine (IACUC-1998-1388) y la Rama Médica de la Universidad de Texas (IACUC-1803024). La corteza temporal de un cerebro no relacionado con la enfermedad de Alzheimer (EA) (mujer, 74 años, intervalo postmortem 2,8 h) y un cerebro con EA (mujer, 74 años, intervalo postmortem 4,5 h) fueron proporcionados por el centro de investigación de la enfermedad de Alzheimer de la Universidad de California Irvine (UCI-ADRC). El consentimiento informado para la donación de cerebro fue obtenido por UCI-ADRC.

NOTA: El tejido cerebral humano no fijo debe tratarse como una fuente de patógenos transmitidos por la sangre (BBP). En consecuencia, se necesita capacitación en BBP antes de comenzar los experimentos. Este protocolo se realiza en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad (BSL2) bajo los requisitos de BSL2. Las pautas y precauciones dentro del laboratorio incluyen: no se permiten alimentos o bebidas en el laboratorio, se deben seguir buenas prácticas de laboratorio, se requiere equipo de protección personal (guantes, bata, no zapatos abiertos) y la puerta debe estar cerrada en todo momento.

1. Preparación de microinyección de ovocitos Xenopus

  1. Para hacer agujas de inyección, tire de tubos de borosilicato de 3.5 pulgadas usando un extractor de micropipetas. Una vez que se extraen las agujas de microinyección, use un microscopio y una cuchilla de afeitar para cortar lo suficiente de la punta de la aguja para que se pueda realizar la microinyección (generalmente entre 2-3 mm).
    NOTA: La longitud de la punta de la aguja para cortar puede variar.
  2. Prepare 1x solución de Barth agregando 200 ml de solución madre de Barth (5x) a 800 ml de agua destilada. Llene una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 24 pocillos con 18 °C 1x solución de Barth.
    1. Prepare la solución de stock de 5x Barth de la siguiente manera. En 1 L de agua destilada, añadir 25,71 g de NaCl (cloruro de sodio), 0,372 g de KCl (cloruro de potasio), 0,301 g de CaCl2 (dicloruro de calcio), 0,389 g de Ca(NO3)2(4H2O) (nitrato de calcio tetrahidrato), 1,01 g de MgSO4(7H2O) (sulfato de magnesio heptahidratado), 1,008 g de NaHCO3 (bicarbonato de sodio), y 11,91 g de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico).
  3. Aislar ovocitos Xenopus utilizando los protocolos descritos en18,19 y utilizando estereoscopio 2x ampliado, seleccionando ovocitos V-VI en estadio V-VI de aspecto saludable. Coloque alrededor de 10 ovocitos por pozo y use uno de los pocillos para albergar ovocitos no inyectados para ser utilizados como células de control al realizar registros.
  4. Recupera una pequeña placa de Petri, de 1 cm de alto y 6 cm de diámetro, y coloca la malla de nylon en el interior para que cubra el fondo de la placa. Luego, vierta 15 ml de 1 solución de Barth para ser utilizada para realizar microinyecciones de los ovocitos.
  5. Coloque un nanoinyector a lo largo de la línea media de la plataforma del microscopio. Gire el imán a la posición De apagado y mueva lentamente el nanoinyector a la posición deseada mientras lo apoya con cuidado. Cuando el nanoinyector esté colocado correctamente, vuelva a girar el imán a la posición completamente Encendida y asegúrese de que esté seguro.
  6. Para un tamaño de muestra de 50,6 nL, utilice los siguientes ajustes en el lado del nanoinyector: 1 es D (abajo), 2 es D, 3 es U (arriba), 4 es D y 5 es U. Coloque un trozo de termoplástico autosellante, o tapa del tubo de microcentrífuga, en el soporte del microscopio, alineándolo con la trayectoria del nanoinyector.
    NOTA: 50 nL está cerca de la cantidad máxima de material inyectado que el citoplasma puede soportar21.
  7. Llene una jeringa de insulina aproximadamente la mitad de su volumen con aceite mineral (aproximadamente 0,5 ml / cc). Con esta jeringa, llene la aguja de microinyección con aceite mineral. Asegúrese de que se vea una cuenta visible de aceite en la punta de la aguja.
  8. Exponga el émbolo del nanoinyector a un mínimo de 1-2 cm. Haga esto manteniendo presionado el botón VACÍO hasta que el émbolo sea visible a la longitud deseada. Una vez que el émbolo esté expuesto, coloque lenta y cuidadosamente la aguja de vidrio de microinyección llena de aceite mineral sobre el émbolo del nanoinyector, y asegúrese de que encaje bien a través de la junta tórica de resistencia negra y se detenga en el anillo de resistencia blanco. Asegúrese de no doblar el émbolo del nanoinyector en el proceso.
  9. Una vez que la aguja de vidrio de microinyección esté segura y en su lugar, presione VACÍO para anular cualquier burbuja de aire potencial. Suavemente, con un pañuelo de papel, limpie el exceso de aceite mineral.

2. Carga de la muestra

  1. Preparar preparados enriquecidos con sinaptosomal (muestras) de la región del cerebro humano de interés como se describe en 10,11,12,13,14,15, y almacenarlos en alícuotas de aproximadamente 5 μL a -80 °C hasta el momento de la inyección.
  2. Antes de la inyección, transfiera la alícuota al hielo húmedo y manténgala en hielo en todo momento, excepto para la sonicación y la recuperación. El número y los tipos de muestras serán determinados por el diseño experimental.
  3. Sonicar las muestras seleccionadas 3x en un baño con hielo húmedo flotante para evitar el calentamiento de la muestra. Use 5 s ciclos cada vez, esperando 1 minuto en hielo húmedo entre ciclos.
  4. Coloque 1 μL de muestra sobre el termoplástico. Haga una indención en la superficie, si es necesario, antes de la colocación de la muestra para evitar el movimiento de la muestra.
  5. Use las perillas del manipulador que sostiene el nanoinyector para colocar la aguja y moverla hacia la muestra que se va a llenar. Una vez que la punta de la aguja esté en la muestra, mantenga presionado el botón FILL hasta que se tome suficiente muestra. Se requieren aproximadamente 0,5 μL para 10 ovocitos. Usando las perillas, mueva la aguja del nanoinyector de nuevo a la posición más alta.

3. Inyección de los ovocitos

NOTA: Las membranas sinaptosomales estandarizadas de la corteza de la rata también se inyectan en todos los experimentos en un conjunto de ovocitos para medir los cambios en la capacidad de fusión entre diferentes lotes de ovocitos.

  1. Coloque los ovocitos seleccionados en la pequeña placa de Petri que tiene la malla de nylon ajustada y la solución de Barth (aproximadamente 10 ovocitos). Organice los ovocitos para que no estén uno encima del otro; esto será útil durante el proceso de inyección.
  2. Usando las perillas del manipulador que sostiene el nanoinyector, mueva la aguja hacia los ovocitos. Una vez que la aguja esté sumergida en la solución de Barth, use el pedal para el nanoinyector para asegurarse de que la aguja de microinyección esté liberando la muestra. Si la muestra se está liberando, será visible desde la vista del microscopio.
  3. Una vez que se haya establecido con confianza que la muestra se está liberando, pase a microinyectar el ovocito. Si no se libera la muestra, repita el proceso de llenado de la aguja.
  4. Penetre el ovocito justo debajo de la superficie con la aguja, no más profundamente, y use el pedal para inyectar la muestra. El pedal emitirá un pitido cuando se libere la muestra. Espere unos 2-3 s. Si la inyección fue exitosa, la célula se expandirá. Una vez que esto suceda, use las perillas del manipulador para salir de la celda.
    NOTA: La fusión de membranas en el ovocito es un proceso polarizado; por lo tanto, el ovocito debe inyectarse en el lado animal de la célula, preferiblemente por encima del ecuador, con el ángulo de la aguja hacia el lado del animal para maximizar la fusión de la membrana.
  5. Mueva la placa de Petri para que el siguiente ovocito esté alineado con la aguja y repita el proceso hasta que se hayan inyectado todos los ovocitos en el plato. Repita este proceso hasta que se haya inyectado el número deseado de ovocitos. Asegúrese de que un pozo de ovocitos se deje sin inyectar para ser utilizado como control.
  6. Una vez que se hayan inyectado todos los ovocitos, retraiga el nanoinyector a su posición original y retire la aguja.

4. Registro de corrientes de iones utilizando una abrazadera de voltaje de dos electrodos

  1. Para hacer dos agujas de electrodo de abrazadera de voltaje de electrodo (TEVC), tire de tubos de vidrio de borosilicato pulido al fuego de 15 cm de largo utilizando el extractor de micropipetas. Una vez que se complete la extracción, llene con 3 M KCl con agujas capilares largas, o alternativamente, sumerja y hierva las agujas en una solución de 3 M KCl durante 15 minutos bajo un vacío continuo. La alta temperatura ayuda en el llenado de los electrodos y la eliminación de burbujas de aire.
    1. Prepare una solución de llenado de electrodos de 3 M KCl utilizando KCl en forma cristalina y agua desionizada, y siga estos pasos cuidadosamente para que no se cambie el potencial de referencia de los electrodos. Seque el KCl cuidadosamente en un horno durante 2-3 h. Usando una balanza analítica, pese cuidadosamente 223.68 g de KCl. Transfiera el KCl a una botella de vidrio de 1 L. Utilice esta solución para clorar los cables de electrodos de plata.
      NOTA: Para tirar de electrodos de vidrio, el libro de cocina de pipeta se puede descargar aquí: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Encienda todos los equipos utilizados para el registro de corrientes iónicas: sistemas principales, válvulas de solución, luz de microscopio, sistemas de válvulas, abrazadera de ovocitos y sistema de vacío. Encienda la computadora de escritorio, inicie sesión en WinEDR V3.9.1., y asegúrese de que el programa se está ejecutando y que los valores de instalación son correctos de la siguiente manera: grabar en disco, establecer la duración de la grabación y borrar la opción del simulador.
    1. Proporcione los siguientes valores de configuración iniciales para el amplificador: para la sección de electrodo de voltaje (Vm), apague la compensación de capacidad negativa (-C); para la sección de electrodos de baño (Im), ajuste el interruptor selector de ganancia (rango de 0.1 a 10) en 10, y el interruptor de palanca de tres posiciones que selecciona el multiplicador de ganancia (x0.1, x1.0 y x10), en x1.0. Las luces LED indicarán la selección del multiplicador de ganancia; para la sección de la abrazadera, apague el selector de modo de abrazadera, establezca el control de ganancia de CC en IN y el control de ganancia de bucle abierto de ancho de banda completo (rango de 0 a 2000) a alrededor de 1200; para los comandos, establezca en 40mV y establezca los controles de retención negativos y el multiplicador de escala para que esté en x2; para el electrodo de corriente, utilice el desplazamiento Ve para establecer una referencia cero antes de empalar el ovocito.
    2. Para grabar, abra el software WinEDR V3.9.1, vaya al menú superior y seleccione Archivo > Abrir nuevo archivo. Cree su propia carpeta y guarde el archivo.
    3. A continuación, en el menú principal, seleccione Grabar > Grabar en disco. Cuando los dos electrodos estén dentro del ovocito, encienda el timbre en el controlador de válvula VC-8 y gire la abrazadera a Slow en el amplificador OC-725C. Luego, vuelva al software WinEDR y seleccione Grabar en la parte superior izquierda de la pantalla.
    4. En el gráfico de marcas de la parte inferior izquierda, anote el potencial inicial de la membrana y pulse Intro. A medida que el experimento continúa, puede escribir el nombre de los medicamentos que se utilizan. Una vez finalizado el experimento, seleccione Detener en la parte superior izquierda de la pantalla.
      NOTA: Utilizamos el software WinEDR o WinWCP para realizar TEVC porque son gratuitos y adecuados para experimentos, pero se puede usar cualquier otro software que esté disponible.
  3. Prepare todas las soluciones de medicamentos necesarias para realizar el experimento (por ejemplo, GABA, Kainate) y confirme que las válvulas de solución funcionan correctamente encendiéndolas y apagándolas y observando el desplazamiento de las válvulas de pellizco.
  4. Llene los tubos vertiendo la solución correspondiente en el receptáculo de la jeringa conectado al tubo y etiquete el controlador de la válvula para que se correlacione con los tubos de la solución. Asegúrese de que el flujo de solución sea constante, que no haya burbujas y que el sistema de vacío funcione correctamente.
  5. Configure el microscopio y el área de la cámara de grabación. Coloque los puentes de agar (ver más abajo) en los respectivos orificios circulares detrás de la cámara de grabación (distal del área de manipulación), conectando los pozos para los electrodos utilizados como referencia a tierra y la cámara de grabación. Agregue la solución de trabajo de Ringer (1x) a la cámara de grabación y a los pozos de electrodos de referencia a tierra.
    1. Los puentes de agar son tubos de borosilicato en forma de U, de 2-3 cm de largo, llenos de agar al 3% en la solución de Ringer. Haga tubos en forma de U cortando tubos de 15 cm de largo, doblándolos sobre la llama abierta y luego llenándolos con agar caliente al 3% con una jeringa de insulina. Guarde los puentes de agar llenos en la solución de Ringer en el refrigerador hasta su uso.
    2. Haga la solución madre de 20x Ringer de la siguiente manera: En 1 L de agua destilada, agregue 134.4 g de NaCl, 2.982 g de KCl, 5.29 g de CaCl2 y 23.83 g de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatenosulfónico). Para 1x solución de trabajo de Ringer, en un matraz aforado, agregue 200 ml de solución madre de Ringer (20x) a 3.800 ml de agua destilada.
  6. Prepare electrodos de plata clorada antes de cada experimento por electrólisis colocando cables de plata en una solución de KCl de 3 M y conectando el electrodo de plata al terminal positivo de una batería de 9 V. Después de aproximadamente 3 minutos, una capa marrón sólida de AgCl se deposita en el electrodo. Coloque los cables de electrodos de plata clorada en la carcasa del electrodo.
    NOTA: Los electrodos clorados de referencia y registro del suelo son electrodos de cloruro de plata/plata (Ag/AgCl).
  7. Retire las agujas de borosilicato de la solución de KCl. Use una jeringa para extraer una pequeña cantidad de solución de KCl del extremo abierto de la aguja del electrodo y reemplace la solución de KCl con aceite mineral; esto evitará la evaporación del agua y los cambios en la concentración de KCl dentro de la aguja. Deslice la aguja de vidrio sobre el alambre del electrodo de plata clorada y apriete en su lugar.
  8. Usando los manipuladores derecho e izquierdo que sostienen los electrodos, guíe las agujas de los electrodos hacia la cámara de grabación que está llena con la solución de Ringer.
  9. Compruebe la resistencia de cada electrodo poniendo a cero las perillas de desplazamiento Vm y Ve y luego presionando los botones de prueba de electrodos . La resistencia debe estar entre 0.5-3 MΩ (leída directamente como 5-30 mV en la pantalla). Si la resistencia está fuera del rango, reemplace con nuevos microelectrodos.
  10. Llene la cámara de grabación con una nueva solución de Ringer. Usando una pipeta de vidrio, coloque un ovocito no inyectado o microtrasplantado en el centro de la cámara de grabación. Asegúrese de que el ovocito sea claramente visible bajo el microscopio, con el lado del animal hacia arriba (ver NOTA en el paso 3.4).
  11. Guíe el electrodo hacia la solución de Ringer hasta que toquen la membrana del ovocito. Perfore suavemente la membrana de ovocitos en el lado del animal (consulte nota en el paso 3.4) con ambos electrodos y registre el potencial de membrana en reposo. Encienda el flujo de solución de Ringer.
  12. Usando el amplificador de abrazadera de ovocitos, cambie el modo a Pinza de voltaje y ajuste el voltaje de retención de -80 mV. La corriente en el monitor debe ser negativa, generalmente entre 0 y 0.4 microamperios.
  13. Cree un nuevo archivo para guardar la grabación como Archivo > Nuevo > Guarde la grabación en el software. Inicie la grabación, presione Grabar > Grabar en disco. Agregue información relevante al archivo mediante el cuadro de diálogo de marca (nombre de la prueba, medicamentos utilizados, etc.).
  14. Aplique agonistas (por ejemplo, GABA, glutamato o kainato) para la estimulación química abriendo las válvulas y perfundiéndolas en la cámara de grabación durante 15 s. Por lo general, use una ganancia de 10x para trazar el número máximo de puntos y reconstruir la respuesta. Si las corrientes son muy pequeñas, aumente la amplificación, o ganancia, para que sean evaluadas y visibles. Siempre tome nota de estos cambios.
    NOTA: La duración de la perfusión depende del paradigma experimental. Si el objetivo principal es medir la amplitud máxima, 15 s serán suficientes para alcanzar el pico para GABA o la meseta para kainate.
  15. Supervise siempre los niveles de solución. La solución de Ringer deberá rellenarse con frecuencia, ya que se utiliza entre todos los usos de la solución. Una vez completada la grabación, gire la abrazadera de voltaje a la posición OFF y apague la válvula de solución del Ringer. Retire el ovocito. Detenga la grabación y guarde el archivo. Repita estos pasos para todos los ovocitos inyectados.

5. Análisis de grabaciones TEVC

  1. Guarde una copia de las grabaciones en una unidad USB. Desde allí, abra el archivo deseado para ser analizado. En el archivo que se abre, la grabación se puede ver, marcar y medir. El análisis más común incluye la medición de la amplitud máxima, el tiempo de activación, la desensibilización y el resumen de las aplicaciones repetitivas.
  2. Mida la respuesta máxima de AMPA y la respuesta de pico de GABA. Para adquirir estas mediciones, primero establezca un nivel cero o línea de base encontrando la línea roja con el cursor y arrastrándola a la corriente generada por la aplicación o línea base de Ringer.
  3. Una vez establecido el nivel cero, determine las medidas de respuesta utilizando el ratón para arrastrar el cursor de lectura vertical verde a la parte deseada del trazador de gráficos. Si lo desea, exporte los rastros para analizarlos en cualquier otro software preferido
    NOTA: Si no se puede definir el nivel cero o hay demasiado ruido indicado en el trazador, exporte el archivo WinEDR a un software analítico fuera de línea, que permitirá modificaciones para proporcionar una línea de base de nivel y la adición de filtros para reducir el ruido.

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Representative Results

A las pocas horas de la inyección, las membranas sinápticas, que transportan sus receptores de neurotransmisores y canales iónicos, comienzan a fusionarse con la membrana plasmática de los ovocitos. La Figura 1 muestra registros de receptores AMPA y GABAA microtrasplantados en ovocitos Xenopus. Para la mayor parte del análisis, se midieron las respuestas de dos o tres ovocitos por muestra, utilizando dos o tres lotes de ovocitos de diferentes ranas, para un total de seis a nueve ovocitos por muestra. Esto se hace para que una gran cohorte de sujetos humanos observe las diferencias grupales. El análisis es sencillo y mide la amplitud de las respuestas. Es importante tener en cuenta que la fusión de las membranas trasplantadas es un proceso polarizado, por lo que la selección del sitio de inyección es muy importante. La inyección en el hemisferio vegetal o en el ecuador da resultados consistentes, con todos los ovocitos inyectados insertando con éxito receptores y generando corrientes iónicas que siguen una distribución unimodal22. Curiosamente, cuando las membranas se inyectaron inicialmente en el polo animal, las respuestas de los ovocitos siguieron una distribución bimodal: un grupo de ovocitos tuvo respuestas nulas o muy bajas, mientras que el otro grupo tuvo respuestas grandes, incluso más grandes que las de los ovocitos inyectados en el polo vegetal o en el ecuador. Para determinar si algunos de los ovocitos inyectados en el polo animal tenían respuestas bajas porque las membranas humanas estaban siendo inyectadas y atrapadas dentro del núcleo del ovocito, se inyectó una mezcla de membranas aisladas del órgano eléctrico de Torpedo y CDNA que codifica para la subunidad GABAρ1 en el polo del lado animal. Los receptores nicotínicos de las membranas torpedo mostraron una activación rápida y una rápida desensibilización durante la perfusión de acetilcolina23, mientras que la subunidad ρ1 forma receptores GABAρ1 homoméricos que no desensibilizan durante la perfusión continua de GABA 24,25,26,27. Si la muestra coinyectada se entregaba accidentalmente en el núcleo y no en el citoplasma, entonces el ADNc se transcribiría en ARN y se traduciría en receptores GABAρ1 funcionales. La Figura 2 muestra que cuando la inyección se dirigió al núcleo, los ovocitos con altas respuestas a la acetilcolina no expresaron receptores GABAρ1; por el contrario, los ovocitos con respuesta cero o baja a la acetilcolina expresaron receptores GABA. Los resultados de este experimento indican, en primer lugar, que en los ovocitos de baja respuesta, las membranas se depositaron accidentalmente en el núcleo del ovocito; en segundo lugar, la inyección de membranas torpederas en el núcleo no interfiere en gran medida con la transcripción del ADNc ρ1. Algunos ovocitos coinyectados tuvieron grandes respuestas tanto a la acetilcolina como al GABA, lo que sugiere la ruptura del núcleo durante la inyección. La inserción mejorada de membranas trasplantadas en el hemisferio animal del ovocito refleja la localización polarizada de los receptores de neurotransmisores expresados heterólogamente 26,28. Por lo tanto, al inyectar en el hemisferio animal sin apuntar al núcleo, es posible obtener respuestas más grandes. Esto es importante para estudiar especímenes con baja densidad de receptores, por ejemplo, de tejido de la enfermedad de Alzheimer (EA) con bajo número de receptores (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Corrientes iónicas representativas de los ovocitos. Se registraron corrientes iónicas de ovocitos inyectados con membranas de receptores sinápticos humanos. Los receptores AMPA se activaron con 100 mM Kainate, y los receptores GABAA con 1 mM GABA. VH = -80 mV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Coinyección de Torpedo y GABAρ1. La coinyección de membranas filtradas (0,1 μm) del órgano eléctrico de Torpedo, rico en receptores de acetilcolina, y el ADNc que codifica para el receptor GABAρ1 en el polo animal produjo principalmente dos grupos de ovocitos en función de sus respuestas: un grupo de ovocitos (A) tuvo grandes respuestas a la acetilcolina (Ach; 1 mM) pero ninguna respuesta a 1 μM GABA (voltaje sujeto a -80 mV), y los ovocitos del grupo (B) tuvieron respuestas nulas o bajas a la ACh pero respuestas grandes al GABA. (C) El gráfico muestra la media ± error estándar de media (SEM) de corriente máxima en el grupo 1 (n = 5 ovocitos) y el grupo 2 (n = 11 ovocitos). Un ovocito en el grupo 2 tenía grandes respuestas de GABA y ACh que sugerían ruptura del núcleo; en consecuencia, la distribución de las respuestas se sesgó a valores bajos, como lo demuestra la diferencia entre la media y la mediana de la distribución de la corriente de membrana (22 nA vs 6 nA). Este resultado indica que una de las causas de los ovocitos de baja respuesta es que las membranas están siendo inyectadas y atrapadas en el núcleo del ovocito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Inserción polarizada de membranas celulares en ovocitos xenopus . Respuestas de GABA y kainato de ovocitos inyectados en los polos animales o vegetales, con membranas sin filtrar obtenidas de un cerebro no AD (hembra, 74 años, intervalo postmortem 2,8 h) y un AD-cerebro (hembra, 74 años, intervalo postmortem 4,5 h). Los ovocitos inyectados cerca del polo animal, sin dirigirse al núcleo, dieron respuestas más grandes que los ovocitos inyectados en el polo vegetal, lo que permitió el estudio de muestras de tejido con un número muy bajo de receptores. Prueba t de Student entre polos vegetales y animales: ** p < 0.01, *** p < 0.001, Las barras indican media ± SEM de corriente máxima, n = 5 ovocitos cada columna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El análisis de complejos de proteínas nativas de cerebros humanos es necesario para comprender los procesos homeostáticos y patológicos en los trastornos cerebrales y desarrollar estrategias terapéuticas para prevenir o tratar enfermedades. Por lo tanto, los bancos de cerebros que contienen muestras congeladas instantáneamente son una fuente invaluable de una gran riqueza de información fisiológica en su mayoría sin explotar29,30. Una preocupación inicial para usar tejido postmortem es la clara posibilidad de degradación de ARNm o proteína que puede confundir la interpretación de los datos. Por ejemplo, el pH del cerebro muestra consistentemente una correlación positiva con la cuantificación del ARNm por PCR cuantitativa en tiempo real, y esta correlación es independiente de la patología31. Las diferencias de pH entre sujetos pueden conducir a diferencias de cuantificación del ARNm con grandes varianzas que pueden oscurecer la interpretación de los resultados32. Curiosamente, a pesar de la menor cuantificación de las transcripciones de ARNm a medida que se acidifica el pH, las covarianzas entre las diferentes transcripciones se mantienen33, proporcionando un marco para obtener perfiles de transcriptoma confiables de estados patológicos. Es importante destacar que, si bien el ARNm es altamente degradable, las proteínas transmembrana en el tejido postmortem son muy resistentes a la degradación34. Experimentos anteriores en el laboratorio han demostrado que los receptores de GABA y glutamato del cerebro humano son funcionales después de intervalos postmortem extremadamente grandes35. Además, el método MSM permite medir directamente los efectos de posibles factores de confusión como el pH en el momento de la muerte, el estado agonal y la degradación del ARNm y las proteínas directamente sobre la función de los receptores, proporcionando así formas de utilizar esta información en el análisis e interpretación de los datos.

Modificaciones y solución de problemas de la técnica
Como se mencionó anteriormente, el MSM es una ligera modificación del trasplante original de membranas totales, que es un método que ha sido ampliamente validado y confirmado por muchos laboratorios en el mundo académico y la industria farmacéutica 12,36,37,38,39,40. Por ejemplo, el microtrasplante de receptores fue importante en el desarrollo del LY3130481 de Eli Lilly, que es un antagonista selectivo de gamma-8 TARP de los receptores AMPA que muestra selectividad de la región cerebral12. El MSM sigue el mismo principio de microtrasplante utilizando preparaciones enriquecidas con sinaptosomal; por lo tanto, tener buenas preparaciones sinaptosomales es importante. Utilizamos el método Syn-Per porque los resultados que se obtienen con este procedimiento son muy consistentes y la amplitud de las corrientes iónicas se correlaciona muy bien con los niveles de proteínas sinápticas en experimentos proteómicos10. Sin embargo, el microtrasplante o el MSM se pueden adaptar para estudiar receptores de muchas fuentes (por ejemplo, membranas de insectos38,39, neurolema40) con excelentes resultados. Hay algunos trastornos en los que las sinapsis se ven fuertemente afectadas, como la enfermedad de Alzheimer, o están disponibles en bajas cantidades; en este caso, la inyección de las membranas en el lado animal ayuda a obtener corrientes más grandes. El aumento de la cantidad de proteína inyectada también aumenta la fusión de membranas y el tamaño de las respuestas. Aunque existe una correlación negativa entre la concentración de membranas inyectadas y la supervivencia de los ovocitos, es posible encontrar una concentración adecuada de membranas que permita el análisis experimental dado.

Limitaciones de los HSH
El MSM es un método cuantitativo que fue desarrollado para el estudio de receptores humanos o canales iónicos; por lo tanto, es muy adecuado para estudiar tejidos con disponibilidad limitada. Debido a que los ovocitos Xenopus no tienen receptores endógenos de glutamato o GABA, cualquier respuesta a GABA o glutamato en ovocitos microtrasplantados proviene de los receptores inyectados que se fusionaron con la membrana de los ovocitos. Sin embargo, una limitación importante del MSM es el estudio de canales iónicos o transportadores que también se expresan endógenamente en ovocitos, ya que la separación de las corrientes iónicas de los canales / transportadores microtrasplantados y endógenos es difícil. Los estudios futuros que silencian los genes endógenos pueden ser útiles con esta limitación.

La importancia de los métodos existentes es que el MSM incorpora la membrana nativa con sus correspondientes proteínas y receptores, y por lo tanto, proporciona un entorno más fisiológico para el análisis. Se ha encontrado que las propiedades de los receptores en su membrana nativa se conservan después del trasplante a los ovocitos, como se observa en los receptores de neurotransmisores tipo AMPA GluR1, α7-AcChoRs y α4β2-AcChoRs de células cultivadas41.

Las aplicaciones futuras de la técnica incluyen el estudio de las propiedades electrofisiológicas de diferentes proteínas y receptores de interés en las membranas de células y tejidos cultivados y no cultivados de cerebros humanos sanos y enfermos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01AG070255 y R01AG073133 A AL. También agradecemos al Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Irvine de la Universidad de California (UCI-ADRC) por proporcionar el tejido humano que se muestra en este manuscrito. El UCI-ADRC está financiado por la subvención NIH/NIA P30 AG066519.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Microinjection
3.5" Glass Capillaries Drummond 3-000-203-G/X
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate Thermofisher FB012929
Flaming/Brown type micropipette puller Sutter P-1000
Injection Dish Thermofisher 08-772B
Microcentrifuge Tubes Thermofisher 02-682-002
Mineral Oil Thermofisher O121-1
Nanoject II Drummond 3-000-204
Nylon mesh Industrial Netting WN0800
Parafilm Thermofisher S37440
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Syringe Thermofisher 14-841-31
Ultrasonic cleaning bath Thermofisher FS20D
Xenopus laevis frogs Xenopus 1 4217
For Two Electrode Voltage clamp
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries Sutter B200-116-15
Any PC computer or laptop
Low-pass Bessel Filter Warner Instruments LPF-8
Stereoscope Fisher Scientific 03-000-037
Two electrode voltage clamp workstation Warner Instruments TEV-700
ValveLink 8.2 Perfusion Controller Automate Scientific SKU:01-18
WInEDR Free software University of Strathclyde Glasgow https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X Series Multifunction DAQ National Instruments NI USB-6341
Reagents
Calcium dichloride Thermofisher C79
Calcium nitrate tetrahydrate Thermofisher C109
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
GABA Sigma-Aldrich A2129
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Thermofisher BP310
Kainic acid Tocris 0222
Magnesium sulfate heptahydrate Thermofisher M63
Potassium chloride Thermofisher P217
Sodium bicarbonate Thermofisher S233
Sodium chloride Thermofisher S271-1
Ultrafree-0.1 µm MC filter, Amicon

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References

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Neurociencia Número 185
Microtrasplante de membranas sinápticas para reactivar los receptores sinápticos humanos para estudios funcionales
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Miller, B., Powell, A., Gutierrez, B. A., Limon, A. Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies. J. Vis. Exp. (185), e64024, doi:10.3791/64024 (2022).

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