Summary
במאמר זה נתאר את השיטה ליצירת מודל דצידואליזציה מלאכותית באמצעות עכבר השחלות, ניסוי נשירת רירית הרחם הקלאסי בתחום המחקר של נשירת רירית הרחם.
Abstract
דצידואליזציה של רירית הרחם היא תהליך התמיינות ייחודי של רירית הרחם, הקשור קשר הדוק לווסת ולהריון. פגיעה בדצידואליזציה מובילה להפרעות רירית הרחם שונות, כגון אי פוריות, הפלות חוזרות ולידה מוקדמת. הפיתוח והשימוש במודל דצידואליזציה של רירית הרחם במחקרי פוריות היו גולת הכותרת עבור חוקרי פוריות במשך זמן רב. העכבר נמצא בשימוש נרחב בחקר רבייה ודצידואליזציה. ישנם שלושה מודלים מבוססים של עכברים בנוגע לדצידוואליזציה, כלומר דצידואליזציה טבעית של הריון (NPD), דצידואליזציה מלאכותית (AD) ועשריריזציה חוץ גופית (IVD). ביניהם, AD נחשב מודל אמין עבור decidualization עכבר, אשר קל ליישם קרוב NPD. מאמר זה מתמקד בשיטה שונה של תהליך הייצור והיישום של מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר עם כריתת שחלות כדי למנוע השפעות שחלתיות, אשר יכול להשיג תוצאות ניתנות לשחזור עם שונות קטנה בתוך הקבוצה. שיטה זו מספקת מודל טוב ואמין של בעלי חיים לחקר עשרוניות רירית הרחם.
Introduction
עם התפתחות טכנולוגיית הרבייה בסיוע אדם, שיעור ההריונות הקליניים הנוכחי של הפריה חוץ גופית-החזרת עוברים (IVF-ET) הגיע או אפילו עלה על זה של הריון טבעי. למרות זאת, מטופלות רבות בקליניקה של רבייה בסיוע עדיין עוברות החזרות עוברים מרובות אך אינן מצליחות להשיג הריון כרצונן. עם זאת, המנגנון המולקולרי הספציפי שלה עדיין אינו ברור, ולכן התערבות קלינית אינה יעילה, וזה אחד האתגרים המשמעותיים העומדים בפני רפואת הרבייה 1,2.
גורמי רירית הרחם מהווים כשני שלישים מהגורמים לכישלון הפריה חוץ גופית3. השתלת עובר אנושי מחולקת לשלושה שלבים: מיקום, הדבקה ופלישה 4,5,6. רירית הרחם האימהית עוברת סדרה של שינויים כדי לפגוש את הגעתו של העובר. יצירת "תקופת חלון" להשתלה מספקת תנאים נוחים להשתלת עובר 7,8.
ברוב היונקים, לאחר שהבלסטוציסט נצמד לאפיתל הלומינלי של הרחם, תאי הסטרומה המקיפים את הבלסטוציסט מתחילים להתרבות ולהתמיין במהירות, והשיפוץ המהיר של המזנכימה משנה את צורתו ותפקודו, מה שמוביל להשתלת עובר 5,9,10. הגידול המהיר בנפח האתר ובמשקלו מאפשר לבלסטוציסט להשתלב בסטרומה של הרחם, תהליך המכונה דצידואליזציה11. סטרומה רירית הרחם מתמיינת ומתעצבת מחדש לקראת הריון, בעוד המעבר של תאי סטרומה מספק מרחב וחיבורי איתות חדשים לתאים נשירים לבצע את תפקידם12,13. תאי סטרומה הופכים לתאים נשירים ומפרישים גורמים איקוניים רבים כגון פרולקטין (PRL), חלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (Igfbp1) וכן הלאה. מחקרים הראו כי דצידואליזציה חריגה היא אחת הסיבות העיקריות לכישלון השתלת עוברים, אך הסיבה לדצידואליזציה חריגה עדיין אינה ברורה ויש צורך להבהיר אותהעוד יותר 1,14.
מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר חיוני לחקר התהליך הפיזיולוגי והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הדצידואליזציה. דצידואליזציה מלאכותית (AD) מתייחסת בעיקר לתהליך של נשירת רירית הרחם שהוקמה בשיטות מלאכותיות כדי לדמות הריון או את המחזור החודשי. מבחינת מורפולוגיה, אין הבדל כולל בין עשרון הריון לבין דצידואליזציה מלאכותית15,16. בלוטות הרחם קיימות ברירית הרחם לפני שהן נוצרות ונעלמות לאחר העשרה. לגבי ביטוי הגנים, רק הבדל קל מזוהה בין דצידואליזציה טבעית של הריון (NPD) לבין AD15. כתוצאה מכך, מודל הדצידואליזציה המלאכותית בעכברים יכול לדמות דצידואליזציה של הריון כדי לחקור את הפתוגנזה הלא ידועה וטיפול חדש במחלות רבייה אנושיות.
NPD, AD ודצידואליזציה חוץ גופית (IVD) הן שלוש שיטות להשגת דצידואליזציה של עכברים. מודל NPD תלוי בהריון טבעי והוא הקרוב ביותר למצב הפיזיולוגי של האם, כולל ההשפעות של עוברים. השוואת ההבדלים בין אתרי השתלה ללא השתלה היא גישה פיזיולוגית ונוחה יותר לחקר דצידואליזציה. מודל האלצהיימר פותח על ידי שימוש בהזרקה תוך רחמית של שמן שומשום כממריץ כדי לגרום לדצידואליזציה אצל עכברה מדומה המזווגת עם זכרים שעברו כריתת כלי דם כדי למנוע את ההשפעה של עוברים. הן מודלים של NPD והן של אלצהיימר ממלאים תפקידים חיוניים במטרות מחקר שונות, אך הם אינם יכולים להימנע מכשל הזדווגות ומהבדלים בתוך הקבוצה הנגרמים על ידי פעילויות שונות של מטבוליזם הורמונלי אימהי. IVD היא שיטה התלויה בטיפול בשילוב אסטרוגן ופרוגסטרון ברמה התאית, הדורשת תנאי ניסוי מחמירים יותר ויכולת הפעלה. עם זאת, מודל המבחנה אינו יכול לדמות באופן מלא את התגובה הנשירים בתנאים פיזיולוגיים15. לכן, אנו מציעים שיטת אינדוקציה פשוטה ומשופרת שונה מן AD מסורתי כדי להפחית את ההשפעה של הורמונים אנדוגניים על decidualization. בהתבסס על הבטחת הצלחת השראת הדצידואליזציה, היא קרובה יותר למצב הפיזיולוגי ומתאימה יותר לניסויים שצריכים להוציא גורמים עובריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים של בית החולים מגדל התוף המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת נאנג'ינג (מס '20171202). כל הפעולות עוקבות אחר הסוכנות המתאימה לטיפול ושימוש בבעלי חיים ולהנחיות לאומיות.
הערה: עכברים גודלו בסביבה ספציפית נטולת פתוגן (SPF), עם טמפרטורה של 22 ° C ± 1 ° C, לחות יחסית של 50% ± 1%, מחזור בהיר / כהה של 12 שעות/12 שעות, וגישה חופשית למזון ומים.
1. עכבר ovariectomy
- לעקר את כלי הניתוח עם מעקר בטמפרטורה גבוהה ולחץ גבוה 1 יום לפני הניתוח.
- שוקלים עכברי C57BL/6 בני 8 שבועות ומזריקים 1% נתרן פנטוברביטל בהתאם כדי להרדים את העכברים. המינון המשמש הוא 40 מ"ג / ק"ג17. מינון זה מספק 40-60 דקות של הרגעה, אשר עונה על הדרישות של כריתת שחלות. לשיכוך כאבים לפני הניתוח, הזריקו לעכברים 5 מ"ג/ק"ג meloxicam (s.c).
הערה: הרדמה מוצלחת בעכברים יכולה להיות מסומנת על ידי היעלמות של רפלקסים שרירים עמוקים ונשימה יציבה. סימנים להרדמה מוצלחת כוללים ללא מצמוץ בעת נגיעה בקנטוס הפנימי, ללא בליעה בעת משיכת הלשון, ללא כיפוף רגליים בעת צביטת העור בין אצבעות הרגליים, וללא קפיצה בעת מחט הזנב. - יש למרוח את משחת המגן על גלגלי העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההרדמה.
- התחל את הפעולה כאשר עכברים מורדמים לחלוטין. מניחים ומקבעים את העכברים במצב נוטה על משטח הניתוח, ומגלחים את השיער על הגב לאחר הרטבתם במי סבון. יש לחטא את העור באתנול 70% לאחר הגילוח.
- מצא את אתר החתך הניתוחי ב-0.5 ס"מ (או 1.0 ס"מ מתחת לצלע) בקצה העליון של שורש הירך של שתי הגפיים האחוריות במקביל לעמוד השדרה (איור 1A).
הערה: מיקום חתך נכון חיוני למיקום מהיר של השחלה. - קח את אתר החתך כמרכז וחטא את אזור החתך עם יודופור 3x, ולאחר מכן מניחים וילון כירורגי סביב אזור החתך.
- בצע חתך אורכי של כ 0.5-1.0 ס"מ באמצעות מספריים. חותכים את הפאשיה ומפרידים באופן פסיבי את השרירים עם פינצטה.
- מצאו חתיכה מכרית השומן הלבן בשדה החתך קרוב לקוטב התחתון של הכליה דרך שכבת השריר הדקה (איור 1B).
הערה: כרית השומן הלבן היא האינדיקטור הברור ביותר למיקום השחלה. - מהדקים את מסת השומן בעזרת קליפסים המוסטטיים, ומוציאים את השחלה העטופה בכרית השומן מהחתך.
- מהדקים את צומת השחלה והחצוצרה בפינצטה מעוקלת, ומסירים את השחלה לאורך הפדיקור השחלתי בעזרת מספריים. עצור את הדימום באמצעות עט electrocoagulation או מחט של מזרק 1 מ"ל מחומם על מנורת אלכוהול.
הערה: הקפד לשמר את החצוצרה, שהיא ציון דרך אנטומי להזרקה הבאה של שמן שומשום לתוך קרני הרחם. - שטפו את החתך הניתוחי במי מלח רגילים כדי למנוע הידבקות רקמות, השתמשו בתפר 4-0 כדי לתפור את השריר והעור בהתאמה, וחיטאו שוב את החתך הניתוחי ביודופור.
- הניחו את העכברים במצב נוטה בכלוב והחיאו אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס המצויד במקור אור ומערכת אוורור למשך כשעתיים.
- שימו לב לעכברים לאחר הניתוח, החזירו אותם למקום ההאכלה המקורי לבדם עד שיחלימו לחלוטין, ותנו להם מספיק מים ומזון.
2. מנוחה לאחר הניתוח וניסוח אסטרוגן ופרוגסטרון
- ודא שהעכברות נחות במשך שבועיים לאחר כריתת השחלות.
- בארון נקי במיוחד, הוסיפו אסטרוגן (2 ננוגרם/מיקרוליטר) ופרוגסטרון (0.2 ננוגרם/מיקרוליטר) לשמן שומשום בצינורות צנטריפוגות נטולות אנזימי RNA.
- הניחו את צינורות הצנטריפוגות באמבט מים תרמוסטטי בטמפרטורה של 37°C ונערו את הצינורות ברציפות כדי להאיץ את ההמסה.
- לאחר המסה מלאה, מחלקים את תמיסת שמן השומשום לאליקוטים של 100 מיקרוליטר לשימוש נוח. אחסנו את תמיסות האסטרוגן והפרוגסטרון המוכנות במקרר בטמפרטורה של 4°C.
3. מודל דצידואליזציה מלאכותית מושרית
- תת עורית (s.c) להזריק 100 ng של אסטרוגן ב 50 μL של שמן שומשום לתוך כל עכבר במשך 3 ימים, ולאחר מכן 2 ימים של מנוחה15.
הערה: ודא שהאסטרוגן והפרוגסטרון נוצרו והונחו במקומות שונים. כל זיהום של אסטרוגן על ידי פרוגסטרון עלול להוביל לכישלון. - הזריקו 1 מ"ג פרוגסטרון ו-10 ננוגרם אסטרוגן ב-50 מיקרוליטר שמן שומשום לכל עכבר למשך 3 ימים נוספים15.
- הפעל את העכברים כדי לגרום למודל הדצידואליזציה המלאכותית15 6 שעות לאחר הזריקה השלישית המשולבת אסטרוגן-פרוגסטרון.
- מצאו את קרן הרחם בקצה התחתון של החצוצרות והזריקו 20 מיקרוליטר שמן שומשום באיטיות יחד עם קרן הרחם, דחפו את הרקמה לאחור, תפרו את החתך ואפשרו לעכבר להתאושש. הגישה לפעולה זהה לכריתת שחלות עכבר15.
הערה: המשך עם הניתוח השני רק במקרה של כריתת שחלות מוצלחת (חתך העור נרפא היטב, השחלה נכרתה לחלוטין, ואת הקצה השיורי של החצוצרה אינו דבוק לרקמות שמסביב).
הערה: עבור השראת מודל AD, 20 μL של שמן שומשום מתאים; יותר מ -20 מיקרוליטר של שמן שומשום יחדרו בקלות לצד השני. - הזריקו 50 מיקרוליטר שמן שומשום המכיל 1 מ"ג פרוגסטרון ו-10 ננוגרם אסטרוגן (H.) למשך 4 ימים נוספים. ראה פירוט באיור 215,18.
4. איסוף דוגמאות
- הרדימו את העכברים (n = 6) על ידי חנק פחמן דו חמצני ואספו את הרחם. התבוננו בצורת הרחם הדו-צדדי, צלמו ושקלו את קרני הרחם (איור 3A, B).
- לתקן 3-5 מ"מ של רקמת הרחם עם 10% פורמלין, להטביע פרפין, לחתוך אותם. צבעו את המקטעים עם המטוקסילין ואאוזין כדי לצפות בשינויים המורפולוגיים19 (איור 4A).
- הטמיעו עוד 3-5 מ"מ מרקמת הרחם בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), הקפיאו בחנקן נוזלי ואחסנו במקרר בטמפרטורה של 80°C-. קפואים חותכים את הרקמה ל-10 מיקרומטר ומזהים פעילות פוספטאז אלקליין ברקמת הרחם באמצעות שיטת צימוד אזו20 (איור 4B).
הערה: ניתן לקבל תוצאות משביעות רצון באמצעות מקטעים מוקפאים כדי לזהות תוכן ALP, ולא קטעי פרפין. - לחלץ את סך כל הרנ"א של הרחם עם מגיב טריזול ולבצע PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) במערכת PCR בזמן אמת (רשימת חומרים) עם תערובת מאסטר qPCR (רשימת חומרים) כדי לזהות את ביטוי ה-mRNA היחסי של תת-משפחה פרולקטין 8 2 (Prl8a2), כבד/עצם/כליה אלקליין פוספטאז (Alpl), וחלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (Igfbp1)15 על-ידי נורמליזציה לרמות mRNA של 18S (איור 4C-E ). בצע את תנאי ה- PCR: שלב 1, 95 ° C למשך 30 שניות; שלב 2, 95 ° C עבור 10 s ו 60 ° C עבור 30 שניות; חזור על המחזור 40x. רשימה מלאה של רצפי פריימר מופיעה בטבלה 1.
- ניתוח נתוני qPCR בשיטת 2-ΔΔCT ושיטת t-test לניתוח סטטיסטי בתוכנה המתאימה. במחקר זה, p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מדדי מודל הדצידואליזציה של העכבר כוללים את המורפולוגיה הכללית של הרחם, יחס המסה של הרחם העשרוני והלא נשיר, המורפולוגיה ההיסטולוגית של רירית הרחם ורמת הביטוי של מולקולות סמן דצידואליזציה. המורפולוגיה הכללית של הרחם המלאכותי הנשיר של עכברים המושרה על ידי שמן קרובה יותר לזו של הרחם בהריון. גוף הרחם הופך עבה, וחלל הרחם הופך קטן יותר מהצד הלא מושרה. הנפח והמשקל של קרן הרחם המושרה גבוהים משמעותית מאלה של הצד הלא מושרה (איור 3A,B). צביעת רקמת הרחם הראתה כי הבלוטות נעלמות ותאי הסטרומה של רירית הרחם על הקרן המושרה התמינו לתאים נשירים גדולים, עגולים, ציטופלזמיים ומרובי גרעינים עם גבולות תאים לא ברורים. חלקי הצד שאינם מושרים מראים את המורפולוגיה של רקמת רירית הרחם במצב פיזיולוגי נורמלי (איור 4A). התוצאה של שיטת צימוד האזו הראתה שתכולת הפוספטאז הבסיסי בצד המושרה בשמן הייתה גבוהה משמעותית מהצד הלא מושרה (איור 4B). תוצאות ה-qPCR הראו שביטוי ה-mRNA של Prl8a2, Alpl ו-Igfbp1 בקרן המושרה היה גבוה משמעותית מזה שבקרן הלא מושרית, מה שמרמז על כך ששמן יכול לגרום לדצידואליזציה מלאכותית בעכברים (איור 4C-E).
איור 1: החתך הניתוחי של כריתת השחלה בעכבר . (A) מנח כריתת שחלות עכבר. (B) מיקום שחלה העכבר במהלך כריתת השחלות. (C) מקום השחלה במהלך כריתת השחלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נוהל הפעולה. ההליך כולו כולל כריתת שחלות, מנוחה לאחר הניתוח, אינדוקציה של מודל הדצידואליזציה המלאכותית, ותיקוף פנוטיפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יצירת מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר . (A) תמונה מייצגת של דצידואליזציה מלאכותית המושרה על ידי שמן. לרחם הימני לא הוזרק שמן, בשם שמן (-). לרחם השמאלי הוזרק שמן, בשם שמן (+). (B) משקל הרחם המוזרק עם או בלי שמן. עמ' < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תיקוף מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר . (A) תמונה מייצגת של דצידואליזציה מלאכותית המושרה על ידי שמן. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ ו- 100 מיקרומטר. (B) שיטת צימוד האזו זיהתה את פעילות הפוספטאז הבסיסי של דסידואה מלאכותית. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר ו- 50 מיקרומטר. (C) רמת הביטוי של Prl8a2 mRNA זוהתה על ידי qPCR. * עמ' < 0.05. (D) רמת הביטוי של Alpl mRNA. ** עמ' < 0.01. (E) רמת הביטוי של Igfbp1 mRNA. ** עמ' < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| עכבר Igfbp1 qPCR-F | GCCCAACAGAAAGCAGGAGATG |
| עכבר Igfbp2 qPCR-R | GTAGACACACCAGCAGAGTCCA |
| עכבר prl8a2 qPCR-F | ACCACAACCCATTCTCAGCTGG |
| עכבר prl8a2 qPCR-R | TGTTCAGGTCCATGAGCTGGTG |
| עכבר Alpl qPCR-F | CCAGAAAGACACCTTGACTGTGG |
| עכבר Alpl qPCR-R | TCTTGTCCGTGTCGCTCACCAT |
| 18s עכבר qPCR-F | ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG |
| 18s עכבר qPCR-R | CGGACATCTAAGGGCATCAC |
טבלה 1: רשימת רצפי פריימר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דצידואליזציה בעכברים היא תהליך ספונטני בהתאם לנוכחות עוברים, השונה מבני אדם. עם זאת, נמצא כי גירוי מלאכותי כגון הזרקת רחם של חרוזי זכוכית וחתך ברחם יכול לגרום לדצידואליזציה של רירית הרחם במקום עוברים. בנוסף, החוקרים מצאו כי גורמים רבים יכולים לגרום לנשירים או להשתתף בדצידואליזציה, כגון הזרקת הורמונים סטרואידים, פרוסטגלנדינים וגורמים מעכבי גדילה לחלל הרחם21. בהשוואה לשיטות הדוגמנות לעיל, מודל העכבר המפורט כאן עם כריתת השחלות, באמצעות שמן שומשום כממריץ, יכול להוציא את ההשפעות של אסטרוגן ופרוגסטרון המיוצרים אנדוגניים. לכן, זה חסכוני וקל לתפעול.
יש להסיר את השחלות בצורה נקייה כדי למנוע רקמת שחלה שיורית, אשר תשפיע על השראת הדצידואליזציה שלאחר מכן. צעד זה נועד להפחית את ההשפעות של אסטרוגן אנדוגני ופרוגסטרון המיוצרים על ידי השחלות. נזק לחצוצרה יש להימנע כי זה יכול לשמש סימן לחפש את הרחם בעת הזרקת שמן שומשום לתוך חלל הרחם. אם מתרחשת הידבקות בטן או הסרת חצוצרות, על המפעיל לשים לב להבחנה בין הרחם למעי.
דליפת שמן מתרחשת בקלות בתהליך של הזרקה תת עורית. יש לבחור את עור הבטן כאתר הזרקה תת עורי ולהימנע מהפטמות. יש צורך להזריק את השמן ולשלוף את המחט לאט. אם לא ניתן לשלוף את המחט כאשר העכבר פעיל, זה בקלות גורם לדליפה. יש ללחוץ על מקום המחט עם כדור צמר גפן לרגע כדי למנוע דליפה. בפעולה זו נעשה שימוש בזריקות אסטרוגן אקסוגני ופרוגסטרון כדי לשמור על רמות ההורמונים של העכברים יציבות לפני פעולת השראת הנשרוניות. שיטת הזרקה זו דימתה שינויים הורמונליים בתקופת טרום ההשתלה של עכברים. כאן גרמנו לדצידואליזציה לאחר שיא האסטרוגן השני.
המפתח להצלחת פעולה זו הוא כמות שמן השומשום המוזרקת. יותר מדי שמן שומשום יחדור לחלל הקרן השנייה של הרחם. מחסור בשמן שומשום יוביל לירידה בתגובת הדצידואליזציה או לדצידואליזציה לא אחידה לאורך הרחם, וכתוצאה מכך להבדלים ניסיוניים בלתי צפויים. במהלך הניתוח יש להחדיר את מחט המזרק לחלל הרחם בעת הזרקת שמן שומשום ולמשוך בעדינות קדימה ואחורה כדי לוודא שהמחט נמצאת בחלל הרחם. חלק מחלל הרחם יכול להיראות שקוף אם מוזרק בהצלחה. יש להדק בעדינות את הדקירה בפינצטה במשך כ-10 שניות כדי לוודא שהיא סגורה, מה שיכול למנוע דליפה של שמן שומשום לאחר שליפת המחט. במקביל, בעדינות לדחוף את גוף הרחם כלפי מטה עם המחט כדי להפוך את שמן שומשום להתפשט באופן שווה בחלל הרחם.
הטיפול וההחייאה לאחר הניתוח הם מפתחות נוספים להצלחת מודל זה. ראשית, שמירה על סביבה סטרילית לחתך במהלך הניתוח היא חיונית. לפני החייאה העכברים, לחטא את חתך הפעולה עם יודופור ולכסות אותו עם חתיכת גזה רפואית כדי להפחית את שכיחות הזיהום. לאחר הניתוח, העכברים צריכים לעכל חומרי הרדמה במשך 2-3 שעות כדי להתאושש. במהלך תקופה זו, העכברים צריכים להיות ממוקמים לתוך אינקובטור 25 מעלות צלזיוס כדי להתאושש מהר יותר ולמנוע היפותרמיה הנגרמת על ידי חיטוי עם 70% אלכוהול יודופור. יש לשים לב לריפוי תוך מספר ימים לאחר הניתוח ולטפל בסוגים שונים של סיבוכים ניתוחיים בזמן, כגון סדקים בחתך, נפיחות, כיב וכדומה.
Prl8a2 ו- Alpl הם סמני הדצידואליזציה הקלאסיים ביותר. Igfbp1 הוא גם החלבון העיקרי בתאים נשירים בעכברים ונחשב לסמן הספציפי של דצידואליזציה בעכברים. רמות הביטוי של Prl8a2, Alpl ו - Igfbp1 mRNA בקרן הרחם המושרה בשמן מוגברות באופן משמעותי בהשוואה לצד הביקורת ללא הזרקת שמן. יתר על כן, פעילות phosphatase אלקליין בצד המושרה שמן הוא גבוה באופן משמעותי מאשר בצד הבקרה. כל התוצאות הללו מצביעות על הצלחתו של מודל הדצידואליזציה המלאכותית15.
מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר יכול לשמש לאימות מולקולות פוריות פתוגניות ולספק מודל תיקוף טוב לאבחון וטיפול באי פוריות הקשורה לעשריריות רירית הרחם חריגה. מודל זה שימושי לחקר מחלות פוריות, כגון הפלות חוזרות ונשנות וכישלון השתלה חוזר. הוא משמש לחקר תפקידם של גורמים אימהיים בהשתלת עוברים ופלישה. מודל AD זה יש בטיחות טובה, שיעור הצלחה גבוה, ופותר את ההשפעה של הורמונים אנדוגניים. עם זאת, זהו תהליך גוזל זמן ותובעני מאוד. אנו נמטב עוד יותר את שיטות הניסוי שלנו כדי להקל על המחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להכיר בתמיכה מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82001629, XQS), תוכנית הנוער של הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20200116, XQS), ומימון מחקר פוסט-דוקטורט במחוז ג'יאנגסו (2021K277B, XQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Estrogen | Sigma | E2758 | Hormone supplement |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Hormone supplement |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | Hormone supplement |
| Sodium pentobarbital | Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. | Anaesthesia | |
| Meloxicam injection | Qilu Animal Health Products Co., Ltd | Analgesia | |
| Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) | Solarbio | G1480 | Alkaline phophatase stain |
| Eosin | Servicebio | G1005-2 | HE stain |
| Hematoxylin | Servicebio | G1005-1 | HE stain |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | qPCR |
| 70% ethanol | Lircon | ZH1120090 | Disinfect |
| Iodophor | Runzekang | RZK-DF | Disinfect |
| Erythromycin Eye Ointment | Guangzhou Baiyunshan | Mice eyeball protect | |
| 4-0 suture | Ethicon | W329 | Incision suture |
| 10% formalin | Yulu | L25010118 | Tissue fix |
| Optimal cutting temperature compound | Sakura | 4583 | Ssection |
| Trizol reagent | Ambion | 15596018 | qPCR |
References
- Carson, S. A., Kallen, A. N. Diagnosis and management of infertility: A review. JAMA. 326 (1), 65-76 (2021).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility dagger. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Sang, Y., Li, Y., Xu, L., Li, D., Du, M. Regulatory mechanisms of endometrial decidualization and pregnancy-related diseases. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 52 (2), 105-115 (2020).
- Ng, S. W., et al. Endometrial decidualization: The primary driver of pregnancy health. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4092 (2020).
- Birgit, G., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Human Reproduction Update. 25 (1), 114-133 (2019).
- Paulson, E. E., Comizzoli, P. Endometrial receptivity and embryo implantation in carnivores-commonalities and differences with other mammalian species. Biology of Reproduction. 104 (4), 771-783 (2021).
- Kelleher, A. M., Milano-Foster, J., Behura, S. K., Spencer, T. E. Uterine glands coordinate on-time embryo implantation and impact endometrial decidualization for pregnancy success. Nature Communications. 9 (1), 2435 (2018).
- Tian, J., et al. Attenuated monoamine oxidase a impairs endometrial receptivity in women with adenomyosis via downregulation of FOXO1dagger. Biology of Reproduction. 105 (6), 1443-1457 (2021).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 155-165 (2012).
- Dunn, C. L., Kelly, R. W., Critchley, H. O. Decidualization of the human endometrial stromal cell: an enigmatic transformation. Reproductive BioMedicine Online. 7 (2), 151-161 (2003).
- Zhu, H., Hou, C. C., Luo, L. F., Hu, Y. J., Yang, W. X. Endometrial stromal cells and decidualized stromal cells: Origins, transformation and functions. Gene. 551 (1), 1-14 (2014).
- Jose, R. M., et al. Endometrial and decidual stromal precursors show a different decidualization capacity. Reproduction. 160 (1), 83-91 (2020).
- Pan-Castillo, B., et al. Morphophysical dynamics of human endometrial cells during decidualization. Nanomedicine. 14 (7), 2235-2245 (2018).
- Wang, C., et al. Comparative analysis of mouse decidualization models at the molecular level. Genes. 11 (8), 935 (2020).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vriens, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. (121), e55168 (2017).
- Kerger, H., et al. Microvascular oxygen delivery and interstitial oxygenation during sodium pentobarbital anesthesia. Anesthesiology. 86 (2), 372-386 (1997).
- Filant, J., Spencer, T. E. Endometrial glands are essential for blastocyst implantation and decidualization in the mouse uterus. Biology of Reproduction. 88 (4), 93 (2013).
- Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. EBioMedicine. 75, 103790 (2022).
- Grogg, E., Pearse, A. G. Coupling azo dye methods for histochemical demonstration of alkaline phosphatase. Nature. 170 (4327), 578-579 (1952).
- Labarta, E., et al. Analysis of serum and endometrial progesterone in determining endometrial receptivity. Human Reproduction. 36 (11), 2861-2870 (2021).
