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Biology

कैप्चर हाई-सी के माध्यम से उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी क्रोमैटिन संगठन को समझना

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64166
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4, 1, 1,5
1EMBL: European Molecular Biology Laboratory, 2Institut Curie, 3Agilent Technologies, 4Genmab BV, 5Collège de France

Summary

यह प्रोटोकॉल कैप्चर हाई-सी विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर मेगाबेस्ड आकार के लक्षित जीनोमिक क्षेत्रों के 3 डी संगठन को चिह्नित करने के लिए किया जाता है, जिसमें टोपोलॉजिकल रूप से संबद्ध डोमेन (टीएडी) की सीमाएं और नियामक और अन्य डीएनए अनुक्रम तत्वों के बीच लंबी दूरी की क्रोमैटिन इंटरैक्शन शामिल हैं।

Abstract

जीनोम का स्थानिक संगठन प्रतिलेखन, प्रतिकृति, पुनर्संयोजन और मरम्मत सहित कई संदर्भों में इसके कार्य और विनियमन में योगदान देता है। जीनोम टोपोलॉजी और फ़ंक्शन के बीच सटीक कार्य-कारण को समझना इसलिए महत्वपूर्ण है और तेजी से गहन शोध का विषय है। क्रोमोसोम रचना कैप्चर प्रौद्योगिकियां (3 सी) जीनोम के किसी भी क्षेत्र के बीच बातचीत की आवृत्ति को मापकर क्रोमैटिन की 3 डी संरचना का अनुमान लगाने की अनुमति देती हैं। यहां हम कैप्चर हाई-सी करने के लिए एक तेज़ और सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, एक 3 सी-आधारित लक्ष्य संवर्धन विधि जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर मेगाबेस्ड आकार के जीनोमिक लक्ष्यों के एलील-विशिष्ट 3 डी संगठन की विशेषता है। कैप्चर हाई-सी में, लक्ष्य क्षेत्रों को डाउनस्ट्रीम उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण से पहले बायोटिनीलेटेड जांच की एक सरणी द्वारा कैप्चर किया जाता है। इस प्रकार, प्रौद्योगिकी की समय-प्रभावशीलता और सामर्थ्य में सुधार करते हुए उच्च रिज़ॉल्यूशन और एलील-विशिष्टता प्राप्त की जाती है। अपनी ताकत का प्रदर्शन करने के लिए, कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल को माउस एक्स-निष्क्रियता केंद्र (एक्सआईसी) पर लागू किया गया था, जो एक्स-क्रोमोसोम निष्क्रियता (एक्ससीआई) का मास्टर नियामक स्थान है।

Introduction

रैखिक जीनोम एक जीव के भ्रूण के विकास से गुजरने और वयस्कता के दौरान जीवित रहने के लिए आवश्यक सभी जानकारी रखता है। हालांकि, आनुवंशिक रूप से समान कोशिकाओं को विभिन्न कार्यों को करने का निर्देश देना सटीक रूप से नियंत्रित करने के लिए मौलिक है कि विभिन्न ऊतकों और / या विकास ता्मक चरणों सहित विशिष्ट संदर्भों में कौन सी जानकारी का उपयोग किया जाता है। जीनोम के त्रि-आयामी संगठन को नियामक तत्वों के बीच भौतिक बातचीत को सुविधाजनक बनाने या रोकने के द्वारा जीन गतिविधि के इस सटीक स्थानिक-अस्थायी विनियमन में भाग लेने के लिए माना जाता है जिसे रैखिक जीनोम में कई सौ किलोबेस द्वारा अलग किया जा सकता है (समीक्षा के लिए 1,2,3;). पिछले 20 वर्षों में, जीनोम फोल्डिंग और गतिविधि के बीच परस्पर क्रिया की हमारी समझ तेजी से बढ़ी है, बड़े पैमाने पर क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर प्रौद्योगिकियों (3 सी) (समीक्षा के लिए 4,5,6,7) के विकास के कारण। ये विधियां जीनोम के किसी भी क्षेत्र के बीच बातचीत की आवृत्ति को मापती हैं और डीएनए अनुक्रमों के बंधाव पर भरोसा करती हैं जो नाभिक के भीतर 3 डी निकटता में हैं। सबसे आम 3 सी प्रोटोकॉल फॉर्मलाडेहाइड जैसे क्रॉस-लिंकिंग एजेंट के साथ सेल आबादी के निर्धारण से शुरू होते हैं। क्रॉस-लिंक्ड क्रोमैटिन को तब एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचाया जाता है, हालांकि MNase पाचन का भी उपयोग किया गया है 8,9. पाचन के बाद, निकट स्थानिक निकटता में मुक्त डीएनए को फिर से बंद कर दिया जाता है, और क्रॉस-लिंकिंग को उलट दिया जाता है। यह कदम 3 सी 'लाइब्रेरी' या 'टेम्प्लेट' को जन्म देता है, जो संकर टुकड़ों का एक मिश्रित पूल है जिसमें नाभिक के 3 डी निकटता में अनुक्रमों में एक ही डीएनए टुकड़े में लिगेट होने की अधिक संभावना होती है। इन हाइब्रिड टुकड़ों की डाउनस्ट्रीम मात्रा जीनोमिक क्षेत्रों के 3 डी अनुरूपण का अनुमान लगाने में सक्षम बनाती है जो रैखिक जीनोम में हजारों आधार जोड़े अलग स्थित हैं लेकिन 3 डी स्पेस में बातचीत कर सकते हैं।

3 सी लाइब्रेरी को चिह्नित करने के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, दोनों के संदर्भ में अलग-अलग हैं कि लिगेशन टुकड़ों के उप-समूहों का विश्लेषण किया जाता है और उनके डाउनस्ट्रीम परिमाणीकरण के लिए किस तकनीक का उपयोग किया जाता है। मूल 3 सी प्रोटोकॉल रुचि के दो क्षेत्रों के चयन और पीसीआर10,11 द्वारा उनकी 'एक बनाम एक' इंटरैक्शन आवृत्ति की मात्रा का ठहराव पर निर्भर था। 4 सी दृष्टिकोण (परिपत्र गुणसूत्र रचना कैप्चर) रुचि के एकल स्थान (यानी, 'दृश्य-बिंदु') और शेष जीनोम ('एक बनाम सभी') 12,13,14 के बीच बातचीत को मापता है। 4 सी में, 3 सी लाइब्रेरी छोटे गोलाकार डीएनए अणुओं को उत्पन्न करने के लिए पाचन और पुन: बंधाव के दूसरे दौर से गुजरती है जो पीसीआर को दृश्य-बिंदु विशिष्ट प्राइमर15 द्वारा प्रवर्धित किया जाता है। 5 सी (क्रोमोसोम रचना कैप्चर कार्बन कॉपी) रुचि के बड़े क्षेत्रों में 3 डी इंटरैक्शन के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है, जो उस क्षेत्र के भीतर उच्च-क्रम क्रोमैटिन फोल्डिंग में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ('कई बनाम कई')। 5 सी में, 3 सी लाइब्रेरी को ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ओवरलैपिंग प्रतिबंध साइटों के एक पूल में संकरित किया जाता है जिसे बाद में सार्वभौमिक प्राइमर15 के साथ मल्टीप्लेक्स पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जा सकता है। 4 सी और 5 सी दोनों में, सूचनात्मक डीएनए टुकड़े शुरू में माइक्रोएरे द्वारा निर्धारित किए गए थे और बाद में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) 17,18,19 द्वारा। ये रणनीतियाँ रुचि के लक्षित क्षेत्रों को चिह्नित करती हैं लेकिन जीनोम-व्यापक इंटरैक्शन को मैप करने के लिए लागू नहीं की जा सकती हैं। यह उत्तरार्द्ध लक्ष्य हाई-सी, एक 3 सी-आधारित उच्च-थ्रूपुट रणनीति के साथ प्राप्त किया जाता है जिसमें 3 सी टेम्पलेट के बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण जीनोम-वाइड स्तर ('सभी बनाम सभी') पर क्रोमैटिन फोल्डिंग के निष्पक्ष लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। हाई-सी प्रोटोकॉल में पचे हुए टुकड़ों के सिरों पर एक बायोटिनीलेटेड अवशेष को शामिल करना शामिल है, जिसके बाद लिगेटेड टुकड़ों की वसूली को बढ़ाने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के साथ बंधाव के टुकड़ों को खींचना शामिलहै।

हाय-सी से पता चला कि स्तनधारी जीनोम संरचनात्मक रूप से 3 डी नाभिक में कई पैमानों पर व्यवस्थित होते हैं। मेगाबेस पैमाने पर, जीनोम को सक्रिय और निष्क्रिय क्रोमैटिन, ए और बी डिब्बों के क्षेत्रों में विभाजित किया गया है, क्रमशः20,21। विभिन्न क्रोमैटिन और गतिविधि राज्यों द्वारा दर्शाए गए आगे के उपडिब्बों का अस्तित्व भी बाद मेंदिखाया गया था। उच्च रिज़ॉल्यूशन पर, जीनोम को आगे उप-मेगाबेस स्व-अंतःक्रियात्मक डोमेन में विभाजित किया जाता है जिसे टोपोलॉजिकल रूप से संबद्ध डोमेन (टीएडी) कहा जाता है, जो पहली बार मानव और माउस जीनोम23,24 के हाई-सी और 5 सी विश्लेषण द्वारा प्रकट किया गया था। डिब्बों के विपरीत जो ऊतक-विशिष्ट तरीके से भिन्न होते हैं, टीएडी स्थिर होते हैं (हालांकि कई अपवाद हैं)। महत्वपूर्ण रूप से, टीएडी सीमाओं को प्रजातियों25 में संरक्षित किया जाता है। स्तनधारी कोशिकाओं में, टीएडी अक्सर एक ही नियामक परिदृश्य को साझा करने वाले जीन को शामिल करते हैं और एक संरचनात्मक ढांचे का प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाया गया है जो पड़ोसी नियामक डोमेन के साथ बातचीत को सीमित करते हुए जीन सह-विनियमन की सुविधा प्रदान करता है (समीक्षा के लिए 3,26,27,28)। इसके अलावा, टीएडी के भीतर, कोहेसिन-एक्सट्रूडेड लूप के आधार पर सीटीसीएफ साइटों के कारण बातचीत प्रमोटर-एन्हांसर या एन्हांसर-एन्हांसर इंटरैक्शन की संभावना को बढ़ा सकती है (समीक्षा29 के लिए)।

हाई-सी में, डिब्बों और टीएडी को 1 एमबी से 40 केबी रिज़ॉल्यूशन पर पाया जा सकता है, लेकिन 5-10 केबी के पैमाने पर डिस्टल तत्वों के बीच लूपिंग इंटरैक्शन जैसे छोटे पैमाने के संपर्कों को चिह्नित करने के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, एचआईसी द्वारा कुशलतापूर्वक ऐसे लूप का पता लगाने में सक्षम होने के लिए रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने के लिए अनुक्रमण गहराई में उल्लेखनीय वृद्धि की आवश्यकता होती है और इसलिए, अनुक्रमण लागत। यदि विश्लेषण को एलील-विशिष्ट होने की आवश्यकता होती है तो यह बढ़ जाता है। दरअसल, रिज़ॉल्यूशन में एक्स-गुना वृद्धि के लिए अनुक्रमण गहराई में एक्स2 वृद्धि की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन और एलील-विशिष्ट जीनोम-वाइड दृष्टिकोण निषेधात्मक रूपसे महंगे हो सकते हैं।

उच्च-रिज़ॉल्यूशन को बनाए रखते हुए लागत-प्रभावशीलता और सामर्थ्य में सुधार करने के लिए, डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण से पहले पूरक बायोटिन-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के साथ संकरण के बाद जीनोम-वाइड 3 सी या हाई-सी पुस्तकालयों से रुचि के लक्षित क्षेत्रों को शारीरिक रूप से नीचे खींचा जा सकता है। इन लक्ष्य संवर्धन रणनीतियों को कैप्चर-सी विधियों के रूप में संदर्भित किया जाता है और जीनोम में बिखरे सैकड़ों लक्ष्य लोकी की बातचीत की पूछताछ की अनुमति देता है (यानी, प्रमोटर कैप्चर (पीसी) हाई-सी; अगली पीढ़ी (एनजी) कैप्चर-सी; कम इनपुट (एलआई) कैप्चर-सी; न्यूक्लियर टाइटरेटेड (एनयूटीआई) कैप्चर-सी; ट्राई-सी) 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, या कई मेगाबेस तक फैले क्षेत्रों में (यानी, कैप्चर एचआईसी; एचवाईब्रिड कैप्चर हाई-सी (हाई-सी2); टाइल-सी) 41,42,43। कैप्चर-आधारित विधियों में दो पहलू भिन्न हो सकते हैं: (1) बायोटिनीलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की प्रकृति और डिजाइन (यानी, आरएनए या डीएनए, बिखरे हुए जीनोमिक लक्ष्यों को कैप्चर करने वाले एकल ऑलिगोस या रुचि के क्षेत्र को कवर करने वाले कई ऑलिगो); और (2) टेम्प्लेट जिसका उपयोग लक्ष्यों को नीचे खींचने के लिए किया जाता है जो 3 सी या हाई-सी लाइब्रेरी हो सकता है, बाद में 3 सी लाइब्रेरी से नीचे खींचे गए बायोटिनीलेटेड प्रतिबंध टुकड़े शामिल हैं।

यहां, 3 सी लाइब्रेरी से लक्ष्य संपर्कों के संवर्धन के आधार पर एक कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। प्रोटोकॉल बायोटिनीलेटेड आरएनए जांच की एक कस्टम-अनुरूप टाइलिंग सरणी के डिजाइन पर निर्भर करता है और 3 सी लाइब्रेरी की तैयारी से एनजीएस अनुक्रमण तक 1 सप्ताह में किया जा सकता है। प्रोटोकॉल तेज, सरल है, और अन्य 3 सी विधियों की तुलना में समय प्रभावशीलता और सामर्थ्य में सुधार करते हुए 5 केबी रिज़ॉल्यूशन पर मेगाबेस-आकार के क्षेत्रों के उच्च क्रम 3 डी संगठन को चिह्नित करने की अनुमति देता है। कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल को एक्स-क्रोमोसोम निष्क्रियता (एक्ससीआई), एक्स-निष्क्रियता केंद्र (एक्सआईसी) के मास्टर नियामक स्थान पर लागू किया गया था, जो एक्सिस्ट नॉनकोडिंग आरएनए को होस्ट करता है। Xic पहले व्यापक संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण का विषय रहा है (समीक्षा के लिए44,45)। स्तनधारियों में, एक्ससीआई महिलाओं (XX) और पुरुषों (XY) के बीच एक्स-लिंक्ड जीन की खुराक की भरपाई करता है और इसमें महिला कोशिकाओं में दो एक्स गुणसूत्रों में से एक की लगभग संपूर्णता की ट्रांसक्रिप्शनल साइलेंसिंग शामिल है। Xic ने 3D जीनोम टोपोलॉजी और जीन विनियमन44 के साथ परस्पर क्रिया में अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली, स्वर्ण मानक स्थान का प्रतिनिधित्व किया है। माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एमईएससी) में एक्सआईसी के 5 सी विश्लेषण ने टीएडी की खोज और नामकरण का नेतृत्व किया, जो टोपोलॉजिकल विभाजन और जीन सह-विनियमन24 की कार्यात्मक प्रासंगिकता में पहली अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। Xic के टोपोलॉजिकल संगठन को बाद में Xist अपरेगुलेशन और XCI 46 के उपयुक्त विकास समय में गंभीर रूप से शामिल दिखाया गया था, और असंदिग्ध सीआईएस-नियामक तत्व जो टीएडी के भीतर और बीच जीन गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं, उन्हें हाल ही में Xic47,48,49 के भीतर खोजा गया था। एक्सिक में फैले माउस एक्स क्रोमोसोम के 3 एमबी पर कैप्चर हाई-सी लागू करना उच्च रिज़ॉल्यूशन पर बड़े पैमाने पर क्रोमैटिन फोल्डिंग को विच्छेदित करने में इस दृष्टिकोण की शक्ति को दर्शाता है। एक विस्तृत और आसानी से पालन किया जाने वाला प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, जो रुचि के क्षेत्र के भीतर प्रत्येक डीपीएनआईआई प्रतिबंध साइट पर बायोटिनीलेटेड जांच की सरणी के डिजाइन से शुरू होकर जीनोम-वाइड 3 सी लाइब्रेरी की पीढ़ी, संकरण और लक्ष्य संपर्कों को कैप्चर करने और डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण तक होता है। उपयुक्त गुणवत्ता नियंत्रण और अपेक्षित परिणामों का अवलोकन भी शामिल है, और समान मौजूदा तरीकों के प्रकाश में दृष्टिकोण की ताकत और सीमाओं दोनों पर चर्चा की जाती है।

Protocol

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए माउस भ्रूण स्टेम सेल (एमईएससी) को इंस्टीट्यूट क्यूरी (पेरिस) 51 के पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार एक टीएक्स / टीएक्स आर 26 आरटीटीए/ आरटीटीए महिला50 के क्रॉस से प्राप्त किया गया था।

1. जांच डिजाइन

  1. रुचि के लक्ष्य क्षेत्र को कवर करने वाले बायोटिनीलेटेड प्रोब्स (120-मेर आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स) की एक सरणी डिजाइन करें।
    1. अतिव्यापी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ रुचि के क्षेत्र को टाइल करें ताकि औसतन लक्ष्य के भीतर प्रत्येक अनुक्रम को दो अद्वितीय जांच (2x कवरेज) द्वारा कवर किया जाए (चित्रा 1)।
    2. विशिष्ट इंटरैक्शन के संवर्धन से बचने के लिए जांच कवरेज से दोहराए जाने वाले अनुक्रमों को बाहर रखें।
      नोट: सूचनात्मक बंधाव टुकड़ों के संवर्धन को अधिकतम करने के लिए, लक्ष्य के पार प्रत्येक डीपीएनआईआई प्रतिबंध साइट के 300 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में फैले क्षेत्रों को परिभाषित किया गया था (सीएचआरएक्स: 102,475,000-105,475,000), और 28,913 बायोटिनीलेटेड प्रोब को श्योर डिज़ाइन प्लेटफॉर्म52 के माध्यम से श्योरसेलेक्ट डीएनए लक्ष्य संवर्धन तकनीक के अनुसार डिज़ाइन किया गया था।. इस रणनीति के अनुसार, प्रत्येक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड में दोहराव वाले अनुक्रमों के अधिकतम 40 आधारों की अनुमति दी जाती है ताकि विशिष्ट इंटरैक्शन के संवर्धन को कम किया जा सके। जांच सरणी को एगिलेंट द्वारा संश्लेषित किया गया था। यहां, डीपीएनआईआई का उपयोग दो कारणों से प्रतिबंध एंजाइम के रूप में किया जाता है: (1) यह एक चार-कटर है जो नियमित रूप से कई 3 सी-आधारितविधियों में उपयोग किया जाता है। और (2) यह इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली एफ 1 हाइब्रिड लाइनों में सिलिको में परीक्षण किए गए अन्य प्रतिबंध एंजाइमों की तुलना में काटने वाली साइटों की निकटता में सूचनात्मक एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (एसएनपी) को पकड़ने की संभावना को अधिकतम करता है (सी 57बीएल / 6 जे एक्स सीएएसटीआई / जे)।

2. प्रायोगिक प्रक्रिया

  1. सेल की तैयारी
    1. निर्धारण के दिन ≥ 5 x 107 कोशिकाओं की कुल सेल संख्या प्राप्त करने के लिए एक या कई सेल कल्चर प्लेटों पर कोशिकाओं की उचित संख्या को बीज दें।
      नोट: इस अध्ययन में माउस भ्रूण स्टेम सेल (एमईएससी) का उपयोग किया गया था। एमईएससी को जिलेटिनयुक्त (1x PBS में 0.1% जिलेटिन - 37 डिग्री सेल्सियस पर o/n, 5% CO2 इनक्यूबेटर) सेल कल्चर प्लेटों पर 2i + LIF और बैच-परीक्षण किए गए भ्रूण बछड़े के सीरम (DMEM, 15% FBS, 0.1 mM β-मर्कैप्टोइथेनॉल, 1,000 U/mL-1 ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF), CHIR99021 (3 μM) और PD99021 (3 μM) युक्त एमईएससी माध्यम में सेल कल्चर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। इस सेल प्रकार के लिए, एक 80% कंफ्लुएंट 10 सेमी प्लेट में लगभग 2 x 107 कोशिकाएं होती हैं।
    2. सेल गिनती के लिए एक अतिरिक्त सेल कल्चर प्लेट तैयार करें।
      नोट: मीडिया उपयोग को कम करने के लिए एक छोटी सेल कल्चर प्लेट का उपयोग किया जा सकता है। इस मामले में, छोटी प्लेट पर बीज करने के लिए कोशिकाओं की संख्या को तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, 15 सेमी प्लेट की तुलना में 10 सेमी प्लेट पर 3 x कम कोशिकाएं)।
  2. फॉर्मलाडेहाइड निर्धारण
    1. क्रॉस-लिंक किए जाने वाले कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाएं।
      1. क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके विशेष रूप से सेल गिनती के लिए तैयार नियंत्रण प्लेट से कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज और गिनते हैं।
      2. व्यवहार्यकोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए एक व्यवहार्यता धुंधलापन (जैसे, ट्राइपैन ब्लू) शामिल करें। इस सेल गिनती से, क्रॉस-लिंकिंग के लिए तैयार प्लेट (प्लेटों) में कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाएं।
    2. क्रॉस-लिंकिंग के लिए तैयार प्लेटों से संस्कृति माध्यम को हटा दें और इसे उचित मात्रा में निर्धारण समाधान (सेल कल्चर माध्यम में 2% फॉर्मलाडेहाइड) के साथ बदलें। 10 सेमी प्लेट पर 10 एमएल का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, 15 सेमी प्लेट के लिए ~ 20 एमएल)।
      नोट: निर्धारण समाधान की एक सटीक मात्रा जोड़ें। यदि अनुयायी कोशिकाओं को ठीक करना संभव नहीं है, तो इस चरण को ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 30 एमएल निर्धारण समाधान में प्रदर्शन किया जा सकता है। फॉर्मलाडेहाइड 1 वर्ष से अधिक पुराना नहीं होना चाहिए। एकल-उपयोग शीशियों का उपयोग करना पसंद किया जाता है। निर्धारण समाधान को उपयोग से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर लाया जाना चाहिए।
      चेतावनी: फॉर्मलाडेहाइड खतरनाक है और उचित स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों के अनुसार संभाला जाना चाहिए।
    3. शेकर पर सौम्य मिश्रण के तहत आरटी पर 10 मिनट के लिए फिक्स करें।
    4. 0.125 M की अंतिम सांद्रता में 2.5 M ग्लाइसिन-1x PBS को जोड़कर निर्धारण प्रतिक्रिया को बुझाएं। 10 सेमी प्लेट पर 2.5 M ग्लाइसिन-1x PBS के 530 μL को 10 mL में जोड़ें (उदाहरण के लिए, 15 सेमी प्लेट पर 1060 μL से 20 mL)।
      नोट: यदि कोशिकाओं को समाधान में तय किया गया था, तो 2.5 एम ग्लाइसिन -1 एक्स पीबीएस के 1590 μL के साथ निर्धारण प्रतिक्रिया को बुझाएं।
    5. आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, धीरे से एक शेकर पर मिलाएं।
    6. प्लेटों को बर्फ में स्थानांतरित करें और शेकर पर धीरे से मिश्रण करते हुए बर्फ पर अतिरिक्त 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: अब से, कोशिकाओं को बर्फ पर रखा जाना चाहिए, और आगे क्रॉस-लिंकिंग से बचने के लिए बफर को पूर्व-ठंडा किया जाना चाहिए। यदि कई प्लेटों को संसाधित करने की आवश्यकता है तो ठंडे कमरे में जाएं।
    7. तेजी से हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए बीकर में डालकर कोशिकाओं से निर्धारण समाधान को हटा दें।
      नोट: उचित स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों के अनुसार फॉर्मलाडेहाइड युक्त तरल अपशिष्ट का निपटान करना सुनिश्चित करें।
    8. मलबे और मृत कोशिकाओं को धोने के लिए 10 सेमी प्लेट को 5 मिलीलीटर ठंडे 0.125 एम ग्लाइसिन -1 एक्स पीबीएस (15 सेमी प्लेट के लिए 8 एमएल) के साथ जल्दी से दो बार कुल्ला करें। तेजी से हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए इसे बीकर में डालकर प्लेट से तरल निकालें।
    9. 10 सेमी प्लेट (15 सेमी प्लेट के लिए 10 एमएल) में 5 एमएल ठंडा 0.125 एम ग्लाइसिन -1 एक्स पीबीएस जोड़ें और प्लास्टिक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके प्लेट से कोशिकाओं को जल्दी से खुरचलें।
    10. सेल सस्पेंशन को सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्री-कूल्ड 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    11. प्लेट को 5 मिलीलीटर ठंडे 0.125 एम ग्लाइसिन -1 एक्स पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला करें और शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन जोड़ें।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 480 x g पर स्पिन करें।
      नोट: यदि कोशिकाओं को घोल में तय किया गया था, तो सेल को पूर्व-ठंडा शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 480 x g पर घूमें। इसे बीकर में डालकर निर्धारण समाधान निकालें और 10 मिलीलीटर ठंडे 0.125 एम ग्लाइसिन -1 एक्स पीबीएस में तीन बार धोएं। प्रत्येक धोने के चरण में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करना सुनिश्चित करें।
    13. बेंचटॉप एस्पिरेशन सिस्टम के साथ एस्पिरेट करके सुपरनैटेंट को हटा दें। P1000 पिपेट के साथ सावधानीपूर्वक ऊपर और नीचे पाइप करके 1x PBS प्रति 1x PBS के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। सटीक मात्रा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए, 2.2.1 में प्राप्त कुल सेल संख्या अनुमान देखें।
    14. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (1 x 107 कोशिकाओं / ट्यूब) की गणना संख्या में सेल निलंबन के एलिकोट 500 μL।
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 480 x g पर स्पिन करें।
    16. एक बेंचटॉप एस्पिरेशन सिस्टम के साथ सुपरनैटेंट को हटा दें और तरल नाइट्रोजन में सेल छर्रों को फ्रीज करें। सूखे सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: नमूने कम से कम 1 वर्ष के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. सेल लाइसिस;
    1. बर्फ पर जमे हुए छर्रों को पिघलाएं।
    2. प्रति नमूना एच 2 0 में 1.5 एमएल लाइसिस बफर तैयार करें: 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0, 10 एमएम एनएसीएल, और0.2% एनपी 40 जोड़ें।
    3. ठंडे लाइसिस बफर के 600 μL जोड़ें और बर्फ पर अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें।
    4. कोशिकाओं को सूजने देने के लिए 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2655 x g पर नीचे घुमाएं और बेंचटॉप एस्पिरेशन सिस्टम का उपयोग करके सुपरनैटेंट को हटा दें।
    6. मलबे को हटाने के लिए, ठंडे लाइसिस बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2655 x g पर घूमें, और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    7. 2655 x g और 4 °C पर फिर से स्पिन करें और P200 टिप के साथ फिट बेंचटॉप एस्पिरेशन सिस्टम का उपयोग करके शेष सतह पर तैरने वाले को जितना संभव हो उतना हटा दें।
    8. 0.5% (vol/vol) SDS के 100 μL में पुन: निलंबित।
    9. 62 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर में इनक्यूबेट करें, 10 मिनट के लिए 1400 आरपीएम पर घूमें।
    10. 290 μL H2O + 50 μL 10% TritonX-100 जोड़ें और हवा के बुलबुले से बचते हुए अच्छी तरह मिलाएं।
    11. 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर में इनक्यूबेट करें, 15 मिनट के लिए 1400 आरपीएम पर घूमें।
    12. 10x Dpnll बफर के 50 μL जोड़ें और मिश्रण करने के लिए ट्यूब को उल्टा करें।
    13. एक अलग ट्यूब में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए 50 μL अनडाइजेस्टेड डीएनए लें। बिना पचे हुए नियंत्रण नमूना लेने के लिए मत भूलना।
  4. DpnII पाचन
    1. Dpnll उच्च सांद्रता (500 U कुल) के 10 μL जोड़ें और इनवर्टिंग करके मिलाएं।
    2. नमूने और बिना पचे हुए नियंत्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर में इनक्यूबेट करें, >4 घंटे के लिए 1400 आरपीएम पर घूमते हैं।
    3. दिन के अंत में Dpnll उच्च सांद्रता (500 U कुल) के 10 μL जोड़ें।
    4. नमूने और बिना पचे हुए नियंत्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, रात भर 1400 आरपीएम पर घूमते रहें।
    5. नमूने में अगले दिन की शुरुआत में Dpnll उच्च सांद्रता (500 U कुल) के 10 μL जोड़ें।
    6. नमूने और बिना पचे हुए नियंत्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोमिक्सर में इनक्यूबेट करें, 4 घंटे के लिए 1400 आरपीएम पर घूमते हुए।
  5. क्रॉस-लिंकिंग का बंधाव और उलटा
    1. ट्यूबों को 1400 आरपीएम पर 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस बिंदु पर SDS न जोड़ें। विचार परमाणु अखंडता को संरक्षित करना है, इसलिए अत्यधिक कमजोर पड़ने की आवश्यकता को दरकिनार करते हुए नाभिक के अंदर बंधाव किया जाता है।
    2. अधिकतम 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने ठंडा करें। एसडीएस वर्षा से बचने के लिए, नमूने को इससे अधिक समय तक बर्फ पर न छोड़ें।
    3. एक अलग ट्यूब में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए अनलिगेटेड डाइजेस्टेड डीएनए का 50 μL लें। -20 डिग्री सेल्सियस पर बिना पचे हुए और अनलिगेटेड नियंत्रण ों को स्टोर करें।
      नोट: अनियंत्रित नियंत्रण नमूना लेने के लिए मत भूलना।
    4. लिगेशन कॉकटेल के 800 μL जोड़ें: 10x लिगेज बफर का 122 μL, T4 लिगेज का 8 μL (30 U / μL), और H20 का 670 μL।
    5. 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, रात भर 1000 आरपीएम पर घूमता है।
    6. नमूने में 7.5 μL Proteinase K (20 mg / mL) और नियंत्रण के लिए 2 μL जोड़ें।
    7. 1000 आरपीएम पर 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. डीएनए शुद्धिकरण
    1. बर्फ पर नमूने को प्री-कूल्ड 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 2 एमएल पानी, 10.5 एमएल बर्फ-ठंडा ईटीओएच और 3 एम एनएएसी के 583 μL जोड़ें।
      नोट: अतिरिक्त पानी का उद्देश्य डीटीटी को गोली में ले जाने से रोकना है।
    2. 200 μL बर्फ ठंडा EtOH, 10.8 μL NaAC, और 1 μL कोप्रेसिपेटेंट को अनडाइजेस्टेड और अनलिगेटेड गुणवत्ता नियंत्रण में जोड़ें।
    3. रात भर तक कम से कम 4 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2200 x g पर 15 एमएल ट्यूबों को स्पिन करें।
    5. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,500 x g पर 1.5 एमएल नियंत्रण ट्यूबों को स्पिन करें।
    6. एक बार 3 एमएल (नमूने) और 1 एमएल (नियंत्रण) बर्फ-ठंडा 70% ईटीओएच के साथ धोएं।
    7. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2200 x g (नमूने) या 20,500 x g (नियंत्रण) पर स्पिन करें।
    8. ध्यान से ईटीओएच को हटा दें और 10-15 मिनट के लिए आरटी पर हवा में सूखने दें; अधिक न सूखें।
    9. H20 के क्रमशः 100 μL और 20 μL में नमूने और नियंत्रण को पुन: निलंबित करें।
    10. RNASEA के 1 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 30 मिनट के लिए 1400 आरपीएम पर घूमें।
  7. 3 सी टेम्पलेट तैयारी का गुणवत्ता नियंत्रण
    1. उच्च संवेदनशीलता डीएनए एकाग्रता माप के लिए फ्लोरोमीटर किट का उपयोग करके प्रत्येक नमूने और नियंत्रण की मात्रा निर्धारित करें।
    2. प्रत्येक नमूने के 100-200 एनजी लोड करें और प्रत्येक नियंत्रण 1% एगारोस / 1x टीबीई जेल पर करें।
    3. सत्यापित करें कि जेल छवि नियंत्रणों के डीएनए टुकड़े के आकार और चित्रा 2 ए में दिखाए गए 3 सी टेम्पलेट में अंतर की तुलना करके अपेक्षित परिणाम दिखाती है।
    4. नमूने और नियंत्रण -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए संकरण, कैप्चर और नमूना प्रसंस्करण
    1. बायोटिनीलेटेड आरएनए जांच की सरणी को 3 सी टेम्पलेट में संकरित करने के लिए, लक्षित बंधाव के टुकड़ों को कैप्चर करना, और युग्मित-अंत मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली लक्ष्य संवर्धन प्रणाली के अनुसार मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए नमूने तैयार करना (देखें सामग्री की तालिका). निम्नलिखित मामूली संशोधनों को पेश करते समय निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटोकॉल का पालन करें:
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल की धारा 2: नमूना तैयारी
        1. जीडीएनए इनपुट के 3 μg से शुरू होने वाले लक्ष्य संवर्धन के निर्देशों का पालन करें।
        2. निम्नलिखित विनिर्देशों का उपयोग करके एक सोनिकेटर में डीएनए को कतरनी करें: 10% ड्यूटी चक्र, 4 तीव्रता, 200 साइक / प्रत्येक कैप्चर प्रतिक्रिया के लिए 130 μL पानी में 3C टेम्पलेट के 4 μg के साथ शुरू करें ताकि कतरनी डीएनए के 3 μg के साथ नमूना तैयारी जारी रखने के लिए पर्याप्त सामग्री सुनिश्चित हो सके।
        3. कतरनी डीएनए की गुणवत्ता का आकलन करें। उच्च संवेदनशीलता प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए बायोएनालाइज़र पर कतरनी डीएनए के 1 μL चलाएं। 150-700 बीपी (चित्रा 2) के बीच टुकड़े के आकार के वितरण की उम्मीद करें।
        4. ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (एसपीआरआई) मोतियों का उपयोग करके नमूने को शुद्ध करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1: 1 बाएं साइड-आकार का चयन करने के लिए डीएनए नमूने के 124 μL में 124 μL SPRI मोती जोड़ें और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 25 μL में एल्यूट करें। यह शुद्धिकरण चरण लगभग 300 बीपी (चित्रा 2) के टुकड़ों को समृद्ध करने के लिए छोटे टुकड़ों को हटा देगा।
          नोट: इस चरण में उपयोग किए जाने वाले नमूनों और एसपीआरआई मोतियों की मात्रा नमूनों को नए ट्यूबों में स्थानांतरित करने और बायोएनालाइजर में गुणवत्ता नियंत्रण चलाने के दौरान हुई मात्रा हानि को ध्यान में रखती है। निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा अनुशंसित अनुपात के अनुसार सभी बाद के आकार चयन चरण किए जाते हैं। एसपीआरआई मोतियों से डीएनए क्षालन पूरे प्रोटोकॉल में आरटी में किया जाता है।
        5. आकार-चयनित कतरनी डीएनए की गुणवत्ता का आकलन करें। उच्च-संवेदनशीलता (एचएस) प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए बायोएनालाइजर पर कतरनी डीएनए के 1 μL चलाएं। 300 बीपी पर उच्चतम संवर्धन के साथ टुकड़े के आकार के वितरण की उम्मीद करें (चित्रा 2)। यदि कतरनी सफल रही तो कतरनी डीएनए की मात्रा का ठहराव करने के साथ आगे बढ़ें।
        6. एचएस डीएनए एकाग्रता माप के लिए फ्लोरोमीटर किट के साथ कतरनी डीएनए की मात्रा निर्धारित करें।
          नोट: यदि डीएनए कतरन के परिणामस्वरूप <3 μg की डीएनए उपज होती है, तो डीएनए के एक और 4 μg के साथ डीएनए कतरन का दूसरा दौर करें और पहले एसपीआरआई बीड शुद्धिकरण चरण के बाद कतरनी डीएनए नमूनों को संयोजित करें ताकि कुल 3 μg कतरनी डीएनए प्राप्त किया जा सके।
        7. आकार-चयनित साफ किए गए डीएनए नमूने (3 μg कुल) में न्यूक्लियस-मुक्त पानी को 48 μL की अंतिम मात्रा में जोड़ें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अंतिम मरम्मत प्रतिक्रिया के साथ आगे बढ़ें।
        8. युग्मित-अंत एडाप्टर के बंधाव के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्री-कैप्चर पीसीआर के पांच चक्रों का प्रदर्शन करके लाइब्रेरी को बढ़ाएं (पीसीआर और प्राइमरों के लिए शर्तें किट में प्रदान की जाती हैं)।
      2. निर्माता के प्रोटोकॉल की धारा 4: संकरण और कब्जा
        1. तैयार डीएनए नमूनों को लक्ष्य-विशिष्ट आरएनए जांच में संकरण करने के लिए, 3.4 μL की अंतिम मात्रा में डीएनए नमूनों के 750 ng को पतला करें, जिसके परिणामस्वरूप 221 ng / μL की प्रारंभिक एकाग्रता हो। बड़ी मात्रा में पतला डीएनए नमूनों के लिए, अंतिम मात्रा को कम करने के लिए गति-वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करें। 15-20 मिनट के लिए एक गति-वैक्यूम एकाग्रता (250 x g; ≤45 °C) आमतौर पर 10 μL में पुन: निलंबित किए गए नमूनों के लिए पर्याप्त होती है। गति-वैक्यूम कंसंट्रेटर शुरू करने से पहले प्रत्येक नमूने के लिए समान इनपुट वॉल्यूम होना सुनिश्चित करें।
        2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 105 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ढक्कन के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए संकरण मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
      3. निर्माता के प्रोटोकॉल की धारा 5: मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए अनुक्रमण और नमूना प्रसंस्करण
        1. इंडेक्सिंग प्राइमरों के साथ कैप्चर किए गए पुस्तकालयों को बढ़ाने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार पोस्ट-कैप्चर पीसीआर के 12 चक्र ों का प्रदर्शन करें (पीसीआर और प्राइमरों के लिए शर्तें किट में प्रदान की जाती हैं)।
  9. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण
    1. एक ही फ्लो सेल पर कई कैप्चर हाई-सी लाइब्रेरी चलाने के लिए, कैप्चर लाइब्रेरी का एक इक्विमोलर मिश्रण तैयार करें और प्रति लाइब्रेरी 100-120 एम रीड को अनुक्रमित करें।
    2. यदि एलील-विशिष्ट विश्लेषण की आवश्यकता है, तो पर्याप्त एसएनपी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए 150 बीपी युग्मित-अंत अनुक्रम करें।

3. डेटा विश्लेषण

  1. कैप्चर हाई-सी डेटा विश्लेषणकरने के लिए HIC-Pro पाइपलाइन लागू करें। HIC-Pro प्रसंस्करण के प्रत्येक चरण में गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान करता है, जिसमें शामिल हैं (चित्रा 3):
    (i) संदर्भ जीनोम पर संरेखण दर एक लिगेशन साइट के साथ-साथ जोड़े और सिंगलटन की संख्या को निर्दिष्ट करती है।
    (ii) वैध बंधाव उत्पादों और गैर-सूचनात्मक पठन जोड़े (झूलते-अंत, स्व-बंधाव, आदि) का अंश।
    (iii) लघु/लंबी दूरी और अंतर/अंतर-क्रोमोसोमल संपर्कों का अंश।
    (iv) कैप्चर हाई-सी के लिए ऑन-टारगेट संपर्कों का अंश।
    (v) यदि निर्दिष्ट किया जाए तो एलील-विशिष्ट का अंश पढ़ता है।
    नोट: HIC-Pro प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला का समर्थन करता है जिसमें सीटू हाई-सी और कैप्चर हाई-सी शामिल हैं। बाद के मामले में, उपयोगकर्ता को बस कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल में लक्षित क्षेत्र (बीईडी प्रारूप) निर्दिष्ट करने की आवश्यकता है। एक बार डेटा संसाधित होने के बाद, एचआईसी-प्रो आउटपुट को आसानी से डाउनस्ट्रीमविश्लेषण के लिए कूलर ऑब्जेक्ट में परिवर्तित किया जा सकता है। इस चरण में, विभिन्न संकल्पों पर संपर्क मानचित्रों को पहले इमाकेवऔर सहकर्मियों द्वारा वर्णित आईसीई विधि का उपयोग करके सामान्यीकृत किया जाता है। क्रोमोसोम कम्पार्टमेंट, टीएडी, या क्रोमैटिन लूप (समीक्षा58 के लिए) को कॉल करने के लिए कई विश्लेषण चलाए जा सकते हैं। प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चित्र 4 में दिखाया गया है। यहां, 'कूलटूल्स' सूट को इन्सुलेशन स्कोर और टीएडी सीमाओं की गणना करने के लिए लागू किया जाता है, जैसा कि चित्रा 5 और चित्रा 659 में दिखाया गया है।

Representative Results

वर्णित कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल चार-बेस कटर (डीपीएनआईआई) का उपयोग करके जीनोम-वाइड 3 सी-टेम्पलेट की तैयारी पर आधारित है। रुचि के जीनोमिक क्षेत्र में बंधाव के टुकड़ों के बाद के संवर्धन को इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले लक्ष्य संवर्धन प्रणाली के अनुसार टाइलिंग आरएनए जांच की एक सरणी के संकरण और उनके स्ट्रेप्टाविडिन-आधारित कैप्चर द्वारा प्राप्त किया जाता है (चित्रा 1)। बायोटिनीलेटेड आरएनए जांच का चयन किया गया क्योंकि वे डीएनए जांच52,60 की तुलना में अपने लक्ष्यों के लिए सख्त बंधन संबंध दिखाते हैं। कैप्चर किए गए पुस्तकालयों को तब अनुक्रमित किया जाता है और मल्टीप्लेक्स उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए पूल किया जाता है। कैप्चर हाई-सी डेटा को उच्च-रिज़ॉल्यूशन हाई-सी इंटरैक्शन मैप्स के रूप में देखा जा सकता है, लेकिन 4 सी जैसे सिंगल व्यू-पॉइंट कॉन्टैक्ट मैप के रूप में भी देखा जा सकता है ताकि विशेष रूप से पूरे कैप्चर किए गए क्षेत्र के भीतर प्रमोटरों या एन्हांसर जैसे छोटे अनुक्रमों की बातचीत की कल्पना की जा सके। प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चित्र 4 में दिखाया गया है। पूर्व-अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण चित्रा 2 में दिखाए गए हैं और इसमें 3 सी टेम्पलेट के उचित पाचन और पुन: बंधाव का आकलन और प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में इसकी कुशल कतरन और शुद्धिकरण शामिल है। कतरनी 3 सी टेम्पलेट डीएनए 150 से 700 बीपी के बीच चलने की उम्मीद है, और >2 केबी के टुकड़ों के किसी संवर्धन का पता नहीं लगाया जाना चाहिए। निम्नलिखित चरणों के दौरान, कई मोती-आधारित डीएनए सफाई और आकार चयन चरण किए जाते हैं, पहले कतरनी के बाद, फिर प्री-कैप्चर और पोस्ट-कैप्चर पीसीआर के बाद। एडाप्टर, अनुक्रमण और अनुक्रमण प्राइमरों के बंधाव के कारण पुस्तकालय की तैयारी के दौरान औसत टुकड़ा आकार बढ़ जाता है। पोस्ट-अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण हाई-सी प्रो के माध्यम से प्राप्त किए जाते हैं और चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। 3 सी जैसे डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए कई अलग-अलग जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों का प्रस्ताव किया गया है। उनमें से, एचआईसी-प्रो पाइपलाइन सबसे लोकप्रिय समाधानों में से एक है, जो विभिन्नसंकल्पों पर अंतिम संपर्क मानचित्रों के लिए कच्चे अनुक्रमण डेटा के प्रसंस्करण की अनुमति देता है। एचआईसी-प्रो संदर्भ जीनोम पर अनुक्रमण पढ़ने को संरेखित करने के लिए दो-चरणीय मैपिंग रणनीति का उपयोग करता है। 3 सी उत्पादों को फिर से बनाया जाता है और संपर्क के गैर-सूचनात्मक जोड़े को हटाने और संपर्क मानचित्र उत्पन्न करने के लिए फ़िल्टर किया जाता है। इसके अलावा, यह एलील-विशिष्ट विश्लेषण करने और अलग-अलग संपर्क मानचित्रों में दो पैतृक एलील से आने वाले संपर्कों को अलग करने के लिए ज्ञात बहुरूपताओं की एक सूची का उपयोग करने में सक्षम है। हाल ही में, एचआईसी-प्रो को एनएफ-कोर फ्रेमवर्क (एनएफ-कोर-एचआईसी) में शामिल और विस्तारित किया गया है, जो एक अत्यधिक स्केलेबल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य समुदाय-संचालित पाइपलाइन61,62 प्रदान करता है।

माउस Xic को पकड़ने के लिए, एक्स क्रोमोसोम के 3 एमबी को टाइलिंग करने वाले 28,913 आरएनए प्रोब की एक सरणी डिजाइन की गई थी। इस क्षेत्र में एक्ससीआई में प्रमुख खिलाड़ी, लंबे नॉनकोडिंग जीन एक्सिस्ट और इसके ज्ञात ~ 800 केबी नियामक परिदृश्य (चित्रा 5) शामिल हैं। इस ~ 800 केबी क्षेत्र को दो टीएडी में विभाजित किया गया है: एक में एक्सिस्ट प्रमोटर और इसके ज्ञात सकारात्मक नियामक (यानी, नॉनकोडिंग ट्रांसक्रिप्ट एफटीएक्स, जेपीएक्स और ज़ेर्ट और प्रोटीन-कोडिंग जीन आरएनएफ 12) शामिल हैं, और पड़ोसी टीएडी में एक्सिस्ट के नकारात्मक सीआईएस-नियामक शामिल हैं (यानी, इसकी एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट टीसिक्स, एन्हांसर तत्व ज़ीट, और नॉनकोडिंग ट्रांसक्रिप्ट लिंक्स) (समीक्षा44 के लिए, 45)।

Xic पर वर्णित कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल को लागू करके, इस टिड्डी का टोपोलॉजिकल संगठन अभूतपूर्व रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 6 और चित्रा 7) पर प्राप्त किया गया था। कैप्चर हाई-सी प्रोफाइल की तुलना पहले प्रकाशित 5 सी47 (चित्रा 6 और चित्रा 7) से करते समय यह विशेष रूप से स्पष्ट है। अनुपूरक तालिका 1) और हाय-सी61 (चित्रा 6 और चित्रा 7; अनुपूरक तालिका 1) प्रोफ़ाइल। उदाहरण के लिए, उप-टीएडी संरचनाएं अधिक स्पष्ट हैं - एक्सिस्ट प्रमोटर (एक्सिस्ट-टीएडी) युक्त टीएडी को स्पष्ट रूप से दो छोटे डोमेन (चित्रा 6 ए, नीला तीर) में विभाजित किया गया है। इससे पहले, यह केवल 5 सी प्रोफाइल (चित्रा 6 बी) से नेत्रहीन "अनुमान" लगाया जा सकता था, हालांकि इन्सुलेशन स्कोर एल्गोरिदम का उपयोग करके इस क्षेत्र में एक सीमा का पता लगाया गया था। इसी तरह, कैप्चर हाई-सी प्रोफाइल का रिज़ॉल्यूशन पड़ोसी टीएडी (चित्रा 6 ए, बी) में दो छोटे डोमेन की पहचान की अनुमति देता है, जिसमें टीसिक्स लोकस (टीसिक्स-टीएडी) का प्रमोटर शामिल है; यह पहले 5 सी (चित्रा 6 बी) के साथ हासिल नहीं किया गया था। ध्यान दें, कैप्चर हाई-सी और 5 सी डेटा से इन्सुलेशन स्कोर द्वारा निर्धारित टोपोलॉजिकल सीमाएं आम तौर पर थोड़ा अलग स्थानों पर और विभिन्न सापेक्ष शक्तियों के साथ पाई जाती हैं।

इसके अलावा, अन्य उप-टीएडी संरचनाएं जैसे संपर्क लूप कैप्चर हाई-सी डेटा से स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं, जैसे कि एक्सिस्ट और एफटीएक्स (चित्रा 7 ए) के बीच लूप, जिसे पहले कैप्चर-सी63 के साथ पहचाना गया था, और एक्सिस्ट और ज़ेर्ट (चित्रा 7 बी) के बीच लूप, जिसे हाल ही में कैप्चर हाई-सी48 के लिए एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके पहचाना गया था।. कैप्चर हाई-सी प्रोफाइल के बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन के कारण अन्य संपर्कों को भी अधिक सटीक रूप से मैप किया जा सकता है, जैसे कि लिंक्स, चिक 1 और ज़ीट लोकी (चित्रा 7 ए) के बीच टीसिक्स-टीएडी के भीतर ज्ञात संपर्क हॉटस्पॉट बनाने वाले।

चित्रा 7 में दिखाए गए हाई-सी डेटा की तुलना में, कैप्चर हाई-सी ने रिज़ॉल्यूशन में चार गुना वृद्धि की अनुमति दी, फिर भी इसे अनुक्रमण गहराई के केवल एक-चौथाई की आवश्यकता थी (यानी, 126 एम रीड बनाम 571 एम) (पूरक तालिका 1)। रिज़ॉल्यूशन में यह वृद्धि सबटीएडी और लूपिंग इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति देती है जिसे चित्रा 6 और चित्रा 7 में दिखाए गए अनुक्रमण गहराई पर हाई-सी द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। कैप्चर हाई-सी के लिए वर्णित प्रोटोकॉल इस प्रकार पिछले दृष्टिकोणों की तुलना में रुचि के एक बड़े जीनोमिक क्षेत्र के अधिक विस्तृत, उच्च-रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्र 1: जांच डिजाइन। जांच डिजाइन के लिए उपयोग की जाने वाली रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 3 एमबी लक्ष्य क्षेत्र में प्रत्येक डीपीएनआईआई प्रतिबंध साइट के 300 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम के क्षेत्रों का चयन किया गया और ओवरलैपिंग बायोटिनीलेटेड आरएनए जांच के साथ टाइल किया गया। इन चयनित क्षेत्रों में से एक दिखाया गया है, chrX: 102,474,805-102,475,500। प्रत्येक जांच में दोहराए जाने वाले अनुक्रमों के 40 से अधिक आधारों की अनुमति नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हाई-सी पूर्व-अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण कैप्चर करें । (ए) 3 सी टेम्पलेट गुणवत्ता नियंत्रण का प्रतिनिधि उदाहरण। 1% एगारोस जेल पर 200 एनजी डीएनए लोड किए गए थे। लेन 1: 1 केबी सीढ़ी। लेन 2: बिना पचे हुए, क्रॉस-लिंक्ड, और बरकरार क्रोमैटिन >10 केबी पर एक तेज बैंड के रूप में चलता है। लेन 3: डीपीएनआई-डाइजेस्टेड क्रॉस-लिंक्ड क्रोमैटिन आकार में 1 केबी से 3 केबी के बीच स्मीयर के रूप में चलता है। लेन 4: अंतिम 3 सी लाइब्रेरी या टेम्पलेट; पचे हुए क्रॉस-लिंक्ड डीएनए टुकड़ों के मुक्त सिरों को फिर से बंद कर दिया जाता है। कम आणविक आकार का डीएनए स्मीयर लगभग अज्ञात है, और बंधाव उत्पाद को >10 केबी के बैंड के रूप में पाया जाता है। (बी) उच्च संवेदनशीलता बायोएनालाइज़र डीएनए प्रोफाइल के प्रतिनिधि उदाहरण। ऊपर बाएं: 150 बीपी और 700 बीपी के बीच टुकड़े के आकार का वितरण दिखाते हुए सफलतापूर्वक कतरनी 3 सी लाइब्रेरी। ऊपर दाएं: असंतोषजनक कतरनी 3 सी लाइब्रेरी। अनशीयर ्ड डीएनए को टुकड़ों के व्यापक संवर्धन >2 केबी के रूप में पाया जाता है। (सी) नीचे बाएं: एसपीआरआई मोतियों का उपयोग करके 1: 1 बाएं साइड-आकार के चयन के बाद कतरनी डीएनए नमूना। ~ 300 बीपी के टुकड़े समृद्ध हैं। नीचे मध्य: निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार युग्मित-अंत एडाप्टर के बंधाव के बाद प्री-कैप्चर पीसीआर प्रोफाइल। नीचे दाएं: मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए एडाप्टर, अनुक्रमण और अनुक्रमण प्राइमरों सहित अंतिम कैप्चर हाई-सी लाइब्रेरी। संक्षेप: बीपी = आधार जोड़े, एफयू = मनमानी प्रतिदीप्ति इकाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एचआईसी-प्रो के साथ हाई-सी पोस्ट-अनुक्रमण गुणवत्ता नियंत्रण कैप्चर करें। (ए) अनुक्रमण जोड़े के पहले साथी के लिए संदर्भ जीनोम पर मैपिंग दर का उदाहरण। हल्का नीला अंश एचआईसी-प्रो द्वारा संरेखित रीड का प्रतिनिधित्व करता है और एक लिगेशन जंक्शन को फैलाता है। इस मीट्रिक का उपयोग इस प्रकार प्रयोगात्मक बंधाव चरण को मान्य करने के लिए किया जा सकता है। (बी) एक बार अनुक्रमण साथियों को जीनोम पर संरेखित करने के बाद, विश्लेषण के लिए केवल विशिष्ट रूप से संरेखित पठन जोड़े रखे जाते हैं। (सी) गैर-मान्य जोड़े (लाल रंग में) जैसे झूलते-अंत, स्व-वृत्त, या पुन: बंधाव को विश्लेषण से हटा दिया जाता है। वैध जोड़े का अंश बंधाव और पुल-डाउन दक्षता का एक अच्छा संकेतक है। (डी) वैध जोड़े को आगे इंट्रा/इंटर-क्रोमोसोमल और शॉर्ट/लॉन्ग-रेंज संपर्कों में विभाजित किया जा सकता है। डुप्लिकेट रीड जोड़े जो पीसीआर कलाकृतियों का प्रतिनिधित्व करने की संभावना रखते हैं, उन्हें विश्लेषण से हटा दिया जाता है। (ई) एलील-विशिष्ट विश्लेषण के लिए, एचआईसी-प्रो प्रत्येक माता-पिता के जीनोम (यानी, सी 57बीएल / 6 जे एक्स सीएएसटीआई / जे) के लिए एक या दो साथियों द्वारा समर्थित एलील रीड की संख्या की रिपोर्ट करता है। मातृ और पैतृक एलील को सौंपे गए पठन का एक ही अंश अपेक्षित है। (एफ) अंत में, संपर्क मानचित्र बनाने के लिए कैप्चर क्षेत्र को ओवरलैप करने वाले केवल वैध जोड़े का चयन किया जाता है। कैप्चर-कैप्चर जोड़े लक्षित क्षेत्र के भीतर संपर्कों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि कैप्चर-रिपोर्टर जोड़े में लक्षित क्षेत्र और ऑफ-टारगेट के बीच बातचीत शामिल होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो। विभिन्न प्रोटोकॉल चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। जीनोम-वाइड 3 सी टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए, क्रोमैटिन को पहले फॉर्मलाडेहाइड के साथ क्रॉस-लिंक किया जाता है और फिर डीपीएनआईआई प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचाया जाता है। मुक्त डीएनए सिरों को फिर से बंद किया जाता है, क्रॉस-लिंकिंग को उलट दिया जाता है, और डीएनए को शुद्ध किया जाता है। लक्ष्य क्षेत्र को शामिल करने वाले टुकड़ों को समृद्ध करने के लिए, बायोटिनीलेटेड आरएनए जांच की एक सरणी को 3 सी टेम्पलेट में संकरित किया जाता है और स्ट्रेप्टाविडिन-मध्यस्थता पुल-डाउन द्वारा कैप्चर किया जाता है। कैप्चर लाइब्रेरी को मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए संसाधित किया जाता है, और लक्ष्य में क्रोमैटिन संपर्कों की आवृत्ति का अनुमान लगाने के लिए वैध लिगेशन टुकड़े निर्धारित किए जाते हैं, जिन्हें उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंटरैक्शन मैप्स के रूप में देखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: माउस एक्स क्रोमोसोम पर Xic को शामिल करने वाले क्षेत्र का अवलोकन। माउस एक्स क्रोमोसोम का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और 3 एमबी कैप्चर किए गए क्षेत्र (सीएचआरएक्स: 102,475,000-105,475,000) का ज़ूम इन करें। लक्षित क्षेत्र में एक्ससीआई के मास्टर नियामक स्थान एक्सआईसी के अनुरूप ~ 800 केबी डीएनए शामिल है। एक्सआईसी में लंबे नॉनकोडिंग जीन, एक्ससीआई के एक प्रमुख खिलाड़ी एक्सिस्ट और इसके नियामक परिदृश्य शामिल हैं। एक्सिस्ट के सकारात्मक नियामकों को हरे रंग में दिखाया गया है, और नकारात्मक नियामकों को बैंगनी रंग में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: 3 एमबी कैप्चर किए गए क्षेत्र में हाई-सी, 5 सी और हाई-सी इंटरैक्शन मैप्स कैप्चर करें। (ए) 10 केबी रिज़ॉल्यूशन (इस अध्ययन) पर माउस एक्सआईसी को शामिल करते हुए 3 एमबी लक्ष्य के हाई-सी इंटरैक्शन मैप को कैप्चर करें। (बी) 6 केबी रिज़ॉल्यूशन पर ए के समान लक्ष्य क्षेत्र का 5 सी इंटरैक्शन मैप (47 से पुन: संसाधित डेटा)। विश्लेषण में शामिल नहीं किए गए दोहराए जाने वाले क्षेत्रों को सफेद रंग में नकाबपोश किया जाता है। 5 सी डेटा को अपने स्वयं के जैव सूचना विज्ञान प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है (47 देखें)। सफाई और संरेखण के बाद, प्राइमर रिज़ॉल्यूशन पर 5 सी मानचित्रों को 6 केबी के अंतिम रिज़ॉल्यूशन तक पहुंचने के लिए रनिंग मीडियन (विंडो = 30 केबी, स्टेप = 5) का उपयोग करके पिन किया जाता है। (सी) 40 केबी रिज़ॉल्यूशन पर ए और बी के समान जीनोमिक क्षेत्र का हाई-सी इंटरैक्शन मैप (64 से पुन: संसाधित डेटा)। सभी इंटरैक्शन मानचित्र माउस ईएससी से उत्पन्न किए गए थे। इन्सुलेशन स्कोर की गणना कूलटूल्स का उपयोग करके की गई थी और इसे टीएडी सीमाओं पर इन्सुलेशन मिनिमा के साथ हिस्टोग्राम के रूप में दर्शाया गया है। टीएडी सीमाओं को मानचित्र के नीचे ऊर्ध्वाधर रेखाओं के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक रेखा की ऊंचाई सीमा की ताकत को इंगित करती है। जीन को प्रतिलेखन की दिशा में इंगित करने वाले तीर के रूप में दिखाया गया है। कैप्चर हाई-सी मानचित्रों में विशेष रूप से या अधिक सटीक रूप से पता लगाए जाने वाले उप-टीएडी सीमाओं को क्रमशः टीसिक्स और एक्सिस्ट टीएडी में उप-टीएडी के लिए मैजेंटा और ब्लू एरोहेड द्वारा इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: कैप्चर किए गए क्षेत्र के भीतर 1 एमबी में हाई-सी, 5 सी और हाई-सी इंटरैक्शन मैप्स कैप्चर करें। (ए) 5 केबी रिज़ॉल्यूशन (इस अध्ययन) पर माउस एक्सिक को शामिल करने वाले 1 एमबी जीनोमिक क्षेत्र के हाई-सी इंटरैक्शन मैप को कैप्चर करें। (बी) ए के समान जीनोमिक क्षेत्र का 5 सी इंटरैक्शन मैप। 6 केबी रिज़ॉल्यूशन पर (डेटा47 से पुन: संसाधित किया गया)। विश्लेषण में शामिल नहीं किए गए दोहराए जाने वाले क्षेत्रों को सफेद रंग में नकाबपोश किया जाता है। ध्यान दें, 5 सी डेटा को अपने स्वयं के जैव सूचना विज्ञान प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है (47 देखें)। सफाई और संरेखण के बाद, प्राइमर रिज़ॉल्यूशन पर 5 सी मानचित्रों को 6 केबी के अंतिम रिज़ॉल्यूशन तक पहुंचने के लिए रनिंग मीडियन (विंडो = 30 केबी, स्टेप = 5) का उपयोग करके पिन किया जाता है। (सी) 20 केबी रिज़ॉल्यूशन पर हाई-सी के ए और बी के समान जीनोमिक क्षेत्र का हाई-सी इंटरैक्शन मैप (64 से पुन: संसाधित डेटा)। सभी इंटरैक्शन मानचित्र एमईएससी से उत्पन्न किए गए थे। इन्सुलेशन स्कोर की गणना कूलटूल्स का उपयोग करके की गई थी और इसे टीएडी सीमाओं पर इन्सुलेशन मिनिमा के साथ हिस्टोग्राम के रूप में दर्शाया गया है। टीएडी सीमाओं को मानचित्र के नीचे ऊर्ध्वाधर रेखाओं के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक रेखा की ऊंचाई सीमा की ताकत को इंगित करती है। जीन को प्रतिलेखन की दिशा की ओर इशारा करने वाले तीर के रूप में दिखाया गया है। कैप्चर हाई-सी में विशेष रूप से या अधिक सटीक रूप से पाए जाने वाले संपर्क लूप क्रमशः टीसिक्स और एक्सिस्ट टीएडी में लूप के लिए मैजेंटा और नीले तारांकन द्वारा इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: इस पांडुलिपि में उपयोग किए गए डेटासेट के लिए पोस्ट-अनुक्रमण आंकड़े: कैप्चर हाई-सी (यह अध्ययन), हाई-सी64, और 5 सी47। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां हम 5-10 केबी रिज़ॉल्यूशन पर मेगाबेस-आकार के जीनोमिक क्षेत्रों के उच्च-क्रम संगठन को चिह्नित करने के लिए अपेक्षाकृत त्वरित और आसान कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। कैप्चर हाई-सी कैप्चर-सी प्रौद्योगिकियों के परिवार से संबंधित है जो जीनोम-वाइड 3 सी या हाई-सी टेम्प्लेट से लक्षित क्रोमैटिन इंटरैक्शन को समृद्ध करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। आज तक, कैप्चर-सी अनुप्रयोगों के बड़े बहुमत का उपयोग पूरे जीनोम में बिखरे हुए अपेक्षाकृत छोटे नियामक तत्वों के क्रोमैटिन संपर्कों को मैप करने के लिए किया गया है। पहले कैप्चर-सी प्रोटोकॉल में, एरिथ्रोइड कोशिकाओं31 से तैयार 3 सी पुस्तकालयों में >400 पूर्व-चयनित प्रमोटरों को पकड़ने के लिए कई अतिव्यापी आरएनए बायोटिनीलेटेड जांच का उपयोग किया गया था। इसी रणनीति में बाद में नेक्स्ट जनरेशन (एनजी) और न्यूक्लियर टाइटरेटेड (एनयूटीआई) कैप्चर-सी में सुधार किया गया ताकि एकल प्रतिबंध स्थलों पर फैले एकल 120 बीपी डीएनए चारा और कैप्चर के दो अनुक्रमिक राउंड का उपयोग करके >8,000 प्रमोटरों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंटरैक्शन प्रोफाइल को प्राप्त किया जा सके।. इन रणनीतियों ने कई अलग-अलग संदर्भों में सीआईएस-अभिनय तत्वों के कार्यात्मक विच्छेदन का नेतृत्व किया, जिसमें माउस भ्रूण विकास, सेल भेदभाव, एक्स-क्रोमोसोम निष्क्रियता, और पैथोलॉजिकल स्थितियों में जीन मिस-विनियमन 46,63,65,66,67,68,69,70,71 शामिल हैं।

प्रमोटर कैप्चर हाई-सी (पीसीएचआई-सी) में, प्रतिबंध टुकड़े34,72 के एक या दोनों सिरों पर एकल आरएनए 120-मेर बायोटिनीलेटेड जांच के संकरण द्वारा प्रतिबंध टुकड़े वाले >22,000 एनोटेटेड प्रमोटरों को हाई-सी पुस्तकालयों से नीचे खींच लिया गया था। इस विधि ने माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, भ्रूण यकृत कोशिकाओं और एडिपोसाइट्स 34,35,72,73 सहित सेल प्रकारों की तेजी से बढ़ती संख्या में हजारों प्रमोटरों के इंटरैक्शन के विच्छेदन की अनुमति दी, लेकिन मानव लिम्फोब्लास्टोइड लाइनें, हेमटोपोइएटिक पूर्वज, एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स और प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं37,74,75,76,77 भी शामिल हैं।.

इन लक्ष्य संवर्धन प्रौद्योगिकियों की तुलना में, कैप्चर हाई-सी मेगाबेस पैमाने तक सन्निहित जीनोमिक क्षेत्रों को लक्षित करता है, जिससे एक या अधिक टीएडी का विस्तार होता है और जीन के नियामक परिदृश्य शामिल होते हैं। रुचि के पूरे क्षेत्र को लक्ष्य के भीतर प्रत्येक डीपीएनआईआई प्रतिबंध साइट को शामिल करते हुए बायोटिनीलेटेड जांच की एक सरणी के साथ जोड़ा जाना चाहिए। 3 सी टेम्पलेट में बायोटिनीलेटेड सरणी का संकरण, इसके बाद स्ट्रेप्टाविडिन-आधारित कैप्चर, और मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए प्रसंस्करण इलुमिना पेयर्ड-एंड मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए लक्ष्य संवर्धन प्रणाली का उपयोग करके किया जाता है। पूरा प्रोटोकॉल तेज़ है, क्योंकि इसे एनजीएस अनुक्रमण के माध्यम से 3 सी लाइब्रेरी की तैयारी से 1 सप्ताह में किया जा सकता है, और इसके लिए केवल मामूली अनुकूलन और / या कस्टम-विशिष्ट समस्या निवारण की आवश्यकता होती है।

प्रोटोकॉल अन्य 3 सी-आधारित विधियों की तुलना में भी लाभ प्रदान करता है। 5-10 केबी के रिज़ॉल्यूशन पर इंटरैक्शन मैप प्राप्त करने के लिए, हमने 100-120 एम पेयर-एंड रीड को अनुक्रमित किया। तुलना के रूप में, हमने यहां 20 केबी रिज़ॉल्यूशन64 (जीएसएम 2053973) तक पहुंचने के लिए 571 एम रीड के एक हाई-सी डेटासेट का उपयोग किया, और क्रोमोसोम-वाइड हाई-सी22 के साथ 5 केबी रिज़ॉल्यूशन तक पहुंचने के लिए कम से कम 1 बिलियन रीड की आवश्यकता होगी।

वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए कैप्चर हाई-सी 6-बीपी कटर प्रतिबंध एंजाइम47 (पूरक तालिका 1) के आधार पर पहले प्रकाशित 5 सी की तुलना में बहुत अधिक रिज़ॉल्यूशन तक पहुंचता है। महत्वपूर्ण रूप से, 5 सी में लक्षित इंटरैक्शन को समृद्ध और बढ़ाने के लिए डिज़ाइन की गई रणनीति क्रोमैटिन इंटरैक्शन के एलील-विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति नहीं देती है। इसके विपरीत, कैप्चर हाई-सी डेटा को एलील-विशेष रूप से मैप किया जा सकता है, जिससे समरूप गुणसूत्रों के जोड़े के 3 डी संरचनात्मक परिदृश्य के विच्छेदन की अनुमति मिलती है, उदाहरण के लिए मानव कोशिकाओं में या आनुवंशिक रूप से भिन्न माउस उपभेदों78 को पार करके प्राप्त एफ 1 हाइब्रिड सेल लाइनों में। 5 केबी रिज़ॉल्यूशन पर एलील-विशिष्ट कैप्चर हाई-सी इंटरैक्शन मैप उत्पन्न करने के लिए, हमने एसएनपी कवरेज बढ़ाने के लिए 150 बीपी पेयर-एंड रीड को अनुक्रमित किया। इसी तरह के एलील-विशिष्ट दृष्टिकोण मानव सेल लाइनों पर लागू किए जा सकते हैं, जिसके लिए एसएनपी का एनोटेशनउपलब्ध है।

महत्वपूर्ण रूप से, हालांकि कैप्चर हाई-सी आम तौर पर अनुक्रमण लागत की सामर्थ्य में सुधार करते हुए उच्च रिज़ॉल्यूशन सुनिश्चित करता है, कस्टम-अनुरूप बायोटिनीलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उत्पादन इस विधि की समग्र लागत पर प्रभाव डालता है। इसलिए, सबसे उपयुक्त 3 सी विधि की पसंद विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अलग-अलग होगी, और जैविक प्रश्न पर निर्भर करेगी जिसे संबोधित किया जा रहा है और आवश्यक समाधान, साथ ही साथ रुचि के क्षेत्र का आकार भी। विकसित अन्य कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्रमुख विशेषताओं को साझा करते हैं। उदाहरण के लिए, स्तन और कोलोरेक्टल कैंसर के जोखिम से जुड़े नॉनकोडिंग वेरिएंट में फैले ~ 50 केबी से 1 एमबी जीनोमिक क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए एक कैप्चर हाई-सी रणनीति लागू की गई थी; इस प्रोटोकॉल में, लक्षित क्षेत्रों को33,38,79 के 3x कवरेज पर लक्षित क्षेत्रों को 120-मेर आरएनए चारा को हाइब्रिड करके हाई-सी पुस्तकालयों से नीचे खींच लिया गया था। इसी तरह, एचवाईब्रिड कैप्चर हाई-सी (हाई-सी 2) का उपयोग2 एमबी80 तक रुचि के क्षेत्रों के भीतर बातचीत को लक्षित करने के लिए किया गया था। दोनों प्रोटोकॉल में, बायोटिन खींचे गए लिगेशन टुकड़ों के लिए समृद्ध हाई-सी टेम्पलेट के उपयोग ने हमारे प्रोटोकॉल की तुलना में कुल सूचनात्मक पढ़ने का प्रतिशत बढ़ा दिया। उदाहरण के लिए, तुलना64 (GSM2053973) के लिए हमने यहां जिस हाई-सी डेटासेट का उपयोग किया है, उसमें डुप्लिकेट को हटाने के बाद मान्य जोड़े का प्रतिशत कैप्चर हाई-सी में प्राप्त वैध जोड़े की तुलना में 4.8 गुना अधिक है जैसा कि चित्रा 3 और पूरक तालिका 1 में वर्णित है। हालांकि, बायोटिनीलेटेड लिगेटेड टुकड़ों और संकरीकृत जांच के लगातार पुल-डाउन प्रोटोकॉल को काफी अधिक जटिल और समय लेने वाला बनाते हैं, जबकि संभवतः कैप्चर किए गए क्षेत्र की जटिलता को कम करते हैं।

टाइलिंग जांच के साथ 3 सी टेम्प्लेट को समृद्ध करने के लिए एक और उपलब्ध विधि टाइल-सी है, जिसे माउस एरिथ्रोइड भेदभाव43 के दौरान उच्च स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन पर क्रोमैटिन आर्किटेक्चर का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। टाइल-सी में, 70 बीपी बायोटिनीलेटेड प्रोब्स के एक पैनल का उपयोग बड़े पैमाने पर क्षेत्रों के भीतर संपर्कों को समृद्ध करने के लिए किया जाता है, जो लक्षित इंटरैक्शन43,81 के बहुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्र उत्पन्न करने के लिए कैप्चर के लगातार दो दौर में होते हैं। कैप्चर हाई-सी की तुलना में डबल कैप्चर संवर्धन प्रोटोकॉल को लंबा और अधिक जटिल बनाता है। हालांकि, एकल प्रतिबंध साइटों को लक्षित करने वाली कैप्चर-सी रणनीतियों से अलग, टाइल्ड-सी में कैप्चर का दूसरा दौर कैप्चर दक्षता में काफी वृद्धि नहीं करता है, और इसलिए इसे संभवतःछोड़ा जा सकता है। अंत में, इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली एक ही लक्ष्य संवर्धन रणनीति के आधार पर एक समान टाइलिंग दृष्टिकोण को जन्मजात विकृतियों वाले रोगियों में वर्णित संरचनात्मक रूपों को शामिल करने वाले नियामक परिदृश्यों के विच्छेदन पर लागू किया गया था और ट्रांसजेनिक चूहों41,42 में फिर से इंजीनियर किया गया था। इस मामले में, जांच की टाइलिंग सरणी को डीपीएनआईआई प्रतिबंध साइटों41 की निकटता के बजाय पूरे लक्ष्य में डिज़ाइन किया गया था। फिर भी, यह काम विभिन्न संदर्भों में बड़े जीनोमिक क्षेत्रों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन को प्राप्त करने के लिए इस रणनीति की संवेदनशीलता और शक्ति को उजागर करने में मौलिक था।

अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल रुचि के किसी भी जीनोमिक क्षेत्रों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी लक्षण वर्णन के लिए एक आसान, मजबूत और शक्तिशाली रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। विभिन्न मॉडल प्रणालियों, सेल प्रकारों, विकास-विनियमित क्रोमैटिन परिदृश्य, और स्वस्थ और रोग स्थितियों में जीन विनियमन के लिए इस दृष्टिकोण का अनुप्रयोग जीनोम टोपोलॉजी और जीन विनियमन के बीच परस्पर क्रिया और कार्य-कारण की हमारी समझ को सुविधाजनक बनाने की संभावना है, जो एपिजेनेटिक्स क्षेत्र में मौलिक खुले प्रश्नों में से एक है। इसके अलावा, जीडब्ल्यूएएस अध्ययनों द्वारा पहचाने गए जोखिम वेरिएंट के लंबी दूरी के इंटरैक्शन और उच्च-क्रम क्रोमैटिन फोल्डिंग को मैप करने के लिए कैप्चर हाई-सी को लागू करने से विभिन्न संदर्भों में मानव रोगों से जुड़े नॉनकोडिंग जीनोमिक लोकी की कार्यात्मक प्रासंगिकता को प्रकट करने की क्षमता है, जिससे संभावित रूप से अंतर्निहित रोगजनन प्रक्रियाओं में नवीन अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है।

Disclosures

काई हौशुल्ज़ एजिएंट टेक्नोलॉजीज - डायग्नोस्टिक एंड जीनोमिक्स ग्रुप में फील्ड एप्लीकेशन साइंटिस्ट हैं। अन्य सभी लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हर्ड प्रयोगशाला में काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद उन्नत अन्वेषक पुरस्कार (एक्सप्रेस - एडीजी 671027) द्वारा समर्थित किया गया था। ए.एल. को यूरोपीय संघ मैरी स्कोलोडोवस्का-क्यूरी एक्शन व्यक्तिगत फैलोशिप (आईएफ -838408) द्वारा समर्थित किया गया है। एएच को आईटीएन इनोवेटिव और इंटरडिसिप्लिनरी नेटवर्क क्रोमडिज़ाइन द्वारा समर्थित किया गया है, जो मैरी स्कोलोडोवस्का-क्यूरी ग्रांट समझौते के तहत 813327। लेखक सहायक तकनीकी सलाह के लिए डैनियल इब्राहिम (आणविक आनुवंशिकी के लिए एमपीआई, बर्लिन), इंस्टीट्यूट क्यूरी (पेरिस) में एनजीएस प्लेटफॉर्म और समर्थन और सहायता के लिए ईएमबीएल (हीडलबर्ग) में व्लादिमीर बेनेस और जीनोमिक्स कोर सुविधा के लिए आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS pH 7.4 Gibco 10010-023
37% (vol/vol) paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15686 single use glass-vials; do not reuse
50 mL PP conical tube Falcon 352070
Agarose Sigma A9539-500g
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Cell Scrapers - 25 cm Handle and 3.0 cm Blade Falcon 353089
CHIR99021 Axon Medchem BV Axon 1386
cOmplete Mini, Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Merck 11836170001
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228
Countess II FL Invitrogen ZGEXSCCOUNTESS2FL Automated cell counter
Covaris S2 Covaris 500217 Sonicator
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DpnII (50000 units/mL) New England Biolabs R0543M
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Merck D6429
Ethanol (100%) Merck 1.00983.2500
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific 10270106
gelatine from porcine skin Sigma G1890
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
GlycoBlue Thermo Scientific AM9516 Coprecipitant
High-Sensitivity Bioanlayzer chips Agilent 5067-4626
Large Cooling Centrifuge 5920 R Eppendorf 5948000018
leukaemia inhibitory factor (LIF) Merck ESG1107
Liquiport KNF NF300 Benchtop aspiration system
Low-binding filter tips Biozym VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U
Molecular biology grade water Merck W3500-6x500ML
Next Seq 500 Illumina SY-415-1001
Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles) Illumina FC-404-2004
Nonidet P40 Substitute (NP40) Merck 11332473001
PD0325901 Axon Medchem BV Axon 1408
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Merck 11873580001
Proteinase K - recombinant, PCR-grade (20 mg/mL) Thermo Scientific EO0491
Qubit 2.0 Thermo Scientific Q32871
Qubit assay tubes Thermo Scientific Q32856
Qubit dsDNA High Sensitivity kit Thermo Scientific Q32851
RNase A (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531
Sodium acetate pH 5.2 (3M) Merck S7899
speed vacuum concentrator Eppendorf EP5305000100-1EA
Agencourt AMPureXP Beckman Coulter A63881 SPRI beads
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent 5190-8645
SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2 Agilent 5190-4455
SureSelect XT Library Prep Kit ILM Agilent 5500-0132
T4 ligase (30 units/µL) Thermo Scientific EL0013
table-top Centrifuge 5427 R Eppendorf 5409000012
Triton-X-100 (500 mL) Merck X100-500ML
Trypan Blue Invitrogen T10282
Trypsine Thermo Scientific 25300054
UltraPure Glycine Thermo Scientific 15527013
β-mercaptoethanol Thermo Scientific 31350010

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References

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Hauth, A., Galupa, R., Servant, N., Villacorta, L., Hauschulz, K., van Bemmel, J. G., Loda, A., Heard, E. Deciphering High-Resolution 3D Chromatin Organization via Capture Hi-C. J. Vis. Exp. (188), e64166, doi:10.3791/64166 (2022).

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