Summary
Detta protokoll beskriver Capture Hi-C-metoden som används för att karakterisera 3D-organisationen av megabaserade riktade genomiska regioner med hög upplösning, inklusive gränser för topologiskt associerande domäner (TADs) och långväga kromatininteraktioner mellan regulatoriska och andra DNA-sekvenselement.
Abstract
Den rumsliga organisationen av genomet bidrar till dess funktion och reglering i många sammanhang, inklusive transkription, replikering, rekombination och reparation. Att förstå den exakta kausaliteten mellan genomtopologi och funktion är därför avgörande och alltmer föremål för intensiv forskning. Teknik för infångning av kromosomkonformation (3C) gör det möjligt att härleda kromatins 3D-struktur genom att mäta frekvensen av interaktioner mellan vilken region som helst i genomet. Här beskriver vi ett snabbt och enkelt protokoll för att utföra Capture Hi-C, en 3C-baserad målanrikningsmetod som karakteriserar den allelspecifika 3D-organisationen av megabaserade genomiska mål med hög upplösning. I Capture Hi-C fångas målregioner upp av en matris med biotinylerade avsökningar före sekvensering med högt dataflöde nedströms. Således uppnås högre upplösning och allelspecificitet samtidigt som teknikens tidseffektivitet och överkomliga priser förbättras. För att demonstrera dess styrkor applicerades Capture Hi-C-protokollet på musens X-inaktiveringscenter ( Xic), huvudregleringsplatsen för X-kromosominaktivering (XCI).
Introduction
Det linjära genomet innehåller all information som behövs för att en organism ska genomgå embryonal utveckling och överleva under vuxen ålder. Att instruera genetiskt identiska celler att utföra olika funktioner är dock grundläggande för att exakt kontrollera vilken information som används i specifika sammanhang, inklusive olika vävnader och / eller utvecklingsstadier. Den tredimensionella organisationen av genomet tros delta i denna exakta spatio-temporala reglering av genaktivitet genom att underlätta eller förhindra den fysiska interaktionen mellan reglerande element som kan separeras med flera hundra kilobaser i det linjära genomet (för recensioner 1,2,3). Under de senaste 20 åren har vår förståelse av samspelet mellan genomveckning och aktivitet snabbt ökat, till stor del på grund av utvecklingen av kromosomkonformationsteknik (3C) (för granskning 4,5,6,7). Dessa metoder mäter frekvensen av interaktioner mellan alla regioner i genomet och förlitar sig på ligering av DNA-sekvenser som ligger i nära 3D-närhet inom kärnan. De vanligaste 3C-protokollen börjar med fixering av cellpopulationer med ett tvärbindningsmedel såsom formaldehyd. Det tvärbundna kromatinet spjälkas sedan med ett restriktionsenzym, även om MNas-rötning också har använts 8,9. Efter matsmältning återliggörs fria DNA-ändar i nära rumslig närhet och tvärbindningen vänds. Detta steg ger upphov till 3C-biblioteket eller mallen, en blandad pool av hybridfragment där sekvenser som var i 3D-närhet till kärnan har större chanser att ligeras i samma DNA-fragment. Nedströmskvantifieringen av dessa hybridfragment gör det möjligt att härleda 3D-konformationen av genomiska regioner som ligger tusentals baspar från varandra i det linjära genomet men kan interagera i 3D-rymden.
Många olika tillvägagångssätt har utvecklats för att karakterisera 3C-biblioteket, som skiljer sig både när det gäller vilka delmängder av ligeringsfragment som analyseras och vilken teknik som används för deras nedströms kvantifiering. Det ursprungliga 3C-protokollet förlitade sig på valet av två intressanta regioner och kvantifieringen av deras "en mot en" interaktionsfrekvens med PCR10,11. 4C-metoden (cirkulär kromosomkonformationsfångst) mäter interaktionerna mellan en enda plats av intresse (dvs. "synvinkeln") och resten av genomet ("en mot alla")12,13,14. I 4C genomgår 3C-biblioteket en andra omgång av matsmältning och religering för att generera små cirkulära DNA-molekyler som PCR-amplifieras av synvinkelspecifika primers15. 5C (kromosomkonformation fångar kolkopia) möjliggör karakterisering av 3D-interaktioner över större regioner av intresse, vilket ger insikter i högre ordningens kromatinveckning inom den regionen ("många mot många")16. I 5C hybridiseras 3C-biblioteket till en pool av oligonukleotider som överlappar restriktionsställen som därefter kan förstärkas med multiplex PCR med universella primers15. I både 4C och 5C kvantifierades de informativa DNA-fragmenten initialt av mikroarrayer och senare av nästa generations sekvensering (NGS) 17,18,19. Dessa strategier karakteriserar riktade regioner av intresse men kan inte tillämpas för att kartlägga genomomfattande interaktioner. Det senare målet uppnås med Hi-C, en 3C-baserad strategi med hög genomströmning där massivt parallell sekvensering av 3C-mallen möjliggör opartisk karakterisering av kromatinvikning på genomomfattande nivå ("alla mot alla")20. Hi-C-protokollet innefattar införlivande av en biotinylerad rest vid de smälta fragmentens ändar, vilket följs av neddragning av ligeringsfragment med streptavidinpärlor för att öka återvinningen av ligerade fragment20.
Hi-C avslöjade att däggdjursgenom är strukturellt organiserade i flera skalor i 3D-kärnan. På megabasskalan är genomet uppdelat i regioner av aktivt och inaktivt kromatin, A- respektive B-facken20,21. Förekomsten av ytterligare underavdelningar representerade av olika kromatin- och aktivitetstillstånd visades ocksåsenare 22. Vid högre upplösning delas genomet vidare upp i sub-megabas självinteragerande domäner som kallas topologiskt associerande domäner (TADs), först avslöjade genom Hi-C och 5C-analys av human- och musgenomerna23,24. Till skillnad från fack som varierar på ett vävnadsspecifikt sätt tenderar TAD att vara konstanta (även om det finns många undantag). Det är viktigt att TAD-gränserna bevaras över arter25. I däggdjursceller omfattar TAD ofta gener som delar samma reglerande landskap och har visat sig representera ett strukturellt ramverk som underlättar gensamreglering samtidigt som interaktionerna med angränsande regleringsdomäner begränsas (för granskning 3,26,27,28). Inom TAD kan dessutom interaktioner på grund av CTCF-platser vid basen av kohesin-extruderade slingor öka sannolikheten för promotor-förstärkare eller förstärkare-förstärkare-interaktioner (för granskning29).
I Hi-C kan fack och TAD detekteras med 1 Mb till 40 kb upplösning, men högre upplösning kan uppnås för att karakterisera mindre skalkontakter som looping interaktioner mellan distala element på skalan 5-10 kb. Att öka upplösningen för att kunna detektera sådana loopar effektivt med HiC kräver dock en betydande ökning av sekvenseringsdjupet och därmed sekvenseringskostnaderna. Detta förvärras om analysen måste vara allelspecifik. Faktum är att en X-faldig ökning av upplösningen kräver en X2-ökning av sekvenseringsdjupet, vilket innebär att högupplösta och allelspecifika genomomfattande tillvägagångssätt kan vara oöverkomligt dyra30.
För att förbättra kostnadseffektiviteten och överkomligheten samtidigt som hög upplösning bibehålls kan målregioner av intresse fysiskt dras ner från genomomfattande 3C- eller Hi-C-bibliotek efter deras hybridisering med komplementära biotinmärkta oligonukleotidprober före sekvensering nedströms. Dessa målanrikningsstrategier kallas Capture-C-metoder och möjliggör förhör av interaktioner mellan hundratals mållokus spridda över genomet (dvs. Promoter Capture (PC) Hi-C; Nästa generations (NG) Capture-C; Låg ingång (LI) Capture-C; Nukleär titrerad (NuTi) Capture-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, eller över regioner som sträcker sig upp till flera megabaser (dvs. Capture HiC; HYbrid Capture Hi-C (Hi-C2); Kaklat C)41,42,43. Två aspekter kan variera i fångstbaserade metoder: (1) arten och utformningen av biotinylerade oligonukleotider (dvs. RNA eller DNA, enstaka oligos som fångar dispergerade genomiska mål eller flera oligos som kaklar en region av intresse); och (2) mallen som används för att dra ner mål som kan vara 3C- eller Hi-C-biblioteket, det senare består av biotinylerade restriktionsfragment som dras ner från 3C-biblioteket.
Här beskrivs ett Capture Hi-C-protokoll baserat på berikning av målkontakter från 3C-biblioteket. Protokollet bygger på utformningen av en skräddarsydd plattsättning av biotinylerade RNA-sonder och kan utföras på 1 vecka från 3C-biblioteksberedningen till NGS-sekvenseringen. Protokollet är snabbt, enkelt och gör det möjligt att karakterisera den högre ordningens 3D-organisation av megabasstora regioner av intresse med 5 kb upplösning samtidigt som tidseffektiviteten och prisvärdheten förbättras jämfört med andra 3C-metoder. Capture Hi-C-protokollet tillämpades på masterregulatorplatsen för X-kromosominaktivering (XCI), X-inaktiveringscentret (Xic), som är värd för Xist icke-kodande RNA. Xic har tidigare varit föremål för omfattande strukturella och funktionella analyser (för granskning44,45). Hos däggdjur kompenserar XCI för doseringen av X-länkade gener mellan honor (XX) och hanar (XY) och involverar transkriptionell tystning av nästan hela en av de två X-kromosomerna i kvinnliga celler. Xic har representerat en kraftfull, guldstandardplats för studier i 3D-genomtopologi och samspelet med genreglering44. 5C-analys av Xic i musembryonala stamceller (mESC) ledde till upptäckten och namngivningen av TADs, vilket gav de första insikterna i den funktionella relevansen av topologisk partitionering och gensamreglering24. Den topologiska organisationen av Xic visade sig senare vara kritiskt involverad i lämplig utvecklingstidpunkt för Xist-uppreglering och XCI 46, och oväntade cis-reglerande element som kan påverka genaktivitet inom och mellan TAD upptäcktes också nyligen inom Xic47,48,49. Att applicera Capture Hi-C på 3 Mb av musens X-kromosom som spänner över Xic visar kraften i detta tillvägagångssätt vid dissekering av storskalig kromatinveckning med hög upplösning. Ett detaljerat och lätt att följa protokoll tillhandahålls, med början från utformningen av uppsättningen biotinylerade sonder över varje DpnII-begränsningsplats inom regionen av intresse för generering av det genomomfattande 3C-biblioteket, hybridisering och fångst av målkontakter och nedströms dataanalys. En översikt över lämpliga kvalitetskontroller och förväntade resultat ingår också, och både styrkor och begränsningar i tillvägagångssättet diskuteras mot bakgrund av liknande befintliga metoder.
Protocol
De musembryonala stamceller (mESC) som användes i denna studie härrörde från en korsning av en TX/TX R26 rtTA/rtTA-hona 50 med en Mus musculus castaneus-hane enligt riktlinjerna för djurvård från Institut Curie (Paris)51.
1. Sond design
- Designa en uppsättning biotinylerade sonder (120-mer RNA-oligonukleotider) som täcker målområdet av intresse.
- Placera det intressanta området i sida med överlappande oligonukleotider så att i genomsnitt varje sekvens inom målet täcks av två unika sonder (2x täckning) (figur 1).
- Exkludera repetitiva sekvenser från avsökningstäckning för att undvika berikning av ospecifika interaktioner.
OBS: För att maximera anrikningen av informativa ligeringsfragment definierades regioner som spänner över 300 bp uppströms och nedströms varje DpnII-begränsningsplats över målet (ChrX: 102 475 000-105 475 000) och 28 913 biotinylerade sonder designades enligt SureSelect DNA-målanrikningsteknik genom Sure Design-plattformen52. Enligt denna strategi tillåts upp till högst 40 baser av repetitiva sekvenser i varje oligonukleotid för att minimera anrikningen av ospecifika interaktioner. Sondmatrisen syntetiserades av Agilent. Här används DpnII som ett restriktionsenzym av två skäl: (1) det är en fyrskärare som rutinmässigt används i flera 3C-baserade metoder53; och (2) det maximerar chanserna att fånga informativa enkla nukleotidpolymorfismer (SNP) i närheten av skärplatserna i jämförelse med andra restriktionsenzymer som testades in silico i F1-hybridlinjer som användes i denna studie (C57BL / 6J x CASTEi / J).
2. Experimentellt förfarande
- Förberedelse av celler
- Frö lämpligt antal celler på en eller flera cellodlingsplattor för att uppnå ett totalt cellantal på ≥ 5 x 107 celler på fixeringsdagen.
OBS: Embryonala stamceller från möss (mESC) användes i denna studie. mESC pläteras på gelatiniserade (0,1% gelatin i 1x PBS - o / n vid 37 ° C, 5% CO2 inkubator) cellodlingsplattor i mESC-medium innehållande 2i + LIF och batchtestat fosterkalvserum (DMEM, 15% FBS, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 1,000 U / ml-1 leukemihämmande faktor (LIF), CHIR99021 (3 μM) och PD0325901 (1 μM)). För denna celltyp innehåller en 80% sammanflytande 10 cm platta cirka 2 x 107 celler. - Bered ytterligare en cellodlingsplatta för cellräkning.
OBS: En mindre cellodlingsplatta kan användas för att minska medieanvändningen. I detta fall måste antalet celler som ska fröas på den mindre plattan justeras därefter (t.ex. 3x färre celler på en 10 cm platta jämfört med en 15 cm platta).
- Frö lämpligt antal celler på en eller flera cellodlingsplattor för att uppnå ett totalt cellantal på ≥ 5 x 107 celler på fixeringsdagen.
- Formaldehydfixering
- Uppskatta det totala antalet celler som ska korslänkas.
- Innan tvärbindningsreaktionen påbörjas, trypsinisera och räkna celler från kontrollplattan förberedd speciellt för cellräkning med hjälp av en automatiserad cellräknare enligt tillverkarens instruktioner.
- Inkludera en viabilitetsfärgning (t.ex. Trypan Blue) för att bestämma procentandelen livskraftiga celler54. Från detta cellantal uppskattas det totala antalet celler i plattan (plattorna) förberedda för tvärbindning.
- Ta bort odlingsmediet från plattorna förberedda för tvärbindning och ersätt det med lämplig mängd fixeringslösning (2% formaldehyd i cellodlingsmediet). Använd 10 ml på en 10 cm platta (t.ex. ~ 20 ml för en 15 cm platta).
OBS: Tillsätt en exakt volym fixeringslösning. Om fixering av vidhäftande celler inte är möjlig kan detta steg anpassas till trypsiniserade celler och utföras i 30 ml fixeringslösning i 50 ml koniska centrifugrör. Formaldehyd får inte vara äldre än 1 år. Det är att föredra att använda injektionsflaskor för engångsbruk. Fixeringslösningen måste bringas till rumstemperatur (RT) före användning.
VARNING: Formaldehyd är farligt och måste hanteras enligt lämpliga hälso- och säkerhetsbestämmelser. - Fixera i 10 minuter vid rumstemperatur under försiktig blandning på en shaker.
- Släck fixeringsreaktionen genom tillsats av 2,5 M glycin-1x PBS till en slutlig koncentration på 0,125 M. Tillsätt 530 μL 2,5 M glycin-1x PBS till 10 ml på en 10 cm platta (t.ex. 1060 μL till 20 ml på en 15 cm platta).
OBS: Om cellerna fixerades i lösning, släck fixeringsreaktionen med 1590 μL 2,5 M glycin-1x PBS. - Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur, blanda försiktigt på en shaker.
- Överför plattorna till is och inkubera i ytterligare 15 minuter på is medan du försiktigt blandar på en skakapparat.
OBS: Från och med nu måste cellerna hållas på is och buffertar måste förkylas för att undvika ytterligare tvärbindning. Flytta till ett kallrum om många plattor behöver bearbetas. - Ta bort fixeringslösningen från cellerna genom att hälla den i en bägare för att säkerställa snabb hantering.
OBS: Se till att kassera det formaldehydhaltiga flytande avfallet enligt gällande hälso- och säkerhetsbestämmelser. - Skölj 10 cm plattan snabbt två gånger med 5 ml kallt 0,125 M glycin-1x PBS (8 ml för en 15 cm platta) för att tvätta bort skräp och döda celler. Ta bort vätskan från plattan genom att hälla den i en bägare för att säkerställa snabb hantering.
- Tillsätt 5 ml kall 0,125 M glycin-1x PBS till 10 cm-plattan (10 ml för en 15 cm platta) och skrapa snabbt cellerna från plattan med en plastcellskrapa.
- Överför cellsuspensionen till ett förkylt 50 ml koniskt centrifugrör med hjälp av en serologisk pipett.
- Skölj plattan två gånger med 5 ml kallt 0,125 M glycin-1x PBS och tillsätt cellsuspensionen till det koniska centrifugröret.
- Snurra nedåt vid 480 x g i 10 min vid 4 °C.
Om cellerna fixerades i lösning, överför cellen till ett förkylt koniskt centrifugrör och snurra nedåt vid 480 x g i 10 minuter vid 4 °C. Ta bort fixeringslösningen genom att hälla den i en bägare och tvätta tre gånger i 10 ml kall 0,125 M glycin-1x PBS. Se till att suspendera cellerna igen vid varje tvättsteg. - Ta bort supernatanten genom att aspirera med ett bänkaspirationssystem. Resuspendera cellerna i 500 μL 1x PBS per 1 x 107 celler genom att försiktigt pipettera upp och ner med en P1000-pipett. För att suspendera celler i den exakta volymen, se den totala cellnummeruppskattningen som erhållits i 2.2.1.
- Alikvot 500 μl av cellsuspensionen till det beräknade antalet 1,5 ml mikrocentrifugrör (1 x 107 celler/rör).
- Snurra nedåt vid 480 x g i 10 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten med ett bänkaspirationssystem och snäppfrys cellpelletsen i flytande kväve. Förvara torrcellspelletsen vid -80 °C.
OBS: Prover kan lagras i minst 1 år.
- Uppskatta det totala antalet celler som ska korslänkas.
- Celllys
- Tina den frysta pelleten/pelleterna på is.
- Bered 1,5 ml lysbuffert iH20 per prov: Tillsätt 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl och 0,2 % NP40.
- Tillsätt 600 μL av köldlysbufferten och suspendera väl på is.
- Inkubera på is i 15 minuter för att låta cellerna svälla.
- Snurra nedåt vid 2655 x g i 5 minuter vid 4 °C och ta bort supernatanten med hjälp av ett bänkaspirationssystem.
- För att avlägsna skräp, suspendera pelleten i 1 ml av kalllysbufferten, snurra ner vid 2655 x g i 5 min vid 4 °C och ta bort supernatanten.
- Snurra kort igen vid 2655 x g och 4 °C och avlägsna så mycket av den återstående supernatanten som möjligt med hjälp av ett bänkaspirationssystem utrustat med en P200-spets.
- Resuspendera i 100 μl av 0,5 % (vol/vol) SDS.
- Inkubera i en termomixer vid 62 °C, virvla runt vid 1400 rpm i 10 min.
- Tillsätt 290 μLH2O+ 50 μL 10% TritonX-100 och blanda väl, undvik luftbubblor.
- Inkubera i en termomixer vid 37 °C, virvla runt vid 1400 rpm i 15 minuter.
- Tillsätt 50 μL 10x Dpnll buffert och vänd röret för att blanda.
- Ta 50 μL osmält DNA för kvalitetskontroll i ett separat rör. Glöm inte att ta det osmälta kontrollprovet.
- DpnII matsmältning
- Tillsätt 10 μL Dpnll hög koncentration (totalt 500 U) och blanda genom att invertera.
- Inkubera proverna och den osmälta kontrollen i en termomixer vid 37 °C, virvla runt vid 1400 rpm i >4 timmar.
- Tillsätt 10 μL Dpnll hög koncentration (totalt 500 U) i slutet av dagen.
- Inkubera proverna och den osmälta kontrollen vid 37 °C och virvla runt vid 1400 varv/min över natten.
- Tillsätt 10 μL Dpnll hög koncentration (totalt 500 U) i början av nästa dag till proverna.
- Inkubera proverna och den osmälta kontrollen i en termomixer vid 37 °C, virvla runt vid 1400 rpm i 4 timmar.
- Ligering och återföring av tvärbindning
- Inkubera rören vid 65 °C i 20 minuter vid 1400 rpm.
Lägg inte till SDS just nu. Tanken är att bevara kärnintegriteten, så ligeringen utförs inuti kärnorna, vilket kringgår behovet av extrem utspädning. - Kyl ner proverna på is i högst 5-10 min. För att undvika SDS-utfällning, lämna inte proverna på is längre än detta.
- Ta 50 μL av det oligerade smälta DNA för kvalitetskontroll i ett separat rör. Förvara de osmälta och oligerade kontrollerna vid -20 °C.
OBS: Glöm inte att ta det oligerade kontrollprovet. - Tillsätt 800 μL ligeringscocktail: 122 μL 10x ligasbuffert, 8 μL T4-ligas (30 U/μL) och 670 μLH20.
- Inkubera vid 16 °C, virvla runt vid 1000 rpm över natten.
- Tillsätt 7,5 μl proteinas K (20 mg/ml) till proverna och 2 μl till kontrollerna.
- Inkubera vid 65 °C i 4 timmar vid 1000 rpm.
- Inkubera rören vid 65 °C i 20 minuter vid 1400 rpm.
- DNA-rening
- Överför proverna på is till förkylda 15 ml koniska centrifugrör och tillsätt 2 ml vatten, 10,5 ml iskall EtOH och 583 μl 3 M NaAC.
OBS: Ytterligare vatten syftar till att förhindra överföring av DTT till pelleten. - Tillsätt 200 μl iskall EtOH, 10,8 μL NaAC och 1 μl coprecipitant till de osmälta och oligerade kvalitetskontrollerna.
- Inkubera vid -80 °C i minst 4 timmar upp till natten.
- Snurra 15 ml rören vid 2200 x g vid 4 °C i 45 minuter.
- Snurra 1,5 ml kontrollrören vid 20 500 x g vid 4 °C i 30 minuter.
- Tvätta en gång med 3 ml (prover) och 1 ml (kontroller) iskall 70% EtOH.
- Snurra vid 2200 x g (prover) eller 20 500 x g (kontroller) vid 4 °C i 10 minuter.
- Ta försiktigt bort EtOH och lufttorka vid RT i 10-15 minuter; Överdriv inte.
- Suspendera proverna och kontrollerna på nytt i 100 μl respektive 20 μl H20.
- Tillsätt 1 μl RNAseA och inkubera vid 37 °C, virvla runt vid 1400 rpm i 30 minuter.
- Överför proverna på is till förkylda 15 ml koniska centrifugrör och tillsätt 2 ml vatten, 10,5 ml iskall EtOH och 583 μl 3 M NaAC.
- Kvalitetskontroll av 3C-mallberedning
- Kvantifiera varje prov och kontrollera med hjälp av ett fluorometerkit för högkänsliga DNA-koncentrationsmätningar.
- Fyll 100-200 ng av varje prov och varje kontroll på en 1% agaros/1x TBE-gel.
- Kontrollera att gelbilden visar det förväntade resultatet genom att jämföra skillnaderna i DNA-fragmentstorlekar mellan kontrollerna och 3C-mallen som visas i figur 2A.
- Förvara proverna och kontrollerna vid -20 °C.
- Hybridisering, avskiljning och provbearbetning för multiplexerad sekvensering
- För att hybridisera uppsättningen av biotinylerade RNA-sonder till 3C-mallen, fånga de riktade ligeringsfragmenten och förbereda proverna för multiplexerad sekvensering enligt målanrikningssystemet som används i denna studie för parad multiplex sekvensering (se Tabell över material). Följ protokollet enligt tillverkarens instruktioner samtidigt som du inför följande mindre ändringar:
- Avsnitt 2 i tillverkarens protokoll: Beredning av prover
- Följ instruktionerna för målanrikning från 3 μg gDNA-ingång.
- Skjuv DNA i en sonicator med hjälp av följande specifikationer: 10% arbetscykel, 4 intensitet, 200 cyc / burst och 130 s. Börja med 4 μg 3C-mall återsuspenderad i 130 μL vatten för varje infångningsreaktion för att säkerställa tillräckligt med material för att fortsätta provberedningen med 3 μg av det klippta DNA.
- Bedöm kvaliteten på skjuvat DNA. Kör 1 μL av det klippta DNA:t på en DNA-bioanalysator enligt högkänslighetsprotokollet. Förvänta dig en fördelning av fragmentstorleken mellan 150-700 bp (figur 2).
- Rengör provet med pärlor av SPRI-immobilisering (fastfasreversibel immobilisering). Tillsätt 124 μL SPRI-pärlor till 124 μL av DNA-provet för att utföra ett urval av vänster sida 1:1 enligt tillverkarens anvisningar och eluera i 25 μL nukleasfritt vatten. Detta reningssteg kommer att ta bort kortare fragment för att anrika fragment på cirka 300 bp (figur 2).
OBS: Mängden prover och SPRI-pärlor som används i detta steg tar hänsyn till volymförlusten som inträffade vid överföring av proverna till nya rör och körning av kvalitetskontrollerna på Bioanalyzer. Alla efterföljande storleksvalsteg utförs enligt de förhållanden som rekommenderas av tillverkarens protokoll. DNA-eluering från SPRI-pärlor utförs vid RT genom hela protokollet. - Bedöm kvaliteten på storleksvalt klippt DNA. Kör 1 μl av det klippta DNA:t på DNA-bioanalysatorn enligt högkänslighetsprotokollet (HS). Förvänta dig en fördelning av fragmentstorlekar med den högsta anrikningen vid 300 bp (figur 2). Gå vidare med kvantifieringen av det klippta DNA: t om klippningen lyckades.
- Kvantifiera det klippta DNA:t med ett fluorometerkit för mätningar av HS-DNA-koncentrationen.
OBS: Om DNA-skjuvning resulterar i ett DNA-utbyte på <3 μg, utför en andra omgång DNA-skjuvning med ytterligare 4 μg DNA och kombinera de klippta DNA-proverna efter det första SPRI-strängreningssteget för att uppnå totalt 3 μg skjuvat DNA. - Tillsätt nukleasfritt vatten till det valda renade DNA-provet (totalt 3 μg) till en slutlig volym på 48 μl och fortsätt med slutreparationsreaktionen enligt tillverkarens protokoll.
- Efter ligering av parade ändadaptrar, förstärk biblioteket genom att utföra fem cykler av pre-capture PCR enligt tillverkarens instruktioner (villkoren för PCR och primers finns i satsen).
- Avsnitt 4 i tillverkarens protokoll: Hybridisering och avskiljning
- För att hybridisera de beredda DNA-proverna till de målspecifika RNA-sonderna, späd 750 ng DNA-prover i en slutlig volym av 3,4 μL, vilket resulterar i en initial koncentration av 221 ng / μL. För DNA-prover utspädda i större volymer, använd en hastighetsvakuumkoncentrator för att minska till den slutliga volymen. En hastighet och vakuumkoncentration (250 x g; ≤45 °C) i 15–20 minuter är normalt tillräcklig för proverna som återsuspenderats i 10 μl. Se till att ha samma ingångsvolym för varje prov innan du startar hastighetsvakuumkoncentratorn.
- Inkubera hybridiseringsblandningen i 16–18 timmar vid 65 °C med ett uppvärmt lock vid 105 °C enligt tillverkarens anvisningar.
- Avsnitt 5 i tillverkarens protokoll: Indexering och provbearbetning för multiplexerad sekvensering
- För att förstärka de fångade biblioteken med indexeringsprimers, utför 12 cykler av PCR efter fångst enligt tillverkarens instruktioner (villkoren för PCR och primers finns i satsen).
- Avsnitt 2 i tillverkarens protokoll: Beredning av prover
- För att hybridisera uppsättningen av biotinylerade RNA-sonder till 3C-mallen, fånga de riktade ligeringsfragmenten och förbereda proverna för multiplexerad sekvensering enligt målanrikningssystemet som används i denna studie för parad multiplex sekvensering (se Tabell över material). Följ protokollet enligt tillverkarens instruktioner samtidigt som du inför följande mindre ändringar:
- Nästa generations sekvensering
- Om du vill köra flera avbildnings-Hi-C-bibliotek i samma flödescell förbereder du en ekvimolär blandning av avbildningsbiblioteken och sekvenserar 100–120 M läsningar per bibliotek.
- Om den allelspecifika analysen behövs, sekvensera 150 bp parad ände för att säkerställa tillräcklig SNP-täckning.
3. Analys av data
- Använd HiC-Pro-pipelinen för att utföra Capture Hi-C-dataanalys55. HiC-Pro tillhandahåller kvalitetskontroller vid varje steg i bearbetningen, inklusive (figur 3):
i) Anpassningshastigheten på referensgenomet som specificerar fraktionen av läsningar som spänner över en ligeringsplats, liksom antalet par och singleton.
ii) Andelen giltiga ligeringsprodukter och icke-informativa läspar (dinglande ände, självligering etc.).
iii) Andelen korta/långväga och intra/interkromosomala kontakter.
iv) Andelen målkontakter för Capture Hi-C.
v) Fraktionen av allelspecifika läsningar om specificerad.
HiC-Pro stöder ett brett utbud av protokoll, inklusive in situ Hi-C och Capture Hi-C. I det senare fallet behöver användaren helt enkelt ange målregionen (BED-format) i konfigurationsfilen. När data har bearbetats kan HiC-Pro-utgångarna enkelt omvandlas till ett kylare objekt för nedströmsanalys56. I detta steg normaliseras kontaktkartorna vid olika upplösningar med hjälp av ICE-metoden som tidigare beskrivits av Imakaev och kollegor57. Flera analyser kan sedan köras för att kalla kromosomfack, TADs eller kromatinslingor (för granskning58). Arbetsflödet för protokollet visas i figur 4. Här används sviten "cooltools" för att beräkna isoleringspoängen och TADs-gränserna, vilket illustreras i figur 5 och figur 659.
Representative Results
Det beskrivna Capture Hi-C-protokollet är baserat på beredningen av den genomomfattande 3C-mallen med hjälp av en fyrbasskärare (DpnII). Den efterföljande anrikningen av ligeringsfragment över den genomiska regionen av intresse erhålls genom hybridisering av en rad kakel-RNA-sonder och deras streptavidinbaserade infångning enligt målanrikningssystemet som används i denna studie (figur 1). Biotinylerade RNA-sonder valdes eftersom de visar stramare bindningsaffinitet till sina mål jämfört med DNA-sonder52,60. Avbildade bibliotek indexeras och poolas sedan för sekvensering med multiplexerat dataflöde. Fånga Hi-C-data kan visualiseras som högupplösta Hi-C-interaktionskartor men också som 4C-liknande kontaktkartor med en synvinkel för att specifikt visualisera interaktionerna mellan mindre sekvenser som promotorer eller förstärkare inom hela den fångade regionen. Arbetsflödet för protokollet visas i figur 4. Kvalitetskontroller före sekvensering visas i figur 2 och inkluderar bedömning av korrekt matsmältning och religering av 3C-mallen och dess effektiva skjuvning och rening över de olika stegen i protokollet. Det skjuvade 3C-mall-DNA förväntas löpa mellan 150 och 700 bp, och ingen anrikning av fragment >2 kb bör detekteras. Under följande steg utförs flera pärlbaserade DNA-rensnings- och storleksvalsteg, först efter skjuvningen, sedan efter PCR före och efter fångst. Rensade bibliotek visar en distinkt fragmentanrikningsprofil som visualiseras på en DNA-bioanalysator med hög känslighet (figur 2). Den genomsnittliga fragmentstorleken ökar under biblioteksförberedelsen på grund av ligering av adaptrar, sekvensering och indexeringsprimers. Kvalitetskontroller efter sekvensering erhålls via Hi-C Pro och visas i figur 3. Många olika bioinformatiska mjukvaruapplikationer har föreslagits för 3C-liknande databehandling och analys. Bland dem är HiC-Pro-rörledningen en av de mest populära lösningarna, vilket möjliggör bearbetning av råsekvenseringsdata till de slutliga kontaktkartorna vid olika upplösningar55. HiC-Pro använder en tvåstegs kartläggningsstrategi för att anpassa sekvensläsningarna på referensgenomet. 3C-produkterna rekonstrueras och filtreras sedan ut för att ta bort icke-informativa kontaktpar och för att generera kontaktkartorna. Dessutom kan den använda en lista över kända polymorfismer för att utföra allelspecifik analys och för att separera kontakterna som kommer från de två föräldraallelerna i distinkta kontaktkartor. På senare tid har HiC-Pro inkluderats och utvidgats till nf-core-ramverket (nf-core-hic), vilket ger en mycket skalbar och reproducerbar community-driven pipeline61,62.
För att fånga musen Xic designades en uppsättning av 28 913 RNA-sonder som kaklade 3 Mb av X-kromosomen. Denna region inkluderar nyckelspelaren i XCI, den långa icke-kodande genen Xist och dess kända ~ 800 kb reglerande landskap (figur 5). Denna ~ 800 kb-region är uppdelad i två TADs: en inklusive Xist-promotorn och dess kända positiva regulatorer (dvs. de icke-kodande transkripten Ftx, Jpx och Xert och den proteinkodande genen Rnf12) och den närliggande TAD som omfattar de negativa cis-regulatorerna för Xist (dvs dess antisense-transkript Tsix, förstärkareelementet Xite och det icke-kodande transkriptet Linx) (för granskning44,45).
Genom att tillämpa det beskrivna Capture Hi-C-protokollet på Xic erhölls den topologiska organisationen av denna plats med oöverträffad upplösning (figur 6 och figur 7). Detta är särskilt tydligt när man jämför Capture Hi-C-profilen med tidigare publicerade 5C47 (figur 6 och figur 7; Kompletterande tabell 1) och Hi-C61 (figur 6 och figur 7; Kompletterande tabell 1) Profiler. Till exempel är sub-TAD-strukturer tydligare - TAD som innehåller Xist-promotorn (Xist-TAD) är tydligt indelad i två mindre domäner (figur 6A, blå pilspets). Tidigare kunde detta bara "gissas" visuellt från 5C-profilen (figur 6B), om än detektering av en gräns i denna region med hjälp av isoleringspoängalgoritmen. På samma sätt möjliggör upplösningen av Capture Hi-C-profilen identifiering av två mindre domäner i den närliggande TAD (figur 6A, B), som innehåller promotorn för Tsix-lokus ( Tsix-TAD ); Detta uppnåddes inte tidigare med 5C (figur 6B). Observera att topologiska gränser som bestäms av isoleringspoängen från Capture Hi-C- och 5C-data i allmänhet detekteras på något olika platser och med olika relativa styrkor.
Dessutom är andra sub-TAD-strukturer såsom kontaktslingor tydligt synliga från Capture Hi-C-data, såsom slingan mellan Xist och Ftx (figur 7A), som tidigare identifierats med Capture-C63, och slingan mellan Xist och Xert (figur 7B), som nyligen identifierats med hjälp av ett liknande protokoll för Capture Hi-C48. Andra kontakter kan också kartläggas mer exakt på grund av den ökade upplösningen av Capture Hi-C-profilerna, såsom de som bildar de kända kontakthotspotsna inom Tsix-TAD mellan Linx, Chic1 och Xite loci (figur 7A).
I jämförelse med Hi-C-data som visas i figur 7 möjliggjorde Capture Hi-C en fyrfaldig ökning av upplösningen, men det krävde bara en fjärdedel av sekvenseringsdjupet (dvs. 126 M läsningar mot 571 M) (kompletterande tabell 1). Denna ökning av upplösningen möjliggör detektering av subTADs och looping-interaktioner som inte kunde detekteras av Hi-C vid sekvenseringsdjupet som visas i figur 6 och figur 7. Det beskrivna protokollet för Capture Hi-C möjliggör således en mycket mer detaljerad, högupplöst karakterisering av ett stort genomiskt område av intresse, jämfört med tidigare metoder.
Figur 1: Sondens utformning. Schematisk representation av strategin som används för sonddesign. Regioner med 300 bp uppströms och nedströms varje DpnII-restriktionsställe över 3 Mb-målregionen valdes ut och kaklades med överlappande biotinylerade RNA-sonder. En av dessa valda regioner visas, chrX: 102 474 805–102 475 500. Högst 40 baser av repetitiva sekvenser är tillåtna i varje sond. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Kvalitetskontroller för försekvensering av Hi-C . (A) Representativt exempel på kvalitetskontroller av 3C-mallar. 200 ng DNA laddades på en 1% agarosgel. Bana 1: 1 kb stege. Bana 2: Osmält, tvärbundet och intakt kromatin körs som ett skarpt band på >10 kb. Bana 3: DpnII-smält tvärbundet kromatin körs som ett utstryk mellan 1 kb och 3 kb i storlek. Lane 4: Slutligt 3C-bibliotek eller mall; fria ändar av smälta tvärbundna DNA-fragment omligeras. DNA-utstryket av lägre molekylstorlek är nästan odetekterbart, och ligeringsprodukten detekteras som ett band på >10 kb. (B) Representativa exempel på DNA-profiler för bioanalysatorer med hög känslighet. Överst till vänster: framgångsrikt skjuvat 3C-bibliotek som visar en fördelning av fragmentstorleken mellan 150 bp och 700 bp. Överst till höger: otillfredsställande klippt 3C-bibliotek. Oklippt DNA detekteras som bred anrikning av fragment >2 kb. (C) Nederst till vänster: klippt DNA-prov efter ett urval av vänster sida 1:1 med SPRI-pärlor. Fragment av ~ 300 bp anrikas. Nedre mitten: Förfångad PCR-profil efter ligering av parade ändadaptrar enligt tillverkarens protokoll. Nederst till höger: slutligt Capture Hi-C-bibliotek inklusive adaptrar, sekvenserings- och indexeringsprimers för multiplexerad sekvensering. Förkortningar: bp = baspar, FU = godtycklig fluorescensenhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fånga kvalitetskontroller av Hi-C efter sekvensering med HiC-Pro . (A) Exempel på kartläggningshastighet på referensgenomet för den första kompisen i sekvensparen. Den ljusblå fraktionen representerar de avläsningar som HiC-Pro riktar in och spänner över en ligeringskorsning. Detta mått kan således användas för att validera det experimentella ligeringssteget. (B) När sekvenseringskompisar är inriktade på genomet behålls endast unikt inriktade läspar för analys. (C) Icke-giltiga par (i rött) såsom dinglande, självcirkel eller religering kasseras från analysen. Andelen giltiga par är en bra indikator på ligerings- och neddragningseffektiviteten. (D) De giltiga paren kan delas in ytterligare i intra-/interkromosomala och kort-/långdistanskontakter. Duplicerade läspar som sannolikt representerar PCR-artefakter tas bort från analysen. (E) För allelspecifik analys rapporterar HiC-Pro antalet allelläsningar som stöds av antingen en eller två kompisar för varje föräldragenom (dvs. C57BL/6J x CASTEi/J). Samma andel av läsningar som tilldelats moderns och faderns allel förväntas. (F) Slutligen väljs endast giltiga par som överlappar fångstregionen för att bygga kontaktkartorna. Hämtningspar representerar kontakter inom målregionen, medan hämtningsrapportpar involverar interaktion mellan målregionen och en utanför målet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Arbetsflöde för Capture Hi-C-protokollet. Schematisk representation av olika protokollsteg. För att generera den genomomfattande 3C-mallen tvärbinds kromatin först med formaldehyd och smälts sedan med DpnII-restriktionsenzymet. Fria DNA-ändar återligderas sedan, tvärbindningen vänds och DNA renas. För att berika fragment som omfattar målregionen hybridiseras en rad biotinylerade RNA-sonder till 3C-mallen och fångas upp genom streptavidinmedierad pull-down. Infångningsbibliotek bearbetas för multiplexerad sekvensering och giltiga ligeringsfragment kvantifieras för att härleda frekvensen av kromatinkontakter över målet, som visualiseras som högupplösta interaktionskartor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Översikt över regionen som omfattar Xic på musens X-kromosom. Schematisk representation av musens X-kromosom och zoom in av det 3 Mb fångade området (ChrX: 102 475 000-105 475 000). Den riktade regionen innehåller ~ 800 kb DNA som motsvarar Xic, den huvudsakliga regleringsplatsen för XCI. Xic inkluderar de långa icke-kodande generna, Xist, en nyckelspelare i XCI, och dess reglerande landskap. Positiva regulatorer av Xist visas i grönt och negativa regulatorer i lila. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 6: Avbilda interaktionskartor för Hi-C, 5C och Hi-C i det avbildade området på 3 Mb. (A) Fånga Hi-C-interaktionskarta över 3 Mb-målet som omfattar musen Xic med 10 kb upplösning (denna studie). (B) 5C interaktionskarta över samma målområde som i A med 6 kb upplösning (data omarbetad från47). Repetitiva regioner som inte ingår i analyserna maskeras i vitt. 5C-data kräver egen bioinformatisk bearbetning (se47). Efter rengöring och justering binnas 5C-kartorna vid primerupplösningen med en löpande median (fönster = 30 kb, steg = 5) för att nå en slutlig upplösning på 6 kb. (C) Hi-C-interaktionskarta över samma genomiska region som i A och B med 40 kb upplösning (data upparbetad från64). Alla interaktionskartor genererades från mus-ESC. Isoleringspoängen beräknades med hjälp av cooltools och representeras som histogram med isoleringsminimer vid TAD-gränser. TAD-gränser visas som vertikala linjer under kartan. Höjden på varje linje indikerar gränsstyrka. Gener visas som pilar som pekar i transkriptionsriktningen. Sub-TAD-gränser som detekteras exklusivt eller mer exakt i Capture Hi-C-kartor indikeras med magenta och blå pilspetsar för sub-TADs i Tsix respektive Xist TADs. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 7: Avbilda interaktionskartor för Hi-C, 5C och Hi-C över 1 Mb inom det avbildade området. (A) Fånga Hi-C-interaktionskarta över 1 Mb genomiska regionen som omfattar musen Xic med 5 kb upplösning (denna studie). (B) 5C interaktionskarta över samma genomiska region som i A. vid 6 kb upplösning (data omarbetad från47). Repetitiva regioner som inte ingår i analyserna maskeras i vitt. Observera att 5C-data kräver egen bioinformatisk bearbetning (se47). Efter rengöring och justering binnas 5C-kartorna vid primerupplösningen med en löpande median (fönster = 30 kb, steg = 5) för att nå en slutlig upplösning på 6 kb. (C) Hi-C-interaktionskarta över samma genomiska region som i A och B av Hi-C vid 20 kb upplösning (data upparbetad från64). Alla interaktionskartor genererades från mESC. Isoleringspoängen beräknades med hjälp av cooltools och representeras som histogram med isoleringsminimer vid TAD-gränser. TAD-gränser visas som vertikala linjer under kartan. Höjden på varje linje indikerar gränsstyrka. Gener visas som pilar som pekar mot transkriptionsriktningen. Kontaktslingor som detekteras exklusivt eller mer exakt i Capture Hi-C indikeras med magenta och blå asterisker för slingor i Tsix respektive Xist TADs. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1: Eftersekvenseringsstatistik för de dataset som används i detta manuskript: Capture Hi-C (denna studie), Hi-C64 och 5C47. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Här beskriver vi ett relativt snabbt och enkelt Capture Hi-C-protokoll för att karakterisera den högre ordningens organisation av genomiska regioner i megabasstorlek med 5-10 kb upplösning. Capture Hi-C tillhör familjen av Capture-C-tekniker som är utformade för att berika riktade kromatininteraktioner från genomomfattande 3C- eller Hi-C-mallar. Hittills har den stora majoriteten av Capture-C-applikationer utnyttjats för att kartlägga kromatinkontakter av relativt små reglerande element spridda över hela genomet. I det första Capture-C-protokollet användes flera överlappande RNA-biotinylerade sonder för att fånga > 400 förvalda promotorer i 3C-bibliotek framställda från erytroida celler31. Samma strategi förbättrades därefter i Next Generation (NG) och Nuclear Titrated (NuTi) Capture-C för att uppnå högupplösta interaktionsprofiler på >8 000 promotorer genom att använda enstaka 120 bp DNA-beten som spänner över enstaka restriktionsställen och två sekventiella omgångar av Capture för att maximera anrikningen av informativa ligeringsfragment32,40. Dessa strategier ledde till funktionell dissektion av cis-verkande element i många olika sammanhang, inklusive musembryonal utveckling, celldifferentiering, X-kromosominaktivering och felreglering av gener vid patologiska tillstånd 46,63,65,66,67,68,69,70,71.
I Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) drogs > 22 000 kommenterade promotorer innehållande restriktionsfragment ner från Hi-C-bibliotek genom hybridisering av enstaka RNA 120-mer biotinylerade sonder i endera eller båda ändarna av restriktionsfragmentet34,72. Denna metod möjliggjorde dissektion av interaktomet hos tusentals promotorer i ett snabbt ökande antal celltyper, inklusive musembryonala stamceller, fosterleverceller och adipocyter 34,35,72,73, men också humana lymfoblastoidlinjer, hematopoetiska stamceller, epidermala keratinocyter och pluripotenta celler 37,74,75,76,77.
I jämförelse med dessa målanrikningstekniker riktar sig Capture Hi-C mot angränsande genomiska regioner upp till megabasskalan och spänner därmed över en eller flera TAD och omfattar reglerande landskap av gener. Hela regionen av intresse måste kaklas med en rad biotinylerade sonder som omfattar varje DpnII-begränsningsplats inom målet. Hybridiseringen av den biotinylerade matrisen till 3C-mallen, dess efterföljande streptavidinbaserade infångning och bearbetning för multiplexerad sekvensering utförs med hjälp av ett målanrikningssystem för Illumina Paired-End multiplexerad sekvensering. Hela protokollet är snabbt, eftersom det kan utföras på 1 vecka från 3C-biblioteksförberedelse till NGS-sekvensering, och det kräver endast mindre anpassningar och / eller anpassad felsökning.
Protokollet ger också fördelar jämfört med andra 3C-baserade metoder. För att få interaktionskartor med en upplösning på 5-10 kb sekvenserade vi 100-120 M parade läsningar. Som en jämförelse använde vi här en Hi-C-dataset på 571 M läser för att nå en 20 kb upplösning64 (GSM2053973), och minst 1 miljard läsningar skulle krävas för att nå en 5 kb upplösning med kromosomomfattande Hi-C22.
Capture Hi-C som används i den aktuella studien når en mycket högre upplösning än den tidigare publicerade 5C baserat på ett 6-bp skärrestriktionsenzym47 (kompletterande tabell 1). Viktigt är att strategin som är utformad för att berika och förstärka riktade interaktioner i 5C inte tillåter allelspecifik analys av kromatininteraktioner. Tvärtom kan Capture Hi-C-data kartläggas allelspecifikt, vilket möjliggör dissektion av 3D-strukturella landskap av par av homologa kromosomer, till exempel i mänskliga celler eller i F1-hybridcellinjer härledda genom att korsa genetiskt olika musstammar78. För att generera allelspecifika Capture Hi-C-interaktionskartor med en upplösning på 5 kB sekvenserade vi läsningar med 150 bp parkopplade ändar för att öka SNP-täckningen. Liknande allelspecifika tillvägagångssätt kan tillämpas på humana cellinjer, för vilka annotering av SNP är tillgänglig22.
Viktigt är att även om Capture Hi-C i allmänhet säkerställer hög upplösning samtidigt som de förbättrar överkomligheten för sekvenseringskostnader, har produktionen av skräddarsydda biotinylerade oligonukleotider en inverkan på den totala kostnaden för denna metod. Därför kommer valet av den lämpligaste 3C-metoden att skilja sig åt för olika applikationer och beror på den biologiska frågan som behandlas och den upplösning som krävs, liksom storleken på regionen av intresse. Andra utvecklade Capture Hi-C-protokoll delar viktiga funktioner med det protokoll som beskrivs här. Till exempel tillämpades en Capture Hi-C-strategi för att karakterisera ~ 50 kb till 1 Mb genomiska regioner som spänner över icke-kodande varianter associerade med risk för bröst- och kolorektal cancer; i detta protokoll drogs målregioner ner från Hi-C-bibliotek genom att hybridisera 120-mer RNA-beten som kakel målregionerna med en 3x täckning33,38,79. På liknande sätt användes HYbrid Capture Hi-C (Hi-C 2) för att rikta interaktioner inom intressanta regioner upp till2 Mb80. I båda protokollen ökade användningen av en Hi-C-mall berikad för neddragna ligeringsfragment med biotin procentandelen av de totala informativa läsningarna jämfört med vårt protokoll. Till exempel, i Hi-C-datasetet som vi använde här för jämförelse64 (GSM2053973) är procentandelen giltiga par efter borttagning av dubbletter 4,8 gånger högre än de giltiga par som erhållits i Capture Hi-C som beskrivs i figur 3 och kompletterande tabell 1. Den konsekutiva neddragningen av biotinylerade ligerade fragment och hybridiserade sonder gör dock protokollet betydligt mer komplext och tidskrävande samtidigt som det möjligen minskar komplexiteten i den fångade regionen.
En annan tillgänglig metod för att berika 3C-mallar med plattsättningssonder är Tiled-C, som användes för att studera kromatinarkitektur vid hög rumslig och tidsmässig upplösning under muserytroiddifferentiering43. I Tiled-C används en panel med 70 bp biotinylerade sonder för att berika kontakter inom storskaliga regioner i två på varandra följande fångstomgångar för att generera mycket högupplösta kartor över riktade interaktioner 43,81. Den dubbla infångningsanrikningen gör också protokollet längre och mer komplext jämfört med Capture Hi-C. Till skillnad från de Capture-C-strategier som är inriktade på enstaka begränsningsplatser verkar dock den andra fångstomgången i Tiled-C inte öka fångsteffektiviteten avsevärt och kan därför förmodligen utelämnas43. Slutligen tillämpades en liknande plattsättningsmetod baserad på samma målanrikningsstrategi som användes i denna studie på dissektion av regulatoriska landskap som omfattar strukturella varianter som beskrivs hos patienter med medfödda missbildningar och omkonstrueras i transgena möss41,42. I det här fallet utformades plattsättningsmatrisen av sonder över hela målet snarare än i närheten av DpnII-begränsningsplatser41. Ändå var detta arbete avgörande för att lyfta fram känsligheten och kraften i denna strategi för att uppnå högupplöst karakterisering av stora genomiska regioner i olika sammanhang41,42,48.
Sammanfattningsvis representerar protokollet som beskrivs här en enkel, robust och kraftfull strategi för högupplöst 3D-karakterisering av alla genomiska regioner av intresse. Tillämpningen av detta tillvägagångssätt på olika modellsystem, celltyper, utvecklingsreglerade kromatinlandskap och genreglering vid friska och patologiska tillstånd kommer sannolikt att underlätta vår förståelse av samspelet och orsakssambandet mellan genomtopologi och genreglering, en av de grundläggande öppna frågorna inom epigenetikområdet. Att tillämpa Capture Hi-C för att kartlägga långväga interaktioner och högre ordningens kromatinveckning av riskvarianter identifierade av GWAS-studier har dessutom potential att avslöja den funktionella relevansen av icke-kodande genomiska loci associerade med mänskliga sjukdomar i olika sammanhang, vilket ger nya insikter i de processer som potentiellt ligger bakom patogenesen.
Disclosures
Kai Hauschulz är Field Application Scientist på Agilent Technologies - Diagnostic and Genomics Group. Alla andra författare deklarerar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Arbetet i Heard-laboratoriet stöddes av European Research Council Advanced Investigator Award (XPRESS - AdG671027). A.L. stöds av Europeiska unionens Marie Skłodowska-Curie Actions Individual Fellowship (IF-838408). A.H. stöds av ITN Innovative and Interdisciplinary Network ChromDesign, enligt Marie Skłodowska-Curie Grant-avtalet 813327. Författarna är tacksamma till Daniel Ibrahim (MPI för molekylär genetik, Berlin) för hjälpsam teknisk rådgivning, till NGS-plattformen vid Institut Curie (Paris) och till Vladimir Benes och Genomics Core Facility vid EMBL (Heidelberg), för stöd och hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| 37% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15686 | single use glass-vials; do not reuse |
| 50 mL PP conical tube | Falcon | 352070 | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Cell Scrapers - 25 cm Handle and 3.0 cm Blade | Falcon | 353089 | |
| CHIR99021 | Axon Medchem BV | Axon 1386 | |
| cOmplete Mini, Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11836170001 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL | Invitrogen | ZGEXSCCOUNTESS2FL | Automated cell counter |
| Covaris S2 | Covaris | 500217 | Sonicator |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DpnII (50000 units/mL) | New England Biolabs | R0543M | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck | D6429 | |
| Ethanol (100%) | Merck | 1.00983.2500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| gelatine from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| GlycoBlue | Thermo Scientific | AM9516 | Coprecipitant |
| High-Sensitivity Bioanlayzer chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Large Cooling Centrifuge 5920 R | Eppendorf | 5948000018 | |
| leukaemia inhibitory factor (LIF) | Merck | ESG1107 | |
| Liquiport | KNF | NF300 | Benchtop aspiration system |
| Low-binding filter tips | Biozym | VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U | |
| Molecular biology grade water | Merck | W3500-6x500ML | |
| Next Seq 500 | Illumina | SY-415-1001 | |
| Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles) | Illumina | FC-404-2004 | |
| Nonidet P40 Substitute (NP40) | Merck | 11332473001 | |
| PD0325901 | Axon Medchem BV | Axon 1408 | |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11873580001 | |
| Proteinase K - recombinant, PCR-grade (20 mg/mL) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Qubit 2.0 | Thermo Scientific | Q32871 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Sodium acetate pH 5.2 (3M) | Merck | S7899 | |
| speed vacuum concentrator | Eppendorf | EP5305000100-1EA | |
| Agencourt AMPureXP | Beckman Coulter | A63881 | SPRI beads |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent | 5190-8645 | |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2 | Agilent | 5190-4455 | |
| SureSelect XT Library Prep Kit ILM | Agilent | 5500-0132 | |
| T4 ligase (30 units/µL) | Thermo Scientific | EL0013 | |
| table-top Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000012 | |
| Triton-X-100 (500 mL) | Merck | X100-500ML | |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsine | Thermo Scientific | 25300054 | |
| UltraPure Glycine | Thermo Scientific | 15527013 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 31350010 |
References
- Ibrahim, D. M., Mundlos, S. The role of 3D chromatin domains in gene regulation: a multi-facetted view on genome organization. Current Opinion in Genetics & Development. 61, 1-8 (2020).
- Bolt, C. C., Duboule, D. The regulatory landscapes of developmental genes. Development. 147 (3), (2020).
- Glaser, J., Mundlos, S. 3D or not 3D: Shaping the genome during development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (5), 040188 (2021).
- Denker, A., De Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Kempfer, R., Pombo, A. Methods for mapping 3D chromosome architecture. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 207-226 (2020).
- McCord, R. P., Kaplan, N., Giorgetti, L. Chromosome conformation capture and beyond: Toward an integrative view of chromosome structure and function. Molecular Cell. 77 (4), 688-708 (2020).
- Jerkovic, I., Cavalli, G. Understanding 3D genome organization by multidisciplinary methods. Nature ReviewsMolecular Cell Biology. 22 (8), 511-528 (2021).
- Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
- Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N.
- Naumova, N., Smith, E. M., Zhan, Y., Dekker, J. Analysis of long-range chromatin interactions using Chromosome Conformation Capture. Methods. 58 (3), 192-203 (2012).
- Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra-and interchromosomal interactions. Nature Genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Würtele, H., Chartrand, P. Genome-wide scanning of HoxB1-associated loci in mouse ES cells using an open-ended Chromosome Conformation Capture methodology. Chromosome Research. 14 (5), 477-495 (2006).
- De Wit, E., De Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes & Development. 26 (1), 11-24 (2012).
- Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
- Splinter, E., et al. The inactive X chromosome adopts a unique three-dimensional conformation that is dependent on Xist RNA. Genes & Development. 25 (13), 1371-1383 (2011).
- Ferraiuolo, M. A., Sanyal, A., Naumova, N., Dekker, J., Dostie, J. From cells to chromatin: capturing snapshots of genome organization with 5C technology. Methods. 58 (3), 255-267 (2012).
- Kim, J. H., et al. 5C-ID: Increased resolution Chromosome-Conformation-Capture-Carbon-Copy with in situ 3C and double alternating primer design. Methods. 142, 39-46 (2018).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Zhang, Y., et al. Spatial organization of the mouse genome and its role in recurrent chromosomal translocations. Cell. 148 (5), 908-921 (2012).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Nora, E. P., et al. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre. Nature. 485 (7398), 381-385 (2012).
- Krefting, J., Andrade-Navarro, M. A., Ibn-Salem, J. Evolutionary stability of topologically associating domains is associated with conserved gene regulation. BMC Biology. 16 (1), 87 (2018).
- Galupa, R., Heard, E. Topologically associating domains in chromosome architecture and gene regulatory landscapes during development, disease, and evolution. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 267-278 (2017).
- Tena, J. J., Santos-Pereira, J. M. Topologically associating domains and regulatory landscapes in development, evolution and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 702787 (2021).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Davidson, I. F., Peters, J. -M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (7), 445-464 (2021).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
- Davies, J. O. J., et al. Multiplexed analysis of chromosome conformation at vastly improved sensitivity. Nature Methods. 13 (1), 74-80 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Sahlén, P., et al. Genome-wide mapping of promoter-anchored interactions with close to single-enhancer resolution. Genome Biology. 16, 156 (2015).
- Joshi, O., et al. Dynamic reorganization of extremely long-range promoter-promoter interactions between two states of pluripotency. Cell Stem Cell. 17 (6), 748-757 (2015).
- Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
- Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
- Oudelaar, A. M., Davies, J. O. J., Downes, D. J., Higgs, D. R., Hughes, J. R. Robust detection of chromosomal interactions from small numbers of cells using low-input Capture-C. Nucleic Acids Research. 45 (22), 184 (2017).
- Oudelaar, A. M., et al. Single-allele chromatin interactions identify regulatory hubs in dynamic compartmentalized domains. Nature Genetics. 50 (12), 1744-1751 (2018).
- Franke, M., et al. Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature. 538 (7624), 265-269 (2016).
- Despang, A., et al. Functional dissection of the Sox9-Kcnj2 locus identifies nonessential and instructive roles of TAD architecture. Nature Genetics. 51 (8), 1263-1271 (2019).
- Oudelaar, A. M., et al. Dynamics of the 4D genome during in vivo lineage specification and differentiation. Nature Communications. 11 (1), 1-12 (2020).
- Galupa, R., Heard, E. X-chromosome inactivation: A crossroads between chromosome architecture and gene regulation. Annual Review of Genetics. 52, 535-566 (2018).
- Loda, A., Collombet, S., Heard, E. Gene regulation in time and space during X-chromosome inactivation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (4), 231-249 (2022).
- van Bemmel, J. G., et al. The bipartite TAD organization of the X-inactivation center ensures opposing developmental regulation of Tsix and Xist. Nature Genetics. 51 (6), 1024-1034 (2019).
- Galupa, R., et al. A conserved noncoding locus regulates random monoallelic Xist expression across a topological boundary. Molecular Cell. 77 (2), 352-367 (2020).
- Gjaltema, R. A. F., et al. Distal and proximal cis-regulatory elements sense X chromosome dosage and developmental state at the Xist locus. Molecular Cell. 82 (1), 190-208 (2022).
- Galupa, R., et al. Inversion of a topological domain leads to restricted changes in its gene expression and affects inter-domain communication. Development. 149 (9), (2022).
- Savarese, F., Flahndorfer, K., Jaenisch, R., Busslinger, M., Wutz, A. Hematopoietic precursor cells transiently reestablish permissiveness for X inactivation. Molecular and Cellular Biology. 26 (19), 7167-7177 (2006).
- Schulz, E. G., et al. The two active X chromosomes in female ESCs block exit from the pluripotent state by modulating the ESC signaling network. Cell Stem Cell. 14 (2), 203-216 (2014).
- Gnirke, A., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nature Biotechnology. 27 (2), 182-189 (2009).
- Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2D and 3D Cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biological Procedures Online. 19 (1), 8 (2017).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2020).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Forcato, M., et al. Comparison of computational methods for Hi-C data analysis. Nature Methods. 14 (7), 679-685 (2017).
- Venev, S., et al. open2c/cooltools: v0.4.1. , (2021).
- Wages, J. M. NUCLEIC ACIDS | Immunoassays. Encyclopedia of Analytical Science. , Elsevier. 408-417 (2005).
- Ewels, P. A., et al. The nf-core framework for community-curated bioinformatics pipelines. Nature Biotechnology. 38 (3), 276-278 (2020).
- Servant, N., Peltzer, A.
- Furlan, G., et al. The Ftx noncoding locus controls X chromosome inactivation independently of its RNA products. Molecular Cell. 70 (3), 462-472 (2018).
- Giorgetti, L., et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse. Nature. 535 (7613), 575-579 (2016).
- Simon, C. S., et al. Functional characterisation of cis-regulatory elements governing dynamic Eomes expression in the early mouse embryo. Development. 144 (7), 1249-1260 (2017).
- Williams, R. M., et al. Reconstruction of the global neural crest gene regulatory network in vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-276 (2019).
- Godfrey, L., et al. DOT1L inhibition reveals a distinct subset of enhancers dependent on H3K79 methylation. Nature Communications. 10 (1), 2803 (2019).
- Hanssen, L. L. P., et al. Tissue-specific CTCF-cohesin-mediated chromatin architecture delimits enhancer interactions and function in vivo. Nature Cell Biology. 19 (8), 952-961 (2017).
- Larke, M. S. C., et al. Enhancers predominantly regulate gene expression during differentiation via transcription initiation. Molecular Cell. 81 (5), 983-997 (2021).
- Oudelaar, A. M., et al. A revised model for promoter competition based on multi-way chromatin interactions at the α-globin locus. Nature Communications. 10 (1), 5412 (2019).
- Long, H. K., et al. Loss of extreme long-range enhancers in human neural crest drives a craniofacial disorder. Cell Stem Cell. 27 (5), 765-783 (2020).
- Schoenfelder, S., Javierre, B. -M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
- Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
- Freire-Pritchett, P., et al. Global reorganisation of cis-regulatory units upon lineage commitment of human embryonic stem cells. eLife. 6, 21926 (2017).
- Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
- Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
- Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
- Baxter, J. S., et al. Capture Hi-C identifies putative target genes at 33 breast cancer risk loci. Nature Communications. 9 (1), 1028 (2018).
- Sanborn, A. L., et al. Chromatin extrusion explains key features of loop and domain formation in wild-type and engineered genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 6456-6465 (2015).
- Owens, D. D. G., et al. Dynamic Runx1 chromatin boundaries affect gene expression in hematopoietic development. Nature Communications. 13 (1), 773 (2022).
