Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64132
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, The George Washington University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול פרוטאומיקה של ליזוזום עצבי המתייג קרבה מתואר כאן כדי לאפיין את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. חלבוני קרום ליזוזומליים וחלבונים המקיימים אינטראקציה עם ליזוזומים (ביציבות או בחולף) ניתנים לכימות מדויק בשיטה זו עם רזולוציה מרחבית תוך תאית מצוינת בנוירונים אנושיים חיים.

Abstract

ליזוזומים מתקשרים לעתים קרובות עם מגוון של ביומולקולות כדי להשיג את הפירוק ותפקודים תאיים מגוונים אחרים. ליזוזומים הם קריטיים לתפקוד המוח האנושי, מכיוון שתאי עצב הם פוסט-מיטוטיים ומסתמכים במידה רבה על מסלול האוטופגיה-ליזוזום כדי לשמור על הומאוסטזיס תאי. למרות ההתקדמות בהבנה של פונקציות ליזוזומליות שונות, לכידת התקשורת הדינמית ביותר בין ליזוזומים לרכיבים תאיים אחרים היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק עבור השיטה האנדוגנית (knock-in) ליזוזום קרבה תיוג פרוטאומית שפורסמה לאחרונה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC).

הן חלבוני ממברנה ליזוזומליים והן חלבונים המקיפים ליזוזומים ברדיוס של 10-20 ננומטר ניתנים לזיהוי בטוח ולכימות מדויק בנוירונים אנושיים חיים. כל שלב בפרוטוקול מתואר בפירוט, כלומר, תרבית נוירונים hiPSC, תיוג קרבה, קציר נוירונים, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, העשרת חלבונים ביוטינילציה, עיכול חלבונים, ניתוח LC-MS וניתוח נתונים. לסיכום, שיטה ייחודית זו לתיוג קרבה ליזוסומלית אנדוגנית מספקת תפוקה גבוהה וכלי אנליטי חזק לחקר הפעילויות הליזוזומיות הדינמיות ביותר בנוירונים אנושיים חיים.

Introduction

ליזוזומים הם אברונים קטבוליים המפרקים מקרומולקולות דרך המסלול הליזוזומלי-אוטופגיה1. מלבד השפלה, ליזוזומים מעורבים במגוון תפקודים תאיים כגון התמרת איתותים, חישת חומרים מזינים והפרשת 2,3,4. הפרעות בתפקוד הליזוזומלי היו מעורבות בהפרעות אחסון ליזוזומליות, סרטן, הזדקנות וניוון עצבי 3,5,6,7. עבור נוירונים פוסטמיטוטיים ומקוטבים מאוד, ליזוזומים ממלאים תפקידים קריטיים בהומאוסטזיס תאי עצבי, שחרור מוליכים עצביים והובלה למרחקים ארוכים לאורך האקסונים 8,9,10,11. עם זאת, חקירת ליזוזומים בתאי עצב אנושיים הייתה משימה מאתגרת. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות נוירונים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) אפשרה לתרבית של נוירונים אנושיים חיים שלא היו נגישים בעבר, וגישור על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין מטופלים אנושיים לחקור את המוח האנושי12,13. במיוחד, טכנולוגיית i3Neuron המתקדמת משלבת ביציבות את גורם השעתוק של נוירוגנין-2 לתוך הגנום של iPSC תחת מקדם דוקסיציקלין-אינדוקלין, מה שמניע iPSCs להתמיין לנוירונים קליפתיים טהורים תוך שבועיים14,15.

בשל הפעילות הליזוזומלית הדינמית ביותר, לכידת אינטראקציות ליזוזומליות עם רכיבים תאיים אחרים היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה. טכנולוגיית תיוג קרבה מתאימה היטב לחקר אינטראקציות דינמיות אלה בגלל יכולתה ללכוד אינטראקציות חלבון יציבות וחולפות/חלשות עם ספציפיות מרחבית יוצאת דופן16,17. פרוקסידאז מהונדס או ביוטין ליגאז יכולים להתמזג גנטית עם חלבון הפיתיון. לאחר ההפעלה, רדיקלים ביוטינים תגובתיים מאוד מיוצרים כדי לתייג באופן קוולנטי חלבונים שכנים, אשר לאחר מכן ניתן להעשיר אותם על ידי חרוזים מצופים סטרפטווידין עבור פרוטאומיקה מלמטה למעלה במורד הזרם באמצעות פלטפורמות ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) 17,18,19,20,21.

לאחרונה פותחה שיטה אנדוגנית לתיוג פרוטאומיקה של קרבה ליזוסומלית כדי ללכוד את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית ב-i3Neurons22. אסקורבט פרוקסידאז מהונדס (APEX2) הוכנס ל-C-terminus של חלבון הממברנה הליזוזומלי הקשור ל-1 (LAMP1) ב-iPSCs, אשר לאחר מכן ניתן להבדיל אותם לנוירונים בקליפת המוח. LAMP1 הוא חלבון ממברנה ליזוזומלי בשפע וסמן ליזוזומלי קלאסי23. LAMP1 מתבטא גם באנדוזומים מאוחרים, המבשילים לליזוזומים; אנדוזומים-ליזוזומים מאוחרים אלה וליזוזומים לא מתכלים מכונים כולם ליזוזומים בפרוטוקול זה. בדיקה אנדוגנית זו של LAMP1-APEX, המתבטאת ברמה הפיזיולוגית, יכולה להפחית את המיסלוקליזציה של LAMP1 ואת ממצאי ביטוי היתר. ניתן לזהות ולכמת מאות חלבוני ממברנה ליזוזומליים ואינטראקטורים ליזוזומליים ברזולוציה מרחבית מצוינת בתאי עצב אנושיים חיים.

כאן, פרוטוקול מפורט לתיוג קרבה ליזוזומית פרוטאומיקה בנוירונים שמקורם ב- iPSC אנושי מתואר עם שיפורים נוספים משיטה22 שפורסמה לאחרונה. זרימת העבודה הכוללת מתוארת באיור 1. הפרוטוקול כולל תרבית נוירונים שמקורה ב-hiPSC, הפעלת תיוג קרבה בתאי עצב, אימות פעילות APEX על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, קביעת יחס אופטימלי בין חלבון חרוזים לקלט של סטרפטאווידין, העשרה של חלבונים שעברו ביוטינילציה, עיכול חלבונים על חרוזים, התפלה וכימות פפטידים, ניתוח LC-MS וניתוח נתוני פרוטאומיקה. הנחיות לפתרון בעיות ואופטימיזציות ניסיוניות נדונות גם כדי לשפר את בקרת האיכות והביצועים של תיוג קרבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי ועדת הבטיחות והאתיקה של אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון. הקומפוזיציות של מדיה ומאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מסופקות בטבלה 1. פרטי המוצר המסחרי המשמשים כאן מסופקים בטבלת החומרים.

1. תרבית נוירונים אנושית שמקורה ב-iPSC

  1. תרבית iPSC אנושית ושילוב גשושית LAMP1-APEX (7 ימים)
    1. הפשרת תמיסת מלאי של מטריגל בדלי קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, aliquot 500 μL של התמיסה לתוך צינורות סטריליים קרים, ולאחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת ציפוי של 50 מ"ל על ידי הוספת 500 μL של מלאי Matrigel לתוך 49.5 מ"ל של מדיום DMEM/F12 קר.
      הערה: שמור על המטריגל קר והשתמש בצינורות חרוטיים מוכנים מראש ובקצות פיפטה כדי למנוע פילמור. ניתן לאחסן תמיסת ציפוי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
    2. מצפים צלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ עם תמיסת ציפוי של 4 מ"ל למשך שעה אחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: Vitronectin יכול להיות פתרון ציפוי חלופי בריכוז של 5 מיקרוגרם למ"ל וציפוי של שעתיים עבור תרבית iPSC. ויטרונקטין (רכיב חלבון יחיד) יקר יותר ממטריגל, אך יש לו פחות וריאציות אצווה ואותות רקע נקיים יותר מאשר מטריגל, המופק מגידול עכבר עם חלבוני מטריצה חוץ-תאית רבים. צלחת תרבית רקמה שאינה מטופלת נחוצה לציפוי ויטרונקטין. ציפוי Matrigel עובד עבור צלחות תרבית רקמה מטופלות ולא מטופלות.
    3. הפשרה וצלחת 1-3 מיליון hiPSCs על כל צלחת מצופה 10 ס"מ טעון מראש עם 8 מ"ל של Essential E8 מדיום שלם בתוספת מעכב ROCK (ריכוז סופי 10 μM Y-27632 או 50 nM Chroman1).
      הערה: הוספת מעכב ROCK (Y-27632 או Chroman1) לתרבית תאי גזע ממזערת אפופטוזיס הנגרם על ידי דיסוציאציה לאחר פיצול ושימור קריוגני. Chroman1 הוכח לאחרונה כחזק יותר מ-Y-27632 בעיכוב גם ROCK1 וגם ROCK224.
    4. שנה ל-10 מ"ל של E8 בתווך שלם ללא מעכב ROCK לאחר שה-iPSCs יוצרים מושבות, בדרך כלל לאחר 1-2 ימים. שמרו על תרבות ה-iPSC במדיום שלם של E8 והחליפו את הסופר-נטנט במדיום טרי כל יומיים.
    5. שלב את אנזים תיוג הקרבה, אסקורבט פרוקסידאז מהונדס (APEX2), לתוך C-terminus של הגן האנדוגני LAMP1 על ידי הנדסת גנום CRISPR. לקבלת שלבים מפורטים ליצירת קו תאים יציב מהונדס, עיין בשיטה שפורסמה בעבר (Frankenfield et al). 22.
  2. התמיינות תאי עצב iPSC אנושיים (3 ימים)
    1. מצפים צלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ למשך הלילה עם 4 מ"ל של תמיסת ציפוי מטריגל באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לפני ההתמיינות.
    2. לשמור על hiPSCs עד ~ 70% מפגש. שטפו בעדינות את ה-hiPSCs עם מי מלח עם מאגרי פוספט (PBS) פי 2 כדי להסיר תאים מתים. שאפו את PBS והוסיפו 3 מ"ל של Accutase לצלחת של 10 ס"מ של תאים. מנערים את הצלחת לחלוקה שווה ומדגרים במשך 8 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 2 מ"ל של PBS כדי לשטוף ולהרים את התאים מהצלחת ולאסוף את כל תמיסת התאים בצינור חרוטי של 15 מ"ל. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות. צלחת 2-4 × 106 hiPSCs על צלחת מצופה מטריגל טעונה מראש עם 8 מ"ל של מדיום אינדוקציה של נוירונים חמים (טבלה 1). לפזר באופן שווה את התאים ולהניח באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: התמיינות נוירונים מונעת על ידי גורם שעתוק הניתן להשראה של דוקסיציקלין, נוירוגנין-2 (NGN2), אשר התבטא יתר על המידה בקו תאי hiPSCיציב זה 15.
    4. שטפו בעדינות hiPSCs עם PBS ביום הראשון של ההתמיינות כדי להסיר פסולת של תאים מתים. יש להחליף ב-10 מ"ל של מדיום אינדוקציה חם ללא מעכב ROCK.
    5. שינוי עם מדיום אינדוקציה חם ללא מעכב ROCK כל יום עד יום 3 של הבחנה.
      הערה: נוירונים מוכנים לציפוי מחדש למדיום עצבי.
  3. ציפוי נוירונים ושמירה על תרבית נוירונים (10 ימים)
    1. הכינו תמיסת ציפוי Poly-L-Ornithine(PLO) בנפח 0.1 מ"ג/מ"ל במאגר בוראט (טבלה 1).
    2. מצפים צלחת תרבית תאים עם תמיסת הציפוי של אש"ף באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות או לילה לפני ציפוי יום 3 נוירונים. לשטוף את המנה עם 4 מ"ל של מים סטריליים שלוש פעמים ולתת לו אוויר להתייבש לחלוטין בתוך ארון biosafety.
    3. נתקו את יום 3 נוירונים מכל צלחת בקוטר 10 ס"מ עם 3 מ"ל של אקוטאז וצלחת 8-10 מיליון תאים על כל צלחת מצופה אש"ף בקוטר 10 ס"מ טעונה מראש במדיום נוירונים קליפת המוח חם (טבלה 1).
    4. בצע שינוי חצי-בינוני כל 2-3 ימים עם מדיום נוירונים חמים עד שהנוירונים i3מגיעים להבשלה תוך שבועיים לאחר ההבחנה.

2. תיוג קרבה באתרו ותזה נוירונים (2 שעות)

  1. יש להכין תמיסת מלאי ביוטין-פנול (BP) של 500 mM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ולאחסן בטמפרטורה של −20°C. ביום של תיוג קרבה, דללו את תמיסת מלאי BP עם מדיום נוירונים חמים וטפלו בתאי העצב בריכוז סופי של 500 מיקרומטר למשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: דוקסיציקלין מתווסף במדיום הנוירונים, אשר יפעיל את ביטוי האנזים APEX. יש להוסיף דוקסציקלין לפחות 24 שעות לפני ניסוי תיוג הקרבה.
  2. התחל את תגובת הסימון על ידי הוספת H 2 O2בריכוז סופי של 1 mM לתוך תרבית הנוירונים ודגירה במשך דקה אחת בדיוק. שאפו מיד את המדיום ושטפו 3 פעמים עם חיץ מרווה (טבלה 1).
    הערה: יש להכין את תמיסת H 2 O2טרייה לפני תגובת התיוג. הפעלת H2 O 2 צריכה להיות בדיוק דקה אחת כדי להפחית את השונות הניסיונית ולמזער את העקה החמצונית הנגרמת על ידי טיפול ממושך ב-H 2 O 2.
  3. הטה את הצלחת כדי לשאוף את כל שאריות החיץ. הוסיפו את מאגר התזה של תאים קרים כקרח (טבלה 1) ישירות על צלחת הנוירונים. השתמש ב-100 μL של מאגר תזה תאית לכל מיליון נוירונים. מערבבים את הצלחת לקבלת תזה מספקת של תאים ומניחים על קרח.
  4. לגרד את התא lysates לתוך צינורות קר 1.5 מ"ל. סוניקט באמבט מים קרים כקרח באמצעות סוניק אמבטיה (>100 וואט) למשך 15 דקות עם לסירוגין 40 שניות מופעל, 20 שניות מחוץ למחזורים.
    הערה: תמיסת חלבון שעברה ליבה מספקת צריכה להיות ברורה ללא כדורים או בועות מוגזמות. סוניקציה מספקת של ליזאט התא חיונית לגזירת חומצות גרעין ולהפחתת הדביקות של התא ליזאט כדי להפחית קשירה לא ספציפית בהליכים במורד הזרם. ניתן להשתמש בבדיקת סוניק גם כדי לספק תזה חזקה ומהירה יותר של תאים, אך שטיפת הבדיקה בין דגימות נדרשת כדי למזער זיהום צולב ואובדן דגימה.
  5. הוסף אצטון קר (−20 °C) לדגימה בנפח של פי 4 של מאגר ליזה. מערבולת לזמן קצר ודוגרת ב-20 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
  6. צנטריפוגה ב 16,500 × גרם במשך 10 דקות ב 2 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מבלי להפריע את גלולת החלבון. לשטוף את הכדור עם 1 מ"ל של −20 מעלות צלזיוס אצטון 2x ולהסיר את supernatant לאחר צנטריפוגה.
  7. יבשו את גלולת החלבון עם רכז ואקום במשך דקה אחת. הוסף מאגר תזה תא כדי להמיס לחלוטין את הכדור. סוניקט לזמן קצר במידת הצורך. אחסן את הדוגמאות ב- −80 °C.
    הערה: משקעי אצטון יכולים להסיר שאריות ביוטין-פנול בדגימה, מה שעלול להפריע להעשרה במורד הזרם של חלבונים שעברו ביוטינילציה.

3. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאימות לוקליזציה ופעילות APEX (1.5 ימים)

  1. לדגום את i3נוירונים המבטאים LAMP1-APEX אנדוגני עם 500 μM BP במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הפעל את ההתוויה עם טיפול 1 mMH 2 O2 למשך שנייה אחת בלבד כדי להגביל את הדיפוזיה של ענן ביוטין.
  2. תקן את התאים מיד עם 4% paraformaldehyde במאגר המרווה ולשטוף בעדינות 3x עם PBS.
    הערה: עבור צלחת בגודל 10 ס"מ, יש צורך ב-4-6 מ"ל לשטיפה מספקת.
  3. לחסום ולחדור לתאים באמצעות סרום 3% חמורים ו-0.1% ספונין ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  4. לדגום את התאים עם נוגדן אנטי-LAMP1 ראשוני (עכבר חד שבטי H3A4, 1:1,000) לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. שטפו את הנוירונים 3 x בעדינות עם PBS. דגרו על הנוירונים עם נוגדן משני נגד עכבר AF561 (1:1,000) וסטרפטאבידין-680 (1:1,000) למשך שעה אחת ב-RT.
  6. יש לשטוף 2x עם PBS ולדגור עם Hoechst או 4',4-diamidino-2-phenylindole (DAPI) סמן גרעיני במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את התאים 2x עם PBS.
  7. דמיינו את הנוירונים הקבועים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימו לב לחלבונים שעברו ביוטינילציה המוכתמים בסטרפטווידין וקולוקליזציה עם צביעת LAMP1 מחוץ לגרעין כדי לאמת את המיקום הנכון של פעילות APEX.

4. קביעת יחס חלבון חרוזי סטרפטווידין לקלט (1.5 ימים)

  1. ביצוע בדיקת חלבון תואמת דטרגנט (DCA) כדי לקבוע את ריכוזי החלבון הכוללים בליזאטים בתאים
    1. יש להמיס את החלבון הסטנדרטי אלבומין בסרום בקר (BSA) במאגר התזה התאית בריכוז של 4 מ"ג/מ"ל. הכינו סדרה של תמיסות סטנדרטיות לחלבון BSA (0.2-2 מ"ג/מ"ל, 5 דילולים) באמצעות מאגר התזה של התא.
    2. העבר 5 μL מכל דגימת חלבון, תמיסה סטנדרטית של חלבון BSA ומאגר תזה תאים ריקים במשולש לתוך כל באר בצלחת של 96 בארות.
    3. הוסף 2 μL של מגיב S לכל 1 מ"ל של מגיב A כדי לקבל מגיב A'. הוסף 25 μL של מגיב A' לכל באר. הוסף 200 μL של מגיב B לכל באר. מערבבים ומפוצצים בועות אם קיימות.
    4. דגרו את אותה צלחת 96 בארות ב-RT במשך 15 דקות, קראו את הספיגה ב-750 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות, וכמתו את ריכוזי דגימות החלבון בהתבסס על עקומת תקן BSA.
  2. בדיקת כתם נקודת טיטרציה של חרוזים (1.5 ימים)
    1. מעבירים סדרה של חרוזי סטרפטווידין מגנטיים (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) לצינורות רצועת PCR. שים את צינורות רצועת ה- PCR על מתלה מגנטי, שטוף את החרוזים 3x עם חיץ 100 μL של 2% SDS, והסר את מאגר הכביסה לחלוטין כשהוא על המדף המגנטי.
    2. הוסף 50 מיקרוגרם של דגימת חלבון לכל צינור. הוסיפו עוד מאגר ליזה לנפח כולל של 80 μL. סגרו כל צינור בחוזקה וסובבו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. צנטריפוגה צינורות רצועת PCR לזמן קצר על ספסל מיקרוצנטריפוגה. הניחו את צינורות רצועת ה-PCR על מתלה מגנטי למשך דקה אחת. יש לזהות 2 μL של סופרנטנט מכל צינור על קרום ניטרוצלולוז יבש ולאפשר לממברנה להתייבש לחלוטין.
      הערה: אם עוצמת האות נמוכה, ניתן לזהות יותר מ-2 μL על הממברנה. ניתן להגדיל את הנפח על ידי תצפית מספר פעמים על אותה נקודה לאחר שהממברנה מיובשת באוויר בין כל פעם. ניתן להשתמש גם במנגנון ביו-דוט.
    4. דגירה של הממברנה במאגר חוסם (TBS) למשך שעה אחת. לדגום את הממברנה במצומד סטרפטווידין אלקסה פלואור 680 (1:1,000 במאגר חוסם) למשך שעה אחת. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם TBS-T (טבלה 1) 5x.
      הערה: חלופה לבדיקת כתם הנקודות היא כתם מערבי באמצעות נוגדן סטרפטאווידין.
    5. מדוד את האות הפלואורסצנטי של כל נקודה על הממברנה תחת אורך גל של 680 ננומטר, וצור תרשים פיזור עם אות פלואורסצנטי על נפח החרוזים. בחר את נפח החרוזים האופטימלי הדרוש עבור 50 מיקרוגרם של דגימת חלבון קלט בהתבסס על המקום שבו הדעיכה האקספוננציאלית של העקומה מסתיימת .
      הערה: עוצמת הפלואורסצנציה מייצגת את שפע החלבונים הביוטינילטים בסופרנטנט, שאמורים לרדת עם כמויות הולכות וגדלות של חרוזים.

5. העשרת חלבונים ביוטינילטים ועיכול על חרוזים (3 ימים)

  1. מעבירים דגימות ליזאט חלבון מ-80 מעלות צלזיוס וסוניקטיים את הדגימות בצינורות של 1.5 מ"ל למשך 30 שניות בסוניק אמבטיה כדי להפשיר במהירות את התמיסות. מערבלים ומניחים את צינורות הדגימה על קרח.
  2. העבר 250 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin (SA) slurry לכל צינור 1.5 מ"ל. שים את הצינורות על מתלה מגנטי, לשטוף את החרוזים 3x עם 1 מ"ל של Wash Buffer A (2% SDS), ולהסיר את המאגר שיורית.
  3. בהתבסס על התוצאות של בדיקת כתם הנקודות ובדיקת חלבון DC, חשב את כמות דגימת החלבון (מיקרוגרם) הדרושה עבור 250 μL של החרוזים המגנטיים של סטרפטאווידין.
    הערה: בגשושית LAMP1-APEX זו, המתבטאת באופן אנדוגני, יש צורך ב-5 μL של חרוזים עבור 50 מיקרוגרם של חלבון קלט. לכן, 2.5 מ"ג של חלבון הכולל הוא הוסיף 250 μL של חרוזים. פחות מ-250 μL של חרוזי SA עשויים לשמש עבור חומר דגימת קלט מוגבל.
  4. הוסיפו חיץ תזה תאי לצינור המכיל את תערובת החרוז-ליזאט המגנטי לנפח כולל של 1 מ"ל וסובבו ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: יש לנרמל דגימות מקבוצות שונות או משכפלים שונים לאותו ריכוז חלבונים, נפח וכמות חרוזים כדי להפחית את הווריאציות הניסיוניות.
  5. סובבו את כל הצינורות לזמן קצר על מיקרוצנטריפוגה על ספסל והניחו את הצינורות על מתלה מגנטי למשך דקה אחת. הסר את הסופר-נטנט כשהוא על המדף המגנטי.
    הערה: חשוב להמתין דקה אחת לאחר הנחת צינורות הדגימה על המדף המגנטי בכל פעם. זה יכול למזער את אובדן החרוזים בגלל כמות החרוזים הקטנה והבלתי נראית שעדיין נעה לכיוון המגנט בתמיסה.
  6. שטפו את החרוזים 2x עם 1 מ"ל של Wash Buffer A ב-RT (סיבוב של 5 דקות בכל פעם). חזור על התהליך עם כל מאגר שטיפה 2x ברצף ב 4 מעלות צלזיוס. (חיץ B, חיץ C ומאגר D; טבלה 1).
    הערה: ריכוז גבוה של תמיסת SDS יכול לזרז בטמפרטורות קרות. הכביסה הראשונה חייבת להתבצע ב- RT.
  7. שים את הצינורות על המדף המגנטי. שטפו את החרוזים 2x עם Buffer D כדי להסיר לחלוטין את שאריות חומרי הניקוי. החזירו את החרוזים ב-100 מיקרו-ליטר של 50 mM Tris buffer והוסיפו 5 mM TCEP (ריכוז סופי) כדי לדגור במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס במערבל מבוקר טמפרטורה, תוך ניעור ב-1,200 סל"ד.
  8. הוסיפו 15 mM יודואצטאמיד (IAA, ריכוז סופי) לכל צינור ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במיקסר מבוקר טמפרטורה, תוך ניעור ב-1,200 סל"ד בחושך (מכסה מיקסר מופעל).
    הערה: רשות העתיקות רגישה לאור ויש להכין אותה טרייה 5 דקות לפני שלב זה.
  9. הוסף 5 mM TCEP (ריכוז סופי) כדי להרוות את עודפי IAA. דגירה במשך 10 דקות ב-37°C במיקסר מבוקר טמפרטורה עם רעידות ב-1,200 סל"ד (מכסה המיקסר כבוי).
  10. צנטריפוגה צינורות הדגימה לזמן קצר ומניחים על מתלה מגנטי למשך דקה אחת כדי להסיר את supernatant. הוסף 200 μL של 5 mM TCEP ב 50 mM Tris buffer כדי להשעות את החרוזים. הוסיפו 1 מיקרוגרם של תערובת טריפסין/Lys-C לדגימה, ודגרה במשך 14 שעות ב-37 מעלות צלזיוס במיקסר מבוקר טמפרטורה, תוך ניעור ב-1,200 סל"ד.
  11. הוסיפו 0.2 מיקרוגרם נוספים של תערובת טריפסין/Lys-C ועכלו במשך 3 שעות.
  12. סובב את צינורות הדגימה לזמן קצר והנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך דקה אחת. העבירו את הפפטיד כדי לנקות את הצינורות בעודכם על מדף מגנטי. שוטפים את החרוזים ב-50 מיקרו-ליטר של 50 מ"מ טריס בופר (ניעור למשך 5 דקות) ומשלבים את חומרי העל הפפטידיים.
  13. יש להוסיף 30 μL של 10% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) לצינורית המכילה פפטיד סופרנטנט כדי לקבל pH <3.

6. התפלת פפטידים ופיצול (2 שעות)

  1. הרטיבו את צלחת מיצוי הפאזה המוצקה בפאזה הפוכה (רק הבארות לשימוש) עם 200 μL של מתנול בדרגה HPLC (MeOH) פי 3 על סעפת הוואקום. הוסף 200 μL של 1% TFA במים בדרגה HPLC 3x כדי לאזן את הצלחת.
  2. טען את דגימות הפפטידים לתוך הצלחת, והפעל באיטיות את הוואקום לקבלת מהירות זרימה נמוכה מ-3 טיפות/שניות כדי למזער את אובדן הדגימה.
  3. לשטוף את צלחת מיצוי 3x עם 200 μL של 1% TFA. שטפו שוב את צלחת המיצוי עם 200 μL של 1% TFA המכיל 2% MeOH (v/v). שמור על מהירות זרימה נמוכה מ-3 טיפות/שניות.
  4. החלף את צלחת האוסף בצלחת אוסף של 96 בארות. אם אין צורך בפיצול, יש לחדד את דגימות הפפטידים פי 3 עם 100 μL של 1% TFA המכיל 80% MeOH ולשלב בצינור דגימה חדש. יבשו את דגימות הפפטידים ברכז ואקום ללא חום.
    הערה: אם רוצים פיצול, ניתן לחלק דגימות פפטידים ל-4 שברים לאחר מכן באמצעות 200 μL של 1% TFA המכילים 15%, 35%, 50% ו-90% MeOH, בהתאמה, בלוח איסוף אחר.

7. בדיקת כימות פפטידים קולורימטריים (אופציונלי) (1 ש')

  1. יש לשלול דגימות פפטידים ב-50 μL של מים בדרגה LC-MS ולקחת 20 μL aliquots כדי לבצע את בדיקת הפפטידים.
    הערה: שלב זה צורך כמות גדולה של דגימת פפטיד אך יכול לספק כימות מדויק של ריכוז הפפטידים לפני ניתוח LC-MS. זה נערך בדרך כלל רק פעם אחת לכל סוג דגימה לבדיקה לפני הכנת דגימה בקנה מידה גדול.
  2. הכן דילולים סדרתיים של תמיסות סטנדרטיות פפטידיות (המסופקות בערכת הבדיקה הצבעונית) במים בכיתה LC-MS. הכן את מגיב העבודה על ידי ערבוב 50% מגיב A, 48% מגיב B ו- 2% מגיב C.
  3. העבר 20 μL של כל תמיסה סטנדרטית פפטידית (שלושה שכפולים) ואת דגימת הפפטיד הלא ידוע לתוך microplate 96 באר. מוסיפים 180 μL של מגיב עובד לכל באר, מערבבים היטב, ודגירה את הצלחת במשך 30 דקות ב- RT.
  4. קרא את הספיגה ב-480 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות וכמת את ריכוזי דגימות הפפטידים בהתבסס על העקומה הסטנדרטית של הפפטידים.

8. ניתוח LC-MS

  1. יש להשהות את דגימות הפפטידים ב-LC Buffer A (2% אצטוניטריל ו-0.1% חומצה פורמית, בדרגת LC-MS). צנטריפוגה ב 16,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להיפטר מכל חלקיקים אפשריים.
  2. העבר את הסופרנטנט לבקבוקוני LC-MS. נתח את הדגימות באמצעות מכשיר nanoLC-MS.
    הערה: פרמטרים מפורטים של LC-MS/MS תלויים במכשיר ותוארו קודם לכן22,25,26.
  3. צור רשימת אי-הכללה מותאמת אישית של LC-MS עם טווח של זמני שמירה עבור פסגות פפטידים מזהמים בשפע רב כגון סטרפטווידין וטריפסין עם דיוק מסה של 5 ppm 22 (לדוגמה, פסגות פפטידים נפוצים של סטרפטווידין הן m/z 402.5435 [טעינה 3], m/z 603.3117 [טעינה 2], m/z 654.9733 [טעינה 3], m/z 678.6812 [טעינה 3], m/z 1017.5182 [טעינה 2], וכו.; פסגות פפטידיות טריפסין נפוצות הן M/Z 421.7584 [מטען 2], M/Z 523.2855 [מטען 2], ו-M/Z 737.7062 [מטען 3]).

9. ניתוח נתוני פרוטאומיקה

  1. נתח את הנתונים הגולמיים של LC-MS באמצעות תוכנה לניתוח נתוני פרוטאומיקה כגון Proteome Discoverer, MaxQuant27 או MS-Fragger28. כלול שתי ספריות FASTA לניתוח נתונים: 1) מסד נתונים של Swissprot Homo Sapiens ; 2) ספריית FASTA מזהמת אוניברסלית חדשה (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), שהוכחה כמשפרת את זיהוי הפרוטאומיקה ומפחיתה תגליות שווא29.
  2. הגדר את הפרמטרים של ניתוח נתוני פרוטאומיקה עם חיתוך של 1% שיעור גילוי שגוי (FDR) עבור זיהוי התאמה ספקטרלית של חלבונים ופפטידים (PSM). בחר עיכול טריפסין עם מקסימום של שלושה מחשופים שהוחמצו, שינוי קבוע של ציסטאין קרבמידומתילציה, ושינוי משתנה של חמצון מתיונין וחלבון N-מסוף אצטילציה. השתמש בעוצמות שיא של פפטיד MS1 לכימות ללא תוויות. לנרמל את עוצמות הפפטידים לקרבוקסילאז שעבר ביוטינילציה אנדוגנית, פרופיוניל-CoA קרבוקסילאז (PCCA), כדי להפחית את וריאציות תיוג הקרבה, כפי שתואר קודםלכן 22.
    הערה: ניתן לבחור נורמליזציה של PCCA בתוכנת Proteome Discoverer על-ידי הכללת קובץ FASTA של רצף חלבונים PCCA. לחלופין, ניתן לבצע נורמליזציה של PCCA בניתוח הנתונים במורד הזרם.
  3. ייצוא תוצאות ברמת החלבון מתוכנת הפרוטאומיקה. הסר חלבונים מזהמים לפני ניתוח סטטיסטי29. הסר חלבונים עם PSM אחד בלבד או ללא תוצאת כימות. ביצוע אונטולוגיה של גנים של חלבונים (GO) - ניתוח מונחים עם Enrichr30 וניתוח רשת חלבונים עם STRING31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר זה של פרוטאומיקה לתיוג קרבה ליזוזום נערך בתאי עצב שמקורם ב-iPSC אנושי כדי ללכוד את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית באתרה בתאי עצב חיים. מורפולוגיות של תאים של hiPSCs ותאי עצב שמקורם ב-hiPSC בנקודות זמן שונות מודגמות באיור 2A. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים גדלים במושבות במדיום E8. ההתמיינות מתחילה על ידי ציפוי iPSCs למדיום אינדוקציה של נוירונים המכיל דוקסיציקלין. הרחבות נויריט הופכות גלויות יותר בכל יום במהלך ההבחנה בת 3 הימים. לאחר המעבר ללוחות מצופים אש"ף בתווך נוירונים, הנוירוריטים יוצרים רשת בין נוירונים, והרחבות אקסונאליות הופכות גלויות יותר ככל שהנוירונים מגיעים להבשלה תוך שבועיים. בתאי עצבi 3, הלוקליזציה של הגשושית APEX מאומתת על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר הפעלה מהירה של APEX. חלבונים שעברו ביוטינילציה מוכתמים באמצעות נוגדן סטרפטווידין (SA), וליזוזומים מוכתמים באמצעות נוגדן anti-LAMP1. התמונה הממוזגת מאמתת את הלוקליזציה הנכונה של LAMP1-APEX לחלבון הפיתיון (איור 2B).

בדיקת טיטרציית החרוזים חיונית כדי לקבוע את היחס האופטימלי בין חרוזים לחלבון, כך שכמות חרוזי הסטרפטווידין מספיקה כדי להעשיר את כל החלבונים הביוטינילטים, אך לא כל כך מוגזמת כדי לגרום לזיהום סטרפטווידין חמור ב-LC-MS. הנפח האופטימלי של החרוזים הדרושים לדגימת חלבון קלט של 50 מיקרוגרם נבחר על בסיס המקום שבו מסתיימת הדעיכה האקספוננציאלית של העקומה (איור 3A) כפי שניתן לראות באיור 3A, אותות כתמי הנקודות מהסופרנטנט של דגירה של חלבון חרוזים פחתו ככל שיותר חלבונים ביוטיניליים נלכדו עם כמויות גדולות יותר של חרוזי סטרפטאווידין. עבור דגימות LAMP1-APEX אנדוגניות, 5 μL של חרוזי סטרפטווידין היו אופטימליים עבור 50 מיקרוגרם של חלבון קלט (מודגש באיור 3A). לאחר ההעשרה, כמות החלבון שנלכדה על ידי חרוזי הסטרפטווידין אינה ידועה. עודף אנזים פרוטאוליטי (טריפסין) יכול להגביר את העיכול האוטומטי של האנזים, עם שפע של רמות שיא של פפטידי טריפסין ב-LC-MS. טריפסין מוגזם יכול גם לעכל יותר פפטידים של סטרפטווידין בדגימות. לכן, כמות הפרוטאז הדרושה לעיכול על חרוזים צריכה להיות אופטימלית. בהשוואה לטריפסין לבדו, עיכול על חרוזים עם תערובת טריפסין/Lys-C הביא לזיהוי של יותר חלבונים ופפטידים ופחות מחמציות שהוחמצו (איור 3B). בנוסף, 1-1.5 מיקרוגרם פרוטאז לכל 250 μL של חרוזים מגנטיים של סטרפטאבידין היו אופטימליים להשגת המספר הגבוה ביותר של חלבונים מזוהים והאחוז הנמוך ביותר של מחשוף שהוחמצו (איור 3C). עם יחס חרוזים לחלבון אופטימלי, אותה כמות של חרוזים אמורה ללכוד את אותה כמות של חלבונים ביוטינילטים. לכן, כמות פרוטאז אופטימלית זו יכולה לשמש לכל הניסויים המעשירים חלבונים ביוטיניליים באמצעות אותם חרוזים מגנטיים של סטרפטאווידין.

אנזימי תיוג קרבה מבוססי פרוקסידאז מופעלים על ידי דגירה של ביוטין-פנול וטיפול קצר ב-H2 O2 (דקה אחת). שלב זה הוא מקור עיקרי לשונות בפרוטאומיקה של תיוג קרבה. בעבר מצאנו שנורמליזציה לקרבוקסילאז הנפוץ ביותר, בעל הביוטינילציה האנדוגנית ביותר, PCCA, יכולה להפחית באופן משמעותי את השונות הניסויית, ולאפשר השוואה של נתוני פרוטאומיקה של תיוג קרבה בין אצוות ניסוי שונות (איור 4)22. עבור נוירונים אנדוגניים LAMP1-APEX, הקו ההורי ללא ביטוי בדיקה LAMP1-APEX שימש כקבוצת ביקורת. נוירוני בקרה טופלו גם בביוטין-פנול וב-H2 O2. התפלגות יחסי החלבון של LAMP1-APEX לעומת קבוצת הביקורת מודגמת באיור 5A. כל הקרבוקסילאזות שעברו ביוטינילציה אנדוגנית הועשרו על ידי חרוזים מצופים סטרפטאווידין, אך נותרו ללא שינוי. כפי שניתן לראות בניתוח מונחי GO ובניתוח רשתות חלבונים (איור 5B,C), הן חלבוני ממברנה ליזוזומליים יציבים והן אינטראקטורים ליזוזומליים חולפים הקשורים לסחר אנדוליזוזומלי ולהובלה הועשרו בפרוטאומיקה LAMP1-APEX32,33,34.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה כוללת עבור פרוטאומיקה של תיוג קרבה ליזוזומית בתאי עצב שמקורם ב-hiPSC. קיצורים: hiPSC = תא גזע פלוריפוטנטי המושרה על ידי האדם; LAMP1 = חלבון ממברנה הקשור ליזוזומלי 1; APEX = אסקורבט פרוקסידאז; דוקס = דוקסיציקלין; BP = ביוטין-פנול; DCA = בדיקת חלבון תואמת דטרגנט; SA = סטרפטאווידין; LC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם; PCCA = פרופיוניל-CoA קרבוקסילאז, חלבון ביוטיניל אנדוגני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים שמקורם ב-hiPSC ופעילות LAMP1-APEX. (A) תמונות מיקרוסקופיה של ברייטפילד של שלבים שונים של hiPSCs ונוירונים שמקורם ב-hiPSC. (B) הדמיה פלואורסצנטית של פעילות LAMP1-APEX בתא העצב. אותות ביוטיניליים המוכתמים נגד סטרפטווידין קולוליזציה עם מכתים LAMP1 מחוץ לגרעין (HOECHST). פסי קנה מידה = (A) 50 מיקרומטר, (B) 1 מיקרומטר. קיצורים: hiPSC = תא גזע פלוריפוטנטי המושרה על ידי האדם; LAMP1 = חלבון ממברנה הקשור ליזוזומלי 1; APEX = אסקורבט פרוקסידאז; SA = סטרפטאבידין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אופטימיזציה של יחס חלבון חרוזים לקלט ועיכול חלבונים אנזימטיים יכולה לשפר את זיהוי החלבונים ולהפחית את ההפרעות. (A) דוגמה לבדיקת טיטרציית חרוזים נובעת מבדיקת כתם נקודה באמצעות 50 מיקרוגרם של חלבון קלט וכמויות שונות של חרוזי סטרפטאווידין. (B) תערובת טריפסין/Lys-C הביאה לזיהוי טוב יותר של חלבון/פפטיד ופחות מחריצים שהוחמצו מאשר טריפסין לבדו. (C) אופטימיזציה של כמות הטריפסין/Lys-C לעיכול על חרוזים. נתון זה שונה מ- Frankenfield et al.22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: נורמליזציה של נתוני פרוטאומיקה של תיוג קרבה לקרבוקסילאז שעבר ביוטינילציה אנדוגנית, PCCA, יכולה להפחית את וריאציות הכימות בין שכפולים ביולוגיים. נתון זה שונה מ- Frankenfield et al.22. קיצור: PCCA = פרופיוניל-CoA קרבוקסילאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תיוג קרבה ליזוזומית של פרוטאומיקה העשירה חלבוני ממברנה ליזוזומליים וחלבונים ליזוזומליים באינטראקציה בתאי עצב. (A) פיזור תרשים של יחסי שפע חלבונים של LAMP1-APEX לעומת ללא בקרת APEX המציגה חלבוני ממברנה ליזוזומליים מועשרים וחלבונים ביוטיניליים אנדוגניים ללא שינוי. (B) ניתוח GO-term של תוצאות פרוטאומיקה המוכיחות רכיב תאי מועשר בליזוזום. (C) ניתוח רשת חלבונים STRING מראה כי חלבונים מתקשרים ישירות עם חלבון הפיתיון (LAMP1), חלבוני ממברנה ליזוזומליים, ואינטראקטורים ליזוזומליים כגון חלבוני סחר בממברנות. נתון זה שונה מ- Frankenfield et al.22. קיצורים: LAMP1 = חלבון קרום הקשור ליזוזומלי 1; APEX = אסקורבט פרוקסידאז; GO = אונטולוגיה גנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בינוני/חוצץ רכיב פרוטוקול
תמיסת ציפוי מטריצת ממברנת מרתף (Matrigel) 1% מלאי מטריצת ממברנות מרתף, 99% בינוני DMEM/F12 1.1, 1.2
תמיסת ציפוי ויטרונקטין ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS 1.1
E8 מדיום שלם עם מעכב ROCK 98% E8 בינוני, 2% תוסף E8, 10 μM Y-27632 או 50 nM Chroman1 1.1
מדיום אינדוקציה של נוירונים 97% DMEM/F12 עם HEPES, 1% תוסף N2, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% L-גלוטמין, 2 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין ומעכב ROCK (10 μM Y-27632 או 5 ננומטר כרומן 1) 1.2
פתרון ציפוי נוירון PLO 0.1 מ"ג/מ"ל פולי-ל-אורניתין (אש"ף), 100 מ"מ חומצה בורית, 25 מ"מ נתרן טטרבוראט, 75 מ"מ נתרן כלורי, 1 מ' נתרן הידרוקסידי 1.3
מדיום נוירונים 98% מדיום נוירונים בקליפת המוח, 2% תוסף B27, 10 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF), 10 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי שמקורו בגליה (GDNF), 10 ננוגרם/מ"ל NT-3, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל למינין, 2 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין 1.3
חיץ מרווה 10 mM נתרן אזיד, 10 mM נתרן אסקורבט, 5 mM TROLOX ב- PBS 2.2
מאגר תזה של תאים 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% SDS, 1% טריטון, 1 mM טריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלוריד (TCEP), 10 mM נתרן אזיד, 10 mM נתרן אסקורבט, 5 mM TROLOX, קוקטייל מעכב פרוטאז 2.3
TBS-T 0.05% Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7.5) 4.2
מאגר א' מאגר SDS של 2% 5.2
מאגר ב' 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% טריטון-X 5.6
מאגר C 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0.5% SDS, 0.5% טריטון-X 5.6
מאגר D 2 מ' אוריאה, 50 מ' טריס-HCl 5.6

טבלה 1: קומפוזיציות של מדיה ומאגרים המשמשים בפרוטוקול זה.

בעיה פרוטוקול פתרון/הצעה
תרבית iPSC מתקלפת מהצלחת 1.1 הגדל את ריכוז ציפוי ויטרונקטין או זמן.
חלק מה-iPSCs לא התמיינו לנוירונים 1.2 הגדל את זמן הטיפול בתמיסת ניתוק תאים כדי לנתק לחלוטין את ה- iPSCs במהלך התמיינות d0.
תרבית נוירונים מתקלפת מהצלחת 1.3 כביסה ושינוי המדיום חייבים להיות עדינים ומהדופן הצדדית של הצלחת.
חלבונים אינם מתמוססים לחלוטין לאחר משקעי אצטון 2.7 מקצרים את זמן הייבוש של גלולת החלבון. הגדל את עוצמת הקול של מאגר הליזיס וסוניקט לזמן קצר כדי לסייע בפירוק.
אותות צביעה חלשים של סטרפטאבידין 3 הגדילו את זמן הטיפול ב-H 2 O 2 כך שיהיה2-3שניות וסובבו את הצלחת לפיזור שווה.
אות נמוך של בדיקת טיטרציה חרוזים 4.2 המתן עד שהממברנה תתייבש לחלוטין והוסף עוד-על לאותה נקודה (יכול לחזור על עצמו עד פי 3) כדי לשפר את עוצמת האות.
חרוזים מגנטיים שאינם מתגלגלים לכיוון המדף המגנטי 5 ניידות החרוזים המגנטיים פוחתת במאגר שאינו מכיל חומרי ניקוי. ניתן להשתמש בריכוז אוריאה גבוה יותר עד 4 M או בחומר ניקוי תואם LC-MS במאגר כביסה D.
אובדן חרוזים מגנטיים במהלך שטיפת חרוזים 5 הגדל את זמן ההמתנה כאשר צינורות דגימה מונחים על החרוזים המגנטיים (דקה או יותר) לפני לקיחת supernatant מן הצינורות.
שיאי זיהום טעונים ב-LC-MS 6 ניקוי פפטידים לא מספיק. הגדילו את נפח וזמני הכביסה במהלך התפלת פפטידים.
בדיקת פפטידים אות נמוך 7 השהה דגימות פפטידים בנפח נמוך יותר כדי להגדיל את ריכוז הפפטידים.
אותות סטרפטאבידין מכריעים ב-LC-MS 8 להפחית את כמות חרוזי streptavidin. אם שיא הטריפסין הוא גם בשפע, להפחית את כמות טריפסין.
יותר מדי רקע של תיוג לא ספציפי 9 שטיפת חרוזי סטרפטווידין לא הספיקה. יש להסיר את כל שאריות הנוזלים במהלך כל שלב כביסה. הגדילו את הזמן והנפח לשטיפת חרוזים.

טבלה 2: פתרון בעיות ופתרונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באמצעות בדיקה זו של LAMP1-APEX, חלבונים על הממברנה הליזוזומלית ובסמוך לה עוברים ביוטינילציה ומועשרים. בהתחשב בקוטר הליזוזום הטיפוסי של 100-1,200 ננומטר, שיטה זו מספקת רזולוציה תוך-תאית מצוינת עם רדיוס תיוג של 10-20 ננומטר. LAMP1 הוא חלבון ממברנה ליזוזומלי בשפע וסמן קלאסי לליזוזומים, המשמש כחלבון פיתיון מצוין לתיוג APEX ליזוזומלי ברמת הביטוי האנדוגנית. עם זאת, מגבלות קיימות גם בעת שימוש ב-LAMP1 כדי להתמקד בליזוזומים, שכן LAMP1 קיים גם באנדוזומים מאוחרים וליזוזומים לא מתכלים35. רוב הסמנים הליזוזומליים באים לידי ביטוי גם באנדוזומים מאוחרים, שבסופו של דבר מבשילים לליזוזומים. חלבוני פיתיון חלופיים לטיפול בליזוזומים הם LAMPTOR, LAMP2 ו-TMEM19235,36,37. חשוב לציין כי רדיקלים ביוטינים תגובתיים אינם חודרים לממברנה. לכן, רוב חלבוני הלומן הליזוזומליים בלבד אינם נלכדים בשיטה זו של פרוטאומיקה LAMP1-APEX. ניתן להשיג חלבוני לומן ליזוזומליים על ידי בידוד ליזוזומלי באמצעות שיטת הצנטריפוגה ההדרגתית המסורתית או אימונופוריפיקציה ליזוזומלית 4,38. עם זאת, חלבונים על הממברנה הליזוזומלית עלולים להיות משובשים במהלך בידוד ליזוזומלי ולאבד את המידע עבור אינטראקציות ליזוזומליות חולפות ודינמיות. לכן, ניתן לשלב תיוג קרבה ליזוזומלית ובידוד ליזוזומלי כדי לקבל תמונת מצב מלאה של פעילויות ליזוזומליות הן מחוץ והן בתוך ליזוזומים.

כדי למזער את השונות מתרבית iPSC-neuron, צפיפות ציפוי הנוירונים חייבת להיות עקבית בכל השכפולים הביולוגיים וקבוצות ההשוואה. אותן רמות של התבגרות עצבית ובריאות הן קריטיות גם מסיבה זו. במהלך הפעלת APEX, תוספת ביוטין-פנול ו-H2 O2 לתאים חייבת להתבצע על ידי ערבוב מוקדם עם מדיום תרבית חם ולאחר מכן הוספת התערובת לתאים, ולאחר מכן ניעור מיידי ועדין כדי להבטיח פיזור שווה. השימוש ב-H2 O2 מעלה גם חששות לגבי עקה חמצונית והפרעות במיקרו-סביבה הדינמית של התא. למרות שלא נמצאו שינויים משמעותיים ברמת השפע של החלבון, יותר פפטידים שונו עם חמצון מתיונין בתאי העצב שטופלו ב-H 2 O2 לעומת תאי בקרה22. לכן, בקרה קפדנית על זמן ההפעלה של H 2 O2(דקה אחת) היא קריטית כדי למזער את העקה החמצונית ולהפחית את הדיפוזיה של ענן ביוטין כדי להבטיח רדיוס תיוג ספציפי סביב חלבון הפיתיון.

עבור קווי תאים לא קוטביים כגון HEK ו-U2OS, ניתן לקצור תאים על ידי קילוף לאחר תיוג קרבה כדי להסיר את הסופרנטנט המכיל ביוטין חופשי. עם זאת, יש לקצור תאי עצב על ידי הוספה ישירה של חיץ תזה תאית לצלחת וגירוד לתוך צינורות כדי למנוע נזק לנויריט ואובדן דגימה במהלך הכדור. נוכחות של ביוטין חופשי יכולה להרוות את חרוזי הסטרפטאווידין. הסרה מלאה של ביוטין חופשי יכולה להיות מושגת על ידי שטיפות מרובות ודגירה עם חיץ מרווה בנוירונים ו / או משקעי חלבון לאחר תזה תאית. מכיוון שלחלבוני פיתיון שונים יש רמות ביטוי שונות, יש לבצע בדיקת כתם נקודה עבור כל בדיקה חדשה של APEX. לאחר שנקבע יחס החרוזים/חלבון האופטימלי, כמות החלבון ההתחלתי ונפח החרוזים צריכה להיות עקבית עבור כל השכפולים עבור אותה בדיקה APEX. כאשר משווים בין בדיקות שונות, כגון LAMP1-APEX לעומת ציטוזוליק-APEX, מומלץ להשתמש באותו נפח חרוזים אך לשנות את כמות החלבון ההתחלתי כדי לשקף את יחסי החרוזים/חלבונים האופטימליים עבור בדיקות APEX שונות. כדי להפחית עוד יותר את השינויים הניסיוניים ולהגדיל את התפוקה, ניתן לבצע תיוג איזוטופים יציבים על ידי חומצות אמינו בתרבית תאים (SILAC)39. תיוג איזוברי מרובב יכול לשמש גם לתיוג כימי של פפטידים לאחר עיכול חלבונים באמצעות תגי TMT/iTRAQ/DiLeu 20,40,41,42.

תיוג קרבה יושם באופן נרחב כדי ללכוד את המיקרו-סביבה התאית והמולקולרית באורגניזמים שונים43. עם זאת, תיוג קרבה עדיין מתמודד עם אתגרים טכניים רבים, כגון זיהום מאותות סטרפטאווידין, שימוש במי חמצן להפעלת אנזימים, ונוכחות של קרבוקסילזות מיטוכונדריאליות אנדוגניות. לכן, ניסויים פרוטאומיים של תיוג קרבה דורשים תכנון קפדני ובקרת איכות. כדי לעזור לחוקרים לפתור את ניסוי תיוג הקרבה שלהם, אנו מספקים מדריך קצר לבעיות ופתרונות נפוצים בטבלה 2. לאחרונה פותחה שיטת תיוג קרבה הניתנת למחשוף באמצעות ביוטין25 בעל יכולת חיתוך תיול. לכן, ניתן לבקע חלבונים שעברו ביוטינילציה מחרוזים באמצעות מגיב מחזר כגון TCEP ללא צורך בעיכול על חרוזים. שיטת ביוטין מחשוף זו יכולה להפחית באופן דרמטי אותות הפרעה מסטרפטאווידין, קרבוקסילאזות שעברו ביוטינילציה אנדוגנית וקשירה לא ספציפית. מאמצים מתמשכים יישמו את שיטת הביוטין המחשוף הזו בפרוטאומיקה LAMP1-APEX כדי לשפר את הספציפיות והדיוק של התווית. ניתן לתכנן גם גשושיות לתיוג קרבה כך שיתמקדו בתאים תת-תאיים אחרים44. כמות וסוג החלבונים שזוהו תלויים באופי חלבון הפיתיון, בסביבתו התוך-תאית וברמת הביטוי של בדיקת תיוג הקרבה. שיטה פרוטאומית אנדוגנית זו LAMP1-APEX מספקת כלי רב ערך לחקר הפעילות הליזוזומית הדינמית בתאי עצב אנושיים. הפרוטוקול המפורט ואופטימיזציה של המתודולוגיה חלים גם על בדיקות תיוג קרבה אחרות ועל ביוטינילציה כימית, ומשמשים כמשאב שימושי עבור קהילת הפרוטאומיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH (R01NS121608). A.M.F. מכיר במלגת פרק ARCS-Metro Washington ובמלגת קרן בורבון פ. סקריבנר. אנו מודים למעבדת מייקל וורד במכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) על התמיכה בביולוגיה מולקולרית ולפיתוח טכנולוגיית i3Neuron.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Tags

מדעי המוח גיליון 184 תיוג קרבה ליזוזום פרוטאומיקה נוירונים שמקורם ב-iPSC LAMP1 APEX אינטראקציה עם חלבונים ממברנה ליזוזומלית
אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L.… More

Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter